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UNIVERSIDAD AUTONOMA DEL ESTADO DE MÉXICO

FACULTAD DE QUÍMICA

EFECTO DE LA CONTAMINACIÓN ATMOSFÉRICA POR METALES

PESADOS EN LAS HOJAS DE LOS ÁRBOLES DE LA ZONA

METROPOLITANA DEL VALLE DE TOLUCA

TESIS

QUE PARA OBTENER ELGRADO DE

MAESTRÍA EN CIENCIAS AMBIENTALES

PRESENTA

IBQ. CLAUDIA ILIANA LEDESMA ORTÍZ

DIRIGIDO POR:

DRA. ARACELI AMAYA CHÁVEZ

DR. JUAN CARLOS SÁNCHEZ MEZA

DR. PEDRO ÁVILA PÉREZ

TOLUCA, ESTADO DE MÉXICO

Efecto de la contaminación atmosférica por metales pesados en las hojas de los árboles de la Zona Metropolitana del Valle de Toluca


El presente trabajo se desarrolló en la Facultad de Química de la Universidad Autónoma

del Estado de México., en colaboración con el Instituto Nacional de Investigaciónes

Nucleares, como parte del proyecto COMECYT Clave EDOMEX-2009-C02-132003 Etapa

3. Toxicidad de partículas

Contando con el apoyo de la beca CONACYT número de registro 481480.

Este trabajo fue registrado con el título “Efecto de la contaminación atmosférica por metales

pesados en las hojas de los árboles de la Zona Metropolitana del Valle de Toluca”, con el

número de registro MACIAS-2012.

El proyecto se inscribe en la línea de prevención, efectos y control de la contaminación

ambiental en el área de calidad ambiental del programa de Maestría en Ciencias

Ambientales de la Facultad de Química de la UAEM.


DEDICATORIAS A mi mamá

Por todo su cariño y paciencia, su ayuda y su incondicional dedicación a mi superación

constante. Por su apoyo en casa y con la familia, porque por su ejemplo soy lo que soy.

A mi esposo

Por su paciencia, su apoyo, su cariño y aguantar todos esos momentos de desvelo conmigo,

por ayudarme en mi conocimiento y su apoyo incondicional.

A mis hijos

Por su amor y paciencia en todas esas horas que no estuve con ellos, por su comprensión

y su impulso en todo lo que realizo.

AGRADECIMIENTOS

A Dios

Por brindarme su sostén en cada momento y mostrarme el camino.

A la Dra. Araceli Amaya

Por su orientación y apoyo, por las horas brindadas de su tiempo para llevar a cabo este

proyecto, por su conocimiento compartido y por su paciencia.

Al Dr. Pedro Ávila Pérez por su apoyo siempre acertado y efectivo para llevar a cabo de

manera exitosa éste proyecto y por todo el conocimiento compartido.

Al Dr. Juan Carlos Sánchez por su ayuda para el cumplimiento de este proyecto y buenas

horas de conocimiento.

Al Instituto Nacional de Investigaciones Nucleares por el proyecto brindado y por el

prestamos de instalaciones, equipo y recursos para lograr resultados.

A CONACYT por el apoyo brindado con la beca número 481480.


A Jorge por su ayuda en el trabajo de campo.

A Dr. Samuel Tejeda, Sr. Sergio y personal de laboratorio de Fluorescencia del ININ por su

ayuda en la toma de muestras y el análisis de metales, por sus horas de apoyo y buena

compañía.


INDICE

RESUMEN .......................................................................................................................................... 1

ABSTRACT ......................................................................................................................................... 1

INTRODUCCIÓN ................................................................................................................................ 2

1.0 MARCO TEORICO ........................................................................................................................ 5

1.1 Contaminación atmosférica ........................................................................................................ 5

1.2 Partículas suspendidas ................................................................................................................ 7

1.2.1 Factores meteorológicos responsables de la dispersión de partículas ................................. 10

1.3 Zona Metropolitana del Valle de Toluca................................................................................... 11

1.3.1 Contaminación en la ZMVT .................................................................................................... 11

1.3.2 Meteorología en la Zona Metropolitana del Valle de Toluca ................................................ 15

1.3.3 Dinámica de vientos en la ZMVT ........................................................................................... 18

2.0 METALES PESADOS ................................................................................................................... 20

2.1 CONTAMINACIÓN POR METALES PESADOS ............................................................................. 20

3.0 LAS PLANTAS COMO BIOINDICADORES .................................................................................... 22

3.1 Efecto de los metales sobre las plantas .................................................................................... 24

3.1.1 Fuentes de metales escenciales y no escenciales ................................................................. 26

4.0 BIOMARCADORES ..................................................................................................................... 28

4.1 Estrés oxidativo ......................................................................................................................... 28

4.1.1 Especies reactivas de oxígeno (ROS) ..................................................................................... 29

4.2 MECANISMOS DE TOLERANCIA ................................................................................................ 31

4.2.1 Mecanismos externos ............................................................................................................ 32

4.2.2 Mecanismos internos de tolerancia ...................................................................................... 32

4.3 Biomarcadores de contaminación por metales pesados en las plantas .................................. 34

4.3.1 Variación en la relación clorofila a y b ................................................................................... 35

4.3.2 Aumento en la peroxidación lipídica ..................................................................................... 36

4.3.3 Peroxidasas ............................................................................................................................ 36

4.3.4 Superoxido dismutasa (SOD) ................................................................................................. 37

4.3.5 Catalasa (CAT) ........................................................................................................................ 37

4.3.6 Ascorbato peroxidas (APX), Glutatión peroxidasa (GPX) ....................................................... 38

5.0 ANTECEDENTES ......................................................................................................................... 38


6.0 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ............................................................................................ 43

6.1 Hipótesis ................................................................................................................................... 45

7.0 OBJETIVO GENERAL .................................................................................................................. 45

7.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................................................................... 45

8.0 METODOLOGÍA ......................................................................................................................... 46

8.1 Selección de los puntos de muestreo ....................................................................................... 47

8.2 Muestreo .................................................................................................................................. 47

8.2.1 Sitios de muestreo ............................................................................................................. 49

8.3 Preparación de la muestra ........................................................................................................ 50

8.4 Determinación de biomarcadores de estrés oxidativo ............................................................ 50

8.4.1 Contenido de proteínas ......................................................................................................... 51

8.4.2 Peroxidación lipídica .............................................................................................................. 51

8.4.3 Catalasa (CAT) ........................................................................................................................ 52

8.4.4 Ascorbato peroxidasa (APX) ................................................................................................. 53

8.4.5 Guayacol peroxidasa (GPX) .................................................................................................... 54

8.4.6 Superoxido dismutasa (SOD) ................................................................................................. 55

8.4.7 Clorofila y Carotenos ............................................................................................................. 55

8.4.8 Carotenos ............................................................................................................................... 55

8.5 Caracterizar y cuantificar a los metales pesados ...................................................................... 56

8.6 Determinación de la sensibilidad de las especies .................................................................... 57

9.0 RESULTADOS ............................................................................................................................. 58

10.0 CONCLUSIONES ....................................................................................................................... 90

11.0 RECOMENDACIONES .............................................................................................................. 90

12.0 REFERENCIAS .......................................................................................................................... 92

INDICE DE FIGURAS

FIGURA 1………………………………………………………………………………………………………………………………….13

FIGURA 2………………………………………………………………………………………………………………………………….15

FIGURA 3………………………………………………………………………………………………………………………………….19

FIGURA 4………………………………………………………………………………………………………………………………….28


FIGURA 5………………………………………………………………………………………………………………………………….33

FIGURA 6………………………………………………………………………………………………………………………………….35

FIGURA 7………………………………………………………………………………………………………………………………….47

FIGURA 8………………………………………………………………………………………………………………………………….48

INDICE DE TABLAS

TABLA 1…..……………………………………………………………………………………………………………………………….12

TABLA 2…..……………………………………………………………………………………………………………………………….34

TABLA 3…..……………………………………………………………………………………………………………………………….49

TABLA 4…..……………………………………………………………………………………………………………………………….50

TABLA 5…..……………………………………………………………………………………………………………………………….53

LISTA DE ABREVIACIONES

ZMVT Zona Metropolitana del Valle de Toluca

ROS Especies reactivas de oxígeno

APx Ascorbato Peroxidasa

GPx Guayacol Peroxidasa

SOD Superoxido Dismutasa

CAT Catalasa


Maestría en Ciencias Ambientales 1

RESUMEN Hojas de dos especies de árboles: Ligustrum sp y Juniperus sp fueron estudiadas como

indicadores de contaminación a metales pesados (Mn, Fe, Cu, Zn y Pb) en la atmósfera de

la Zona Metropolitana del Valle de Toluca (ZMVT). Se midieron los biomarcadores catalasa,

superoxido dismutasa, ascorbato peroxidasa, guayacol, proteínas y pigmentos para

determinar los efectos ante el estrés atmosférico, durante dos periodos en el año (Diciembre

2012 y Mayo 2013). Los resultados muestran una mayor inhibición en la respuesta

enzimática, disminución en contenido de proteínas y mayor lipoperoxidación en sitios con

mayor contenido de metales en tejido perteneciente a zonas urbanas que presentan mayor

flujo vehicular y actividad industrial.La biodisponibilidad de los metales fue Mn>Zn>Cu para

la primer época de muestreo y Mn>Cu>Zn para las segunda época de muestreo.

ABSTRACT

Leaves of two tree species: Juniperus sp and Ligustrum sp were studied as

indicators of pollution heavy metals (Mn, Fe, Cu, Zn and Pb) in the atmosphere of

the Metropolitan Area of the Toluca Valley (ZMVT). Biomarkers of catalase,

superoxide dismutase, ascorbate peroxidase, guaiacol, proteins and pigments were

measured in order to determine the effects to atmospheric stress caused by heavy

metals during two periods in the year (December 2012 and May 2013. Metals were

quantified in dry deposit and tissue on trees tissue leaves using the technique of

Fluorescence spectrometry X-ray in energy dispersive (EDXRF) and Fluorescence

spectrometry X-ray in total reflation (TXRF) respectively.

The results show greater response of enzyme inhibition in Juniperus sp. species,

with decreased protein content and increased lipid peroxidation at sites with higher



content of metals in tissue belonging to urban areas with increased industrial activity

and traffic flow. In dry deposit Biacumulacón factor of metals was Fe>Mn> Zn>

Cu>Pb for the first time of sampling and Fe>Mn> Cu> Zn>Pb for the second

sampling period.

INTRODUCCIÓN

La contaminación del aire es un serio problema en todo el mundo, especialmente en países

en donde las primeras etapas del crecimiento industrial son, con frecuencia, llevadas a cabo

sin mucha inversión en la protección ambiental, lo que conduce a la contaminación del aire

en áreas urbanas. La actividad industrial y el tráfico automotor juegan un papel importante

en la formación de éstas partículas y participan directa e indirectamente en la formación de

aerosoles secundarios; en consecuencia, la concentración de partículas en áreas urbanas

es alta comparada con áreas no urbanas (Machado et al., 2008), es por ello la importancia

en estudiar la calidad del aire presente en zonas urbanas, tal es el caso de la Zona

Metropolitana del Valle de Toluca (ZMVT) que ha experimentado un crecimiento vertiginoso

de población, sobre todo después de la época de los sesenta, cuando el país entro en un

desarrollo económico importante, con la participación de fuerte inversión en el sector

industrial. De esta manera se establecieron corredores industriales en las áreas

circunvecinas, destacando la zona de Toluca-Lerma, Toluca-Atlacomulco con grandes

flujos de emigración poblacional proveniente de los estados, municipios, ciudades y

localidades de gran parte del país (Moráles, et al.).

El incremento de las actividades productivas y la concentración de una población creciente,

han detonado un aumento en los servicios de transporte, tanto público como privado,



ocasionando un mayor consumo de combustible y por lo tanto, la degradación de su calidad

del aire.

La ZMVT se localiza en la parte central del Estado de México, entre los paralelos 18°59’07’’

y 19°34’47’’ de latitud norte y los meridianos 99°38’22’’ y 99°56’13’’ de longitud oeste con

respecto al meridiano de Greenwich. Se encuentra conformada por 22 municipios, que la

sitúan como la segunda concentración poblacional en importancia de la entidad y la quinta

a nivel nacional (Aire limpio 2012).

En los últimos años se ha observado una disminución considerable del bosque urbano,

muchos de los árboles han desaparecido del paisaje de la ZMVT, trayendo consigo un

deterioro del ambiente, que se ha manifestado en una reducción de la humedad atmosférica

y un aumento de la temperatura y contaminación. Los árboles actúan como filtros biológicos

atrapando las partículas contaminantes, repartidos racionalmente en las ciudades hacen el

papel de áreas reguladoras del medio ambiente, y además de contribuir a su depuración,

actúan como correctores de ciertos efectos nocivos originados por el urbanismo. Los

árboles tiene múltiples funciones y generalmente contribuye con sus beneficios a mejorar

la calidad del ambiente urbano, obteniéndose mayores beneficios cuando se establece un

criterio técnico en su manejo (ubicación, tipo de especie, características del medio y de la

especie, mantenimiento, etcétera), es por ello que es importante reconocer a las diferentes

especies que además de contribuir a mejorar la calidad de aire nos sean de utilidad para

detectar daños atmosféricos.

Debido a las condiciones adversas que prevalecen en el medio urbano, la vegetación está

sometida a un continuo estrés, al generarse niveles altos de sustancias reactivas de

oxigeno (ROS) en las células vegetales, el estrés en las plantas se reflejara en daños

significativos tales como: (i) inhibición de enzimas sensibles de reaccionar con ellas donde

su reacción con proteínas puede modificar determinados animoácidos y romper las cadenas



polipéptidas o modificar lugares de señalización para proteólisis, (ii) la reacción con los

pigmentos tipos clorofila produciendo su degradación (iii) la peroxidación de lípidos: los

radicales libres y también el H2O2 reaccionan con los ácidos grasos insaturados

produciendo hidroxoperóxidos de lípidos ( Montoliu, 2010).

Las enzimas juegan un papel relevante en la eliminación de ROS, en situaciones de estrés

oxidativo éstas forman parte de un complejo mecanismo de detoxificación, Superoxido

dismutasa (SOD) y Ascorbato peroxidasa (APX) contribuyen a impedir los efectos nocivos

que puede causar la acumulación de O2- y H2O2, respectivamente que se da

preferentemente en condiciones de estrés.

Los elementos potencialmente tóxicos como por ejemplo los metales pesados pueden tener

efectos fitotóxicos en plantas y se consideran inductores potenciales de estrés oxidativo,

debido a que propician la producción de ROS. Existen numerosos ROS, entre ellos

podemos encontrar radicales libres, como el anión superóxido (O2.-), el radical hidroxilo (OH)

(Edreva, 2005). Por otro lado, entre las formas no radicales encontramos el peróxido de

hidrógeno (H2O2) y el oxígeno singlete (1O2) (Briviba et al., 1997). Las condiciones adversas

inducen cambios transitorios en los niveles de determinados iones como el calcio y

moléculas (lípidos, ROS, especies antioxidantes, óxido nítrico) que advierten a la célula que

ha sido detectada una señal de estrés (Montoliu, 2010). Para evitar los daños por ROS, las

plantas poseen mecanismos antioxidantes de defensa, que incluyen moléculas (ascorbato)

y enzimas antioxidantes, como la superóxido dismutasa, catalasa y ascorbato peroxidasas

(Schützendübel A y Polle A., 2002).



1.0 MARCO TEORICO

1.1 Contaminación atmosférica

La atmósfera terrestre es la envoltura gaseosa, de unos 200 km de espesor. Constituye el

principal mecanismo de defensa de las distintas formas de vida; actúa como regulador

térmico, trae lluvia de los océanos, calor de los desiertos y trópicos, y frío de los polos. La

atmósfera da a la tierra la capacidad de sostener vida, está formada por 5 capas: troposfera,

estratosfera, mesosfera, ionosfera o termosfera y exosfera.

La contaminación del aire, es la presencia en la atmósfera de uno o más elementos, en

cantidad suficiente, con ciertas características y una permanencia determinada, que pueda

causar efectos indeseables tanto en el ser humano, la vegetación, los animales, las

construcciones y los monumentos. Estos componentes pueden ser polvo, olores, humos o

vapor.

La contaminación del aire por partículas es un serio problema en todo el mundo,

especialmente en países en donde las primeras etapas del crecimiento industrial son, con

frecuencia, llevadas a cabo sin mucha inversión en la protección ambiental, lo que conduce

a la contaminación del aire en áreas urbanas.

La actividad industrial y el tráfico automotor juegan un rol importante en la formación de

partículas y participan directa e indirectamente en la formación de aerosoles secundarios;

en consecuencia, la concentración de partículas en áreas urbanas es alta comparada con

áreas no urbanas (Machado et al., 2008).

Las fuentes de contaminación antropogénica incluyen, fuentes fijas, tales como industrias,

efluentes domésticos y fuentes móviles tales como transporte público y privado. Las fuentes

naturales son fundamentalmente los volcanes en erupción, los incendios forestales, la

erosión del suelo debida al viento, etc. (Vargas, 1989).



