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Universidad Autónoma de Sinaloa Facultad de Ciencias Químico Biológicas
Doctorado en Ciencias Biomédicas
“Efecto del tratamiento con metformina y 4-hidroxichalcona en ratas
Wistar macho con hígado graso no alcohólico en un modelo de obesidad y
resistencia a insulina”
TESIS
Que presenta
M. en C. Selene de Jesús Acosta Cota
Como requisito para obtener el grado de
DOCTORA EN CIENCIAS BIOMÉDICAS
Directores
Dr. Lorenzo Ulises Osuna Martínez
Dra. Elsa Maribel Aguilar Medina
Culiacán de Rosales, Sinaloa, México; a 1 de julio de 2019.
II
PRESENTACIÓN
El presente trabajo de investigación fue realizado en la “Unidad de Servicios
Farmacéuticos”, “Laboratorio de Inmunología” y “Laboratorio de Química de Productos
Naturales” pertenecientes a la Facultad de Ciencias Químico Biológicas de la Universidad
Autónoma de Sinaloa, en Culiacán, Sinaloa.
III
DEDICATORIAS
A Manuel de Jesús Acosta y Paulina Cota Arreola.
Mis padres, mis mejores amigos, los más leales, sinceros y desinteresados.
Mis maestros de vida, mis pilares, los que siempre me brindan su amor y apoyo.
No sería quien soy sin ustedes. Los amo.
A Manuel Eduardo Acosta Cota.
Mi hermanito, mi compañero de juegos de la infancia y de vida.
Hoy mi médico favorito de cabecera. Muy orgullosa de ti.
Sabes que siempre podrás contar conmigo aunque estés lejos.
A José Carlos Castro.
Mi prometido, amigo y amor de mi vida.
Quien me ayuda a ver la vida de una forma más relajada y alegre.
IV
AGRADECIMIENTOS
A la “Universidad Autónoma de Sinaloa” por ser mi alma mater; en especial al
“Doctorado en Ciencias Biomédicas” de la Facultad de Ciencias Químico Biológicas, por
aceptarme en su programa y brindarme la capacitación necesaria para poder culminar este
proyecto.
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) por el apoyo otorgado a través
de la beca de doctorado.
Al Programa de Fomento y Apoyo a Proyecto de Investigación de la UAS, por el
financiamiento otorgado para la realización de este proyecto (PROFAPI2015/201).
A mis directores de tesis Dr. Lorenzo Ulises Osuna Martínez y Dra. Elsa Maribel Aguilar
Medina, por haberme aceptado como su alumna, por sus consejos, comentarios y correcciones,
por compartir sus conocimientos, por el apoyo otorgado para la realización de este proyecto;
pero sobre todo por su valiosa dirección en este trabajo.
A los integrantes de mi comité evaluador: Dr. Hector Samuel López Moreno, Dr. José
Guadalupe Rendón Maldonado, Dr. Julio Montes Ávila y Dr. Rosalio Ramos Payán, por sus
acertados comentarios y críticas realizadas que contribuyeron a mejorar el presente trabajo, por
su disposición e interés, por corregir mis errores y también por valorar mis aciertos. De manera
especial, agradezco al Dr. Julio y Dr. Rosalio quienes además me apoyaron en cuestiones
metodológicas y con financiamiento para la realización de este proyecto.
Un agradecimiento especial a la Dra. Araceli Sánchez López y Dr. David Centurión
Pacheco quienes a pesar de que no me fue posible realizar el doctorado con ellos, siempre han
estado al pendiente de mí, brindándome sus consejos y apoyo tanto moral como académico, así
V
como sus conocimientos; y gracias a ellos fue posible la donación de los animales de
experimentación para la realización de este proyecto, por parte del CINVESTAV Sede Sur.
Al Dr. Elvic Noguera por su valioso apoyo y enseñanza de las metodologías para la
realización e interpretación de las histologías de tejido hepático.
A mis compañeros y amigos del laboratorio de Inmunología. Algunos de ellos estuvieron
al inicio, otros al final y otros durante todo el doctorado, pero todos en su momento permitieron
que esto fuera más llevadero y alegre, además de aprender de ellos de manera directa o indirecta.
Un agradecimiento especial a Geovanni, Erik y Mariana, quienes en diferentes aspectos me
llegaron a apoyar con cuestiones metodológicas (de biología molecular e histologías) en el
proyecto, y me compartieron sus conocimientos, permitiendo que pudieran realizarse de una
mejor manera éste proyecto.
A mis compañeros y amigos de la Unidad de Servicios Farmacéuticos: Lumadhar, Karen,
Antonio, Hernán, Grecia, Analy, Mónica, Carolina, Sneyder y Jesús, por hacer los días menos
cansados y más divertidos, por su tiempo invertido, comentarios y preguntas realizadas, sobre
todo en esos días de seminarios que a veces parecían interminables. En particular a Karen,
Antonio y Mónica quienes además me ayudaron en la parte técnica y metodológica de este
proyecto, y que en algunas ocasiones llegaron a sacrificar sus fines de semana.
A mis amigos más cercanos: Geovanna, Farah, Yareni, Denisse, Mónica, Analy, Carolina,
Mercedes, Lumadhar, y Geovanni, por escucharme, por brindarme sus consejos y en ocasiones
ser como mis psicólogos, pero sobre todo por su valiosa amistad que me ayuda a ser una mejor
persona cada día.
VI
ÍNDICE GENERAL
Página
ÍNDICE DE FIGURAS .......................................................................................................... XI
ÍNDICE DE CUADROS ...................................................................................................... XIV
I. RESUMEN ................................................................................................................... 1
II. ABSTRACT ................................................................................................................. 2
III. INTRODUCCIÓN ....................................................................................................... 3
IV. REVISIÓN DE LITERATURA ................................................................................. 5
4.1. El hígado ....................................................................................................................... 5
4.1.1. Unidad funcional y estructural ........................................................................... 5
4.1.2. Otros tipos de células en hígado .......................................................................... 7
4.1.3. Principales funciones ............................................................................................ 9
4.2. Hígado graso no alcohólico ....................................................................................... 10
4.2.1. Epidemiología de HGNA ................................................................................... 12
4.2.2. Factores de riesgo ............................................................................................... 13
4.2.3. Fisiopatología ...................................................................................................... 14
4.2.3.1. Progresión de EHNA a EHNAS................................................................... 15
4.2.3.2. Progresión de EHNAS a fibrosis .................................................................. 19
4.3. Correlación entre obesidad, RI e HGNA ................................................................ 23
4.3.1. Obesidad .................................................................................................................. 23
4.3.1.1. Definición de obesidad ...................................................................................... 23
4.3.1.3. Fisiopatología de obesidad ................................................................................ 24
4.3.2. Resistencia a insulina ............................................................................................. 26
4.3.2.1. Epidemiología de RI y DMT2 ........................................................................... 26
4.3.2.2. Fisiopatología de RI .......................................................................................... 27
4.3.3. Mecanismos de interacción entre obesidad, RI y enfermedad de HGNA ......... 28
4.4. Diagnóstico de HGNA y enfermedades asociadas .................................................. 36
4.4.1. Diagnóstico de obesidad ..................................................................................... 36
4.4.2. Diagnóstico de RI ............................................................................................... 36
4.4.3. Diagnóstico de HGNA ........................................................................................ 37
4.4.3.1. Exclusión de consumo significativo de alcohol ........................................... 37
VII
4.4.3.2. Análisis de laboratorio de rutina .................................................................. 38
4.4.3.3. Biomarcadores .............................................................................................. 38
4.4.3.4. Biopsia hepática ........................................................................................... 39
4.5. Alternativas farmacológicas para la enfermedad de HGNA................................. 39
4.5.1. Metformina ................................................................................................................ 41
4.5.2. Chalconas como potencial alternativa farmacológica ..................................... 42
4.5.2.1. Acción antioxidante...................................................................................... 42
4.5.2.2. Acción antiinflamatoria ................................................................................ 44
4.5.2.3. Acción antihipertensiva ................................................................................ 46
4.6. Antecedentes .............................................................................................................. 46
4.6.1. Efecto de la metformina en hígado graso ......................................................... 47
4.6.2. Toxicidad de 4-HC ............................................................................................. 48
4.6.3. Efectos farmacológicos de la 4-HC y análogos ................................................ 50
4.6.3.1. Acción antiparasitaria ................................................................................... 50
4.6.3.2. Acción antineoplásica .................................................................................. 50
4.6.3.3. Acción antioxidante y antiinflamatoria ........................................................ 51
4.6.3.4. Acción hepatoprotectora de hidroxichalconas ............................................. 53
V. JUSTIFICACIÓN ..................................................................................................... 57
VI. HIPÓTESIS ............................................................................................................... 58
VII. OBJETIVOS .............................................................................................................. 59
7.1. Objetivo general ........................................................................................................ 59
7.2. Objetivos específicos.................................................................................................. 59
VIII. MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................. 60
8.1. Tipo de estudio ........................................................................................................... 60
8.2. Síntesis de 4-HC ......................................................................................................... 60
8.3. Confirmación molecular a través de técnicas analíticas ........................................ 61
8.3.1. Cromatografía en capa fina ............................................................................... 61
8.3.2. Espectroscopía de infrarrojo ............................................................................. 61
8.3.3. Resonancia magnética nuclear .......................................................................... 61
8.4. Animales de experimentación................................................................................... 61
8.5. Protocolo experimental ............................................................................................. 62
8.6. Inducción de obesidad y RI ...................................................................................... 63
VIII
8.7. Determinación de consumo de alimento y masa corporal ..................................... 67
8.8. Evaluación de homeostasis de glucosa ..................................................................... 67
8.9. Determinación de tejido adiposo intraabdominal .................................................. 68
8.10. Evaluación de daño hepático .................................................................................... 68
8.10.1. Determinación de enzimas hepáticas ................................................................ 69
8.10.1.1. Determinación de FA sérica ......................................................................... 69
8.10.1.2. Determinación de AST y ALT séricas ......................................................... 69
8.11. Análisis histopatológico del hígado .......................................................................... 70
8.11.1. Preparación de tejido ......................................................................................... 70
8.11.2. Tinción de H&E de Mayer en tejido hepático ................................................. 70
8.11.3. Determinación del grado de HGNA ................................................................. 71
8.11.4. Tinción TM en tejido hepático .......................................................................... 72
8.11.5. Determinación del estadio de fibrosis ............................................................... 73
8.12. Determinación sérica de citocinas ............................................................................ 73
8.13. Análisis estadístico ..................................................................................................... 74
IX. RESULTADOS .......................................................................................................... 75
9.1. Síntesis y confirmación molecular de 4-HC ............................................................ 75
9.1.1. Síntesis de la 4-HC .............................................................................................. 75
9.1.2. Espectrometría de infrarrojo ............................................................................ 75
9.1.3. RMN-1H ............................................................................................................... 78
9.2. Estandarización de modelo animal de desarrollo de HGNA en ratas Wistar macho ……………………………………………………………………………………….78
9.2.1. Efecto del consumo de agua con sacarosa en consumo de alimento .............. 80
9.2.2. Efecto del consumo de sacarosa en peso corporal ........................................... 80
9.2.3. Efecto del consumo de sacarosa en tolerancia a la glucosa oral .................... 81
9.2.4. Efecto del consumo de sacarosa sobre porcentaje de peso del tejido hepático y adiposo .............................................................................................................. 86
9.2.5. Efecto del consumo de sacarosa sobre los niveles séricos de enzimas hepáticas …………………………………………………………………………………..88
9.2.6. Efecto del consumo de sacarosa sobre la morfología del tejido hepático ...... 91
9.2.7. Efecto del consumo de sacarosa sobre los cambios en la formación de colágeno en tejido hepático ................................................................................................ 95
9.2.8. Efecto del consumo de sacarosa en niveles séricos de citocinas ..................... 95
IX
9.3. Efecto del tratamiento con metformina y 4-HC en ratas sanas o con HGNA ..... 98
9.3.1. Efecto del tratamiento con metformina y 4-HC en ratas sanas o con HGNA sobre el consumo de alimento y peso corporal .............................................. 100
9.3.2. Efecto del tratamiento con metformina y 4-HC en ratas sanas o con HGNA sobre la tolerancia a la glucosa........................................................................ 105
9.3.3. Efecto del tratamiento con metformina y 4-HC en ratas sanas o con HGNA sobre el porcentaje de peso del tejido hepático y adiposo ............................ 111
9.3.4. Efecto del tratamiento con metformina y 4-HC en ratas sanas o con HGNA sobre la actividad de enzimas hepáticas ......................................................... 115
9.3.5. Efecto del tratamiento con metformina y 4-HC en ratas sanas o con HGNA sobre la morfología hepática ........................................................................... 119
9.3.6. Efecto del tratamiento con metformina y 4-HC en ratas sanas o con HGNA sobre los cambios en formación de colágeno en tejido hepático .................. 124
9.3.7. Efecto del tratamiento con metformina y 4-HC en ratas sanas o con HGNA sobre los niveles séricos de citocinas ............................................................... 127
X. DISCUSIÓN ............................................................................................................. 135
10.1. Síntesis y confirmación molecular de 4-HC .......................................................... 135
10.2. Efecto del consumo de sacarosa sobre el desarrollo de la enfermedad de HGNA en ratas Wistar macho ............................................................................................ 136
10.2.1. Efecto de la ingesta de sacarosa sobre el consumo de alimento y peso corporal …………………………………………………………………………………136
10.2.2. Efecto del consumo de sacarosa sobre los niveles de glucosa en sangre...... 138
10.2.3. Efecto del consumo de sacarosa sobre el desarrollo de tejido adiposo intraabdominal ................................................................................................. 138
10.2.4. Efecto del consumo de sacarosa sobre el daño hepático ............................... 139
10.2.4.1. Efecto del consumo de sacarosa sobre el porcentaje de peso del hígado ... 139
10.2.4.2. Efecto del consumo de sacarosa sobre la actividad de enzimas hepáticas . 140
10.2.4.3. Efecto del consumo de alimento sobre la esteatosis y fibrosis .................. 143
10.2.5. Efecto del consumo de sacarosa sobre el proceso inflamatorio ................... 144
10.2.6. Posible mecanismo de acción del consumo de sacarosa ................................ 144
10.3. Efecto del tratamiento con metformina y/o 4-HC sobre la enfermedad de HGNA ……………………………………………………………………………………...151
10.3.1. Efecto de los tratamientos sobre el consumo de alimento y peso corporal . 151
10.3.2. Efecto de los tratamientos sobre la tolerancia a la glucosa .......................... 153
X
10.3.3. Efecto de los tratamientos sobre el desarrollo de tejido adiposo intraabdominal ................................................................................................. 154
10.3.4. Efecto de los tratamientos sobre la disminución de daño hepático e inflamación ........................................................................................................ 155
XI. CONCLUSIONES ................................................................................................... 162
11.1. Conclusión general .................................................................................................. 162
11.2. Conclusiones específicas.......................................................................................... 162
XII. LIMITACIONES DEL PROYECTO .................................................................... 164
XIII. BIBLIOGRAFÍA ..................................................................................................... 165
XIV. ANEXOS .................................................................................................................. 187
11.1. Perspectivas .............................................................................................................. 187
11.2. Productos .................................................................................................................. 187
XV. SIGLAS Y ABREVIACIONES .............................................................................. 207
XI
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura Página
1 Historia natural de la enfermedad de HGNA………………………………….. 17
2 Progresión de EHNAS a fibrosis en presencia de obesidad y RI..…………….. 21
3 Mecanismos moleculares en la relación de RI, obesidad e HGNA en una célula
hipotética (hepatocito, miocito o adipocito)………………………………...…
34
4 Estructura general de las chalconas…………………………………………... 43
5 Diagrama de protocolo experimental del grupo 1 para establecer el desarrollo
de HGNA………………………………………..…………………………….
64
6 Diagrama de protocolo experimental del grupo 2 para determinar el efecto de
los tratamientos………………………………….…………………………….
65
7 Mecanismo de reacción de la 4-HC empleando BF3∙OEt2 como catalizador… 76
8 Espectro de infrarrojo de la 4-HC……………..………………………………. 77
9 Espectro de RMN-1H de la 4-HC……………………………………..……… 79
10 Efecto del consumo de agua con sacarosa sobre el consumo de alimento y peso
corporal………………………………………………………….…………….
82
11 Curso temporal de PTGO en grupos con ingesta de sacarosa por diferentes
tiempos y con diferentes concentraciones.………………………………...…..
84
12 Efecto del consumo de agua con sacarosa sobre porcentaje (%) de peso del
tejido hepático y adiposo………………………………………………………
87
13 Efecto del consumo de agua con sacarosa sobre los niveles séricos de enzimas
hepáticas………………………………………………………………………
90
14 Efecto del consumo de agua con sacarosa sobre la morfología de tejido
hepático……………………………………………………………………….
93
15 Efecto del consumo de agua con sacarosa sobre los cambios de colágeno en
tejido hepático…………………………………...…………………………….
96
16 Efecto de consumo de agua con sacarosa sobre los niveles séricos de IL-6,
TNF- y TGF-
99
17 Efecto del tratamiento con metformina y 4-HC sobre el consumo de alimento. 101
18 Efecto del tratamiento con metformina y 4-HC sobre el peso corporal……….. 104
XII
19 Efecto del tratamiento con metformina y 4-HC sobre la tolerancia a la glucosa
oral……………………...…………………………………………………......
106
20 Efecto del tratamiento con metformina y 4-HC sobre la tolerancia a la glucosa
oral entre grupos con ingesta de agua pura y de sacarosa al 50%, para cada
tratamiento…………………………………………………………………….
109
21 Efecto del tratamiento con metformina y 4-HC sobre la tolerancia a la glucosa
oral a lo largo del tratamiento…………………………………………………
110
22 Efecto del tratamiento con metformina y 4-HC sobre el porcentaje (%) de peso
del hígado……………………………………………………………………..
112
23 Efecto del tratamiento con metformina y 4-HC sobre el porcentaje (%) de peso
del tejido adiposo……………………………………………………………...
114
24 Efecto del tratamiento con metformina y 4-HC sobre los niveles séricos de FA 116
25 Efecto del tratamiento con metformina y 4-HC sobre los niveles séricos de
AST……………………………..……………………………………………..
118
26 Efecto del tratamiento con metformina y 4-HC sobre los niveles séricos de
ALT…………………….……………………………………………………..
120
27 Efecto del tratamiento con metformina y 4-HC en ratas sanas sobre la
morfología del tejido hepático……………………...………………................
121
28 Efecto del tratamiento con metformina y 4-HC en ratas con HGNA sobre la
morfología del tejido hepático…………………………………………..…….
123
29 Efecto del tratamiento con metformina y 4-HC en ratas sanas sobre los
cambios de colágeno en tejido hepático……………………………………….
125
30 Efecto del tratamiento con metformina y 4-HC en ratas con HGNA sobre los
cambios de colágeno en tejido hepático……………………………………….
126
31 Efecto del tratamiento con metformina y 4-HC sobre los niveles séricos de IL-
6 y TNF-
129
32 Efecto del tratamiento con metformina y 4-HC sobre los niveles séricos de
TGF- e IL-10……………………………….………………………………...
132
33 Mecanismo propuesto del efecto del consumo de sacarosa al 50% durante 20
semanas……………………………………………………………………….
149
XIII
34 Posible mecanismo de acción del tratamiento con metformina y/o 4-HC en
HGNA………………………………………...……………………………….
160
XIV
ÍNDICE DE CUADROS
Cuadro Página
1 Sistema de puntuación histológica de la Red de Investigación Clínica sobre
EHNA………………………………………………………………………..
40
2 Resumen de resultados de efecto del consumo de sacarosa………………… 146
1
I. RESUMEN
Actualmente la enfermedad de hígado graso no alcohólico (HGNA) es la enfermedad hepática más común en seres humanos en el mundo, y tiene una estrecha correlación con la presencia de obesidad y resistencia a insulina, además de ser considerada el componente hepático del síndrome metabólico. A pesar de que ya se han realizado estudios sobre los posibles tratamientos para la enfermedad de HGNA, actualmente se carece de un tratamiento específico para el padecimiento. La metformina es uno de los tratamientos farmacológicos que se han utilizado; sin embargo, los resultados de su efecto en HGNA no son concluyentes. Como otras alternativas de tratamiento, se han realizado algunas investigaciones en animales para determinar el efecto de la 4-hidroxichalcona (4-HC) sobre la actividad antioxidante, antiinflamatoria y hepatoprotectora, sugiriendo que podría ser un candidato para estudios preclínicos en HGNA. Por lo tanto, el objetivo general de este estudio fue determinar el efecto del tratamiento con metformina y 4-HC sobre el desarrollo de HGNA en ratas Wistar macho; así como su participación en el proceso de formación de fibrosis hepática asociada a inflamación crónica. Se utilizaron 96 ratas Wistar macho que fueron divididas en dos grupos: 1) Estandarización del modelo animal de desarrollo de HGNA (n= 48); a su vez dividido en cuatro grupos con acceso ad libitum a: a) agua pura (n=18) y b) agua con sacarosa al 30%; que fueron sacrificados al final de las semanas 12, 16 y 20 (n= 6 c/u), c) agua con sacarosa al 40% (20 semanas), y d) agua con sacarosa al 50% (20 semanas); y 2) para determinación del efecto de los distintos tratamientos (n=48), el cual fue dividido en dos grupos: a) sanos (n=24) y b) con HGNA (n=24), que a su vez fueron divididos en 4 grupos que recibieron tratamiento (n= 6 c/u, vía p.o. por 35 días) con: i) 1 mL de solución salina (por ser vehículo), ii) metformina (200 mg∙kg-1 por día); iii) 4-HC (80 mg∙kg-1 por día), y iv) metformina (200 mg∙kg-1 por día) + 4-HC (80 mg∙kg-1 por día). Se monitoreo peso corporal y consumo de alimento semanalmente, se realizaron pruebas de tolerancia a la glucosa oral un día antes de iniciar el tratamiento, al día 17 y al finalizar el tratamiento. Al finalizar el tratamiento, los animales fueron sacrificados y se realizaron análisis histopatológicos (tinción hematoxilina y eosina, y con tricrómica de Masson), pruebas de funcionamiento hepático y determinación de niveles séricos de IL-6, IL-10, TGF- y TNF-. Como resultados, se observó que la ingesta de sacarosa al 50% durante 20 semanas llevó al desarrollo de esteatohepatitis no alcóholica severa (EHNAS) con grado 6 de esteatosis, infiltrado inflamatorio y fibrosis (F2); utilizándose dicha concentración de sacarosa para inducir HGNA en los animales tratados con metformina y 4-HC. Por otra parte, la monoterapia con metformina o 4-HC y el co-tratamiento, disminuyeron la progresión de HGNA a nivel lipídico y hepático, así como el desarrollo de fibrosis. El co-tratamiento y monoterapia con metformina disminuyeron la intolerancia a la glucosa. El tratamiento con metformina y 4-HC y la monoterapia de 4-HC disminuyeron el progreso de inflamación. En conclusión, el tratamiento con 4-HC tiene efecto terapéutico en la enfermedad de HGNA, en ratas Wistar macho, y es más eficaz que la monoterapia con metformina o el tratamiento en conjunto con metformina y 4-HC. Nuestros resultados muestran que el tratamiento con 4-hidroxichalcona fue el más efectivo entre los tratamientos probados contra HGNA. (Palabras clave: HGNA, obesidad, resistencia a insulina, metformina, 4-hidroxichalcona.)
2
II. ABSTRACT
Nowadays, nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) is the most common liver disease in the world, and has a direct relation with obesity and insulin resistance, and is considered a condition of metabolic syndrome. Despite studies on possible treatments for NAFLD have already been carried out, actually there is no specific treatment for the condition. Metformin is one of the treatments that has been used; however, there are no conclusive results of its effect on NAFLD. Like other treatment alternatives, some animal research has been conducted to determine the effect of 4-hydroxychalcone (4-HC) on antioxidant, antiinflammatory and hepatoprotective activity; suggesting that it may be a candidate for preclinical studies in NAFLD. Therefore, the aim of this study was determine the effect of treatment with metformin and 4-HC in the development of NAFLD in male Wistar rats, as well as its participation on the process of formation of liver fibrosis related with chronic inflammation. We used 96 Wistar rats that were divided into two groups: 1) Animal model of NAFLD (n=48), in turn divided into four groups with free access to: a) tap water (n=18) and b) 30% sucrose; that were euthanized at the end of 12, 16 and 20 weeks (n=6 each), c) 40% sucrose (20 weeks) and d) 50% sucrose (20 weeks); and 2) to determine the effect of the different treatments (n=48), divided into two groups: a) healthy (with tap water ingestion, n=24) and b) with NAFLD (with 50% sucrose ingestion, n=24), that after 20 weeks of induction each were divided into four groups that received daily p.o. administration of: i) saline solution (1 mL); ii) metformin (200 mg∙kg-1 per day); iii) 4-HC (80 mg∙kg-1 per day) and iv) co-treatment over 5 weeks period (n=6 each). The measurement of body weight and food intake were performed weekly, oral glucose tolerance tests were performed one day before starting treatment, on day 17 and at the end of treatment. One day after finished the treatments, the animals were euthanized, and blood samples, and hepatic and adipose tissues were collected. Finally, the percentage by weight of liver and adipose tissue, as well as serum ALP, AST, ALT, IL-6, IL-10, TGF-and TNF- levels were determined. In addition, the liver histology stained with H&E and MT was obtained. As results, it was observed that 50% sucrose ingestion during 20 weeks led to the development of nonalcoholic steatohepatitis (NASH), with grade 6 steatosis, inflammatory infiltrate and fibrosis (F2); using this sucrose concentration to induce NAFLD in animals treated with metformin and 4-HC. On the other hand, monotherapy with metformin and 4-HC, and the co-treatment decreased the progression of NAFLD at lipid and liver level, as well as the development of fibrosis. The co-treatment and monotherapy with metformin decreased glucose intolerance. The co-treatment and monotherapy with 4-HC decreased the development of inflammation. In conclusion, the treatment with 4-HC has therapeutic effect on male Wistar rats with NAFLD, and was the most effective among the treatments tested against NAFLD. Our results showed that 4-hydroxychalcone treatment was the most effective among the treatments tested against NAFLD. (Keywords: NAFLD, obesity, insulin resistance, metformin, 4-hydroxychalcone.)