La dispersión de los contaminantes se refiere al conjunto de procesos que ocurren en la

atmósfera y por los cuales se diluyen, transportan o transforman químicamente los

contaminantes, la dispersión de contaminantes de una fuente depende de la cantidad de

turbulencia en la atmósfera cercana, está determinada tanto por variaciones locales,

regionales o globales del clima, como diversos procesos atmosféricos íntimamente ligados

a la topografía; los relieves naturales del terreno, e incluso la presencia de edificios

modifican el régimen local de los vientos. (Sandoval, 2010).

En el caso del uso de carbón, los principales contaminantes producidos son: cenizas

volantes, hollines, metales pesados y óxidos de nitrógeno. Cuando el combustible usado es

líquido los contaminantes principales que se emiten son SO2, SO3, NO, NO2, hidrocarburos

volátiles no quemados, partículas carbonosas y algunos metales que están comúnmente

presentes en algunos petróleos crudos, tales como Pb y Cu (Vargas, 1989).

Se han identificado en la atmósfera más de 100 contaminantes, entre los que se incluyen

en la fracción inorgánica más de 20 elementos metálicos y en la orgánica, un gran número

de hidrocarburos, ácidos y bases. Sin embargo, se consideran como indicadores de la

contaminación atmosférica sólo a los más abundantes para los cuales se han establecido

normas de calidad. Estos contaminantes principales son: bióxido de azufre (SO2), óxidos

de nitrógeno (NOx), ozono (O3), monóxido de carbono (CO), hidrocarburos (HC) y

partículas suspendidas.

Otros contaminantes específicos como la suma de compuestos orgánicos volátiles excepto

metano o la selección de algunos de ellos (ejemplo: tolueno, xileno), así como los depósitos

de polvo y compuestos de material particulado como plomo (Pb), cadmio (Cd), arsénico

(As), níquel (Ni), benzopirenos y hollín en el aire entre otros, también se miden

frecuentemente dependiendo de los objetivos de monitoreo y de las características de la

zona de estudio.



Hay que considerar el problema de que generalmente se tiene una multitud de

contaminantes emitidos, de una o varias fuentes, los cuales habrá que priorizar de acuerdo

a su toxicidad individual, su concentración o la cantidad emitida de ese contaminante y su

altura de emisión.

Una forma de determinar el efecto en organismos de contaminantes que no son

comúnmente medidos en los programas de monitoreo es usando bioindicadores, estos

organismos presentes en el área de estudio mediante la evaluación de sus procesos

bioquímicos, como es el caso de la vegetación, la principal ventaja de los experimentos in

situ es que se llevan a cabo bajo condiciones naturales. Sin embargo debido a la

heterogeneidad de las condiciones del ambiente en el material de las plantas, puede ser

difícil determinar inequívocamente cual factor es el más importante en el control de las

respuestas de las plantas (Pandey y Agrawal, 1993).

1.2 Partículas suspendidas

Por partícula se entiende cualquier sustancia, a excepción del agua pura, presente en la

atmósfera en esta sólido o líquido, dispersas y arrastradas por el aire, mayores que la

moléculas individuales, las moléculas miden aproximadamente 0.0002 µm de diámetro,

pero menores de 500 µm (Caballero, 2009). Se utilizan varios términos en relación con las

partículas del aire.

1. Polvos: partículas sólidas dispersas en gas, originadas por la desintegración mecánica

de algún material, como por ejemplo, las nubes producidas por la trituración y la

pulverización de rocas o las formadas cuando ráfagas de aire levantan una polvadera.

2. Humos: pequeñas partículas originadas por condensación de un vapor supersaturado,

conteniendo concentraciones relativamente elevadas de sustancias con baja presión

de vapor. Ejemplo las suspensiones de partículas resultantes de la combustión



incompleta. Emanación es otro término semejante a humos, se refiere a partículas

formadas por condensación, sublimación o reacción química, y de las cuales una parte

predominante en peso posee un diámetro inferior a 1 µm ejemplo el humo de tabaco.

3. Nieblas: suspensión de pequeñas gotas líquidas formadas por la condensación de un

vapor, aunque algunas veces también por atomización. Una niebla se compone de

partículas bastante grandes, con un diámetro a 10 µm, y cuyas concentraciones son

relativamente bajas. El tamaño de las partículas es la característica principal que

distingue a las nieblas de los humos. Si su concentración es lo suficientemente elevada

como para oscurecer la visibilidad, la niebla toma el nombre de neblina.

4. Aerosoles: una nube de partículas microscópicas y submicroscópicas en el aire, tales

como humo, una emanación, una niebla o una neblina.

5. Neblina: dispersión de pequeñas gotas de líquido de suficiente tamaño como para caer

desde el aire.

6. Cenizas finas: son partículas finas no combustibles que provienen de la combustión del

carbón. Su tamaño oscila entre 1 y 10000 µm. entre sus componentes se encuentras

sustancias inorgánicas de metales, óxidos de silicio, alumnio, hierro y calcio. Al

depositarse en superficies actúan como abrasivos.

7. Vapores: partículas formadas por condensación, sublimación o reacción química

mayores de 1µm /humo o tabaco)

8. Hollín: una aglomeración de partículas de carbón.

La materia particulada también se puede dividir en subclases, dependiendo de su tamaño,

incluye polvo fino (menor de 100 µm de diámetro), polvo grueso (más de 100 µm de

diámetro) y neblinas (0.1 – 10 µm de diámetro)



Las partículas pueden estar constituidas por una gran diversidad de sustancias, las

partículas de origen natural se componen principalmente de suelo y ocasionalmente por

material de origen biológico (restos orgánicos de plantas y animales, esporas, virus, etc.),

las que provienen de la combustión incompleta generalmente están integradas por

partículas atomizadas y cenizas del combustible. También pueden formarse por reacciones

fotoquímicas en la atmósfera, estas últimas pueden estar formadas por sulfatos, nitratos y

sus ácidos correspondientes, o por carbón orgánico.

Las partículas son dispersadas y depositadas de nuevo en la superficie del terreno de

acuerdo con sus propiedades sedimentables y con los patrones meteorológicos que

prevalecen en un momento determinado.

Las partículas se clasifican en primarias y secundarias, según la fuente que las origina. Las

primarias son aquellas emitidas directamente por las fuentes bajo forma de partícula, tales

como el polvo en suspensión o partículas emitidas por una chimenea. Las secundarias son

aquellas producidas en la misma atmósfera, por ejemplo a causa de reacciones químicas

gaseosas que producen especies capaces de condensarse, las partículas primarias

abarcan todos los tamaños, en cambio las secundarias son principalmente partículas muy

pequeñas.

La formación de partículas secundarias se realiza principalmente a partir de los 3 procesos

siguientes:

1. Coagulación por el cual las partículas colisionan entre ellas debido a su movimiento

relativo adhiriéndose para formar partículas más grandes.

2. Nucleación a partir de un vapor sobresaturado con la presencia de un núcleo de

condensación (heterogénea o no homogénea)



3. Condensación simultánea ( proceso cinético de nucleación heterogénea) o consecutivo

(difusión, inercia, difusoforético o electrostático)

La exposición a este contaminante puede causar reducción en las funciones pulmonares,

asimismo se pueden presentar los siguientes efectos: Interferir con uno o más mecanismos

del aparato respiratorio y actuar como vehículo de sustancias tóxicas absorbidas o

adheridas a su superficie, adicionalmente las partículas muestran efectos sobre la

visibilidad, debido a que éstas, dispersan y absorben la luz. Las partículas suspendidas

menores a 10 y 2.5 de micras de diámetro aerodinámico pueden ser inhaladas y llegar a

los pulmones, causando daño a la salud. Los humos que se forman de la combustión de

materiales carbonosos, y son producto generalmente de una combustión incompleta, están

formados por partículas con tamaño inferior a 0.5 µm (Vargas, 1989). Actualmente se

considera que este tipo de partículas es un mejor indicador de calidad del aire que las

partículas suspendidas totales, (Oyarzún, 2010). En años recientes, el nivel de materia

particulado ha sido de interés, debido a que diversos estudios confirman que las partículas

pueden inducir diversos efectos sobre la salud pública. Los estudios toxicológicos

demuestran, que los efectos de las partículas a la salud humana y vegetal parecen ser

determinantes por su tamaño y su composición química pues pueden contener metales de

transición solubles tales como Cu, Fe, V, Ni o Zn (Sandoval, 2010).

1.2.1 Factores meteorológicos responsables de la dispersión de partículas

La presencia en el aire de las partículas se ve afectada por los efectos meteorológicos y

climáticos de la zona. Los factores que definen la deposición de partículas son:

a) Viento, su velocidad puede afectar en gran medida la concentración de contaminantes

en un área. Las diferencias de presión de aire hace que el aire se mueva de las áreas



de alta presión (aire frío) a las de baja presión (aire caliente). Mientras mayor sea la

velocidad del viento, menor será la concentración de contaminantes

b) Estabilidad Atmosférica que se refiere al movimiento vertical que tienen masas de aire

en la atmósfera.

c) Precipitación, la cual lava los contaminantes de la atmósfera y posterior deposición

en tierra, agua.

d) Topografía, cuando las ciudades están rodeadas de una topografía compleja como,

valles o cadenas montañosas experimentan altas concentraciones de contaminantes

en el aire.

e) Temperatura

(Sandoval, 2010; Caballero, 2009).

1.3 Zona Metropolitana del Valle de Toluca

1.3.1 Contaminación en la ZMVT

La Zona Metropolitana del Valle de Toluca se encuentra conformada por 22 municipios, que

la sitúan como la segunda concentración poblacional en importancia de la entidad y la quinta

a nivel nacional (ver tabla 1).

El área cuenta con 2 millones 166 mil 024 habitantes, sobre una superficie de 2,669.6 km2,

se localiza a una altura de 2660 m.s.n.m.; el Valle de Toluca está rodeado por grandes

sierras y volcanes, entre estos están: al suroeste, la Sierra Nevada de Toluca; al este la

Sierra de las Cruces; al noreste, la Sierra de Monte Alto y al sur, la Sierra Matlazinca. (Aire

limpio: Programa para el Valle de Toluca 2012-2017). En la tabla 1 se muestran municipios

que conforman la ZMVT, que corresponde al 5.3% del territorio estatal. Es importante

considerar que el área urbana de los 22 municipios comprende una superficie de 315.80



km2 (26.1%), según los usos del suelo identificados en los planes de desarrollo urbano

municipales (GEM, 1995).

Tabla 1. Características generales de los municipios que conforman la Zona Metropolitana

del Valle de Toluca.

Fuente: InventarIo de Emisiones de la Zona MetropolItana del Valle de Toluca (2004)

La ZMVT ha experimentado un crecimiento vertiginoso de población, sobre todo después

de la época de los sesenta, cuando el país entro en un desarrollo económico importante,

con la participación de fuerte inversión en el sector industrial, en ésta década la tasa de

migración era del 4.35% con un total de habitantes de 270, 985, para la década de los 80´s

la tasa de migración se elevó al doble hasta 8.7%. De esta manera se establecieron

corredores industriales en las áreas circunvecinas, destacando la zona de Toluca-Lerma,

Toluca-Atlacomulcon con grandes flujos de emigración poblacional proveniente de los

estados, municipios, ciudades y localidades de gran parte del país (Moráles, et al.), para la



década de los 90 fue de 9.4% y así en el año 2000 el número de habitantes ascendió a

1,755,195 (GEM, 2005). El incremento de las actividades productivas y la concentración de

una población creciente, han detonado un aumento en los servicios de transporte, tanto

público como privado, ocasionando un mayor consumo de combustible y por lo tanto, la

degradación de su calidad del aire.

La base de datos generada por el monitoreo atmosférico es uno de los principales

instrumentos para proporcionar información acerca del estado que guarda el aire en la zona.

La operación de la Red automática de Monitoreo Atmosférico de la Zona Metropolitana del

Valle de Toluca (RAMA-ZMVT), está a cargo de la Secretaría del Medio Ambiente del

Gobierno del Estado de México, a través de la Dirección General de Prevención y Control

de la Contaminación Atmosférica. Cuenta con 7 estaciones de monitoreo ambiental

distribuidas en la zona roja del mapa de la ZMVT representado en la Figura 1. Actualmente

como lo señala el Programa para mejorar la calidad del aire, se tienen normas vigentes para

los siguientes contaminantes criterio: partículas menores a 10 micrómetros (PM10),

partículas menores a 2.5 micrómetros (PM2.5), Ozono (O3), Bióxido de Azufre (SO2),

Monóxido de Carbono (CO) y Bióxido de Nitrógeno (NO2).



Figura 1. Mapa de la ZMVT

En la ZMVT la principal fuente de energía, después de la eléctrica es la quema de

combustibles fósiles; existen otras actividades que generan emisiones a la atmósfera, como

por ejemplo, el uso de solventes, la aplicación de pintura, la pavimentación y asfaltado de

calles, el almacenamiento y distribución de combustibles, incluso, algunos fenómenos

naturales como la erosión del suelo y el metabolismo de las plantas tienen un papel

importante en el problema de la contaminación del aire. En particular hablando sobre

partículas, el cumplimiento de la norma ha sido muy irregular, a partir de 1998 y en particular

a partir del año 2003. Las máximas concentraciones se presentan en la zona norte del Valle

de Toluca, en la cual existen vialidades de intenso tráfico vehicular, así como zonas

agrícolas y suelos erosionados, resuspensión del polvo de vialidades sin pavimentar y

actividades de la construcción, así como por las emisiones vehiculares. Las partículas de

mayor tamaño se sedimentan rápidamente y en condiciones de viento débil recorren



distancias cortas. La partículas finas o menores a 2.5 μg/m3 se monitorea a partir del 2011,

registrándose durante este año en todas las estaciones el valor del promedio anual fuera

de norma con respecto a la Norma Oficial Mexicana de 15 μg/m3 (NOM-025-SSA1-1993).

Se realizó un inventario de emisión correspondiente a 1995 como parte del programa de

calidad del aire para esta zona. Este inventario incluye emisiones de NOx, SO2, CO, HC,

PST y Pb de industrias, servicios, vehículos automotores, suelos y vegetación (solo erosión

eólica). Los vehículos automotores en ruta son la fuente del 89% del total de emisiones de

NOx, CO, HC y Pb. Las industrias generan 82% de las emisiones de SO2 y la erosión de

suelos por el viento produce más del 97% de las partículas suspendidas totales registradas

en el inventario. (Inventario Nacional de Emisiones de México 1999., Primera edición,

2006).

1.3.2 Meteorología en la Zona Metropolitana del Valle de Toluca

La presencia de contaminantes atmosféricos está definida por factores diversos entre ellos

se encuentra el clima. Según la clasificación climática de Köppen modificada por E. García,

en la ZMVT están presentes los siguientes tipos de clima (GEM, 1993):

1. Clima templado húmedo

Presenta verano largo, lluvia invernal inferior a 5%, es isotermal y la temperatura más

elevada se manifiesta antes del solsticio de verano; abarca la mayor parte de los municipios

que corresponden a la ZMVT.

2. Clima semifrío subhúmedo

Con porcentaje de precipitación invernal menor a 5%, el verano es largo; isotermal y con la

temperatura más elevada antes del solsticio de verano, es característico de aquellas zonas

con altitud considerable, como el volcán “Nevado de Toluca” y la Sierra de las Cruces,

localizados al suroeste y este de la zona de estudio respectivamente.



3. Clima frío

Con temperatura media anual entre -2 y 5° C, y la del más frío es menor a 0° C. Es

característico de regiones altas, manifestándose sobre la zona de estudio en la parte alta

del volcán “Nevado de Toluca”.

El climograma expuesto en la Figura 2 permite apreciar el comportamiento que se da tanto

de temperatura promedio mensual como de precipitación pluvial sobre el espacio geográfico

de la ZMVT a partir de datos que se han registrado a lo largo de un determinado período

de años (1961-1990).

Figura 2 Climograma. Con base a la estación climatológica “Toluca”

Fuente: GEM 2007

Se aprecia dentro del climograma que sobre la zona de estudio se presentan tres épocas

climatológicas por la regularidad que guarda el tiempo atmosférico a lo largo del año:

Época seca-fría, expresa la temperatura promedio mensual más baja durante el año, y

comprende los meses de noviembre a febrero con un rango de entre 9° y 11° C.



Época seca-cálida, dentro de los meses de marzo a mayo se presenta un ascenso en la

temperatura hasta llegar a los 15° C, siendo la temperatura media que se expresa como

máxima en la zona a lo largo del año.

Con respecto a las precipitaciones durante estas dos épocas del año, se muestran lluvias

insignificantes con registros inferiores a los 40 milímetros de precipitación.

Época de lluvia, definida por los meses de junio a octubre, se caracteriza por la presencia

de precipitaciones que se desarrollan con un rango de entre 160 y 210 milímetros. En

cuanto a la temperatura de esta época, se manifiesta un decremento para mantenerse entre

los 11° y 13° C.