3
III. INTRODUCCIÓN
El hígado es el órgano más voluminoso del cuerpo, pesa alrededor de 1500 gramos en un
adulto (Guyton y Hall, 2009), el cual es uno de los órganos más activos y versátiles, ya que
posee diversas funciones, la mayor parte de las cuales las llevan a cabo los hepatocitos (Gartner
y Hiatt, 2001). Tiene funciones tanto exocrinas como endócrinas y también tiene la función
protectora de desintoxicar y eliminar muchas toxinas de la sangre y medicamentos hacia la bilis,
así como eliminar eritrocitos muertos (Gartner y Hiatt, 2001; Guyton y Hall, 2009); así mismo
actúa como depósito de sangre y formador de linfa. Es un órgano que realiza metabolismo
intenso, además, en el hígado se procesan y sintetizan numerosas sustancias transportadas a
otras regiones del organismo que cumplen múltiples funciones metabólicas (Guyton y Hall,
2009). Entre sus funciones metabólicas se destaca el metabolismo de hidratos de carbono, de
lípidos y proteínas, así como en el almacenamiento de vitaminas y minerales, y producción de
sustancias procoagulantes y de bilis (Gartner y Hiatt, 2001; Kierszenbaum, 2008; Guyton y Hall,
2009).
El hígado puede ser afectado por diversos tipos de enfermedades llamadas hepatopatías,
entre las que destacan las de origen vírico, alcohólico y la no alcohólica, esta última conocida
como enfermedad de hígado graso no alcohólico (HGNA) que tiene relación con la presencia
de obesidad, diabetes mellitus tipo 2 (DMT2) y síndrome metabólico (SM). La enfermedad de
HGNA actualmente es considerada dentro de las enfermedades hepáticas crónicas más comunes
(Dietrich y Hellerbrand, 2014; Croci y col., 2019).
En la actualidad son pocos los tratamientos que tratan de manera eficaz el HGNA. Los
objetivos principales del tratamiento son, disminuir o detener la progresión de la enfermedad,
disminuir la esteatosis, reducir los niveles de enzimas hepáticas, prevenir inflamación y fibrosis,
4
y debido a su asociación con la presencia de los factores de riesgo de obesidad, DMT2 o
resistencia a insulina (RI); el manejo del HGNA se realiza tratando los factores de riesgo, debido
a que en la actualidad no existe un tratamiento específico para el manejo del HGNA (Dietrich y
Hellerbrand, 2014). En cuanto al tratamiento se han utilizado agentes sensibilizadores de
insulina (metformina, tiazolidinedionas), antilipémicos (fibratos), antioxidantes (vitamina E),
inhibidores del factor de necrosis tumoral alfa (TNF-, entre otros (López-Oliva y Muñoz-
Martínez, 2014).
Ante la necesidad de un tratamiento eficaz para el HGNA, se ha realizado una búsqueda
de moléculas farmacológicas con posible acción terapéutica, y las que tienen actividad
antioxidante son las que han generado mayor interés entre los investigadores; entre ellas se
encuentran las chalconas y sus derivados que exhiben una amplia variedad de propiedades
biológicas, como por ejemplo, antiinflamatoria, antimicrobiana, antifúngica, antioxidante,
citotóxica y antihipertensiva (Arianingrum, 2014; Qu y col., 2014). Dentro de estos compuestos,
destaca la 4-hidroxichalcona (4-HC), la cual ha mostrado ejercer efecto antioxidante (Armenta-
Gutiérrez, 2016; Kucerova-Chlupacova y col., 2018), antiinflamatorio (Qu y col., 2014) y
hepatoprotector (Ebadollahi-Natanzi y col., 2011).
Por lo anterior, es que en este estudio se evaluó el efecto del tratamiento con metformina
y 4-HC en ratas Wistar macho con HGNA, sin embargo, para esto primero fue necesario realizar
la estandarización de un modelo animal en ratas Wistar macho para el desarrollo del HGNA.
5
IV. REVISIÓN DE LITERATURA
4.1. El hígado
El hígado se encuentra clasificado como un órgano accesorio del tracto gastrointestinal
(Porth y Garpard, 2003); este órgano es considerado el segundo más voluminoso del cuerpo,
después de la piel, y pesa alrededor de 1500 g en un adulto (Guyton y Hall, 2009). Se localiza
en el cuadrante superior derecho de la cavidad abdominal, justo debajo del diafragma (Gartner
y Hiatt, 2001; Kierszenbaum, 2008).
El hígado recibe irrigación sanguínea a través de dos vasos sanguíneos: 1) la vena porta
(75-80% de flujo sanguíneo aferente), la cual transporta sangre rica en nutrientes desde el tubo
digestivo, el bazo y páncreas, y 2) la arteria hepática que aporta 20-25% de sangre oxigenada
al hígado a través de las arterias interlobulillares e interlobulares antes de llegar al espacio porta;
mientras que la sangre sale del hígado a través de las venas hepáticas y la bilis sale del hígado
por los conductos hepáticos derecho e izquierdo (Gartner y Hiatt, 2001; Kierszenbaum, 2008).
El flujo sanguíneo entra a través de pequeñas ramas de la vena porta y arteria hepática,
desembocando en los sinusoides cerca de los espacios porta en la zona periportal (zona 1) la
cual es muy rica en nutrientes y oxígeno, mientras que la zona central, centrolobulillar o zona
3, recibe un flujo poco oxigenado; el espacio entre ellas es llamado zona 2 (López-Panqueva,
2013).
4.1.1. Unidad funcional y estructural
El hígado está constituido por hepatocitos que representan cerca del 75% de su peso, éstos
son las células funcionales del lobulillo hepático y son poligonales con actividad exocrina y
endocrina (Gartner y Hiatt, 2001). Los hepatocitos forman láminas de una a dos células de
espesor unidos de forma repetitiva a modo de red, que limitan los espacios sinusoidales y junto
6
con la vena central (zona 3) y espacio periportal (zona 1) constituyen el lobulillo hepático, el
cual es la unidad estructural y funcional del hígado (Porth y Garpard, 2003; Kierszenbaum,
2008; Guyton y Hall, 2009).
Los lobulillos hepáticos se encuentran distribuidos radialmente alrededor de una vena
central, mientras que las ramas de la arteria hepática y la vena porta, junto con conductos
biliares, forman la triada portal presente en el espacio porta, que rodea al lobulillo hepático de
forma hexagonal (Kierszenbaum, 2008; Guyton y Hall, 2009). En la zona periportal (zona 1),
los hepatocitos sintetizan de forma activa glucógeno y proteínas plasmáticas; esta zona 1 tiene
concentraciones elevadas de oxígeno en la sangre sinusoidal. La zona de drenaje venoso central
(zona 3) es la que tiene menor concentración de oxígeno, esta zona interviene en la
desintoxicación (Kierszenbaum, 2008).
De manera particular, los hepatocitos tienen diversas funciones ejercidas por diferentes
organelos. Estas células sintetizan de manera activa proteínas para su propio uso y también para
enviarlas a otros sitios; como consecuencia tienen abundancia de ribosomas libres, retículo
endoplásmico rugoso (RER) y aparato de Golgi. Además, por las altas necesidades de energía
de los hepatocitos, cada célula contiene hasta 2000 mitocondrias (Gartner y Hiatt, 2001).
El RER del hepatocito está implicado en la síntesis de proteínas plasmáticas, mientras que
el retículo endoplásmico liso (REL) se encuentra muy desarrollado y se asocia con la síntesis de
glucógeno y lípidos, así como a los mecanismos de desintoxicación (Kierszenbaum, 2008). El
REL posee enzimas que participan en: 1) síntesis de colesterol y sales biliares; 2) conjugación
del glucorónido de la bilirrubina, los esteroides y los fármacos; 3) degradación del glucógeno a
glucosa; 4) esterificación de los ácidos grasos (AG) libres en triglicéridos (TG); 5) eliminación
del yodo de las hormonas tiroideas para generar triyodotironina (T3) y tiroxina (T4), y 6)
7
desintoxicación de los fármacos liposolubles; este organelo tiene incrementado su número y su
función en presencia de ciertos fármacos y toxinas en la sangre (Gartner y Hiatt, 2001;
Kierszenbaum, 2008).
El hígado también tiene lisosomas y peroxisomas; y en personas que consumen sustancias
hepatotóxicas, como el alcohol, se presenta un número mayor de depósitos de lípidos en sus
hepatocitos de la zona 3 (Gartner y Hiatt, 2001).
4.1.2. Otros tipos de células en hígado
Además de los hepatocitos, los sinusoides venosos están tapizados por otros tipos
celulares: 1) las células endoteliales típicas, 2) las grandes células de Kupffer y 3) las células
estrelladas (Porth y Garpard, 2003; Guyton y Hall, 2009; López-Panqueva, 2013).
Las células endoteliales presentan características diferentes tanto estructural como
fenotípicamente comparadas con cualquier otra célula endotelial vascular, son células
fenestradas, es decir, carecen de membrana basal, lo cual permite que el plasma y sus
componentes estén en contacto directo con los hepatocitos en el espacio subendotelial de Dissé
(perisinusoidal) (Gartner y Hiatt, 2001; Guyton y Hall, 2009; López-Panqueva, 2013). Estas
células no expresan factor VIII, tampoco contienen moléculas características de los endotelios
vasculares como E-selectina, CD31 o CD34 y son más numerosas y grandes en las zonas más
distales del sinusoide o zonas perivenulares (López-Panqueva, 2013).
Mientras que las células de Kupffer, o células retículo-endoteliales, son macrófagos
hepáticos que constituyen aproximadamente 4% de la población celular; éstas revisten los
sinusoides y forman parte del sistema mononuclear fagocítico, poseen receptores Fc y para
complemento. Su importancia radica en formar parte del sistema de defensa y están involucradas
8
en la patogénesis de varias enfermedades hepáticas. Son más numerosas en los espacios
sinusoidales periportales y migran a las zonas de daño (Gartner y Hiatt, 2001; Guyton y Hall,
2009; López-Panqueva, 2013). Su importancia radica en el hecho de que la sangre de la vena
porta puede contener diversos microorganismos que penetran en el torrente sanguíneo de la luz
del tubo digestivo y las células de Kupffer reconocen y fagocitan cuando menos a 99% de estos
microorganismos; también eliminan de la sangre desechos celulares y eritrocitos muertos
(Gartner y Hiatt, 2001).
Por otra parte, la células estrelladas o células de Ito, son otro tipo celular que en
condiciones normales, son quiescentes y actúan como depósito de grasa, se cree que almacenan
vitamina A (80%) en su citoplasma como ésteres de retinil, sintetizan citocinas proinflamatorias
y proteínas de matriz extracelular que constituyen principalmente la trama estructural del
hígado. Ejercen un papel muy importante en la biología normal hepática, al interactuar de forma
muy estrecha en el espacio de Dissé con las fenestras de las células endoteliales y los
hepatocitos, ayudando a mantener su diferenciación, crecimiento y función por acción de
integrinas de superficie y receptores en la superficie de los hepatocitos (Gartner y Hiatt, 2001;
López-Oliva y Muñoz-Martínez, 2014).
Ante un daño hepático, estas células pierden su capacidad de almacenar vitamina A, y
son activadas transformándose en células que semejan miofibroblastos contráctiles, incluso
fenotípicamente expresan actina de músculo liso, constituyendo la mayor fuente de colágeno en
condiciones anormales, donde las citocinas secretadas por las células de Kupffer y las células
inflamatorias producen la activación de las células estrelladas para que se dividan, perpetúen la
síntesis de citocinas proinflamatorias, en especial de integrina, y que produzcan abundante
matriz extracelular. De esta manera se favorece el desarrollo de fibrosis, la cual constituye la
9
respuesta del tejido a una lesión persistente, que a su vez resulta en una acelerada generación de
matriz extracelular (Gartner y Hiatt, 2001; López-Panqueva, 2013).
4.1.3. Principales funciones
El hígado es además un órgano con funciones exocrinas y endocrinas, así mismo, posee
la función protectora de desintoxicar y eliminar eritrocitos muertos (Gartner y Hiatt, 2001).
Entre sus funciones se encuentran las siguientes:
1) El hígado actúa como depósito de sangre y formador de linfa (Guyton y Hall, 2009).
2) Las células del hígado realizan un metabolismo intenso, es decir, participan en:
a) Metabolismo de hidratos de carbono, al ser depósito de grandes cantidades de
glucógeno, convierte la galactosa y la fructosa en glucosa, participa en
gluconeogénesis, glucogenólisis y formación de muchos compuestos químicos a
partir de los productos intermedios del metabolismo de los hidratos de carbono
(Guyton y Hall, 2009).
b) Metabolismo de lípidos, debido a que en él se lleva a cabo la oxidación de los AG;
síntesis de colesterol, fosfolípidos y casi todas las lipoproteínas; así como síntesis
de grasa a partir de las proteínas y de los hidratos de carbono (Gartner y Hiatt, 2001;
Guyton y Hall, 2009).
c) Metabolismo de proteínas, al participar en desaminación y transaminación de los
aminoácidos; formación de urea para eliminar el amoniaco de los líquidos
corporales; formación de proteínas del plasma; interconversión de los distintos
aminoácidos y síntesis de otros compuestos a partir de aminoácidos (Porth y
Garpard, 2003).
10
3) Almacenamiento de vitaminas y minerales; donde las vitaminas que se almacenan en
el hígado son la vitamina A (en mayor proporción), vitamina D y B12 (cobalamina);
además almacena hierro en forma de ferritina, esto gracias a que las células hepáticas
contienen grandes cantidades de apoferritina que al combinarse con hierro forman
ferritina para poder ser depositadas en las células hepáticas cuando hay grandes
cantidades de hierro en el organismo y si el hierro de los líquidos corporales es muy
bajo, la ferritina lo libera (Gartner y Hiatt, 2001; Guyton y Hall, 2009).
4) Producción de sustancias procoagulantes, tales como fibrinógeno, protombina,
globulina aceleradora, factor III y VII y algunos otros factores importantes, por lo que
los trastornos de coagulación se asocian a las hepatopatías (Gartner y Hiatt, 2001;
Kierszenbaum, 2008).
5) Desintoxicante (Guyton y Hall, 2009).
6) Formación de bilis (Porth y Garpard, 2003; Kierszenbaum, 2008).
Además, el hígado posee una alta capacidad de recuperación después de una pérdida
importante de tejido hepático, ya sea por hepatectomía parcial o por una lesión hepática aguda,
siempre y cuando dicha lesión no se complique con una infección vírica o con inflamación
(Gartner y Hiatt, 2001; Guyton y Hall, 2009). En la mayoría de los casos la regeneración se debe
a la capacidad de replicación de los hepatocitos restantes; sin embargo, la regeneración del
hígado depende de la actividad mitótica de las células ovales de los colangiolos y los conductos
de Hering cuando la agresión hepatotóxica es considerable (Gartner y Hiatt, 2001).
4.2. Hígado graso no alcohólico
De acuerdo a la Asociación Americana para el Estudio de las Enfermedades Hepáticas la
definición de enfermedad de HGNA requiere la presencia de esteatosis hepática no alcohólica
11
(EHNA) y que sea excluida la acumulación de grasa hepática secundaria (por ejemplo, por alto
consumo de alcohol, por medicamentos o por trastornos hereditarios) como causa de la
enfermedad (Dietrich y Hellerbrand, 2014). Algunos factores que contribuyen directamente al
desarrollo de enfermedad de HGNA son: estilo de vida sedentario e incremento en el consumo
de alimentos altos en grasa y bebidas con altas concentraciones de fructosa o sacarosa (Sanches
y col., 2015).
La EHNA se define como un cúmulo de grasa en el hígado >5% de los hepatocitos, y
cuando la esteatosis es producida por un componente diferente a fármacos, alcohol o virus,
además de presentar anormalidades persistentes de enzimas hepáticas (Dietrich y Hellerbrand,
2014; Abd El-Kader y El-Den Ashmawy, 2015; Fazel y col., 2016). Si la EHNA conduce a
inflamación y daño hepatocelular, la esteatosis simple progresa a esteatosis hepática no
alcohólica severa (EHNAS); esta última a su vez puede progresar a fibrosis, cirrosis y carcinoma
hepatocelular (CHC) (Tilg y Moschen, 2008; Dietrich y Hellerbrand, 2014; Croci y col., 2019);
es decir, el espectro de esta enfermedad incluye EHNA, EHNAS, fibrosis, y cirrosis.
En la mayoría de los pacientes, el HGNA es asociado con factores de riesgo metabólicos
que se presentan en el SM, tales como obesidad (Tilg y Moschen, 2008; Dietrich y Hellerbrand,
2014; Abd El-Kader y El-Den Ashmawy, 2015), RI (Dietrich y Hellerbrand, 2014; Firneisz,
2014; Gruben y col., 2014) y/o dislipidemia (Dietrich y Hellerbrand, 2014). Esta asociación se
realizó inicialmente, al observar un incremento en la prevalencia del HGNA con la epidemia de
obesidad (Abd El-Kader y El-Den Ashmawy, 2015) y DMT2 (Gruben y col., 2014; Abd El-
Kader y El-Den Ashmawy, 2015) y debido a que estos padecimientos van en aumento, se espera
que el HGNA será un problema hepático cada vez más común. Actualmente, la enfermedad de
HGNA es considerada el componente hepático del SM, el cual es caracterizado por la presencia
12
de al menos tres de los siguientes factores: RI, obesidad (>90% de pacientes con HGNA son
obesos), hiperinsulinemia, dislipidemia, hipertensión y niveles reducidos de lipoproteína de alta
densidad (HDL). Además de que es considerada como un importante factor de riesgo para el
desarrollo de enfermedades cardiovasculares, la cual es la característica más prevalente en
enfermedad de HGNA (Rodriguez-Ramiro y col., 2016).
4.2.1. Epidemiología de HGNA
La enfermedad de HGNA es el trastorno hepático más común en países industrializados
occidentales, esta enfermedad tiene una prevalencia de 6-35% alrededor del mundo y se
considera que afecta a más de un cuarto de la población adulta. Tiene una media de 20%
alrededor del mundo para EHNA y una prevalencia de 2.7-12.2% para EHNAS (Bellentani,
2017; Croci y col., 2019).
La prevalencia del HGNA en Norte América es similar en sus diferentes poblaciones y
está estimada en un rango de 27-34%. Sin embargo, se estima que ciertas poblaciones presentan
una prevalencia de HGNA significativamente mayor, como es en pacientes con obesidad
mórbida, la prevalencia de HGNA es de 75-92%, mientras que la prevalencia en pacientes con
DMT2 es estimada entre 60-70% (Fazel y col., 2016). Por otra parte, el 80% de pacientes con
HGNA tienen sobrepeso u obesidad, 72% tienen dislipidemias y 44% han sido diagnosticados
con DMT2 (Diehl y Day, 2017). Además, existen diferencias de prevalencia del HGNA en los
diferentes grupos étnicos, al respecto, los hispanos americanos tienen la mayor prevalencia de
45%, mientras que los afro-americanos tienen la menor prevalencia de 24% y los europeos
americanos tienen una prevalencia de 33% (López-Velázquez y col., 2014; Fazel y col., 2016).
Se considera que existen más de 70 millones de adultos Americanos con enfermedad de
HGNA (López-Velázquez y col., 2014). En México, los valores de prevalencia no son muy
13
diferentes a los reportados en otros países, debido a que estudios poblacionales han estimado
una frecuencia de alrededor de 17% en población asintomática, a los que se les realizó estudio
con ultrasonido (Méndez-Sanchez y col., 2010; López-Velázquez y col., 2014). Cabe mencionar
que dentro de los países de América, México se encuentra en el cuarto lugar entre los países con
mayor prevalencia de la enfermedad de HGNA (López-Velázquez y col., 2014).
La prevalencia y severidad del HGNA se correlaciona con el grado de obesidad y con
DMT2. Debido a la asociación entre estos factores de riesgo y el HGNA, aunado al rápido
incremento en la prevalencia mundial de obesidad y DMT2, se sugiere que la prevalencia de
HGNA continuará en aumento.
En cuanto a la incidencia de la enfermedad de HGNA, no existen datos precisos. Esto
debido, al menos en parte, a que la enfermedad de HGNA, normalmente es silenciosa y
detectada accidentalmente. Sin embargo, dado que la prevalencia de obesidad en adultos
prácticamente se ha duplicado desde inicios de 1960 (1962 – 48% contra 2010 – 75%), la
incidencia de HGNA relacionada con obesidad también ha incrementado (Fazel y col., 2016).
4.2.2. Factores de riesgo
Factores relacionados con el medio ambiente y estilo de vida, como una baja actividad
física y trastornos alimenticios con dieta alta en grasa, se encuentran asociados con el desarrollo
de la enfermedad de HGNA y se encuentran relacionados con RI. Los mejores predictores de
HGNA pueden ser el índice de masa corporal (IMC) y la circunferencia de cintura. Los factores
de riesgo asociados al desarrollo de HGNA son: principalmente la RI y/o DMT2 (70%),
obesidad (75-95%), y dislipidemia (50%) (López-Velázquez y col., 2014; Abd El-Kader y El-
Den Ashmawy, 2015). La enfermedad de HGNA es la manifestación hepática del SM. La
14
prevalencia de EHNA y EHNAS en pacientes con DMT2 se ha estimado en cerca de 60-76% y
22%, respectivamente (López-Velázquez y col., 2014; Bellentani, 2017).
También se considera factor de riesgo tener entre 40-65 años, debido a que su prevalencia
incrementa en este rango de edad; además es considerado factor de riesgo ser hispano, por
observarse una mayor prevalencia en esta población. El poseer antecedentes familiares o el
consumo de medicamentos como amiodarona, coralgil, tamoxifeno, maleato de perhexilina,
corticoides, estrógenos sintéticos, metotrexato, tetraciclina o fármacos antirretrovirales de alta
actividad, también son considerados factores de riesgo (LaBrecque y col., 2012; López-
Velázquez y col., 2014; Weiss y col., 2014).
Dentro de los factores de riesgo para el desarrollo de HGNA, la presencia de obesidad y
DMT2 son la segunda causa de consulta médica tanto a nivel nacional (México) (ENSANUT,
2012) como a nivel estado (Sinaloa) (ENSANUT, 2013), y si a eso se le suma el hecho de que
la población Mexicana y Sinaloense es hispana y que una gran proporción de la población es
mayor de 40 años (ENSANUT, 2012, 2013), estamos hablando de que la población Sinaloense
presenta varios factores de riesgo para el desarrollo de la enfermedad de HGNA.
4.2.3. Fisiopatología
El incremento de grasa en las células hepáticas usualmente se asocia con un incremento
de AG derivados de tejido adiposo con RI, también se asocia la obesidad central con
acumulación de TG en el hígado, desbalance en el metabolismo de AG que produce un
incremento en la lipogénesis de novo y/o un daño en la exportación de lípidos desde los
hepatocitos a otros tejidos del organismo; en conjunto, estas alteraciones metabólicas
desencadenan el desarrollo de esteatosis hepática (Dietrich y Hellerbrand, 2014; Abd El-Kader
y El-Den Ashmawy, 2015), así como por un daño en la actividad de ATP mitocondrial,
15
agotamiento de glutatión (GSH) en la mitocondria y desbalance en la producción de
adipocitocinas (Peverill y col., 2014).
Además del exceso de grasa, un subgrupo de pacientes con esteatosis hepática progresa a
EHNAS, caracterizada por la existencia de daño en hepatocitos e inflamación, esta última es el
resultado de un desbalance en factores pro y antiinflamatorios. Los pacientes con EHNAS
pueden mostrar progresión histológica y clínica a fibrosis, desarrollo de estado cirrótico (<5%)
y eventualmente a CHC (figura 1) (Dietrich y Hellerbrand, 2014; Peverill y col., 2014; Weiss
y col., 2014).
Por otra parte, en la última década se han realizado diversos estudios que ligan la presencia
de la enfermedad de HGNA con un mayor riesgo de desarrollo de enfermedad cardiovascular,
ya que se ha observado que los pacientes diagnosticados con HGNA presentan una mayor
prevalencia de enfermedad cardiovascular que la población en general (Brea y col., 2017;
Motamed y col., 2017). Además, se ha incrementado la evidencia de que ésta constituye la
principal causa de muerte en pacientes con HGNA (Adams y col., 2017; Brea y col., 2017).
Asimismo, se ha relacionado a la enfermedad de HGNA como potencial agente causal de otras
patologías como DMT2, enfermedad crónica de riñón y en menor medida con ciertos tumores
extrahepáticos y osteoporosis. Por lo que se considera una enfermedad multisistémica (Byrne y
Targher, 2015; Adams y col., 2017).