Por su posición geográfica con respecto al territorio nacional, la ZMVT, durante el verano

(época de lluvia) se encuentra bajo la influencia de sistemas meteorológicos tropicales, el

paso constante de ondas y ciclones tropicales aportan la humedad más importante del año

en forma de nublados y lluvias abundantes sobre la zona; esto permite tener una calidad

de aire excelente al ser arrastrados a la superficie los contaminantes suspendidos sobre la

atmósfera. Sin embargo, en invierno (época seca-fría) el desplazamiento de frentes fríos y

masas de aire polar son los sistemas meteorológicos que predominan; cuando son intensos

estos fenómenos la ZMVT se ve afectada con sistemas anticiclónicos (tiempo atmosférico

estable y seco) que pueden generar inversiones térmicas, originando condiciones

desfavorables para la dispersión de los contaminantes que se presentan en la atmósfera.

El fenómeno natural inversión térmica (aire frío y denso confinado cerca de la superficie,

mientras que el aire más caliente y ligero se halla por encima) se acentúa en invierno debido

a bajas temperaturas en esta región, ocasionando disminución de la visibilidad a causa de

los contaminantes atrapados cerca de la superficie que forman una espesa capa de color

café oscuro.



Para la ZMVT la inversión térmica es un fenómeno importante por la frecuencia con que se

presenta a lo largo del año, pero no determinante en los niveles máximos de contaminación,

porque influyen otros parámetros meteorológicas como el aumento de temperatura

ambiente conforme transcurre el día, que incrementa la inestabilidad atmosférica y la

velocidad del viento, lo que provoca la ruptura de la inversión térmica.

Otros fenómenos meteorológicos importantes en los alrededores de la ZMVT, relacionados

a bajas temperaturas del periodo invernal son las heladas que se presentan

periódicamente, y en forma ocasional las nevadas.

1.3.3 Dinámica de vientos en la ZMVT

A la ZMVT no la encierran por completo barreras naturales que impidan la circulación del

viento, esto hace que su ventilación se vea favorecida la mayor parte del año.

En esta zona la circulación del viento en dirección y frecuencia es muy compleja y variada

en gran medida en función del relieve, pero en general, y como se puede apreciar en la

figura 3, el Valle de Toluca se encuentra en la zona de influencia de los vientos alisios, cuya

intensidad se expresa más bien débil e incluso estable en el período que comprende la

época fría (finales de noviembre a finales de febrero) predominando los vientos

provenientes del sur y con dirección norte, con una ligera curvatura desviada a favor de las

manecillas del reloj, todo esto en función del relieve, es el caso del volcán “Nevado de

Toluca” que no permite que circulen libres los vientos que llegan por el sur provocando el

cambio de su trayectoria y haciendo que se deslicen hacia el valle por su flanco sureste.

En el período que comprende la época seca-cálida, (meses de marzo a mayo), los vientos

se intensifican más y modifican su curso por la aceleración de los alisios; sin embargo, aquí

influye el sistema de relieve que presenta la Sierra de las Cruces orientada de norte a sur,



la cual obstruye de manera determinante el paso libre de los vientos alisios hacia este valle;

así pues se encuentran estos vientos del este con los del sur para rotar hacia el noroeste

describiendo una prominente curvatura en sentido de las manecillas del reloj.

Para cerrar el ciclo anual, se muestra la máxima expresión de los alisios durante la época

de lluvia, cuya dinámica se expresa del este y sureste con dirección noroeste y norte

favoreciendo la transportación de contaminantes generados en lugares como la zona

industrial del municipio de Lerma para depositarse y ser afectada la porción extrema

noroeste de Toluca.

El registro del comportamiento del viento a través de los años se refleja en la gráfica de la

rosa anual de vientos, que hace de manifiesto para el caso de la ZMVT una marcada

dominancia de los vientos del sur y sureste, situación que refleja las concentraciones de

partículas suspendidas fracción respirable PM10 y las totales PST más elevadas, en época

seca.

Figura 3. Dinámica de vientos sobre la ZMVT

Fuente: GEM, 2007.



2.0 METALES PESADOS

Un metal es un elemento químico caracterizado por una fuerte conductividad térmica y

eléctrica, brillo peculiar (metálico), aptitud para la deformación y una marcada tendencia a

formar cationes. Los metales pesados se definen como aquéllos elementos químicos que

presentan una densidad igual o superior a 5 g cm-3 cuando están en forma elemental o cuyo

número atómico es superior a 20, excluyendo a los metales alcalinos y alcalinotérreos

(Navarro-Aviñó, et al., 2007).

Existen metales de transición tales como Mn, Fe, Ni, Cu and Zn los cuales son componentes

intrínsecos de las enzimas y por lo tanto son esenciales para la vida vegetal; también

existen los iones metálicos extremadamente tóxicos que inhiben la función enzimática

causando daño oxidativo estos son llamados metales no esenciales tales como Cd, Hg, Pb,

Se y As. (Callahan et al., 2006).

2.1 CONTAMINACIÓN POR METALES PESADOS

Una clase de contaminantes atmosféricos, son los metales pesados tales como el Pb, Hg,

Cd, etc. Se hallan presentes en la atmósfera en muy baja concentración pero son

seriamente peligrosos para la salud de la población en general y para el ambiente (Vargas

1989). Las Fuentes principales de contaminación por metales pesados incluyen actividades

tales como la minería y refinería, la producción de energía y gas, emisiones de automotores,

las industrias. La contaminación por metales tóxicos se ha incrementado en zonas urbanas

debido, entre otras causas, al alto aforo vehicular que caracteriza éstas zonas. Los

automóviles emiten cantidades importantes de metales tóxicos en forma de partículas por

los escapes, también por la corrosión de las piezas metálicas de los mismos, la degradación

de las llantas y las fugas del aceite de los frenos. Otras fuentes de metales tóxicos en las

zonas urbanas son: la erosión de la capa de recubrimiento de las calles y avenidas, la



desintegración de los materiales de construcción por la acción de la lluvia y el viento, las

emisiones de las chimeneas de las industrias, panaderías, tortillerías, baños públicos,

hoteles y hospitales. La mayor parte de éstos metales quedan depositados en las calles o

en forma de aerosoles atmosféricos (Flores et al., 1998). Los metales persisten en la

atmósfera y llegan al humano y animales mediante de la comida, el agua o el aire. Los

metales pesados son uno de los principales contaminantes que requieren ser tratados. El

Pb, Cd, Cu, Zn, Ni y Cr reportan los mayores daños en los organismos (Mayank et al., 2012).

Se han hecho estudios en varias ciudades industriales donde los niveles de muerte se han

visto disminuidos cuando los niveles de contaminación del aire asociada a metales pesados

baja. Por tal motivo los efectos de los metales pesados deben ser examinados

minuciosamente (Onder et al., 2005).

Existe preocupación a nivel mundial con relación a la contaminación por transporte

atmosférico de metales pesados a gran escala, debido a su capacidad de asociación a

masas de aire; por efectos de la recirculación de los vientos, dichos metales tienden a

depositarse en áreas alejadas a su fuente de origen (Machado et al., 2008).

La toxicidad de los metales pesados depende, como ha quedado expuesto previamente, de

la concentración, la forma química y la persistencia (tiempo que tarda un contaminante en

transformarse en una forma no tóxica).

La toxicidad está causada frecuentemente por la imposibilidad del organismo afectado para

mantener los niveles necesarios de excreción (Navarro-Aviño et al., 2007).

A pesar de que en la actualidad aún existe incertidumbre acerca de los efectos provocados

por las diferentes especies químicas, la mayoría de los estudios apuntan que el mayor

impacto en la salud viene causado por las partículas de carbono elemental (CE),

compuestos orgánicos (CO), especialmente hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP),

sulfatos, nitratos y determinados metales como Cd, Fe, Zn, Cr, Cu, Al, V, Ni y Pb.



3.0 LAS PLANTAS COMO BIOINDICADORES

El proceso evolutivo de los organismo vegetales puede ser analizado en dos niveles: la

micro evolución y la macro evolución, la primera consiste en cambios evolutivos producidos

en las especies en periodos de tiempo relativamente cortos debido a la fuerza de la

selección natural, mientras que la macro evolución, involucra cambios evolutivos entre

especies y se presenta generalmente después de largos periodos de tiempo. Un ejemplo

de micro evolución en organismos vegetales es el desarrollo de tolerancia a metales, en

este proceso las actividades antropogénicas actúan como la fuerza de selección que genera

los cambios evolutivos en los organismos, en periodos de tiempo relativamente corto. La

tolerancia a elementos potencialmente tóxicos (metales esenciales y no esenciales) en los

organismos vegetales, puede definirse como el resultado de un proceso evolutivo que

confiere a distintas especies de plantas la capacidad de crecer y desarrollarse en

ambientes, con concentraciones elevadas de elementos potencialmente tóxicos. Los

cambios evolutivos que han dado origen a la tolerancia, se deben al desarrollo de una serie

de mecanismos eficientes y específicos (procesos adaptativos) que permiten mantener la

toma de elementos esenciales dentro de intervalos fisiológicos permisibles (Winner 1994),

además proporcionar la capacidad de inactivar metabólicamente los elementos esenciales

y no esenciales, cuando representan un riesgo para la integridad celular (González y

Zapata, 2008).

La bioindicación refiere al uso de animales y plantas como instrumentos para evaluar el

pasado, el presente y futuras condiciones y procesos (Kamran y Hosein, 2011).

Los bioindicadores son organismos cuya presencia y/o abundancia es representativa para

una o más propiedades del ecosistema en donde se encuentran, por lo que permiten

determinar con precisión el impacto de acciones antropogénicas. Un bioindicador debe ser



un organismo sedentario, de importancia ecológica, estudiado y sensible a las variaciones

ambientales. (Pernia et al., 2008).

Las respuestas que presentan los árboles ante la contaminación, pueden predecir el nivel

de contaminación en cierta área y por medio de esto se puede establecer de manera

temprana, el grado de contaminación y proponer medidas para evitarlo (Nowak et al., 2006).

El método más económico y razonable para monitorear los niveles de metales pesados en

la atmósfera, es usando vegetación (Onder, et al, 2005; Kamran y Hosein, 2011). Ya que

los estudios sobre la contaminación atmosférica han sido frecuentemente limitados por altos

costos de instrumental de metodos de monitoreo y la dificultad que presenta en transportar

gran cantidad de muestras en tiempo y espacio, las platas dan una respuesta mas completa

en comparación con las técnicas instrumentales de monitoreo (Anicic et al., 2011). El

método instrumental que generalmente se usa para el monitoreo de contaminantes

atmosféricos es el de Dispositivos de muestreo total; sin embargo las plantas proveen

información no sólo cuantitativa y cualitativa de los contaminantes atmosféricos sino

también los efectos de los contaminantes en los sistemas vivos.

Las plantas son organismos sedentarios, base de la cadena alimenticia y sensibles a las

variaciones ambientales. Los árboles remueven la contaminación mediante la intercepción

de las partículas en el aire. Algunas partículas pueden ser absorbidas, mientras que otras

se depositan en la superficie de la planta, estas últimas por lo general se re-suspenden en

la atmósfera, se lavan mediante la lluvia y nuevamente caen con la precipitación.

Consecuentemente los árboles sufren constantemente los efectos de la contaminación.

(Nowak et al., 2006).

Los árboles son muy eficientes atrapando las partículas atmosféricas, y ellos juegan un

papel especial en la reducción de los niveles de las partículas respirables las cuales tienen

el potencial de causar serios problemas en la salud humana (Sawidis et al., 2011).



Las plantas reaccionan más rápido ante la presencia de contaminantes que otros

organismos, lo que las convierte en elementos idóneos para ser usados como

bioindicadores en el monitoreo de la contaminación (Pernia et al., 2008). La función crucial

de la célula de la planta es responder al estrés mediante mecanismos de defensa, en donde

se altera la expresión genética cuantitativamente por medio de cambios enzimáticos

(Qureshi et al., 2007) y no enzimáticos (Hossain et al., 2012).

En los últimos años la biorremedación de la contaminación ambiental a adquirido

importancia, debido a que es altamente efectiva, conlleva un costo relativamente bajo, ésta

usualmente incluye la bioextracción o adsorción por medio de la acumulación, ambos usan

microorganismos o plantas superiores y es utilizado para extraer los metales tóxicos por las

plantas (Tsuji et al., 2002).

3.1 Efecto de los metales sobre las plantas

Algunos metales son necesarios para el buen funcionamiento bioquímico de las plantas,

hay dos tipos de nutrientes: los macronutrientes (N, P, K, Ca, Mg, S), necesarios en grandes

cantidad, y los micronutrientes (Fe, Mn, Zn, Cu, Bo, Cl, Mo), necesarios en cantidades

pequeñas. Los tres grandes –nitrógeno, fósforo y potasio- representan juntos más del 75%

de los nutrientes minerales que se encuentran en la planta.

Se denominan "elementos traza" a aquellos elementos químicos que tienen una

concentración baja en las plantas (inferior al 0,1 %), independientemente de que sean

esenciales para su metabolismo o tengan efectos tóxicos. Los elementos traza, como el

arsénico (As), cadmio (Cd) o plomo (Pb), son poco abundantes en el agua y el suelo, en

condiciones naturales. Sin embargo, las actividades industriales y mineras pueden originar

una contaminación por estos elementos, que pasarían a las plantas y animales donde se

pueden concentrar y causar efectos tóxicos. Después de eliminar el agua de los tejidos los



macroelementos constituyen aproximadamente el 99,5% de la materia seca, mientras que

los microelementos forman cerca del 0,03%. El contenido mineral de los tejidos vegetales

es variable, dependiendo del tipo de planta, las condiciones climáticas prevalecientes

durante el período de crecimiento, la composición química del medio y la edad del tejido

entre otros.

Los metales pesados tienen efectos negativos en el desarrollo de las plantas, inhiben

procesos enzimáticos y causan daños por oxidación (Callahan et al., 2006). La toxicidad de

los metales pesados depende, de la concentración, la forma química y la persistencia

(Navarro-Aviñó et al., 2007).

La tolerancia que presentan las plantas ante la contaminación de metales pesados son dos

tipos, de acuerdo con el conjunto de mecanismos moleculares o bioquímicos que la

conforman: a) co-tolerancia, la cual puede ser el resultado de un mecanismo específico que

confiere una tolerancia a diversos metales; y b) tolerancia múltiple, en la que la tolerancia

es generada por una serie de mecanismos independientes para cada metal o metales, que

interactúan de manera conjunta para evitar el daño a la planta. De acuerdo con este

pensamiento la tolerancia múltiple es el tipo que se presenta en la mayoría de las plantas

(González y Zapata, 2008).

Las altas concentraciones de metales pesados inhiben la germinación de semillas, el

crecimiento y desarrollo, además de alterar muchos procesos bioquímicos y fisiológicos que

dañan las membranas de las células, reducen la transpiración, impiden la síntesis de

proteínas y ácidos proteicos (Hossain et al., 2012; Foy et al., 2006), dañan e inhiben la

fotosíntesis y afectan la actividad de varias enzimas (Mishra et al., 2006). Los metales

pesados afectan también la radícula saliente y el crecimiento de la planta (Foy, et al., 2006),

en general reaccionan al estrés por medio de la alteración de los patrones protéicos

(Hossain et al., 2012)



Los sistemas de tolerancia que presentan las plantas para soportar el estrés ante los

metales pesados, están los de desintoxicación y acumulación usando uniones de péptidos

con metales pesados como las metalotioneinas (MT) y fitoquelatinas (PC) (Tsuji et al.,

2002).

Las plantas reaccionan al estrés de metales pesados de distintas formas. Sus respuestas

pueden incluir; clorosis en las hojas (Liu et al., 2008) inmovilización, exclusión, quelación y

compartir metales a un péptido (Qureshi et al., 2007) y otra respuestas ligadas al estrés en

general como etileno y proteínas del estrés.

El estrés no sólo es un reflejo físico ante los metales pesados, es también el reflejo del

componente biológico que se da ante la exposición de los metales pesados (Qureshi et al.,

2007). El incremento de la fotosíntesis es un indicativo de que las plantas tratan de

compensar el estrés producido por la contaminación (Pandey y Agrawal., 1994).

La absorción de contaminantes en organismos vivos de su medio es llamada

bioconcentración. El factor de bioconcentracion (FB) es definido como el radio de la

concentración de un químico expuesto a un sistema biológico sobre la concentración del

medio circundante (Hellstrom, 2004)

Las plantas presentan varias capacidades de adaptación ante el estrés. El hecho de que

las proteínas medien estas características directamente a nivel celular o físico, se

encuentran a los estresores directamente, mediante las enzimas antioxidantes (Qureshi et

al., 2007).

3.1.1 Fuentes de metales escenciales y no escenciales

El Fe es un microelemento escencial para las plantas y no podrían completar sus ciclos

naturales sin este pero a mayores concentraciones causa efectos de estrés. Los valores

que se encierran en la planta son alrededor de 50-500μg.g-1. El Fe se produce por procesos



de combustión fósil, asfalto u polvo en el suelo y es una parte importante de cenizas

volátiles. El Cu y Fe son fácilmente transportados en el aire y depositados en las superficies

de las plantas.