4.2.3.1. Progresión de EHNA a EHNAS
La EHNA progresa a un estado de severidad (EHNAS) en cerca del 40% de los pacientes
(figura 1); en esta progresión se encuentran interconectadas múltiples vías (Chiang y col.,
2011). Entre estas vías, la lipotoxicidad representa el principal mecanismo que participa en la
disfunción del hepatocito llevando a la progresión de la enfermedad a EHNAS. Al parecer, el
16
daño por lipotoxicidad ocurre a consecuencia del tránsito excesivo de AG libres más que por
una simple acumulación de TG; incluso se sugiere que la acumulación de TG puede actuar como
mecanismo protector en contra de la lipotoxicidad (Peverill y col., 2014).
En el proceso de desarrollo de inflamación hepática, el estrés oxidativo tiene una
participación importante, debido a que ocurre peroxidación de lípidos en hepatocitos con
esteatosis. El exceso de AG libres en hígado incrementa la -oxidación en mitocondrias y
peroxisomas, y promueve la inducción hepática de enzimas del citocromo P450 (CYP2E1 y
CYP4A1), lo que promueve estrés oxidativo generando un incremento en producción de
especies reactivas de oxígeno (ROS, por sus siglas en inglés) contribuyendo a la progresión a
EHNAS (McClain y col., 2004; Chiang y col., 2011; Peverill y col., 2014; Abd El-Kader y El-
Den Ashmawy, 2015). Los niveles aumentados de ROS promueven la toxicidad de organelos,
como de las mitocondrias, a través del incremento en la peroxidación lipídica y en inflamación,
e interferencia con la cadena respiratoria y la integridad del DNA mitocondrial. A su vez, este
daño puede contribuir al desarrollo de la esteatosis al inducir la inhibición de la -oxidación
(Chiang y col., 2011; López-Oliva y Muñoz-Martínez, 2014).
Los AG libres característicos de la esteatosis hepática también pueden inducir apoptosis
de hepatocitos, a través de la expresión incrementada de Fas, activación de cinasas Jun (JNK)
por la vía de interleucina 6 (IL-6) en tejido adiposo y desestabilización de lisosomas (Chiang y
col., 2011; Peverill y col., 2014; Sanches y col., 2015). Las vías apoptóticas son activadas por
los AG libres debido a la desestabilización de membranas lisosomales causando la liberación de
catepsina B, un activador de la apoptosis (Peverill y col., 2014).
17
Figura 1. Historia natural de la enfermedad de HGNA. La mayoría de los individuos con
obesidad, RI o DMT2, desarrollan EHNA. Tanto obesidad como RI se asocian al consumo
elevado de grasas saturadas e hidratos de carbono. En la obesidad existe un incremento de ácidos
grasos en hígado. En la RI se genera un incremento en la lipólisis, gluconeogénesis y
glucogenólisis, así como una disminución en la captura de glucosa, esto a su vez genera
hiperglucemia e hiperinsulinemia, llevando a un incremento en lipogénesis de novo, y en
consecuencia EHNA. De los pacientes con EHNA, alrededor del 40% desarrolla inflamación
(EHNAS); de los pacientes con EHNAS otra fracción (74%) desarrolla fibrosis hepática lo que
lleva a cirrosis y en última instancia se desarrolla CHC. Modificado de (Dietrich y Hellerbrand,
2014; Leite y col., 2014).
18
Las adipocitocinas y citocinas proinflamatorias (TNF-, IL-6) sintetizadas por los
adipocitos pueden mediar las interacciones patológicas entre el tejido adiposo y el hígado.
Debido a que las adipocitocinas poseen funciones tanto anti como proinflamatorias, cuando
existe un desbalance entre las principales adipocitocinas y citocinas pueden promover daño
hepático en estado de esteatosis hepática. En pacientes con HGNA, los niveles de adiponectina
se encuentran disminuidos y se relacionan de forma inversa con RI y con inflamación hepática
(Chiang y col., 2011), es decir, a mayor inflamación hepática y RI, serán menores los niveles de
adiponectina. Por otra parte, se ha observado en modelos de ratón con HGNA que la
administración de adiponectina disminuye las concentraciones séricas de alanina
aminotransferasa (ALT) y el contenido de lípidos hepáticos; en personas con HGNA también
se ha observado una relación inversamente proporcional entre los niveles de adiponectina y ALT
(McClain y col., 2004).
En el proceso inflamatorio es relevante la variación en las concentraciones de varias
citocinas proinflamatorias, como el incremento de TNF-, IL-6 e IL-1, las cuales activan a los
linfocitos T que inducen apoptosis en hepatocitos (Hassan y col., 2014; Abd El-Kader y El-Den
Ashmawy, 2015). El TNF- se ha asociado tanto a RI como a progresión a HGNA, debido a
que se correlaciona con un incremento en los niveles de proteína de unión al elemento de
respuesta a esterol (SREBP-1c) que se encuentran elevados en la RI. El TNF- también participa
incrementando la síntesis de AG en el hepatocito a través de la activación de la acetil-CoA
carboxilasa, lo que a su vez lleva a incrementar la concentración intracelular de AG libres.
También incrementa la lipólisis periférica (principalmente en tejido adiposo) que a su vez
aumenta la disponibilidad de AG libres en el hígado (McClain y col., 2004).
19
La IL-6 muestra niveles elevados en la RI, diabetes mellitus e hígado graso, tanto en
animales como en seres humanos (Hassan y col., 2014). Mientras que se ha sugerido que las
concentraciones altas de TNF- y bajas de adiponectina en plasma son predictores de EHNAS
en pacientes con HGNA. Cabe mencionar que, los niveles séricos de leptina y resistina se
correlacionan de manera positiva con la presencia de RI, esteatosis hepática y daño hepático
(Chiang y col., 2011).
4.2.3.2. Progresión de EHNAS a fibrosis
Aunque de un 30-40% de las personas con esteatosis simple progresa a EHNAS,
aproximadamente un 74% de los pacientes con EHNAS progresan al desarrollo de fibrosis y
cirrosis (Chiang y col., 2011).
En este proceso de evolución tiene participación importante la activación de las células
estelares hepáticas. En el daño agudo hepático, estas células pierden su capacidad de almacenar
vitamina A, sufren transdiferenciación a miofibroblastos contráctiles, remodelan la matriz
extracelular y contribuyen a sanar el daño hepático. En contraste, en el daño hepático crónico,
las células estelares hepáticas migran a la zona de daño y promueven el desarrollo de fibrosis a
través del exceso de producción de matriz extracelular, formado principalmente con colágeno y
reducción del metabolismo de la matriz extracelular (Chiang y col., 2011; Peverill y col., 2014).
Por otra parte, la activación de neutrófilos incrementa la liberación de citocinas
proinflamatorias (principalmente IL-1) e inducen daño oxidativo en células hepáticas.
Mientras que una reducción del número y actividad de las células asesinas naturales (en inglés
natural killer- NK) puede incrementar la susceptibilidad del hígado a desarrollar cirrosis en
sujetos obesos, debido a que estas células tienen un efecto antifibrótico en el hígado (Peverill y
col., 2014; Abd El-Kader y El-Den Ashmawy, 2015). También se observa la activación de las
20
células de Kupffer que pasan de un fenotipo de macrófagos antiinflamatorios (M2) a un fenotipo
proinflamatorio (M1), lo cual es crítico para el desarrollo de la inflamación, daño tisular e
inducción de fibrosis (López-Oliva y Muñoz-Martínez, 2014).
La principal diferencia entre EHNA y EHNAS es el incremento en el número de
hepatocitos apoptóticos y necróticos detectados en el hígado. Esta muerte celular genera señales
críticas que promueven la activación de células estelares. Por ejemplo, las células de Kupffer,
que son activadas en parte por la muerte de hepatocitos, producen: i) activación de factor de
crecimiento transformante beta (TGF-), ii) ROS y iii) productos de peroxidación de lípidos;
cada uno de éstos, constituyen un estímulo potente para la activación de células estelares,
favoreciendo con ello la progresión a fibrosis. El incremento del estrés oxidativo puede elevar
directamente la producción de colágeno por activación de células estelares, esto ocurre
principalmente en EHNAS avanzado (Chiang y col., 2011; Peverill y col., 2014). La producción
de colágeno es estimulada principalmente por el TGF- (Peverill y col., 2014).
En cuanto a las células estelares, al ser activadas producen quimiocinas, por ejemplo la
proteína quimioatrayente de monocitos-1 (MCP-1), que posee potentes efectos de activación y
quimioatracción en las células estelares y células del sistema inmunológico. Un incremento en
la inflamación hepática y muerte celular puede perpetuar señales de activación de células
estelares y progresión de EHNAS a fibrosis (figura 2) (Chiang y col., 2011; Peverill y col.,
2014). Algunos factores adicionales que promueven la progresión de EHNAS a fibrosis incluyen
un incremento en neurotransmisores del sistema nervioso simpático (como noradrenalina), así
como un incremento en angiotensina II, factor de crecimiento de tejido conectivo (CTGF) y
endocanabinoides (Chiang y col., 2011).
21
Figura 2. Progresión de EHNAS a fibrosis en presencia de obesidad y RI. Modificado de
(Chiang y col., 2011).
22
Es importante mencionar a los receptores activados de proliferación de peroxisomas
(PPAR), son un grupo de receptores nucleares implicados en la regulación del metabolismo y
almacenamiento de AG, de estos el PPAR y PPAR han mostrado estar asociados con el
desarrollo de HGNA. El PPAR incrementa la -oxidación, absorción y eliminación de AG.
Estudios en animales knock out y con polimorfismos, indican que la ausencia o disminución de
actividad de PPARse asocia con el desarrollo de esteatosis hepática, mientras que estudios
demuestran que el uso de fibratos mejora la esteatosis en ratón (Hassan y col., 2014; López-
Oliva y Muñoz-Martínez, 2014). El PPAR también ha mostrado tener relación con el desarrollo
de HGNA, debido a que está involucrado en la sensibilidad a la insulina y el almacenamiento
de TG. PPAR se correlaciona de forma positiva con fibrosis, además, existen reportes que
indican que tiene un papel importante en esteatosis hepática (Tilg y Moschen, 2008; Hassan y
col., 2014).
La distinción entre EHNA, EHNAS y fibrosis solo puede realizarse mediante histología y
no es posible predecirse por estudios de laboratorio clínicos (Tilg y Moschen, 2008). Los
componentes histológicos clave de HGNA son esteatosis, balonamiento hepatocelular
(normalmente en zona 3, es decir, cercano a vena central, sitio pobre en oxígeno) e inflamación
lobular; aunque la fibrosis no es incluida en la definición si permite predecir el pronóstico del
paciente, dependiendo del grado de fibrosis observable en biopsia hepática (LaBrecque y col.,
2012). Una característica de las enfermedades crónicas de hígado es la existencia de patrones
diferentes de fibrosis de acuerdo a la etiología. La fibrosis en adultos con EHNAS es
clásicamente perivenular y/o pericelular, y de forma densa, afectando el parénquima hepático
lobular. La fibrosis progresiva de un adulto con EHNAS se caracteriza por el desarrollo de
fibrosis portal que puede progresar a cirrosis (Peverill y col., 2014; Sanches y col., 2015).
23
4.3. Correlación entre obesidad, RI e HGNA
Hasta el momento se ha descrito la fisiopatología del HGNA, el desarrollo de esta
patología está estrechamente relacionado con la presencia de obesidad y RI.
4.3.1. Obesidad
4.3.1.1. Definición de obesidad
Es una enfermedad sistémica, crónica, progresiva y multifactorial que se define como una
“acumulación de grasa anormal o excesiva que representa riesgo para la salud”. También se
refiere a un exceso de grasa en el organismo que genera riesgo a la salud (Chiang y col., 2011;
ENSANUT, 2012). Se ha observado un incremento en la obesidad tanto en adultos, como niños
y adolescentes (Zhang y col., 2014). Normalmente se encuentra definida con base al IMC, que
puede ser utilizado para ambos sexos y para adultos, y representa una medida base poblacional
para el cuerpo. Sin embargo, tiene limitaciones, debido a que no representa los mismos niveles
de grasa en diferentes individuos. Aun así se considera que una persona tiene obesidad cuando
tiene un IMC ≥ 30 kg∙m-2 (Chiang y col., 2011). Varias observaciones realizadas indican que
más que el exceso de grasa por sí sola, lo que tiene un papel importante en el riesgo de desarrollar
comorbilidades es la distribución de la grasa, especialmente las regiones centrales del cuerpo
(llamado tejido adiposo visceral) por estar la grasa más cerca de órganos importantes (Castro y
col., 2014), por lo que otro parámetro que se considera es la circunferencia de cintura (>88 cm
en mujeres y >102 cm en hombres), el índice cintura-cadera y el porcentaje de grasa corporal
(Moreno, 2012).
24
4.3.1.2. Epidemiología de obesidad
El grado de obesidad se correlaciona fuertemente con la prevalencia y severidad de la
enfermedad de HGNA. La prevalencia mundial de obesidad se duplicó de manera importante
entre 1980 y 2014 y, en ese año, el 11% de los varones y el 15% de las mujeres (más de medio
billón de adultos) eran obesos. De acuerdo a las estadísticas mundiales de 2016, más de uno de
cada tres (39%) de los adultos de 18 años o más tenían sobrepeso (más de 1900 millones), y el
13% eran obesos (más de 650 millones) (OMS, 2018).
México ocupa el segundo lugar en prevalencia en obesidad, después de Estados Unidos
de América, a nivel mundial (ENSANUT, 2012; López-Velázquez y col., 2014). De acuerdo a
la Encuesta Nacional de Salud y Nutrición de Medio Camino, en México la prevalencia
combinada de sobrepeso y obesidad, en adultos de 20 años o más, fue de 72.5%. La prevalencia
combinada de sobrepeso y obesidad (IMC ≥ 25 kg∙m-2) es mayor en las mujeres (75.6%) que en
los hombres (69.4%) y que la prevalencia de obesidad (IMC ≥ 30 kg∙m-2) también es mayor en
el sexo femenino (38.6%) que en el masculino (27.7%); así mismo en la categoría de obesidad
mórbida (IMC ≥ 40 kg∙m-2) es 2.4 veces más alta en mujeres que en hombres. También se
observa mayor prevalencia de obesidad en los grupos de 40 a 79 años comparados con el grupo
de 20 a 29 años (ENSANUT-MC, 2016). En Sinaloa, en 2013 se reportó que el 18.6% de la
población adulta de 20 años o más presenta sobrepeso y obesidad (ENSANUT, 2013).
4.3.1.3. Fisiopatología de obesidad
La obesidad es un padecimiento multifactorial y su etiología no es clara. De los
componentes que pueden llevar a su desarrollo, se considera que se debe, al menos en parte, a
un consumo excesivo de alimentos altos en hidratos de carbono y a inactividad física; asociado
a un desequilibrio en el balance entre el aporte y utilización de las grasas (ENSANUT, 2012;
25
Zhang y col., 2014). De acuerdo a un comunicado realizado por la Organización Mundial de la
Salud (octubre 2016, Ginebra), “la ingesta de azúcares libres, entre ellos los contenidos en
productos como las bebidas azucaradas, es uno de los principales factores que está dando lugar
a un aumento de la obesidad y la diabetes en el mundo” (OMS, 2016b); en México de acuerdo
a ENSANUT-MC, 2016, el 85.3% de adultos consumen regularmente bebidas azucaradas no
lácteas; 38% botanas dulces y postres y 45.6% cereales dulces.
Otros factores que pueden contribuir son aspectos de la personalidad, depresión, efectos
adversos de fármacos, adicción a la comida o predisposición genética; así como causas de
carácter neuroendocrino, metabólico y genético (Zhang y col., 2014). También existen estudios
que exponen que la obesidad es determinada por factores genéticos en un 50% a 90% de los
casos, pero solo es el medio ambiente el que determina la expresión fenotípica. Llegando al
consenso de que la obesidad no es causada solamente por el factor genético (Rosini y col., 2012).
Por otra parte, la presencia de obesidad se asocia con incremento en riesgo de padecer
enfermedades cerebrovasculares, ateroscleróticas, enfermedad arterial coronaria,
hiperlipidemia, hipertensión, enfermedad de vesícula biliar, RI y DMT2, así como un
incremento en el grado de mortalidad. Estudios epidemiológicos indican que la obesidad
contribuye a que exista una mayor incidencia de muerte por cáncer de colon, mama (en mujeres
posmenopáusicas), endometrio, riñón, esófago (adenocarcinoma), estómago, páncreas e hígado,
y posiblemente otros tipos (Rosini y col., 2012; Zhang y col., 2014).
26
4.3.2. Resistencia a insulina
4.3.2.1. Epidemiología de RI y DMT2
Existen muy pocos reportes, de prevalencia de RI. En un estudio realizado en México en
adultos jóvenes de entre 18 y 24 años de edad, se reportó una prevalencia de RI de 12.1% en
mujeres y de 15.3% en hombres (Murguia-Romero y col., 2015).
Por otra parte, la relación entre obesidad central y RI ha sido ampliamente descrita y se
ha sugerido que estos son importantes factores en la etiología de la DMT2 en niños y
adolescentes. Además, la RI es considerada el preámbulo al desarrollo de la DMT2. Por lo que
es importante, mencionar la epidemiología de esta patología, la cual es el tipo de diabetes más
común, aproximadamente del 90 a 95% de las personas que padecen diabetes mellitus presentan
este tipo, la cual, está caracterizada por presentar RI, puede permanecer años sin ser
diagnosticada y el riesgo de desarrollarla incrementa con la edad, la obesidad y la ausencia de
actividad física (Scully, 2012; American Diabetes, 2015).
La prevalencia de diabetes está aumentando en todo el mundo especialmente en países de
ingresos medios y bajos. Aunque las causas de este incremento son complejas, se debe en parte
al aumento del número de personas con sobrepeso u obesidad y a la inactividad física
generalizada (OMS, 2016a). El número de personas con diabetes en el mundo ha aumentado de
108 millones en 1980 a 422 millones de personas en 2014, este aumento ha sido en paralelo al
incremento de la prevalencia de sobrepeso y obesidad. Es decir, la prevalencia mundial de
diabetes en adultos (mayores de 18 años) ha aumentado de 4.7% en 1980 al 8.5% en 2014.
Además, en 2012 fue la causa directa de 1.5 millones de muertes a nivel mundial (OMS, 2016a).
De acuerdo a la OMS, en México la prevalencia de diabetes es de 10.4%, siendo mayor en
mujeres (11%) que en hombres (9.7%). Además, de ser considerada la segunda causa de muerte
27
(14%) después de las enfermedades cardiovasculares (24%) (OMS, 2016c). Sin embargo, estos
datos pueden estar subestimados debido a que un gran número de personas con diabetes no
saben que la padecen. En México, por ejemplo, se considera que una de cada tres personas con
diabetes no sabe que la padece (Scully, 2012). En cuanto a los datos por entidad federativa, la
prevalencia de diabetes en el estado de Sinaloa se encuentra entre el 8.2 y 9.2% de la población
a nivel nacional (ENSANUT, 2012).
4.3.2.2. Fisiopatología de RI
En condiciones normales, la insulina se une al receptor de insulina para activar una
cascada de eventos intracelulares, que incluyen la fosforilación de su receptor y varios miembros
de la familia de sustratos de receptor a insulina (IRS) (Tilg y Moschen, 2008). En la RI, la
hormona no ejerce su función de forma adecuada en la disminución de los niveles de glucosa
en sangre, por lo que el páncreas a manera de compensación produce mayor cantidad de insulina,
hiperinsulinemia, para lograr el objetivo de disminuir los niveles de glucosa en sangre (Tilg y
Moschen, 2008; Leite y col., 2014).
La fosforilación de IRS por insulina es un evento clave en la regulación de la acción de
insulina, y se ve dañado de forma importante en la RI. Varias vías activan en respuesta a la
fosforilación de IRS (figura 3); la vía de fosfoinositol 3-cinasa (PI3K)-Akt, la cual controla la
gluconeogénesis, síntesis de proteínas y glucógeno por la vía de regulación de blanco de
mamífero de rapamicina (mTOR), FOXO1 y otras; y la vía de proteína asociada a c-Cbl
(CAP)/Cbl y proteína G pequeña TC10 que regula al transportador de glucosa 4 (GLUT-4) y la
captura de glucosa al interior de los adipocitos y músculo (Tilg y Moschen, 2008).
La RI es caracterizada por el daño en la acción de la insulina, que se define por un daño
en la captura de la glucosa en músculo y un incremento en la producción de glucosa endógena
28
por el hígado, generando hiperglucemia, tanto en estados de ayuno y postpandrial. Además, se
caracteriza por la alteración de la función de la insulina en el metabolismo de lípidos (por
ejemplo, incremento de lipólisis en adipocitos) o en metabolismo de proteínas (por ejemplo,
alteración en la síntesis de proteínas en músculo) (Tilg y Moschen, 2008; Castro y col., 2014).
Como consecuencia de la RI, se ve incrementada la producción de glucosa endógena por
el hígado y disminuye la utilización por tejidos periféricos (por ejemplo, músculo), a su vez,
esto genera un incremento de glucemia y promueve un aumento en la secreción de insulina por
el páncreas. Además, se ve alterada la depuración de la insulina hepática contribuyendo a la
hiperinsulinemia, la cual promueve la regulación a la baja del receptor de insulina (Tilg y
Moschen, 2008; Castro y col., 2014). De forma notable, el efecto mitogénico celular de la
insulina se conserva en estados de RI, lo que produce crecimiento celular (por ejemplo, acantosis
nigricans, o predisposición a cáncer) (Castro y col., 2014).
4.3.3. Mecanismos de interacción entre obesidad, RI y enfermedad de HGNA
Existen dos hipótesis que explican cómo los AG libres se pueden asociar con la obesidad
central, RI e HGNA: I) hipótesis portal y II) hipótesis de derrame (o grasa ectópica) (Castro y
col., 2014).
De acuerdo a la teoría portal un incremento de tejido graso abdominal (o adiposidad
visceral) lleva a un incremento de entrega de AG al hígado a través del drenaje de la vena porta;
como consecuencias existen problemas de RI en tejido hepático, lo que lleva a estimular la
producción de glucosa (Castro y col., 2014). De acuerdo a esta misma teoría es que la obesidad
contribuye al desarrollo de HGNA, porque el flujo sanguíneo de la vena porta conduce
directamente a que el hígado tenga una alta exposición de AG libres y TG resultantes de la
29
lipólisis (Dietrich y Hellerbrand, 2014). En efecto, alrededor del 70-100% de pacientes con
HGNA son obesos (Ahmed y col., 2015).
De acuerdo a la hipótesis de derrame, en cuanto al balance positivo de energía, la
capacidad reducida o limitada del tejido adiposo para expandirse dará lugar a un derrame de AG
libres al compartimiento de la grasa visceral y tejido no adiposo. Esto, más los metabolitos
activos derivados de los AG libres, puede llevar a RI, así como a un deterioro de la capacidad
celular hepática para utilizar los AG libres e incorporarlos a TG y exportarlos, esto lleva a
lipotoxicidad y apoptosis celular, comprometiendo la función de los órganos involucrados, entre
ellos el hígado en donde generan hepatotoxicidad y contribuye al desarrollo de HGNA (Chiang
y col., 2011; Castro y col., 2014; Firneisz, 2014).
Por otra parte, se ha observado que los niveles de los AG se encuentran elevados en
pacientes con HGNA y están directamente relacionados con la presencia de obesidad. Además,
la ganancia de peso en un 10% por ingesta de alimento en exceso o comida rápida y estilo de
vida sedentario puede generar un incremento de grasa en hígado; dicha grasa es almacenada
como TG en hígado. Se ha demostrado que los AG libres, en tejido adiposo visceral son la
principal fuente de TG hepáticos en HGNA. Además, la lipogénesis de novo en hígado se
encuentra incrementada de manera significativa en individuos con enfermedad de HGNA
(Chiang y col., 2011).
Los mecanismos involucrados en la etiopatogénesis de la RI relacionada con obesidad,
incluyen defectos caracterizados a nivel de pre-receptor, receptor y/o post-receptor,
principalmente como consecuencia de AG libres elevados, hiperinsulinemia e incremento de
citocinas (TNF-, IL-1, IL-6) (figura 3) (Castro y col., 2014). Mientras que, la asociación entre
HGNA y RI se debe, al menos en parte, al efecto de insulina en la producción de glucosa
30
hepática (gluconeogénesis) y la síntesis de novo de lípidos en hígado (Firneisz, 2014; Gruben y
col., 2014), supresión de lipólisis e hiperglucemia (Leite y col., 2014; Ahmed y col., 2015).
Además, se conoce que la RI es selectiva y sólo se produce por la vía implicada en el
metabolismo de la glucosa, pero no para la lipogénesis de novo. Por lo tanto, el incremento en
los niveles de insulina, sobre estimula la lipogénesis de novo, llevando a un incremento en la
producción de lípidos (López-Oliva y Muñoz-Martínez, 2014). Una ingesta excesiva de glucosa
o sacarosa también han mostrado promover el HGNA debido al incremento de lipogénesis de
novo (Ahmed y col., 2015).
A nivel de pre-receptor se considera que la RI se produce por disminución del acceso de
insulina al músculo como consecuencia de exceso de AG libres y sus metabolitos, así como por
disfunción endotelial secundaria llevando al incremento de insulina en circulación. En la
obesidad, la hiperinsulinemia es producida debido a un incremento en la producción de insulina
inducida por un exceso de AG y glucosa, así como por la disminución de la depuración de
insulina por el hígado (Castro y col., 2014).