El Mn es uno de los micronutrientes esenciales para las plantas. EL Fe y Mn juegan un

papel muy importante en arreglar problemas de oxidación por elementos como Co, Cu, Zn

y Ni y algunos contaminantes como Pb. La asociación de estos elementos con el Mn y el

Fe en suelos presenta importantes implicaciones en la agricultura y en el crecimiento de la

planta en general. La toxicidad del Mn es comúnmente asociada a suelos ácidos y a climas

templados.

El Cu es uno de los micronutrientes que es esencial para la planta. Alrededor del 70% del

Cu en hojas se encuentra en el cloroplasto de plantas terrestres. La concentración de Cu

en la atmosfera proviene de tráfico, ya que es producido por el neumático. Los valores

recomendados en el tejido de la planta son de 5-30 μg.g -1 y valores de 20-30 μg.g-1 son

considerados tóxicos

Zn es un microelemento esencial en todos los organismos y juega un rol importante en

enzimas, proteínas que son esenciales para la plantas pues sin este elemento las plantas

presentan retardo en la elongación celular. Los valores recomendados de Zn en la planta

son de 20-100 μg.g-1. Valores críticos: 15 μg.g-1

Cd es un elemento móvil especial en el suelo y es tomado principalmente por las plantas

por la raíz. El Cd se transfiere a las plantas dependiendo del pH, valores de humus. Las

cantidades de Cd en plantas son 0.1-1 μg.g-1.

El Pb está presente en las plantas por el suelo y fuentes de aerosoles. La contaminación

por Pb es causada por los vehículos de automotor que usan Plomo. Los valores

recomendados en plantas es de 30-300 μg.g-1 (Kamran et al., 2011).



4.0 BIOMARCADORES

4.1 Estrés oxidativo

El estrés oxidativo es un fenómeno que merece ser estudiado, dada su complejidad e

importancia en el desarrollo de los mecanismos básicos de la célula. Como resumen de

dicho fenómeno basta decir que provoca daño a nivel de proteínas, ácidos grasos y ácidos

nucléicos, destacando los siguientes aspectos (Navarro-Aviñó et al., 2007):

a) Inactivación de proteínas y enzimas, fundamentalmente por la oxidación de los grupos

sulfidrilo, dando lugar a puentes disulfuro, que causan la interrupción del

funcionamiento normal de la proteína o enzima.

b) Peroxidación lipídica de membranas, causando rupturas y subproductos de las

cadenas hidrocarbonadas.

En este conjunto de reacciones participan las sustancias reactivas al oxígeno (ROS)

principalmente O2− y H2O2 que han demostrado jugar un papel esencial en la interacción

de los metales pesados con las células de los seres vivos, como se observa en la Figura 4.

Ambos son, además, elementos señalizadores relevantes. No obstante, es interesante

señalar que todas estas reacciones requieren la presencia previa de H2O2.

La célula necesita tener los siguientes caminos metabólicos en buen estado: la producción

de ATP mitocondrial, el metabolismo de calcio, la síntesis de proteínas, la regulación del

ADN, la glicólisis y el ciclo del ácido cítrico o ciclo de Krebs. Estos dos últimos proporcionan

los precursores para síntesis de aminoácidos y los equivalentes reducidos, cuya oxidación

genera la mayoría del ATP (Navarro-Aviñó et al., 2007). Los daños a la membrana

plasmática, a la producción de ATP mitocondrial y al control de los niveles de calcio

intracelular son rutas comunes para la destrucción final de la célula y merecen especial

atención.



Fuente: (Hossain et al.,2011)

Figura 4. Esquema de estrés oxidativo

4.1.1 Especies reactivas de oxígeno (ROS)

Cuando la planta se enfrenta a un estrés ante un contaminante como la presencia de

metales pesados la célula produce especies reactivas de oxígeno (ROS), las cuales se

forman principalmente por reducción, un mecanismo inequívoco de defensa primaria ante



el estrés; de hecho la comunicación ante los organelos celulares y el citosol tiene como

resultado una dinámica de organelos y proteínas (Hossain et al., 2012). La mayoría de las

proteínas receptoras se encuentran en el plasma de la membrana, y por lo tanto las células

en la membrana son las que están envueltas en el proceso de estrés (Hossain et al., 2012).

Las células bajo estrés produce varios ROSs: radicales superoxido(O2), el peroxido de

hidrogeno (H2O2), el radical hidroxilo(OH.) y oxígeno (O2), los cuales ante estrés

rápidamente pueden atacar todo tipo de biomoléculas como acidos nucleicos, proteínas,

lípidos y aminoácidos (Feng-Qin et al., 2006). La respuesta de la célula depende de la

severidad del estrés y del intervalo de activación de los mecanismos de defensa

antioxidante. La producción de ROS en organelos como las mitocondrias y los cloroplastos

no son procesos celulares normales. Sin embargo, ante condiciones de estrés acelerado y

con la producción excesiva de ROS, se causan los daños en estos organelos. La activación

proteínica durante el estrés se han reportado en varios organelos y compartimentos

subcelulares como núcleo, mitocondria, cloroplastos, membrana y pared celular.

Las células de las plantas y los cloroplastos tienen sistemas especializados de defensa para

prevenir la formación de especies reactivas del oxígeno (Philosoph-Hadas et al., 1994).

Estos sistemas incluyen enzimas como Dismutasa superoxidasa (SOD), peroxidasas y

catalasas; o antioxidantes como el glutatión (Philosoph-Hadas et al., 1994).

Es ampliamente discutido en la literatura que la exposición de las plantas a metales pesados

trae como consecuencia variadas respuestas biológicas, a nivel bioquímico, celular y

fisiológico, cambios a los que se denomina biomarcadores (Pernia et al., 2008), los cuales

sirven para alertar antes de la aparición de daños irreversibles.

Los biomarcadores se utilizan para:

a) detectar la presencia de una exposición



b) determinar las consecuencias biológicas de la exposición

c) detectar los estados iniciales e intermedios de un proceso patológico

d) identificar a los individuos sensibles de una población

e) fundamentar la decisión de intervenir, tanto a nivel individual como ambiental

(Pernía et al., 2008)

La definición de biomarcador implica que éste debe cumplir los siguientes requisitos:

a) recolección de la muestra y análisis fácil

b) específico

c) debe reflejar únicamente un cambio subclínico y reversible

d) debe permitir adoptar medidas preventivas

e) debe ser éticamente aceptable

4.2 MECANISMOS DE TOLERANCIA

Se ha observado que algunas peroxidasas son fuertemente inducidas por la presencia de

metales pesados, pesticidas y también por diferentes elementos de la contaminación

industrial y urbana. Por ello, se puede usar el nivel enzimático de una planta para controlar

el grado de contaminación de una zona, no solo de peroxidasa sino también de superoxido

dismutasa, de glutatión reductasa o utilizando la concentración de ascorbato. La principal

desventaja de este método es que no se sabe cuál es el contaminante responsable de dicha

inducción (Sánchez, 2009)

Algunas de estas enzimas se pueden considerar ubícuitas y se localizan en diferentes

partes de la célula, ya sea, en el citosol, en el estroma y el tilacoide en cloroplasto, en la

mitocondria o en los peroxisomas (Ueda, 2006).



4.2.1 Mecanismos externos

Los hongos mocorrizogenos y su mecanismo de acción en donde los metales al entrar al

apoplasto son retenidos por la red de Harting, antes de penetrar a la raíz.

El apoplasto es un espacio extracelular periférico al plasmalema de las células vegetales

por el que fluyen agua y otras sustancias; este transporte se dice que se realiza por la vía

del apoplasto. En las raíces llega a representar un 10% de su volumen. En las mencionadas

raíces la ruta del apoplasto a través de la endodermis está impedida puesto que la banda

de Caspari, impregnada de lignina y suberina (impermeables), provoca que el flujo sea a

través del citoplasma de las células. La vía del apoplasto transporta sustancias muy

diversas, como el dióxido de carbono (que se capta de la atmósfera y que ha de ser

transportado al cloroplasto, para que intervenga en la fijación del carbono durante la

fotosíntesis), sales minerales (captadas del suelo a través de la raíz) e incluso elementos

de respuesta a estrés; por ejemplo, interviene en la resistencia sistémica adquirida a

fitopatógenos (González y Zapata, 2008).

4.2.2 Mecanismos internos de tolerancia

a) Enlace a la pared celular y exudados radicales

b) Están formados por ácidos orgánicos de bajo peso molecular generados a partir del

ciclo de ácidos tricarboxilicos. Estos ácidos orgánicos como el ácido oxálico se ha visto

presente en la presencia de Al, incrementando su flujo. El secuestro de metales como

Zn, Cu, y Cd en la pared celular de la raíz está relacionado con una mayor lignificación

de las células radicales. Esto ocurre porque hay mayor actividad de la peroxidasa que

estimula la biosíntesis de la lignina en respuesta al estrés causado por los metales

pesados (González y Zapata, 2008).

http://es.wikipedia.org/wiki/Membrana_plasm%C3%A1tica

http://es.wikipedia.org/wiki/C%C3%A9lula_vegetal

http://es.wikipedia.org/wiki/Ra%C3%ADz_(bot%C3%A1nica)

http://es.wikipedia.org/wiki/Endodermis

http://es.wikipedia.org/wiki/Banda_de_Caspari

http://es.wikipedia.org/wiki/Banda_de_Caspari

http://es.wikipedia.org/wiki/Lignina

http://es.wikipedia.org/wiki/Suberina

http://es.wikipedia.org/wiki/Citoplasma

http://es.wikipedia.org/wiki/Di%C3%B3xido_de_carbono

http://es.wikipedia.org/wiki/Cloroplasto

http://es.wikipedia.org/wiki/Fotos%C3%ADntesis

http://es.wikipedia.org/w/index.php?title=Resistencia_sist%C3%A9mica_adquirida&action=edit&redlink=1

http://es.wikipedia.org/wiki/Fitopat%C3%B3geno



c) Quelación de los metales por diversos ligandos en el citosol (fitoquelatinas,

metalotioneinas y aminoácidos)

d) Presencia de proteínas de estrés térmico

e) Acumulación en la vacuola

La vacuola ha sido descrita como un componente celular que ocupa cerca de 80% del

volumen de la célula, las cuales pueden distinguirse por el contenido de proteínas solubles

y por su proteína de membrana. Sirven como reservorio de metabolitos y nutrientes y

participan en el proceso de regulación homeostática del citosol (González y Zapata, 2008).

Las plantas presentan diferentes sistemas de protección a las especies reactivas de

oxígeno como catalasa (CAT), ascorbato peroxidasa (APX), glutatión peroxidasa (GPX),

glutatión reductasa (GR) y otros compuestos antioxidantes como guayacol peroxidasa

(GPX), carotenoides, etc.

Los principales biomarcadores reseñados en plantas como respuesta a la exposición a

metales pesados son aumento en la peroxidación lipídica y de la actividad enzimática de la

catalasa (Jung et al.,2006) variaciones en la relación clorofila/carotenoides (Shi et al.,

2006), ascorbato peroxidasa (Jung et al.,2006) aumento en la concentración de ácido

jasmónico, nicotianamina, glutatión (GPX) y tioles, aparición de péptidos quelantes y

fitoquelatinas y aumento en la actividad o inhibición de las enzimas antioxidantes (Pernia

et al., 2008).

La respuesta de un biomarcador ante la presencia de metales pesados, depende, entre

otros al nive de estrés al que se encuentre sometido (Duarte et al., 2011).



4.3 Biomarcadores de contaminación por metales pesados en las plantas

Como se ha señalado con anterioridad los ROS son moléculas derivadas del oxígeno con

gran capacidad de reacción por su alta inestabilidad química. La Figura 5 representa el

primer paso en la formación de ROS.

Figura 5. Representación de la formación de peróxido de hidrogeno.

Primer efecto de ROS

El análisis de estas reacciones enzimáticas permite realizar tres observaciones. La primera

es que los ROS sólo se generan en situaciones de aerobiosis, dado que la presencia de O2

es una condición indispensable. La segunda, que la síntesis de superóxido es el primer

acontecimiento común en todo el proceso, dando lugar posteriormente al resto de los ROS.

Finalmente, tienen que existir determinados mecanismos intracelulares que generen

electrones libres, que desencadenen la síntesis de superóxido.

La síntesis continua de ROS en el metabolismo, sería incompatible con la viabilidad celular

si no existieran unos sistemas antioxidantes celulares capaces de mantener bajas

concentraciones intracelulares de ROS. Dentro de los mecanismos antioxidantes

intracelulares se pueden clasificar en enzimáticos y no enzimáticos (Garrido, 2007).

Algunos de estos, se pueden apreciar en la tabla 2:



Tabla 2. Representación de mecanismos antioxidantes enzimáticos y no enzimáticos

MECANISMOS ENIZIMATICOS MECANISMOS NO ENZIMATICOS

Superoxido Dismutasa (SOD) Glutatión

Catalasa (CAT) Clorofila

Tiorredoxina reductasa (TrxR) Vitamina C y E

Glutatión Reductasa (GSH) Ácido lipoico

Ascorbato peroxidasa Carotenoides

4.3.1 Variación en la relación clorofila a y b

Las plantas superiores contienen dos formas de clorofila, designadas como “clorofila a” y

“clorofila b”. La “clorofila a” es un complejo magnesio-porfirina. La “clorofila a” pura disuelta

en acetona, posee unos máximos de absorción a 663 y 420 nm (Lehninger, 1993).

La diferencia entre la clorofila a y b es que la clorofila b tiene un grupo formilo (-CHO) en

lugar de un grupo metilo de la clorofila “a” (Figura 6) en uno de los carbonos del anillo de

porfirina. En los vegetales superiores, la más abundante es la clorofila “a”.

Los metales pesados divalentes positivos pueden sustituir al ión Mg+2 en la molécula de

clorofila, lo que imposibilita la captación de fotones (Belyaeva y Litvin, 2007), generando

como consecuencia, una disminución de la actividad fotosintética (Pernia et al., 2008). En

estudios recientes también se ha presentado esta actividad (Liu et al., 2008). El precursor

de la clorofila es la protoclorofila y su especificidad depende de compuestos proteínicos

pigmentados (Belyaeva y Litvin, 2007).

La biosíntesis de clorofila es fundamental para la formación del aparato fotosintético que

abarca a la fotosíntesis y consecuentemente la existencia de biosfera. (Belyaeva y Litvin,

2007).



Figura 6. Clorofila “a” y “b”

4.3.2 Aumento en la peroxidación lipídica

El daño causado por el estrés oxidativo en las estructuras ricas en ácidos grasos como las

membranas, resulta en pérdida de la rigidez, integridad y permeabilidad. Este proceso se

conoce como peroxidación lipídica, produciendo compuestos carbonilicos como

malondialdehído (Soto et al., 2011).

La peroxidación lipídica implica la formación y propagación de radicales lipídicos, pérdida

de O2 y la eventual destrucción de las membranas, generando una variedad de productos

que incluye cetonas, alcoholes, éteres y aldehídos. Uno de estos productos es el

malondialdehido (MDA) generado por la ruptura de los ácidos grasos poliinsaturados, el que

es utilizado para determinar el grado de peroxidación. El biomarcador se presenta en el

incremento de la concentración de especies generadas por la reacción del MDA con el ácido

tiobarbitúrico (TBA) (Pernia et al., 2008).

4.3.3 Peroxidasas

El grupo de peroxidasas cumplen una importante función en la reducción del estrés causado

por diferentes factores, es así como la producción de Especies Reactivas de Oxigeno



(ERO´s), como efecto secundario del estrés salino, hídrico y demás tipos de estrés, son

degradados por las plantas con la síntesis de diferentes enzimas como la ascorbato

peroxidasa, superoxido dismutasa, catalasa, glutatión reductasa y guayacol peroxidasa

entre otras. Algunas de estas enzimas se pueden considerar ubícuitas y se localizan en

diferentes partes de la célula, ya sea, en el citosol, en el estroma y el tilacoide en cloroplasto,

en la mitocondria o en los peroxisomas (Acevedo 2009).

4.3.4 Superoxido dismutasa (SOD)

En 1969, McCord y Fridovich identificaron la primera enzima antioxidante, la Cu-Zn

superóxido dismutasa. Desde entonces se han descrito tres isoformas de la misma: la

Cu,Zn-SOD ó SOD citosólica, la Mn-SOD ó SOD mitocondrial y la Cu,Zn-SOD extracelular

ó ec-SOD. La tres isoformas de SOD son productos de distintos genes aunque las tres

catalizan la misma reacción (Garrido, 2007):

2H+ + 2O2- SOD H2O2 + O2

La enzima SOD transforma los aniones superoxido a aniones peróxido (H2O2) y O2 (Landber

et al., 2002) (Feng-Qin et al, 2006).

4.3.5 Catalasa (CAT)

Es un homotetrámero formado por 4 subunidades, conteniendo en su sitio activo un grupo

ferroprotoporfirina. Se localiza fundamentalmente en los peroxisomas, en el citosol (Garrido,

2007) y mitocondrias (Landberg yGreger, 2002). La función de la catalasa es doble: en

primer lugar, catalizar la degradación del H2O2 a agua y oxígeno molecular, en una reacción

que consta de dos pasos produciendo dos compuestos intermedios con capacidad

oxidante, llamados compuesto I y II. En segundo lugar, indirectamente, también detoxifica



a la célula de los radicales O2.

ya que favorece el paso del O2.

a H2O2 por la SOD, por la

disminución en los niveles de H2O2 intracelular por parte de la CAT (Garrido 2007).