Las bases moleculares que explican el incremento de la lipogénesis de novo en hígado, se
deben a que la hiperglucemia e hiperinsulinemia activan a SREBP-1c, el cual es un importante
factor de transcripción lipogénico; mientras que factores que participan en la glucogenólisis se
encuentran inhibidos (Gruben y col., 2014; Leite y col., 2014). También pueden activar el
proceso de lipogénesis, por su unión a proteína de unión a elemento de respuesta a hidratos de
carbono (ChREBP), la cual al ser activada incrementa la síntesis de novo de AG libres (Hassan
y col., 2014; Leite y col., 2014; López-Oliva y Muñoz-Martínez, 2014). En estudios realizados
en pacientes con HGNA se ha mostrado que la mayoría de grasa hepática se origina de AG libres
(59-60%), pero 25-26% proviene de lipogénesis de novo y el 15% restante se forma a partir de
31
los AG procedentes de la dieta (figura 3) (Leite y col., 2014; López-Oliva y Muñoz-Martínez,
2014).
El exceso de AG libres característico de estado de obesidad, pueden ser oxidados por las
mitocondrias y los peroxisomas; pero el incremento de oxidación de AG libres lleva a la
producción excesiva de ATP, estrés oxidativo y disfunción mitocondrial, producción de ROS,
estrés del retículo endoplásmico (ERS), almacenamiento de lípidos y acumulación de derivados
tóxicos no oxidativos (diacilglicerol -DAG- y ceramidas) productos del metabolismo de AG
libres. Los factores mencionados activan vías de inflamación (Castro y col., 2014; Leite y col.,
2014). Además, el DAG y las ceramidas generan daño en la función celular (lipotoxicidad) o
apoptosis, y en el páncreas estos efectos tóxicos llevan a una disminución del número y
capacidad de células para secretar insulina, predisponiendo al desarrollo de DMT2 (Castro y
col., 2014).
El incremento de adiposidad y RI en individuos obesos contribuye a la progresión de
EHNAS a fibrosis (Chiang y col., 2011). Además, en estados de hiperinsulinemia y RI, se
incrementa la producción de ROS, debido a un incremento en la inducción y actividad de
CYP2E1. Esto es debido a la pérdida del efecto represivo de la insulina en la expresión de
CYP2E1. La producción de ROS promueve la activación de células estelares hepáticas y
progresión a fibrosis. Por su parte el incremento de estrés oxidativo mediado por CYP2E1 puede
dañar la señalización de insulina hepática, exacerbando la RI en hígado, así como daño hepático
(McClain y col., 2004; Chiang y col., 2011).
La RI en tejido adiposo también produce cantidades excesivas de AG libres por la vía de
la lipólisis, creando un círculo vicioso de acumulación de metabolitos tóxicos, esteatosis y RI
(Peverill y col., 2014). Por otra parte, la lipotoxicidad producida por los AG libres y sus
32
metabolitos, induce apoptosis de células hepáticas; activación de células de Kupffer, daño en la
señalización de insulina y RI en hígado, así como progresión a fibrosis y eventualmente puede
llevar a cirrosis (Firneisz, 2014).
En la RI asociada a obesidad, existe una regulación negativa del receptor de insulina,
secundario a hiperinsulinemia, llevando a la eliminación de la insulina de la circulación
sanguínea. La hiperinsulinemia también promueve la RI debido a una retroalimentación
negativa que inhibe la fosforilación de los sustratos de receptor de insulina (IRS-1 o -2) y la
subsecuente inhibición de la vía de PI3K responsable de los efectos metabólicos. Como
consecuencia de esta inhibición ocurre: 1) disminución en la translocación de GLUT-4 a
membrana de tejido hepático, muscular y adiposo, alterando la captura de glucosa; 2)
incremento en la producción de glucosa por el hígado, ya sea por inhibición de glucogénesis o
promoción de glucogenólisis y 3) incremento de lipogénesis de novo, almacenamiento de lípidos
y derivados tóxicos (Tilg y Moschen, 2008; Castro y col., 2014).
A nivel post-receptor ocurre una inhibición de cascadas intracelulares de varios factores
relacionados con adiposidad, por ejemplo, AG libres, alteración de secreción adipocitocinas y/o
citocinas, como es la disminución de adiponectina, e incremento de TNF- e IL-6. Como
consecuencia, los AG libres y las citocinas son liberados a circulación sanguínea (Castro y col.,
2014). Por otra parte, el sustrato de receptor Shc, es inhibido por AG libres o citocinas y es
estimulado por hiperinsulinemia; en consecuencia, la vía de proteína cinasa activada por
mitógeno (MAPK) es activada, produciendo efectos antiapoptóticos y proliferación,
culminando en crecimiento de tejido (figura 3) (Castro y col., 2014). Las consecuencias
metabólicas y no metabólicas de RI y acumulación ectópica de grasa son: hiperglucemia,
33
hipertrigliceridemia, acantosis nigricans, neoplasias, esteatosis, crecimiento celular o disfunción
de apoptosis celular (Castro y col., 2014; López-Oliva y Muñoz-Martínez, 2014).
Se ha sugerido que la obesidad puede llevar al desarrollo de RI en hígado a través de la
activación de macrófagos proinflamatorios M1 en tejido adiposo y a la liberación de citocinas
proinflamatorias como IL-6 y TNF-(Chiang y col., 2011). Además, el desbalance de lípidos,
el estrés oxidativo y las citocinas proinflamatorias actúan sinérgicamente para promover la
acumulación de grasa hepática con el tiempo (Dietrich y Hellerbrand, 2014; Ahmed y col.,
2015). El TNF-tiene participación importante en la RI e HGNA, se ha reportado que tanto
personas como ratones obesos presentan un incremento en la secreción de TNF- y esta citocina
junto con AG libres estimulan la inhibición de la fosforilación de IRS1, llevando a una
disminución en la señalización de insulina (Tilg y Moschen, 2008). Así mismo, se ha observado
un incremento en la expresión de TNF- en pacientes con enfermedad de HGNA,
correlacionando la expresión de la citocina con el grado de fibrosis y DMT2 (Tilg y Moschen,
2008). Los cambios en la expresión de citocinas (TNF-IL-6) y adipocinas (adiponenctina y
leptina), actúan como mediadores de la activación de células estelares y fibrogénesis. La leptina
y adiponectina se han implicado en la patogénesis de EHNA y RI. Se han asociado bajas
concentraciones de adiponectina con niveles elevados de grasa visceral, lo cual está implicado
en el desarrollo de RI (McClain y col., 2004). Además, existen reportes que sugieren que la
leptina activa directamente a células estelares hepáticas y también indirectamente mediante
efectos estimulantes sobre las células de Kupffer (Chiang y col., 2011).
34
Figura 3. Mecanismos moleculares en la relación de RI, obesidad e HGNA en una célula
hipotética (hepatocito, miocito o adipocito). La RI asociada con obesidad ocurre debido a
alteraciones a nivel pre-receptor, receptor y/o post-receptor, como consecuencia de AG libres
elevados, hiperinsulinemia e incremento de citocinas. El acceso de insulina al espacio
intersticial puede ser inducido por el exceso de AG libres y sus metabolitos, así como por
disfunción endotelial secundaria, llevando a incremento de insulina en circulación. La
hiperinsulinemia causada lleva a una regulación a la baja de los receptores de insulina. Además,
la señalización del receptor de insulina se encuentra inhibida como consecuencia de los AG
libres y citocinas. El incremento de AG libres también contribuye a disfunción mitocondrial,
incremento en ROS, almacenamiento de lípidos y acumulación de derivados tóxicos no
oxidativos (DAG y ceramida), estos a su vez activan vías de inflamación. Independientemente
del nivel del daño del receptor a insulina, la RI ocurre por inhibición de la fosforilación de los
35
IRS y la subsecuente inhibición de la vía de PI3K que a su vez lleva a la inhibición del
componente metabólico a excepción de lipogénesis de novo. Por otra parte, el sustrato de
receptor Shc, es inhibido por AG libres o citocinas y es estimulado por hiperinsulinemia. En
consecuencia, la vía de MAPK es activada, produciendo efectos antiapoptóticos y proliferación,
culminando en crecimiento de tejido. Por otra parte, el HGNA es una enfermedad con un
espectro continuo que incrementa su gravedad desde EHNA, EHNAS, caracterizada por la
existencia de necroinflamación, apoptosis de los hepatocitos, que puede progresar a fibrosis y
cirrosis. En este proceso de evolución de EHNA a EHNAS tiene participación importante la
activación de células de Kupffer y células estelares hepáticas que favorecen procesos de
inflamación y fibrosis (Castro y col., 2014; López-Oliva y Muñoz-Martínez, 2014).
36
La IL-1, sintetizada por el tejido adiposo, también tiene participación importante en el
desarrollo de RI. La IL-1 reduce la expresión de IRS1 a nivel transcripcional a través de un
mecanismo dependiente de ERK y a nivel post-transcripcional por un mecanismo independiente
de ERK. Al tener como blanco a IRS1, la IL-1 daña la señalización de insulina y puede
contribuir con otras citocinas a la asociación de inflamación con la RI (GPC, 2012).
Los AG, entre otros factores, inducen ERS que induce activación de Jun cinasas (JNK9
por la vía de IRE1/ASK2), una señalización que se ha descrito tanto en células del páncreas
como en células hepáticas. La activación de esta vía puede llevar hasta el inicio de un proceso
apoptótico produciendo la muerte de células del páncreas y células hepáticas (Firneisz, 2014),
la hiperactivación de JNK también puede desencadenar en daño de la señalización de insulina
llevando al desarrollo de DMT2 (Peverill y col., 2014).
4.4. Diagnóstico de HGNA y enfermedades asociadas
4.4.1. Diagnóstico de obesidad
En el proceso de evaluación diagnóstica médica integral del paciente con obesidad, se
deben obtener datos clínicos, antropométricos, bioquímicos y dietéticos. Se recomienda
documentar en la nota médica: estatura, peso, IMC (donde un IMC ≥ 30 kg∙m-2 determina
obesidad), circunferencia de cintura, signos vitales, hábitos de actividad física y alimentaria,
entre otros. Se recomienda considerar a un paciente con sobrepeso si tiene una circunferencia
de cintura en mujeres >80 cm y hombres >90 cm (GPC, 2012).
4.4.2. Diagnóstico de RI
El método más utilizado para medir la sensibilidad tisular a la acción de la insulina es el
“clamp”. En este procedimiento deben conocerse dos parámetros: 1) los niveles de glucemia y
37
2) los niveles de insulina en condiciones controladas. El método consiste en administrar insulina
hasta alcanzar una concentración estable determinada por lo común de 100 U∙mL-1; una vez
que se logra, la cantidad de glucosa que se necesita administrar, por vía intravenosa para
mantener la normoglicemia (80 a 90 mg∙dL-1), se toma como indicador del grado de RI; sin
embargo, este método es costoso y se utiliza solo en investigación (Garber y col., 2004).
Otras alternativas menos complejas son la prueba de sensibilidad a la insulina endovenosa
o el modelo mínimo que también se limitan a estudios de investigación. Existen diferentes
ecuaciones que sirven para estimar la sensibilidad a la insulina a partir de la glucemia e insulina
en ayunas, así como a través de una prueba de tolerancia a la glucosa oral (PTGO) con
aproximación razonable a la obtenida con el “clamp” o pinza metabólica (Garber y col., 2004;
LaBrecque y col., 2012). Alrededor del 40% de los pacientes con intolerancia a hidratos de
carbono tiene glucosa en ayuno <110 mg∙dL-1, por lo que no se les puede diagnosticar diabetes,
motivo por el cual la PTGO es útil para detectar con mayor sensibilidad a los pacientes con RI
(Garber y col., 2004).
4.4.3. Diagnóstico de HGNA
El diagnóstico de HGNA generalmente se basa en características clínicas, pruebas de
funcionamiento hepático y pruebas de imagen (Dyson y Day, 2014).
4.4.3.1. Exclusión de consumo significativo de alcohol
Para considerar que se trata de HGNA se deben tener datos detallados del consumo de
alcohol del paciente, debe encontrarse en un umbral <20 g/día en mujeres y <30 g/día en
hombres (LaBrecque y col., 2012; Dietrich y Hellerbrand, 2014; Abd El-Kader y El-Den
Ashmawy, 2015).
38
Además de excluir el consumo de alcohol, también debe excluirse la posibilidad de que
el hígado graso sea causa de infección de hepatitis B o C, hemocromatosis o enfermedad de
Wilson (Abd El-Kader y El-Den Ashmawy, 2015), o bien como consecuencia de consumo de
medicamentos como, prednisolona, tamoxifeno, amiodarona, metrotrexato, entre otros (Leite y
col., 2014).