La Catalasa como diferentes peroxidasas (guiacol y ascorbato) toma el producto de la SOD

(H2O2) y lo transforman en agua (Landberg y Greger, 2002).

H2O2 CAT H2O + O2

4.3.6 Ascorbato peroxidas (APX), Glutatión peroxidasa (GPX)

La guayacol peroxidasa y la ascorbato peroxidasa desempeñan una función catalítica

importante al reducir los niveles de H2O2 en los tejidos vegetales, evitando con ello que este

compuesto se difunda entre las membranas biológicas para reaccionar con iones libres

como el Fe 2+ y generar el potente radical hidroxilo, a través de la reacción de Fenton

(Vogiatzi et al., 2009).

5.0 ANTECEDENTES

Ha sido ampliamente investigado que las plantas presentan diferentes respuestas ante las

condiciones de estrés que se ven envueltas en la contaminación. Tal como se mostró en

un estudio realizado por Pignata en Buenos Aires en 1997 al estudiar el efecto que tuvo

Ligustrum lucidum Ait. F. tricolor (Rehd.) Rehd. ante la contaminación atmosférica y se

concluyó que la concentración pigmentica y proteínica tuvo una alteración mayor en los

sitios con una elevada contaminación atmosférica. Investigaciones previas han mostrado

que hay una relación entre la producción de clorofila y la actividad proteínica cuando las

plantas comestibles se ven expuestas a la contaminación (Philosoph-Hadas et al., 1994).

Se realizaron estudios en Estocolmo en el año 2002, sobre los mecanismos antioxidantes

originados por metales pesados, se investigó el estrés oxidativo y sus mecanismos, se

usaron plantas expuestas a diferentes concentraciones de zinc, cadmio y cobre y se



observó una relación entre la concentración del metal y el efecto antioxidante. Las ramas

de los árboles fueron evaluadas para este fin. (Landberg y Greger, 2002).

Se estudió en el 2003, en España la especie de Ligustrum lucidum ante contaminación

atmosférica por metales pesados encontrándose que esta especie resultaba ser un

excelente candidato para dicho estudio y concluyendo que las hojas de los árboles

reflejaban la concentración de metales pesados de acuerdo con el nivel de contaminación

atmosférica reportada en los diferentes puntos de muestreo. Chaoui y El-Ferjani en el 2004

hicieron crecer in vitro chicharos contaminados con diferentes concentraciones de Cu y Cd,

analizando la actividad enzimática en sus hojas, encontrando que la actividad de

lipoperoxidación aumentaba, así como la actividad de la guaiacol peroxidasa, mientas que

la actividad de la CAT y SOD decrecía (Chaoui y El-Ferjani 2004). Durante este mismo año

Cicek en Turkia realizó una investigación sobre la acumulación de sulfuro y metales

pesados en suelo y hojas de árboles encontrando que la concentración de los metales

decrecía en árboles más alejados de la fuente de contaminación.

Durante el año 2006 se destacaron algunas investigaciones sobre el tema, como en

Australia que realizaron investigaciones para conocer el mecanismo de selección a nivel

molecular que tienen las plantas hiperacumuladoras de metales. Se estudió el rol que

juegan las metalotioninas y aminoácidos en la desintoxificación de metales (Callahan et al.,

2006). En otro estudio se evaluaron árboles con respecto a sus edades, para conocer la

capacidad de acumular metales, encontrando que árboles más viejos tenían mayor

capacidad de biorremediación. (Onder et al., 2006). Otra investigación realizada en Turkia

por Baycu fue conocer las concentraciones de metales pesados, clorofila y POD en hojas

de árboles con respecto a la estación del año de primavera y otoño-invierno demostrándose

que las concentraciones de metales pesados y POD fueron mayores en otoño-invierno al

contrario de la cantidad de clorofila en la misma época del año. Se estudió en China el



efecto del lantano en hojas de lechuga y como elementos traza tales como cobalto sobre la

producción de clorofila y se encontraron resultados de asociación. (Shi et al., 2006). En este

mismo año, en India se utilizaron algunos árboles bioacumuladores de cadmio para

biorremedación y se evaluaron los efectos sobre la biomasa, los pigmentos fotosintéticos y

el nivel de proteína ante la presencia de cadmio tras el reflejo de estrés oxidativos en

plantas. Primero se monitorearon a las plantas y posterior frente a la respuesta de

desintoxificación a los metales. Se analizaron las raíces, los tallos y las hojas, concluyeron

que el cadmio induce el estrés oxidativo el cual se ve reflejado en el incremento de la

peroxidación lipídica y la conductividad eléctrica con decremento en los pigmentos

fotosintéticos (Mishra et al., 2006). En Estados Unidos, se elaboró un modelo usando

arbustos y árboles, tomando como referencia la concentración de la contaminación y la

estación del año. Se demostró que los árboles eliminan grandes cantidades de

contaminantes del aire, que consecuentemente aumenta la calidad del mismo en las zonas

urbanas. Con los resultados obtenidos se pudo evaluar el uso de árboles como

bioindicadores de la contaminación y su función en la biorremedación (Nowak et al., 2006).

Durante el año 2007 prosiguieron las investigaciones encontrándose resultados

interesantes; En Rusia se investigó el efecto que produce diferentes intensidades de luz

sobre la producción de clorofila, así como la presencia de partículas extrañas, como polvo

y otros contaminantes, descubriendose nuevos componentes que estaban relacionados

con los pigmentos fotoactivos como los complejos enzimáticos (Belyaeva y Litvin, 2007).

Se investigó también, en Estados Unidos a las plantas para fines de biorremediación, en

dichas investigaciones se midio el nivel de toxicidad cuando la plantas son expuestas a

diferentes metales pesados, entrotrandose que las plantas son buenas candidatas para

usarlas en dicho proceso (Muthukumar et al., 2007). Qureshi estudio en Italia en ese año la

respuesta celular de las plantas ante el estrés y los mecanismos de defensa, concluyendo



que el estrés altera los mecanismos genéticos y existen cambios cualitativos y cualitativos

en las proteínas, ante distintos tipos de contaminación (Qureshi et al., 2007).

Durante el 2008, en Pakistan se investigó el efecto que produce el Pb en el crecimiento de

las hojas, así como la afectación de la actividad enzimática ante la presencia de este metal.

Se observó que la actividad enzimática se veía incrementada y existía daño en la membrana

celular (Liu et al., 2008). Sin embargo solo se realizó este estudio con el Pb.

En cuanto a los estudios realizados en México en el año 1998 Flores et al estudiaron las

concentración de Pb, Cu y Mn presente en partículas en la ciudad de México encontrando

que la presencia de éstos metales es mayor en partículas con tamaño inferior a 0.42 mm y

que estos polvos están suficientemente contaminados como para evaluar un estudio

epidemiológico de la zona, también cada metal mostró un perfil de especiación particular

que ayudo a inferir el mecanismo de liberación (Flores et al., 1998).

Sandoval presentó en México en el año 2007 un estudio sobre la “Caracterización

morfológica y química elemental de PM10 aerotransportadas en el Valle de Toluca del 2004”,

evaluada en las 7 estaciones de monitoreo establecidas por la RAMAT, en tres zonas:

Centro, Sur y Norte. El material analizado fue dispersado vía aire. Las conclusiones a las

que llego fueron que la morfología de las partículas es variada y los elementos identificados

fueron: C, O, Na, Mg, Al, SI, S, K, Ca, Ti, Fe, Cu, Zn, V, Pb.

En el 2009, Caballero realizó un estudio sobre aeropartículas del Valle de Toluca mediante

la recolección de agua de lluvia en donde se encontró la presencia de partícula conformada

por metales, indicativo inequívoco de contaminación atmosférica. También en este año en

China se investigó la toxicidad que producían el Cd, Zn y Cu sobre hojas de los árboles,

reflejándolo en el área, en la biomasa seca, en la concentración de clorofila encontrándose

que el Cu presentaba mayor toxicidad en las hojas en cuanto a la producción de clorofila

(Shi y Cai, 2009).



En el año 2010 se estudiaron a las hojas como bioindicadores de contaminación del aire

por elementos traza, se estudió el Fe, V, Cr, Fe, Ni, Cu, Zn, As, Cd, y Pb, se examinó la

morfología y desarrollo foliar, observándose una disminución en el follaje ante la presencia

de estos elementos (Tomašević et al., 2010).

Se ha estudiado el efecto de los metales pesados como fuente de contaminante en musgos;

Duarte en el 2011 en Argentina, evaluaron el estrés oxidativo como biomarcador de la

contaminación en musgos, midiendo funcionamiento enzimático y su relación con la

concentración de metales pesados cuantificados, tomando en consideración parámetros

del medio como estaciones y nivel de contaminación, se cuantificaron metales pesados en

sedimento y tejido de musgos, el estudio se realizó con referencia a cuatro ciudades con

impacto antropogénico. De acuerdo con esta cuantificación, encontraron cambios

significativos en las actividades enzimáticas, por lo cual se pudo comprobar que tiene

correlación con la cantidad de metales encontrados en los musgos. De igual forma se

pudieron encontrar diferencias ante la respuesta de los biomarcadores con respecto a la

estación del año (Duarte et al., 2011). También en el 2011, se estudio en la India la

contaminación de suelos debida a metales pesados y el uso de la flora propia del lugar

para analizar biorremedación. Se seleccionaron 20 plantas, 3 arbustos y 2 pastizales

analizando sus raíces. En esta investigación se concluyó sobre la biorremediacion de las

plantas excepto ante la presencia de Co y Ni (Mayank et al., 2011). En serbia en este año

se estudiaron la deposición de metales pesados en las hojas de dos tipos de especie de

árboles en dos periodos del año encontrándose diferencias en el contenido de metales

pesados de ambas especies, sin embargo ambas reflejaron mayor contenido en el mes de

mayo (Anicic et al., 2011). Durante este año en Serbia se estudió la concentración de

metales pesados en la corteza y las hojas de pinos y platanos, encontraron que el Fe y Pb

presentan una muy baja traslocación a las hojas y mayor concentración de metales en



corteza (Sawidis et al., 2011). En Taiwan Wu analizó y comparó las propiedades

antioxidantes de 5 especies de ligustrum ante la presencia de metales pesados, estas

especies presentaron una correlación en la actividad antioxidante encontrada y la cantidad

de metales (Wu et al., 2011). También en China se midieron área y biomasa en hojas de

distintas especies de árboles bajo condiciones de estrés por contaminación atmosférica, se

observó que las especies nativas presentan menos variación en cambios antes los

contaminantes atmosféricos a diferencia de especies introducidas en esa área. (Wei et al.,

2011).

En el año 2012 en Serbia se investigó el efecto que tenía Robinia pseudoacacia L. ante la

contaminación de Cu, As, Zn, y Pb proveniente de una industria metalúrgica. Los índices

más altos de Zn se encontraron en ramas, sin embargo se concluyó que las hojas servían

como indicadores de estos metales y serían un buen candidato para estudio. (Serbula et

al., 2012). En este año en Noruega y Polonia se estudió la concentración de metales

pesados por deposición de contaminación en superficies de hojas de 47 especies diferentes

de árboles y arbustos encontrándose que las concentraciones de metales pesados variaban

según la especie y también encontraron que la deposición era mayor en árboles ubicados

en zonas urbanas (Sæbø et al., 2012).

6.0 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Los biomarcadores han sido una herramienta importante para evaluar la contaminación del

ambiente, ya que ellos pueden predecir los efectos en los organismos expuestos a un

compuesto en especial, dentro de programas de monitoreo (Duarte et al., 2011). El uso de

hojas de los árboles como bioindicadores es económico, además de predecir de manera

eficaz el nivel de contaminación y las zonas con mayor daño. Los cambios bioquímicos que

predicen el daño por contaminantes atmosféricos son de suma importancia debido a su



reducido tiempo de respuesta y ofrecen la oportunidad de actuar a tiempo para prevenir

problemas irreversibles de salud y daño al entorno.

En el presente trabajo se conocerá sobre la utilidad de los bioindicadores y biomarcadores

de estrés oxidativo de las hojas de los árboles del Valle de Toluca, debido a la exposición

a metales pesados a través de sus variaciones enzimáticas.

Las plantas tiene la capacidad de combatir el estrés oxidativo causado por metales

pesados. El nivel de clorofila y varios antioxidantes sugeridos a evaluar son un candidato

adecuado para medir el daño causado por metales pesados a nivel atmosférico.

Se ha señalado anteriormente que la actividad de la enzima en las hojas de los árboles se

ve alterada, cuando la planta se encuentra sometida al estrés. Con esta investigación se

pondrá en evidencia el papel que juegan los procesos enzimáticos ante la presencia de

metales pesados como contaminantes. Con el resultado de este trabajo se determinaran

las zonas con mayor incidencia de contaminación por metales pesados, en el Valle de

Toluca.

Por lo tanto se usara como base lo anterior para conocer el nivel de estrés que presentan

los árboles usando como bioindicadores a las hojas y como biomarcadores a las enzimas

y producción de clorofila. Esta información podrá ser usada tanto para validar la eficacia de

los sistemas de monitoreo existentes que se consideran para medir los daños de los

contaminantes en la Zona Metropolitana del Valle de Toluca, así como obtener información

pertinente y útil para que las autoridades responsables tomen las medidas necesarias para

mitigar los índices de contaminación atmosférica generada por metales pesados.

Si la vegetación urbana se emplea como medida para disminuir la contaminación

atmosférica, entonces las especies más eficientes se pueden utilizar e incluir programas de

reforestación.



6.1 Hipótesis

Los metales pesados como contaminantes atmosféricos, en las hojas de los árboles de la

Zona Metropolitana del Valle de Toluca provocarán una disminución en la producción de

clorofila, aumento de carotenoides y estrés oxidativo que se reflejara en un cambio en las

enzimas antioxidantes.

7.0 OBJETIVO GENERAL

Evaluar el efecto de la contaminación atmosférica de metales pesados en árboles de la

Zona Metropolitana del Valle de Toluca, usando como bioindicador a las hojas y como

biomarcadores al estrés oxidativo y la producción de pigmentos (clorofila y carotenos).

7.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

7.1.1 Seleccionar los puntos de muestreo representativos en la Zona Metropolitana del

Valle de Toluca.

7.1.2 Seleccionar la especie de árbol en la cual se tomaran las muestras de hojas.

7.1.3 Determinar los biomarcadores de estrés oxidativo (peroxidación lipídica, catalasa,

guayacol peroxidasa (GPX), superoxido dismutasa (SOD), proteínas, glutatión reductasa

(GR), producción de clorofila y carotenoides en las hojas de los árboles).

7.1.4 Caracterizar y cuantificar a los metales pesados, a través de la técnica de

Fluorescencia de Rayos X en Reflexión Total (Martínez et al., 2004; Rosano-Ortega et al.,

2007).

7.1.5 Evaluar la asociación que existe entre la concentración de metales pesados

presentes en las hojas y los biomarcadores. Por medio del método estadístico de análisis

de varianza (ANOVA) y programa estadístico MINITAB.



8.0 METODOLOGÍA

ZMVT

(22 municipios)

Selección de puntos de muestreo

Muestreo Época seca-fría (Dic 2012)

Muestreo Época seca-cálida (May 2013)

Transporte y almacenamiento

Análisis

Concentración de metales en depósito

y en tejido

Determinación de biomarcadores

Análisis estadístico

Área foliar



8.1 Selección de los puntos de muestreo

Los puntos de muestreo se determinaron en base a los sitios donde exista la especie de

árbol Ligustrum sp por ser una especie representativa en la ZMVT y estar integrada en los

programas de reforestación, ésta especie es introducida y conjuntamente se trabajó con

Juniprus sp, la cual es una especie endémica. Se consideraron factores tales como:

dirección del viento, áreas mayormente afectadas por contaminación antropogénica

(actividades comercial e industrial y tráfico automotor), densidad demográfica.

8.2 Muestreo

El muestreo en un rodal debe considerar los siguientes criterios: especie de árbol, época

del año, edad de las hojas, posición en la copa, exposición a la luz y posición sociológica

del árbol (Figura 7).

a) Especie de árbol. En una muestra debe haber follaje de una sola especie. No

mezclar hojas de especies distintas.

b) Época del año. Desde mediados del verano hasta fines de éste (febrero - marzo),

porque en esa época los árboles están sometidos al máximo estrés en casi todos los sitios

y manifiestan las menores concentraciones de elementos nutritivos en el follaje. Sin

embargo, las muestras foliares pueden tomarse en cualquier época del año para identificar

situaciones especiales.

c) Tipo de follaje. Deben recolectarse hojas o acículas del último período vegetativo,

cuando éstas ya presenten un desarrollo completo. Para precisar algunos diagnósticos

también se recolectan, en muestras aparte, hojas del período vegetativo anterior, cuidando

de no juntarlas con hojas de otras edades. En lo posible, evitar hojas dañadas por

patógenos.



Figura 7. Muestreo de hojas de árbol

d) Número de árboles por muestra. Para caracterizar un rodal se debe muestrear 15 -

20 árboles, que constituyen una muestra mezcla. En situaciones especiales, como rodales

de pequeña superficie o sectores puntuales de un rodal, puede reducirse a 3 - 5 árboles por

muestra.

e) Número de muestras. Con una muestra mezcla se puede obtener una visión de la

condición promedio o más generalizada del rodal, lo cual es normalmente suficiente para

realizar un diagnóstico. Para conocer la variabilidad de la situación nutritiva del rodal,

conviene obtener por lo menos tres muestras mezcla.

f) Cantidad de follaje por muestra. Obtener de 300 a 400 g de follaje fresco por cada

muestra mezcla. Esto significa que de cada árbol muestreado se debe extraer una cantidad

similar de follaje. Por ejemplo, un puñado lleno de acículas de cada árbol hasta completar

el número de árboles necesarios; otro ejemplo: 20 g/árbol por 15 árboles = 300 g de muestra

mezcla. (Laboratorio de Nutrición y suelos forestales. Universidad Austral de Chile).



g) Equipo para manejo, toma y transporte de muestra: Se deberán usar guantes de

polietileno, Tijeras para cortar follaje. Las muestras deben transportarse en bolsas de

polietileno perforadas para permitir respiración de la muestra (Anicic et al., 2011). Las

muestras de hojas deberán ser cortadas con peciolo.

8.2.1 Sitios de muestreo

Con base a la presencia de las especies seleccionadas (Juniperus sp y Ligustrum sp) se

definieron un total de 25 sitios de muestreo pertenecientes a los 7 municipios que conforman

la ZMVT, en el cuadro y en la Figura 8 se muestran los sitios de muestreo, los cuales fueron

clasificados en 3 categorías: Zonas urbanas, Zonas de transición y Áreas protegidas (ver

Tabla 3). Los criterios empleados para la clasificarlos en estas categorías se tomaron del

Plan Regional de Desarrollo Urbano del Valle de Toluca emitido por la Secretaría de

Desarrollo Urbano del Estados de México (Gobierno del Estado de México, 2005).

Figura 8. Sitios clasificados en Zonas Urbanas, Zonas de transición y Áreas Protegidas



Tabla 3. Clasificación de los puntos de muestreo en Zonas Urbanas, Zonas de transición y

Áreas Protegidas

8.3 Preparación de la muestra

Se recolectó 1 kg de hojas de 10 árboles ubicados en cada zona, se mezclaron las hojas y

se tomó una muestra compuesta. Se tomó 100g y con este se realizaron las

determinaciones de estrés oxidativo y con otros 100g se realizaron las determinaciones de

clorofila y carotenoides.

El material triturado fue mezclado en 50 mmol/L KH2PO4 /K2HPO4 (pH 7.0) y 10g/L PVP-10,

y después centrifugado a 10,000 g por 10 min. El sobrenadante fue usado para ensayos de

todas las enzimas.

8.4 Determinación de biomarcadores de estrés oxidativo

Extracción enzimática

Se pesaron 500 mg de tejido de planta y se homogenizaron con 5 ml de solución de

extracción (ver Tabla 4).



Tabla 4. Solución de extracción buffer pH 7.0

K3PO4.nH2O (Fosfato de potasio tribásico) 0.1 M

EDTA 0.1 mM

5% polivinilpirrolidona (PVP)

Se centrifugan las muestras a 25000g (13500 rpm) a 4°C por 30 min y el sobrenadante es

empleado para determinar la actividad enzimática.

8.4.1 Contenido de proteínas

Se tomó la técnica según Bradford (Bradford, 1976); a un volumen de 1 ml de sobrenadante

de extracto enzimático se adicionaron 5 ml de reactivo de Bradford y se mezcló

mecánicamente. Se midió la absorbancia a 595 nm después de 5 minutos.

Las absorbancias se interpolaron en una curva estándar preparada con diferentes

concentraciones de una solución de albúmina bovina para calcular la concentración de

proteína en las muestras.

Reactivo de Bradford. 100 mg de azul de cromassie se disuelven en 50 ml de etanol al 95%.

A ésta solución agregar 100 ml de ácido fosfórico al 85%(w/v), llevar a aforo de 1000 ml

con agua destilada. La concentración final del reactivo es de 0.01% (w/v) de azul de

cromassie, 4.7% (w/v) de etanol y 8.5% (w/v) de ácido fosfórico.

8.4.2 Peroxidación lipídica

El malondialdeído es uno de los productos finales de la lipoperoxidación y ha sido usado

como índice para conocer el daño de lípidos en las memebranas. Los niveles de

peroxidación lipídica fueron determinados mediante el método de Kosugi y Kikugawa del

ácido tiobarbitúrico (TBA) reportada por Buege y Aust (1978). Al término de la inducción del

estrés oxidativo, se agregó a cada muestra 2 ml de una solución ácida compuesta por ácido

tricloroacético 15%, TBA 0.375% y HCl 0.25 N. Posteriormente, las muestras se calentaron



en un baño de agua hirviendo y a los 15 minutos, fueron enfriadas en hielo y centrifugadas

a 3000 rpm durante 5 minutos.

Por último, se extrajo el sobrenadante y se leyó su absorbancia a 532 nm en un

espectrofotómetro UV-Vis Genesis Thermo código 252131. Los resultados fueron

expresados como nanomoles de sustancias reactivas al TBA (TBARS) producidas por mg.

de proteína y fueron calculados en base al coeficiente de extinción molar (ε) de

malondialdehido de 1.56X105 M-1 cm-1.

Concentración de Lipoperoxidación= (Abs)(Fd)/ (ε535nm)(VM)(g) ……… Ec. 1

Donde:

Abs = absorbancia de la muestra

Fd = factor de dilución

ε535nm = 1.56 x 105 cm-1/M-1, coeficiente de extinción molar del MDA

g = gramos de muestra VM= volumen de la muestra

8.4.3 Catalasa (CAT)

La catalasa (CAT) de los peroxisomas fue calculada de acuerdo al método de Hernández

2005. Se tomaron 20 µl del homogenado obtenido de 500 µl de extracto de plantas y 4 ml

de PBS sonicados durante 15 minutos y posteriormente centrifugados a 9000 rpm por 15

minutos, + 1 ml de solución reguladora de aislamiento (0.3 M de sucrosa, 1.0 mM de

HEPES, 5 mM de KH2PO4, pH ajustado a 7.4). Posteriormente 0.2 ml - 200 µl – de H2O2

20mM, evaluando la absorbancia inmediatamente y a los 60 segundos a una longitud de

onda de 240 nm en celdas de cuarzo. La actividad de la enzima fue calculada con un

coeficiente de extinción molar de 0.043 cm-1 mM-1 y los resultados reportados por min/mg

de proteína.

Actividad de la Catalasa = (Abs 0´´ - Abs 60´´)(VRX)(Fd) / (VM)( ε240nm)(g) …… Ec. 2



Donde:

Abs 0’’ = absorbancia a los 0 segundos


VRx = volumen de reacción

VM = volumen de la muestra


ε240nm = 0.043 mM-1cm-1, coeficiente de extinción molar del H2O2 a 240 nm

g = gramos de muestra

8.4.4 Ascorbato peroxidasa (APX)

El material de hojas triturado y mezclado con 0.5 mMol/L ascorbato y 2 mmol/L de H2O2 y

la decreción de absorbancia será medida durante 3 minutos a 280 nm. El coeficiente de

extinción será de 2.8 mMol/L (Landberg y Greger, 2002).

Se siguió el método descrito por Porcel 2006, basado en la medida espectrofotométrica a

290 nm de la oxidación de ascorbato en presencia de H2O2. La reacción se llevó a cabo a

25°Cen un volumen de reacción de 1 ml formado por tampón Hepes-NaOH 50mM, pH 7.6

con ascorbato 0.2 mM, 100 µl de muestra y H2O2 0.3 mM. La reacción se inicio añadiendo

H2O2 y se siguió el descenso de la absorbancia con un espectrofotómetro UV-Vis Genesis

Thermo código 252131 por 3 minutos. Se registraron también blancos de muestra

conteniendo éstos sólo muestra y tampón con ascorbato. La actividad enzimática

expresada en nmol de ácido ascórbico oxidado min-1, se calculo usando un coeficiente de

extinción molar (ε290) para el ácido ascórbico de 2.8mM-1cm-1.

Actividad de la Ascorbato = (Abs 0´´ - Abs 60´´)(VRX)(Fd) / (VM)( ε290nm)(g) … Ec. 3

Donde:








ε290nm = 2.8 mM-1cm-1, coeficiente de extinción molar del H2O2 a 290 nm


8.4.5 Guayacol peroxidasa (GPX)

La actividad de la Guayacol peroxidasa se determinó por medio de la oxidación del guayacol

presente en la mezcla de reacción. Se tomaron 50 μl de extracto de proteínas obtenido

previamente, se agregó a 0,35 mL de la mezcla para la reacción y se agitó con vortex

durante 15 seg para homogenizar la reacción. Pasado un periodo de 5 min, se determinó

el diferencial de absorbancia a 470 nm. Como blanco se consideró la mezcla para la

reacción. Se consideró que el Coeficiente de Extinción del tetraguayacol a 470 nm es 26.6

mM-1cm-1(Acevedo, 2009).

Tabla 5. Mezcla de reacción:

0,1 M buffer fosfato de potasio (pH 6.8)

56 mM solución de guayacol

0,2 mM peróxido de hidrógeno

Enzima para un volumen total de 0,35 mL.

Actividad de la Guayacol = (Abs 0´´ - Abs 5´) / (ε470nm)(g) ……… Ec. 4


Abs 5’ = absorbancia a los 5 minutos

Ε470nm = 26.6 mM-1cm-1, coeficiente de extinción molar del H2O2 a 470 nm




8.4.6 Superoxido dismutasa (SOD)

Se siguió el método de Misra y Friedrich (1972) con modificaciones. Se toman alícuotas del

homogenado, obtenido de 500 µl del extracto de la planta en 4 ml de agua destilada

sonicados durante 15 min y posteriormente añadir 2.5 ml de etanol/cloroformo 1:1 agitados

y centrifugados a 3000 rpm durante 15 min. En celda de cuarzo agregar 150 µl del

homogenado + 750 µl se solución reguladora de carbonatos (bicarbonato de sodio 50 mM,

EDTA 0.1 mM ajustada a pH 10.2 con Na2CO3 en polvo). Se agrega inmediatamente 600

µl de sustrato (adrenalina 30 mM en ácido acético al 0.05%) registrando la lectura inicial, a

los 30 segundos y a los 5 minutos con una longitud de onda de 480 nm.

Actividad SOD. = (Y-b)(VRX)(Fd) / (VM)(g) …… Ec. 5

Donde:

Y = ordenada al origen de la curva estándar, con la absorbancia en tiempo lineal

b = intercepto en el eje “Y” de la curva estándar





8.4.7 Clorofila y Carotenos

8.4.8 Carotenos

Las hojas serán recolectadas y con una muestra homogénea se partirán la hojas en

pedazos pequeños, se colocarán 0.5 g en tubos de ensaye; se adicionarán 10ml de acetona

al 80% y se dejaran reposar toda la noche para lograr una completa extracción. Se



determinará el contenido de clorofila “a”, “b” y carotenos a longitudes de 663 nm, 645 mn y

480 mn respectivamente y usando un espectrofotometría UV (Liu et al., 2008).

Ca = (12.7 x A663 – 2.69 x A645) x (V/(1000 x W)) ……… Ec. 6

Cb = (22.9 x A645 – 4.68 x A663) x (V/(1000 x W)) ……… Ec. 7

carotenos = ( 1000 A470 – 2.86 Ca – 129.2 Cb ) / 245……… Ec. 8

Ca= mg clorofila a /g de tejido

Cb= mg clorofila b / g de tejido

V = volumen del extracto clorofílico (en mL)

W = Peso fresco (en gramos) del tejido

8.5 Caracterizar y cuantificar a los metales pesados

En el laboratorio, las hojas de la especie seleccionada fueron liofilizadas durante 6 horas

para eliminar el agua en los tejidos de la hoja, molidas en un mortero de ágata, tamizadas

a 200 mallas y homogeneizadas durante 20 minutos (Avila y Zarazúa, 1993). Las muestras

fueron analizadas para determinar el contenido de metales acumulados en los tejidos de

los organismos a través de la técnica de Fluorescencia de Rayos-X en Reflexión Total

(Martínez et al., 2004; Rosano-Ortega et al., 2007) cuya detección es de 0.002% (20ppm)

y su fundamento se basa en la emisión secundaria o fluorescente de radiación X que se

genera al excitar una muestra con una fuente emisora de rayos X. La radiación X incidente

o primaria expulsa electrones de capas interiores del átomo. Entonces, los electrones de

capas más externas ocupan los lugares vacantes, y el exceso energético resultante de esta

transición se disipa en forma de fotones: la llamada radiación X fluorescente o secundaria.

Esta radiación de fluorescencia es característica para cada elemento químico. Las muestras

por triplicado de 0.5 g fueron digeridas en un horno de microondas MARS X (CEM. La

digestión se realizó en una etapa, utilizando los siguientes reactivos: 2 mL de agua tipo 1,

http://es.wikipedia.org/wiki/Electrones

http://es.wikipedia.org/wiki/Fotones



5 mL de HNO3 concentrado (Ultrex II) y 1 mL de acido fluorhídrico (Ultrex II). El método de

digestión está recomendado por el fabricante (CEM), denominado Citrus Leaves (SRM

1572). Del licor obtenido al final de la digestión se tomó una alícuota de 5 mL y se aforará

a 10 mL con agua tipo 1, posteriormente se realizaron las lecturas en Fluorescencia de

Rayos-X por Reflexión Total. Las muestras de las hojas fueron analizadas por triplicado,

usando un espectrómetro de Rayos X TX-2000,en el modo de Reflexión Total. El tubo de

molibdeno fue operado a 40 kV y 30 mA. Los Rayos X derivados de las muestras fueron

detectados mediante un detector de Si-Li de estado sólido de 20 mm2 de área frontal y

enfriado mediante nitrógeno líquido. El programa EDXRF32-Ital Structures fue usado para

el análisis de los espectros. Todas las muestras fueron medidas durante 500 s. La

concentración de los metales y los límites de detección fueron determinados mediante el

programa EDXRF32-Ital Structures utilizando el método de sensibilidades con estándar

interno. Como control de calidad analítico se analizó un material certificado de referencia.

Al ser una técnica multielemental, se pueden analizar todos los elementos presentes en la

muestra, sin embargo se enfocó el análisis de Cr, Mn, Fe, Ni, Cu, Zn y Pb. (Avila et al.,1993)

(Martínez et al., 2004), (Rosano-Ortega et al., 2007)

8.6 Determinación de la sensibilidad de las especies

Para conocer la sensibilidad de las especies se analizaron los resultados de biomarcadores

con respecto a la presencia de metales en los sitios de muestreo. Una mayor respuesta

significativa de los biomarcadores (inhibición o inducción) ante la presencia de los metales

con respecto a sitios considerados como referencia (Zonas Protegidas) indica la

sensibilidad de la especie.



9.0 RESULTADOS Los resultados se presentan en el artículo anexo, titulado Bioaccumulation and effects of

trace metals by dry deposition on leaves of Ligustrum sp. and Juniperus sp., enviado

a la revista Ecological Indicators con un nivel de impacto de 3.230



Bioaccumulation and effects of trace metals by dry deposition on leaves of Ligustrum sp. and Juniperus sp.

Ledesma-Ortíz C.I.a, Amaya-Chávez A.a*, Ávila-Pérez P.b, Sánchez-Meza J. C.a, Tejeda-Vega S.c, Endara-Agramont A. R.d, Tejocote-Pérez M.

aFacultad de Química, Universidad Autónoma del Estado de México. Paseo Colon Esq. Paseo Tollocan, Toluca, Estado de México, C.P. 50120

bDirección de Investigación Tecnológica. Instituto Nacional de Investigaciones Nucleares (ININ).

cGerencia de Ciencias Ambientales. Instituto Nacional de Investigaciones Nucleares (ININ).

dInstituto de Ciencias Agropecuarias y Rurales (ICAR-UAEM).

correo electrónico: * [email protected]

Abstract

Leaves of Juniperus sp and Ligustrum sp were studied as indicators of pollution heavy

metals (Mn, Fe, Cu, Zn and Pb) in the atmosphere of a zone with high population density

and industrial development. Catalase, superoxide dismutase, ascorbate peroxidase,

guaiacol, proteins and pigments were measured in order to determine the effects to

atmospheric stress caused by heavy metals during two periods in the year (December 2012

and May 2013). Metals were quantified in dry deposit and tissue of trees leaves using the

technique of Fluorescence spectrometry X-ray in energy dispersive (EDXRF) and

Fluorescence spectrometry X-ray in total reflation (TXRF) respectively.

The results show greater response of enzyme inhibition in Juniperus sp. species, with

decreased protein content and increased lipid peroxidation at sites with higher content of

metals in tissue belonging to urban areas with increased industrial activity and traffic flow.

In dry deposit Biacumulation factor of metals was Fe>Mn> Zn> Cu>Pb for the first time of

sampling and Fe>Mn> Cu> Zn>Pb for the second sampling period.



Key words: oxidative stress, air pollution, metals, bioavailability.

1. Introduction

The atmospheric concentration of trace elements has increased due to anthropogenic

activities and consequently its adverse effects to the organisms (Machado et al., 2008;

Oyarzún, 2010). Metals are persistent, they disperse widely in the environment influenced

by the wind direction and interaction with different natural and anthropogenic components,

causing damage to human health and to the ecosystem. (Jarup, 2003; Cicek and Koparal,

2004; Ostroff, 2007; Olowoyo et al., 2010).

In land ecosystems, dry and wet atmospheric deposition, where particles with significant

content of metals are found, depends on the degree of combustion and industrial processes

(Tomasevic et al., 2005; Petroff, 2007; Rodriguez et al., 2012; Saebo et al., 2012). Likewise

their mobility, transport and concentration depend of the season of the year and for the wind

direction (Cicek and Koparal, 2004; Anici'ca et al., 2010; Tlustos et al., 2007).

Air pollution studies have been limited by high costs of the monitoring, its maintenance and

the difficulties in carrying out long time sampling in broader areas. This is the reason why

our focus has been drawn to the use of indirect monitoring methods, which are based on the

response to stress of the organisms (Anze et al., 2007). Trees act as biological filters

catching air particles and play an important role in reducing the amount of fine particles

which have been found to be associated with the presence of heavy metals (Tomasevic et

al., 2005). Particulate matter, aerosols and heavy metals in soil and vegetation have

influenced their biochemical behavior by affecting their enzyme systems and consequently

their metabolic processes (Baycu et al., 2005; Van Assche et al., 1988).



Biomonitoring of air quality using plants to detect the effects of pollution has been widely

used in the last decades in countries such as Serbia, China, Mexico and several countries

in Europe as an excellent alternative that reduces costs and effectively correlates to the

response of living organisms (Anicic et al., 2010; Li-qiang 2004, Rodriguez et al., 2012;

Sawidis et al., 2011; Shi et al., 2009, Zhang et al., 2007; Liu et al., 2006)

The main route of absorption of metals present in the atmosphere into trees, is through the

surface of the leaves, (Espinosa, 2007, referencing Olowoyo et al., 2010). The effects in

higher plants depends on the ligands and the solubility of the particles deposited on the

leaves, the concentration and bioaccumulation of the elements (Castañe et al., 2003;

Callahan et al., 2006; Chaoui et al., 2005). When plants are exposed to environmental

pollution, UV radiation, excess water, toxic chemical substances such as heavy metals,

reactive oxygen species (ROS) are produced in the cell. The most important ones are

superoxide anion (O2-), hydrogen peroxide (H2O2), hydroxyl radical (OH-) and peroxynitrite

(ONOO.), which can attack biomolecules such as nucleic acids, proteins and lipids (Feng-

Qin et al., 2006; Navarro-Aviñó et al., 2007). The cell response depends on the stress level

and the range of activation of antioxidant defense mechanisms, when the antioxidant

capacity of organisms is exceeded oxidative stress is produced and its associated damage

occurs. There are two types of antioxidants: enzymatic, consisting of enzymes such as

superoxide dismutase (SOD), catalases or peroxidases and non-enzymatic such as

glutathione, chlorophyll and carotene (Philosoph-Hadas et al., 1994).

The purpose of this study was to evaluate two tree species: Ligustrum sp. and Juniperus sp.

as bioindicators of metal pollution in the atmosphere of ZMVT and their association between

oxidative stress biomarkers and the levels of metals on the dry deposit.



2. Materials and methods

The study was conducted in tjhe Metropolitan Area of the Toluca Valley (ZMVT), State of

Mexico, Mexico. Includes 22 municipalities, second place most populated city in Mexico with

2,166,024 inhabitants (GEM, 2010). It has an area of 1208.55 km2, located at an altitude of

2660 masl. The population has grown rapidly, especially after the sixties when was 270.985

inhabitants, the town went into a major economic development due to increasing investment

in the industrial sector and the production activities. The growing population have triggered

an increase in public and private transportation, resulting in higher fuel consumption and

therefore, in air quality degradation.

For the selection of the sampling sites following factors were considered: wind direction,

population density and areas most affected by anthropogenic pollution (industrial and

commercial activities and vehicular traffic), and the kind of species.

Sampling were carried out during the winter season (December 2012) and the dry season

(May 2013).

A total of 25 sampling sites belonging to the 22 municipalities were chosen and classified

into 3 categories under the criteria of the Regional Urban Development (GEM, 2005).

From the total of 25 sampling sites, 17 sites correspond to Urban (SU) located in places with

high traffic flow or industrial area: Alameda (SU1), Reforma (SU2), Tollocan (SU3), Izcali

Toluca (SU4), CU (SU5), Casa Blanca (SU6), Zinacantepec (SU7), Los Sauces (SU8),

Hipico (SU9), La Mora (SU10), La Pilita (SU11), San Pedro (SU12), Cacalomacan (SU13),

Santa Cruz (SU14), San Felipe (SU15), Mexicalcingo (SU16), PIT 2000 (SU17)), 6

transitional sites, located in residential areas (ST) that are not exposed to high traffic flow;

Tlachaloya (ST1), Allende (ST2), Temoaya Sur (ST3), S. M. Ocoyoacac (ST4), Almoloya



(ST5), Nicolas Peralta (ST6) and 2 protected areas (PE) that were considered as a reference

for not being exposed to anthropogenic stress; Cacalomacán (PE1) and Zacango (PE2).

Their coordinates were found between a north latitude range of 19° 11'57.5 " and 19°28'33.7"

and a west longitude between 99°45'18.1’’ and 99°29'02.8’’, Figure 1.

Figure 1. Sampling sites in ZMVT. Own adequate elaboration of GEM 2012.

2.2 Tree Species

The species selected were Ligustrum sp., belongs to the oleaceae family, with 6-8 m of high,

evergreen, with broadleaf, native to China, Korea and Japan and Juniperus sp. of 10 to 20

m of high, thick branches with round lenticels, it has a well formed straight cylindrical shaft

with buttress roots, (Moráles and Herrera.2009).



In each sampling site, 10 specimens of each species were randomly selected taking only

into account that the specimens had a similar development. Leaf samples were taken at a

height between 1.5 to 2.5 m (Tlustos et al., 2007). The leaves were mixed and a composite

sample of 1600 g was taken from each site. The samples were placed in paper bags in

coolers to be transported to the laboratory of ININ for metal quantification of leaves dry

deposition and tissue and to the laboratory of Pharmacy, Faculty of Chemistry, UAEM for

biomarkers determination.

2.3. Quantification of heavy metals

2.3.1. Metals in tissue

The concentration of metals in tissue was determined using the technique of Fluorescence

spectrometry X-ray in total reflation (TXRF) (Caballero-Segura, et al., 2014).

Sample preparation

The digestion process consists of two stages: (1) a sample of leaves weighing 0.3 g was

taken and 4 ml of HNO3 and 1 ml of HCl were added; (2) 1.5 ml of H2O2 was added, then

was sealed in a PTFE vessel and was digested in a ‘CEM-Mars-X’ microwave oven at 1200

W and increasing the temperature to 200°C at 20 min (1241 kPa) including 15 min of

maintenance time. The digested sample was centrifuged for 5 min at 80 rpm. The sample

digested was transferred into a volumetric flask of 10 ml, the volume was completed with

deionised water. 100 μL of Ga standard solution (Merck) of 10 μg/ml was added as internal

standard to 1 mL of the digested samples. After mixed was deposited 20 μL in a silicon



quartz glass holder and dried under infrared light. Supra pure grade quality chemicals were

used.

2.3.1.2. TXRF Analysis

The analysis was realized in an Ital Structures TX-2000 equipment under the conditions

descrited by Caballero-Segura, et al., 2014. EDXRF32-Ital Structures program was used for

the spectra analysis, the metal concentration and detections limits using the sensibility

method as internal estándar. As analytical quality control certified reference material was

analyzed. This is a multielement technic that can analyze all the elements present in the

sample, but the analysis focused on Mn, Fe, Ni, Cu, Zn and Pb.

2.3.2. Metals in dry deposit

The metals in dry deposit were determined using the technique of Fluorescence

spectrometry X-ray of energy dispersive using a X-ray fluorescence spectrometry (EDXRF)

according Ávila et al., 2011. The samples were analyzed by triplicate with a Si–Li detector

with an integrated amplifier and 185 eV (FWHM) at 5.9 keV resolution. The areas of each of

the elements were obtained by AXIL software, while metal concentration was determined by

SAX software by using a Compton correction. K, Ca, Ti, Mn, Fe, Ni, Cu, Zn, Ga and Pb were

determined by using a standard calibration curve.

2.4. Bioacumulation of metals in the two species of trees

Determination of leaf area

The leaves were placed arranging them in a frame of 1 m2 and photographed with a SONY

DSC-R1 digital camera. The image was processed in order to calculate the leaf area using



the System of Geographic Information Gis Arc View version 3.3, which discriminates the

space occupied by the leaves eliminating gaps, obtaining only the area occupied by the

foliage. Knowing leaf area and dimensions of the specimens such as height, shaft diameter,

leaf area per sampling site was estimated using the formulae for calculating the area of a

triangle and a cylinder. Leaves were weighed using an Ohaus grain scale in order to

determine the amount of particles retained per weight.

Knowing the leaves weight in 1 m2 and the area occupied by the foliage of each tree the

amount of metals deposited on leaves per weight can be determined.

To calculate the fraction of the quantified bioaccumulate metals (BF), the concentration

deposited (CD) on the leaf area specific for each species and the concentration found in the

leaf tissue (CT) was taken into account, Equation 1.

BF = CT * 100) / CD Eq. 1

2.4.2. Effect of metals accumulated on the leaves of the trees.

Supernatant preparation

It was taken 500 mg of leaves sample and homogenized in 5 mL of buffer solution pH 7.0

(0.1 M K3PO4.nH2O, 0.1 mM EDTA, 5% polivinilpirrolidone). It was centrifuged at 13,500

rpm to 4 ° C for 30 min, the supernatant was frozen until used.

Proteins

The analysis was performed according to the Bradford Method (Bradford, 1976). 5 mL

Bradford reagent (0.01% cromassie blue, 4.7% ethanol and 8.5% of phosphoric acid) were



added to 1 mL enzyme extract supernatant and mixed, after 5 min the absorbance was

measured at 595 nm in a Thermo Genesis UV-Vis spectrophotometer. The protein

concentration was calculated with a standard curve prepared with a solution of bovine serum

albumin.

Chlorophyll and Carotenes

The pigments were analyzed according to Liu et al., 2007. 0.5 g of tissue was homogenized

in 10 mL of acetone 80%, it placed into test tubes and allowed to sit overnight for complete

extraction. It was centrifuged at 3000 rpm for 10 min, an aliquot of 2 mL was diluted to 10

mL with acetone 80%. The chlorophyll "a" and "b" and carotenes were determined at 663

nm, 645 nm and 470 nm respectively. The concentrations were calculated with the equations

2, 3 and 4.

Ca = (12.7 x A663 – 2.69 x A645) (V/(1000 x W)) Eq. 2

Cb = (22.9 x A645 – 4.68 x A663) (V/(1000 x W)) Eq. 3

Carotenes = (1000 A470 - 2.86 Ca - 129.2Cb) / 245 Eq. 4

Where

Ca = mg chlorophyll a/g tissue

Cb = g chlorophyll b/g tissue

V = volume of the extract (mL)

W = Fresh weight (g of tissue)



Lipid peroxidation

The thiobarbituric acid (TBA) method was used (Buege and Aust, 1978). 0.5 mL of the

supernatant was taken, was added 2 mL of an acid solution (trichloroacetic acid 15% TBA

0.375% and HCl 0.25 N). The samples were heated in a boiling water bath for 15 min, cooled

and centrifuged at 3000 rpm for 5 min. The supernatant was removed and its absorbance

was measured at 532 nm. The results were expressed as nmoles of TBARS produced per

mg protein and were calculated from the molar extinction coefficient (ε) of malondialdehyde:

1.56 x 105 cm-1/M-1.

2.4.2.5. Determination of the activity of antioxidant enzymes

Catalase (CAT)

CAT was determined according to Hernandez, 2005. 20 uL of supernatant obtained from

500 mL of plant extract and 4 mL of Phosphate Buffered Saline (PBS) were sonicated for

15 minutes, after that centrifuged at 9000 rpm for 15 min. To 1 mL isolation buffer was added

(0.3 M sucrose, 1.0 mM HEPES, 5 mM KH2PO4, pH adjusted to 7.4). Then 0.2 mL of 20

mM H2O2 was added, the absorbance was read immediately and after 60 seconds at 240

nm. The enzyme activity was calculated with equation 6.

CAT Activity = (Abs 0´´ - Abs 60´´)(VRXFd) / (VMVM ε240nm)(g) Eq. 6

Where:

VRx = reaction volume

VM = volume of sample



Fd = dilution factor

ε240nm = 0.043 mM -1 cm -1, molar extinction coefficient of H2O2 at 240 nm

g = grams of sample

Ascorbate peroxidase (APx)

The method of Porcel, 2006 was used, which is based on the spectrophotometric

measurement at 290 nm of ascorbate oxidation with H2O2. The reaction was carried out at

25 ° C in a reaction volume of 1 mL consisting of 50 mM Hepes-NaOH buffer, pH 7.6 with

0.2 mM ascorbate, 100 µL of sample and 0.3 mM H2O2. The reaction was started by adding

H2O2 and the decrease of the absorbance was followed for 3 minutes. Blanks containing

only sample and ascorbate buffer. Enzyme activity in nmol ascorbic acid oxidized/min was

calculated using a molar extinction coefficient (ε290) for ascorbic acid 2.8 mM-1cm-1,

equation 7.

APx Activity = (Abs 0´´ - Abs 60´´)(VRX)(Fd) / (VM)( ε290nm)(g) Eq. 7

where:

VRx = reaction volume

VM = volume of sample

Fd = dilution factor

ε290nm = 3.6 mM -1 cm -1, molar extinction coefficient of H2O2 at 290 nm

g = grams of sample



Guaiacol peroxidase (GPx)

The GPx activity was determined through the oxidation of guaiacol present in the reaction

mixture (0.1 M potassium phosphate buffer pH 6.8, 56 mM guaiacol, 0.2 mM H2O2 and

enzyme). 50 uL of supernatant was taken and 350 uL of the reaction mixture for 15 seconds.

After a period of 5 min, the absorbance at 470 nm was determined. The reaction mixture

was used as blank. The enzyme activity was calculated with equation 8.

GPx Activity = (Abs 0´´ - Abs 5´) / (ε470nm)(g) Eq. 8

ε470nm = 26.6 mM -1 cm -1, molar extinction coefficient of H2O2 at 470 nm (Acevedo,

2009).

g = grams of sample

Superoxide dismutase (SOD)

The method of Misra and Friedrich (1972) was followed. Aliquots of 500 uL of the

homogenate obtained from 500 µL plant extract were mixed with 4 mL of distilled water,

sonicated for 15 min and 2.5 ml of ethanol / chloroform 1: 1 were added, shaken and

centrifuged at 3000 rpm for 15 min. 150 µL of homogenate and 750 µL of carbonate buffer

pH 10.2 (50 mM sodium bicarbonate, 0.1 mM EDTA) were placed in a quartz cuvette, 600

µl of substrate (30 mM adrenaline in 0.05% acetic acid) were immediately added. The initial



measurement was recorded at 30 seconds and at 5 minutes to 480 nm. The enzyme activity

was calculated using a standard curve.

3. Results

The species of Ligustrum sp had an average height of 4.5 ± 2.13 m and a width canopy of

4.9 ± 2.2 m, Juniperus sp had an average height of 11.5 ± 0.5 m and a width canopy of 8.8

± 2.1 m.

3.1. Metal concentration in dry deposit

In the table 1 summarizes the averages and concentration ranges of the metals present in

the leaves´deposit of Ligustrum sp species, by sampling area. The highest accumulation of

metals (Cu + Zn + Pb) were found at the sites located in the Urban zone (589.13 mg / g)>

Transition zone (448.0 mg / g)> Protected Area (303.0 ug / g) in the following order: Zn>

Cu> Pb. Manganese (Mn) was the metal found with highest concentration in the deposits

(ST> SU> PE) it showed a 2.6 times higher concentration in the first sampling period,

compared to the second. There were no significant differences between the levels of Zn, Cu

and Pb in the sampling periods of the same area (ANOVA 95%).



Table 1. Average concentration (AC), intervals and Biocumulation factor (BF) of Pb, Mn, Cu,

Fe and Zn, determined in dry deposition and tissue in leaves of Ligustrum sp at the ZMVT

in the first sampling period (Cold-Dry) and second sampling period (Hot-Dry).

1rst Cold-Dry 2nd Hot-Dry

AC and intervals (µg/g) BF

(%)

AC and intervals (µg/g) BF

Deposit Tissue Deposit Tissue

Urban Zone

Pb

87.71

(44-215)

<LD w/v 92.9

(44-342)

<LD w/v

Mn

493.6

(320-1778)

35.3

(20.5-75.3)

8.3

380.8

(251-494)

36.3

(14.24-119.5)

9.6

Zn

400.18

(195-844)

26.6

(15.6-54.3)

7.2

296.5

(195-616)

24.6

(16.3-36.5)

8.8

Cu

101.3

(43-342)

4.9

(2.2-10.0)

5.0 125.0

(43-642)

4.6

(2.3-7.4)

7.2

Fe w/v 60.2

(48.14-77.69)

w/v 68.7

(55.30-87.81)

w/v

Transition Zone

Pb 60.0 <LD w/v 53.2 <LD w/v

Mn 950

(457-1819)

34.5

(27.9-40.5)

4.5 371.2 32.1

(25.52-41.52)

9.1

Zn

331.5

(239-407)

19.7

(14.5-26.4)

6.0

231.7

21.4

(14.89-29.12)

9.9



Cu

57.0

(63-234)

3.9

(2.2-5.1)

4.2

63 4.3

(2.56-5.46)

5.0

Fe w/v 48.8

(40.3-56.5)

w/v 60.9

(54.7-65.7)

w/v

Protected Area

Pb 45.0 <LD w/v 22.0 <LD w/v

Mn 488.0 40.7 8.3 405.0 26.5 6.5

Zn 203.0 26.9 13.3 158.0 31.3 19.8

Cu 55.0 5.0 9.0 39.0 2.3 5.8

Fe w/v 66.35 w/v 66.4 w/v

w/v=without value

The Mn emission sources can be natural and anthropogenic. In the dry cold season, the

fires and campfires increase and produce coal ash containing metals which are carried by

the wind.

The type of anthropogenic atmospheric particles differs depending on the kind of industries

located in certain areas of the city and as shown in this study the content on the dry

deposition is also influenced by nearby sources the wind rose, Aragon et al. (2006). This

coupled with the dispersion of air pollutants in the ZMVT is influenced by the geographical

position on the national territory, during Winter (dry-cold season) the weather systems which

predomínate with direction from south to north are the movement of cold fronts and polar air



masses; when these phenomena are intense, the ZMVT is affected with cyclonic systems

(stable and dry weather) that can generate inversions, causing unfavorable conditions for

the dispersion of pollutants present in the atmosphere (GEM, 2012). The wind changes

direction is the dry-hot season where winds traveling from southeast to northwest, figure 2.

The SU12 point is northeast of point SU3 is strongly influenced by the direction of winds

carrying pollutants from SU3 point which is located in the industrial area and roads of the

area with largest transit.

Figure 2. Dynamics of the winds in ZMVT, GEM 2012

Dendrograms in figures 2a and 2b show great similarity in the metal content in sites

belonging to the same area. Of the 17 sites from SU sampling, SU1, SU2, SU4, SU6 and

SU9 are above average. These sites are located in the middle of the study area,

characterized by high population density and traffic flow and for having the highest

concentrations. In SU3 (Tollocan), the results show high metal content in both sampling



periods (170% and 342%), compared to the average of the remaining points of the urban

area. The reference sites also showed similarity

a. b.

Figure 3. Metals deposited in Ligustrum sp.

a. First sampling (December 2012) b. Second sampling, (May 2013)

3.1 Concentration of absorbed metals in leaves

The metal that was found in highest concentration in leafs tissue of the species of Ligustrum

sp was Iron (Fe), even though it was not one of the elements of consideration in all areas

and in both sampling periods, Table 1. The analysis t-student showed a significant difference

(p <0.001 and ὰ<0.05) between sampling periods, being the concentration in the second

period 12% higher for Fe and 6% for Zn. For Cupper (Cu), the concentration was 19% higher

in the first period sampling period compared to the second and Mn 15% higher in the first

period.

The mineral content of plant tissues is variable, depending on the type of plant, the prevailing

weather conditions during the growing period, the chemical composition of the environment



and the wind direction. As reported Prause et al. (2006), the Fe concentrations tend to

increase during the spring season compared to winter. In soils are soluble organic Fe

compounds which help to mantain the supply of this micronutrient in plants, particularly

chelates, which have a pH-dependent stability of the soil solution and found that the

concentrations decrease during the winter season, coinciding with the period of lower rainfall

and increased leaf abscission of the tree species, in the present study significant differences

with respect to sampling periods for this metal are found.

Cu tends to bind to organic matter that also affect the bioavailability of Zn and Mg (Castilho

et al., 1993) which can be seen in SU3 point where the highest concentration of Cu (743

mg/g) was found in dry deposit and Zn bioacumulation was 6%, the concentration of this

element deposited was 800 mg/kg, compared to the rest of the sample points which showed

a mean of 329 mg/kg.

The SU had average concentrations of Cu of 4.72 mg/g, Fe of 64.47 mg/g, in ST from 4.08

mg/g for Cu to 54.83 mg/g for Fe and PE from 5.38 mg/g for Cu to 66.35 mg g for Fe, with

intermediate concentrations of Mn (35.8 mg/g)> Zn (25.58 mg/g) and non detectable

concentrations of Pb. Fe> Mn> Zn> Cu> Pb.

In the case of the species Juniperus sp no accumulation factor determined but Pb was found

absorbed in the different sampling areas; in average concentrations of 1.13 mg / g in PE,

1.12 mg / g in ST and 1.32 mg / g in SU. Similar to the Ligustrum sp, the Juniperus sp

showed higher concentrations of Fe compared with other metals in the SU which was 340.21

mg/g, 4% higher than ST and 2% higher than PE, the average concentrations of metals for

both sampling periods, urban areas reported concentrations from 1.32 mg/g of Pb to 340.21

mg Pb/g of Fe in transition zones, from 1.12 mg/g of Pb to 325.75 mg Pb/g of Fe and



protected areas from 1.15 mg/g of Pb to 278.57 mg/g of Fe, with intermediate concentrations

of Mn> Zn> Ti> Cu. This specie showed higher concentrations of absorbed metals/g tissue.

The mineral content of plant tissue in Ligustrum sp did not show significant difference

between the concentration of metals in tissue and the sampling period at different sites.

3.3. Biocumulation of metals in both species

The average area of the sheet to the species of Juniperus sp was 134.22 m2 and 43 m2

Ligustrum sp. Pearson correlation to determine the association between the concentration

of the absorbed metal bioaccumulation and fraction showed a significant correlation (p =

0.01) only for Fe it found in Ligustrum sp in the first sampling, table 1.The metal with greatest

averaged BF was Zn in PE, 13.2% for the first period and 19.8% for the second. The lowest

average BF corresponded to Cu in ST with 3.96% in the first period and 4.96% for the

second.

To determine the influence of leaf area on BF, a Pearson´s correlation was performed,

obtaining no significant association in both species neither sampling periods. Also showed

that the BF of Mn and Zn had a correlation with an R2 = 0.685 and p = 0.000 for the first

sampling and R2 = 0.434 and p = 0.034 for the second period. The good correlation between

Zn and Mn can be explained in terms of both elements are complexed with organic

compounds, such as glutathione phytochelatins or within tissues of the species studied.

Generally there are large differences in the bioavailability (BA) of metals in plants. Some

studies have reported low values of bioconcentration for Co, Pb, Cr and Ni, metals with low

solubility like Cr, Ag, Hg, or Sn have very low BA (Memon et al., 2008). This is the case of



Pb in spite of being present in deposit was not found in appreciable amounts in tissues of

both species.

The waxy cuticle of Ligustrum's leaves, allow quick removal of particles by rain or wind. In

contrast, the roughness of the surface of Juniperus’s leaves have greater retention of

particulated material, in addition to the presence of resins or honey deposits dew from

aphids, which make the sticky surface can enhance particle capture air. This could be the

reason for the high concentrations of lead found on the same areas.

The BA of metals depends of factors like as pH, can be more BA at lower pH (Navarro et

al., 2006). The pH of the washing solutions of the leaves was of 5.4 to 6.9, in 90% of the

sampled points, the BA of the metals present in the deposit was favored for the presence of

moisture in the leaves due to transpiration of the plant and previous studies have reported

pH 5.5 in rainwater in ZMVT (Caballero, 2009). The metals that showed higher bioavailability

in SU were Mn> Zn> Cu. In the case of PE and ST the BA of Zn was higher.

3.4. Effect of the absorbed metals in the leaves of Ligustrum sp and Juniperus sp.

It was performer the analysis of the sites with highest concentration of metals. The results

of the biomarkers were compared to values obtained from the Protected Areas, Table 2.

Table 2. Metals in tissue and enzymatic activities in sites with the highest concentrations in

Ligustrum sp and Juniperus sp. tissue.

Spec

ie

Biomar

kers

SU1 SU2 SU3 SU5 SU9 SU10 SU11 PE

Lsp Prot. 0.83 0.72 1.58 1.19 0.63 0.83 1.15 0.95



Jsp 0.47 1.02 1.18 0.55 0.39 0.48 0.31 0.87

Lsp

Jsp

Car./

chlor.

0.027

0.031

0.030

0.0612

0.050

0.0613

0.0467

0.0664

0.041

0.076

0.0313

0.059

0.048

0.15

0.0399

0.058

Lsp

Jsp

LPOx 32.6

10.47

46.9

28.5

30.9

28.6

38.8

61.0

56.5

89.9

48.6

50.8

44.2

133.1

41.7

36.8

Lsp

Jsp

CAT

97.76

56.00

38.86

81.42

27.96

28.08

26.71

76.00

140.86

176.70

98.67

186.85

32.56

135.55

75.21

69.13

Lsp

Jsp

APx 163.9

736.1

351.2

181.9

226.2

190

303.7

466.7

658.0

642.5

541

458.3

228.8

980

337

370

Lsp

Jsp

GPx 12.2

29.3

15.4

8.7

12.4

11.28

11.6

35.3

22.6

35.8

12

22

7.8

62

7.3

19

Lsp

Jsp

SOD 26.4

0.93

65.9

1.3

6.6

0.78

68.3

13.50

18.0

1.1

33

0.67

11.6

42

12.

0.4

Lsp

Jsp

Cu 6.22

7.88

2.25

5.63

10.01

9.90

4.53

7.99

3.68

5.51

4.25

4.96

2.84

4.98

4.95

3.85

Lsp

Jsp

Zn 45.74

30.17

51.37

21.94

54.30

26.70

23.84

23.92

21.20

21.78

24.43

21.47

16.31

23.44

26.90

14.86

Lsp

Jsp

Mn 25.08

18.47

23.71

45.85

50.37

15.47

44.30

24.35

25.12

25.05

23.49

24.70

20.51

30.96

40.67

17.70

Lsp

Jsp

Fe 70.75

324.74

77.69

311.93

60.50

377.35

60.28

329.04

61.74

338.11

73.95

347.17

55.90

317.60

66.35

212.59

Lsp Pb ND

Jsp Pb 1.79 1.39 3.54 1.05 1.40 1.38 1.35 0.98

Protein (mg), Chlorophylls (mg/g tissue), Carotene (mg/g of tissue), lipid peroxidation

(nM/mg protein/g tissue), CAT (mM H2O2/mg protein /g tissue) APx (mU/mg protein/g of



tissue), GPx (mU/mg protein/g of tissue), SOD (mU/g protein/g tissue), metals (µg/g tissue),

Ligustrum sp. (Lsp), Juniperus sp. (Jsp).

a. b.

c. d.

Figure 4. Analysis of main components for Ligustrum sp.

a. Dry-cold season Ligustrum sp. b. Dry-warm season Ligustrum sp.

c. Dry-cold season Juniperus sp. d. Dry-warm season Juniperus sp.

According of the results in main components analysis, in the first sampling period can be

distinguished that Juniperus sp has a greater resilience to stressors compared to the

vulnerability that showed in the second sampling. As observed in Figures 4c and 4d there

was a greater effect on the biomarkers determined, mainly in the content of chlorophyll. In



this season the plants have most flowering and seeds developing so the photosynthesis is

a determining factor.

The metals that showed a strong correlation with the effect in the chlorophyll were the

bivalents, which could replace the Mg center, as can be observed the increase of Mn in the

SU17 point affected the ratio of chlorophyll a/b especially in the second sampling period. An

increase in the ratio of carot./chlor. reflects stress which the trees were subject, which was

1.2 times higher than the found at PE sites of SU (SU 4, SU 11, SU14, SU5 and ST4) in the

first period and 1.6 times higher for the second period. Olivares (2003) investigated the effect

of Pb on Tithonia diversifolia that grew up at roadside, exposed to automobile emissions.

The author found that the highest contents of Pb and Ni in leaves decreased chlorophyll

content. The present study has check that the photosynthetic processes were affected

depending on seasonal, the climatic conditions of the site, the tree species studied and micro

environments conditions of the leaves that could influence to the BA of the metals.

The protein content decreased by 50% and damage of the cells membranes was manifested

by increased lipid peroxidation until 50% in SU sites (SU1, SU2, SU10, SU17) for the species

of Ligustrum sp, where the concentration of Fe and Zn were 30% higher than the PE. In

Juniperus showed the same trendency but increased three times more than the PE, with the

same difference in the content of these metals.

The activity enzymatic of APx, SOD, GPx and CAT was increased of different form for each

metal. The Pearson´s correlation analysis showed that Fe induced a greater response in the

biomarkers measured in both species, Table 3.

There was an enzymatic induction of SOD regarding the PE. In the first period was 5.5 times

higher in the sites SU2 and SU5 for Ligustrum sp and in the second period in the SU11 was



of 10 times higher for Juniperus sp. The high content of Fe in leaves from SU1, SU10 SU9,

produced damage in the protein levels, high lipid peroxidation and there was induction in the

enzymatic activity of the APx, SOD, GPx and CAT until of 150% compared to PE in

Juniperus sp.

Table 3. Pearson´s correlation for Fe in Ligustrum sp and Juniperus sp

Carot./chlor. proteins SOD LPx GPx

Fist sampling

Ligustrum sp. p

R2

0.001

0.827

0.012

-0.698

0.040

0.599

s/c

Juniperus sp. p

R2

s/c 0.050

-0.554

0.050

-0.775

Second sampling

Ligustrum sp. p

R2

s/c 0.047

0.519

s/c

In relationship with the Cu only in the site SU3 had high concentrations in both samplings in

tissues of Ligustrum sp (642 for the first period and 824 mg/g for the second). It found a

significative correlation between concentration and enzymatic activity of SOD, R2 = 0.834

and p= 0.099. This area is characterized by high traffic flow and be close to an industrial

area.



The point SU1 had high concentration of Zn in Ligustrum tissue, 1.7 higher than content in

the reference point, where it found an induction of twice of SOD compared to PE and 20%

less protein content. The Mn was 1.5 to 2.5 times highest compared to PE in the urban sites

2, 11 and 17 where CAT and APx showed less activity, higher lipid peroxidation and an

increased GPX (Table 2). These effects are twice more visible in Juniperus sp than

Ligustrum sp.

4. Conclusions

This research has been able to classify areas according to different pollution levels. It found

that the zones with more contamination problems were those exposed to vehicle and

industrial emissions.

In Urban Areas such as SU1, SU2, SU3, SU17, was found higher levels of lipid peroxidation,

chlorophyll/carotenes ratio and a greater effect on the activity of the enzymes catalase and

ascorbate peroxidase, indicators of stress.

The specie of Juniperus sp was more sensitive than the Ligustrum sp, reflected in a greater

effect in the enzymatic activities of CAT, SOD and APx, in proteins production and increased

lipid peroxidation.

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67, 44–50.



10.0 CONCLUSIONES

La presente investigación ha podido clasificar a las zonas de acuerdo a los diferentes

niveles de exposición a contaminantes encontrando que en las zonas más expuestas a flujo

vehicular o emisión industrial presentan mayor respuesta a los biomarcadores medidos. Las

muestras tomadas de áreas protegidas se consideraron como referencia.

En las Zonas Urbanas tales como Tollocan, Alameda, Reforma y Parque y PIT 2000, se

encontraron mayores niveles de lipoperoxidación, relación de clorofilas y un mayor efecto

en la actividad de las enzimas Catalasa y Ascorbato Peroxidasa lo cual es un indicador de

estrés.

La especie de Juniperus sp resultó más sensible que la del Ligustrum sp, reflejándose en

mayor efecto en cuanto a los comportamientos que presentaron biomarcadores tales como

CAT, APx y SOD, así como mostrar un mayor daño a proteínas y mayor lipoperoxidación.

11.0 RECOMENDACIONES

Ya habiendo determinado la especie con mayor sensibilidad se recomienda estudiar a fondo

los niveles basales normales de metales en su tejido y en base a ello determinar la

concentración enriquecida para los metales.

Se recomienda realizar el análisis especifico de enzimas realacionadas intimamente con la

actividad de determinados metales, tales como: alcohol deshidrogenasa, anhidrasa



carbónica las cuales facilitan la transferencia de CO2 / HCO3 para la fijación fotosintética de

CO2 y la polimesterasa RNA las cuales están íntimamente relacionadas con la función de

Zinc y otras que son activadas por éste metal en el metabolismo de carbohidratos,

particularmente en las hojas.



12.0 REFERENCIAS

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