4.4.3.2. Análisis de laboratorio de rutina
Se utilizan algunas pruebas de imagenología para identificar grasa en hígado, como son
la resonancia magnética y la ecografía; sin embargo, ningún estudio imagenológico puede
identificar la grasa con exactitud si es menor al 33%, tampoco permite distinguir entre hígado
graso e HGNA, normalmente lo que se distingue es hepatomegalia (LaBrecque y col., 2012;
Abd El-Kader y El-Den Ashmawy, 2015). Por lo que es necesario realizar otro tipo de pruebas
diagnósticas, como es la cuantificación de enzimas hepáticas. La anormalidad más común
observada en HGNA es la presencia de niveles elevados de las transaminasas ALT (incremento
de 1.5 a 4) y aspartato aminotransferasa (AST) (LaBrecque y col., 2012; Dietrich y Hellerbrand,
2014; Abd El-Kader y El-Den Ashmawy, 2015). También se pueden ver elevados los niveles
en suero de las enzimas -glutamiltransferasa (GGT) y colinesterasa. Sin embargo, a pesar de
que se consideren en conjunto, los análisis de laboratorio de rutina no son suficientes para el
diagnóstico de HGNA o para diferenciar HGNA de otros tipos de enfermedades hepáticas
(Dietrich y Hellerbrand, 2014).
4.4.3.3. Biomarcadores
Se ha considerado una gran variedad de biomarcadores para el diagnóstico de EHNA,
tales como TNF-, IL-6, quimiocinas MCP-1 y quimiocina CCL5 (RANTES) o factor de
crecimiento de fibroblastos 21 (FGF21). Sin embargo, muy pocos se han validado de forma
39
independiente, y la capacidad de diferenciar entre EHNA e EHNAS no es satisfactoria. Esto
puede ser por el hecho de que estos biomarcadores no indican únicamente actividad inflamatoria
en hígado, sino que también indican inflamación de otros órganos que pueden ser afectados por
el SM. La capacidad diagnóstica puede mejorar cuando se evalúan dos factores inflamatorios
(Dietrich y Hellerbrand, 2014).
4.4.3.4. Biopsia hepática
En la biopsia hepática, el análisis de la muestra se realiza con base a un sistema de
puntuación histológica (Cuadro 1) para determinar el grado de esteatosis hepática (LaBrecque
y col., 2012); y de manera independiente se determina el grado de fibrosis, de la manera
siguiente: sin fibrosis (F0), con fibrosis interlobulillar o portal sin septa (F1), fibrosis portal con
algunas fibras septa (F2), con fibras septa que unen vena central y portal (F3) y cirrosis (F4)
(Diehl y Day, 2017). La biopsia hepática es considerada el patrón de oro para identificar hígado
graso, al considerarse como el método diagnóstico más preciso, aunque no permite distinguir
entre hígado graso e HGNA. Sin embargo, ésta solo se realiza después de haber realizado
pruebas no invasivas que indiquen que el paciente puede presentar HGNA. Además de que la
alta prevalencia de SM hace irreal a la biopsia hepática como opción de diagnóstico (Dietrich y
Hellerbrand, 2014).
4.5. Alternativas farmacológicas para la enfermedad de HGNA
Los objetivos principales en pacientes con enfermedad HGNA son: disminuir o detener la
progresión de la enfermedad, disminuir la esteatosis, reducir los niveles de enzimas hepáticas,
prevenir inflamación y fibrosis. Teniendo en cuenta el papel fisiopatológico del SM en el
desarrollo y progresión de la enfermedad, el enfoque que se da en el manejo de HGNA es el
tratamiento de los factores de riesgo (obesidad y RI) (Dietrich y Hellerbrand, 2014).
40
Cuadro 1. Sistema de puntuación histológica de la Red de Investigación Clínica sobre
EHNA (LaBrecque y col., 2012).
Grado de actividad de EHNA: grado = puntuación total: S + L + B (rango 0-8)
Esteatosis Puntuación
S Inflamación
lobular Puntuación
L Balonamiento hepatocítico
Puntuación B
<5% 0 No hay 0 No hay 0
5- 33% 1 <2 1 Pocas células
balonadas 1
34- 66% 2 2- 4 2 Muchas células balonadas
2 >66% 3 >4 3
41
Es decir, se ha postulado el uso de agentes sensibilizadores de insulina (metformina,
tizolidinedionas), antilipémicos (fibratos), antioxidantes (vitamina E), inhibidores de TNF-
(pentoxifilina), entre otros (Ganesh y Rustgi, 2016; Lisboa y col., 2016). Sin embargo, en la
actualidad no existe ningún tratamiento farmacológico específico probado para EHNA/EHNAS.
Por lo que, en ausencia de un tratamiento para el manejo de HGNA, se opta para el manejo de
afecciones asociadas.
4.5.1. Metformina
La metformina es un medicamento utilizado para el control de la RI y DMT2, considerado
como tratamiento de primera elección en estos padecimientos, especialmente en pacientes con
sobrepeso; también pudiera considerarse como una opción en el tratamiento de HGNA, debido
a que se sugiere puede permitir manejar las afecciones asociadas con la patología (Dietrich y
Hellerbrand, 2014). Es una biguanida que mejora la RI e hiperinsulinemia por reducción de
producción de glucosa hepática (gluconeogénesis), incrementa la recaptura de glucosa periférica
por los músculos y tejido adiposo, al incrementar la acción de insulina; a nivel molecular estas
acciones son mediadas por la activación de la proteína cinasa activada por AMP celular (AMP
cinasa) y revierte RI inducida por TNF- (Davis, 2007; Cicero y col., 2012; Lisboa y col., 2016).
Además de sus efectos antihiperglucémicos, la metformina también ha reportado ejercer
efectos antilipídicos, hepatoprotectores, antineoplásicos y cardioprotectores. Debido a que
disminuye el apetito, incrementa la esterificación de AG libres e inhibición de lipólisis en tejido
adiposo (Cicero y col., 2012; Clarke y col., 2015). Este medicamento, también puede disminuir
los niveles en suero de aminotransferasas debido a la mejora en RI hepática, aunque los cambios
no son significativos, en contraste, algunos estudios han confirmado que la metformina no tiene
42
efectos benéficos en histología hepática en niños y adultos (Dietrich y Hellerbrand, 2014; Dyson
y Day, 2014; Firneisz, 2014; Abd El-Kader y El-Den Ashmawy, 2015).
4.5.2. Chalconas como potencial alternativa farmacológica
Las chalconas son consideradas precursores de los flavonoides e isoflavonas, actúan en
mecanismos de defensa de algunas plantas para contrarrestar ROS con lo que permite la
sobrevivencia y prevención de daño molecular y daño por animales, microorganismos e insectos
(Qu y col., 2014). Se encuentran distribuidas ampliamente en productos naturales; frutas,
vegetales, especias, té y productos alimenticios de soja (Nowakowska, 2007). Son metabolitos
secundarios de las plantas e incluyen 2 anillos bencénicos que están unidos entre sí por tres
carbonos, formando un grupo carbonilo ,-insaturado (figura 4) (Ebadollahi-Natanzi y col.,
2011; Quian y col., 2011).
Las chalconas y sus derivados ejercen una gran cantidad de propiedades biológicas, como
por ejemplo, antiinflamatoria, antimicrobiana, antifúngica, antioxidante, citotóxica
(Nowakowska, 2007; Arianingrum, 2014) y antihipertensiva (Qu y col., 2014).
4.5.2.1. Acción antioxidante
El estrés oxidativo es producido por las ROS, las cuales pueden destruir la función
fisiológica de proteínas celulares, lípidos, ácidos nucleicos y otras macromoléculas. La
producción de ROS produce daño oxidativo del DNA mitocondrial, lleva al envejecimiento y a
muchas enfermedades en seres humanos. El efecto antioxidante de las chalconas es uno de los
más estudiados. Algunos estudios sugieren que las chalconas con buena actividad
antiinflamatoria usualmente poseen de manera simultánea efectos antioxidantes significativos
(Wu y col., 2014).
43
Figura 4. Estructura general de las chalconas. Las chalconas están constituidas por dos
anillos bencénicos (anillos A, B) que están unidos entre sí por tres carbonos, formando un grupo
carbonilo ,-insaturado (Quian y col., 2011).
44
Por otra parte, se ha sugerido que los sustituyentes hidroxilo en grupos aromáticos de las
chalconas pudieran ser grupos claves para incrementar la actividad antioxidante de las chalconas
(Lahsasni y col., 2014).
Derivados de chalconas (E)-3-(4-hidroxi-3-metoxifenil)-1-(4-metoxifenil)-prop-2-en-1-
ona y (E)-3-(4-hidroxifenil)-1-(4-metoxifenil) prop-2-en-1-ona disminuyen el daño causado por
H2O2 en cultivo de células de feocromocitoma de rata (Wu y col., 2014). Mientras que chalconas
con sustituyente éster en anillo B han mostrado ejercer actividad antioxidante, mediante el uso
del método de barrido (scavenger) del radical 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH) (Pan y col.,
2013; Lahsasni y col., 2014). Así mismo, la 4-hidroxi-3,5-dimetoxi-2’-hidroxichalcona (Pan y
col., 2013) y la licochalcona C (Zhou y col., 2015) incrementan la actividad anti radicales libres
en ratones y en ratas Sprague-Dawley en respuesta a estrés oxidativo, debido a su capacidad de
elevar los niveles de glutatión peroxidasa (GPx) y superóxido dismutasa (SOD), mientras que
disminuye los niveles de malondialdehído (MDA), en un modelo de Alzheimer inducido por
escopolamina y en un modelo de daño de corazón por isquemia y perfusión, respectivamente.
4.5.2.2. Acción antiinflamatoria
La inflamación es el principal factor de riesgo de DMT2, aterosclerosis, cáncer y otras
enfermedades crónicas (Yadav y col., 2011). Por tal motivo, se ha dado gran importancia al
desarrollo de compuestos que ejerzan acciones antiinflamatorias.
La inhibición de prostaglandina E2 (PGE2) y producción de óxido nítrico (NO) se han
propuesto como una potencial terapia para diferentes trastornos inflamatorios. Esto, debido a
que grandes cantidades de NO pueden llevar a daño tisular, y se ha observado que en
enfermedades inflamatorias se presenta una excesiva producción de NO por la activación de
macrófagos (Nowakowska, 2007; Singh y col., 2014). También se sabe que el factor nuclear
45
kappa B (NF-B) regula estímulos proinflamatorios como TNF-, IL-1, IL-6, ciclooxigenasa 2
(COX-2) y 5-lipooxigenasa (Yadav y col., 2011).
Algunas chalconas han mostrado tener actividad importante como “barrendero” (en
inglés: “scavenger”) de anión superóxido generado por estimulación de neutrófilos humanos o
por el sistema de hipoxantina/xantina oxidasa (HX/XO) (Nowakowska, 2007). La chalcona
brusochalcona A (BCA) inhibe la expresión de sintasa de óxido nítrico inducible (iNOS) a través
de un mecanismo dependiente de superóxido (Yadav y col., 2011). Estas características
antiinflamatorias participan en la reducción de migración de leucocitos, probablemente
dependiente de la captura de superóxido como radicales libres de oxígeno y otros antioxidantes,
puede llevar a la activación de neutrófilos y adhesión a endotelio (Nowakowska, 2007). Algunas
otras chalconas (p. ej. cardamonina, buteina, licochalcona A) inhiben la producción NO y PGE2
por su acción sobre la expresión de iNOS y de COX-2. Indicando que la inhibición de NO es
debido a la inhibición de iNOS, mientras que la inhibición de PGE2 lo es por la inhibición de
COX-2 (Nowakowska, 2007; Yadav y col., 2011; Singh y col., 2014).
Madan y col., 2000, describieron a la 2’-hidroxichalcona como un compuesto con
capacidad de inhibir la adhesión de neutrófilos a células endoteliales al disminuir la expresión
de moléculas de adhesión intercelular-1 (ICAM-1), moléculas de adhesión vascular-1 (VCAM-
1) y E-selectina inducidas por IL-1 y TNF- a través de la activación de NF-B. Indicando
que la 2’-hidroxichalcona tiene actividad antiinflamatoria, debido a que estas proteínas se
encuentran sobre expresadas en células endoteliales en varias enfermedades inflamatorias.
Mientras que Dorn y col., 2012, demostraron que Xanthohumol, una chalcona de origen natural,
puede inhibir a TNF- debido a que disminuye la actividad de NF-B en cultivos celulares de
hepatocitos humanos primarios y disminuye la activación de células estelares hepáticas in vitro.
46
Sin embargo, el Xanthohumol no ejerció cambios significativos en ratones BALB/c en la
progresión de inflamación en un modelo de esteatohepatitis no alcohólica.
4.5.2.3. Acción antihipertensiva
Se tienen pocos reportes sobre la habilidad de las chalconas para actuar como
antihipertensoras, al respecto Qu y col. estudiaron el efecto de la 4-HC (10, 20, 40 mg∙kg-1, vía
p.o., dos veces al día, por 35 días) en ratones carentes de citocromo. Ellos describen que los
ratones carentes de citocromo tienen una presión sanguínea más elevada (118 ± 8.6 mmHg) que
los tipos silvestres (103 ± 5.5 mmHg), y la 4-HC disminuyó de manera significativa la presión
sanguínea y el daño renal asociado en los ratones carentes de citocromo. El efecto observado,
lo explican debido a que la 4-HC: i) disminuye los niveles de aldosterona; ii) ejerce actividad
antiinflamatoria, al disminuir de manera significativa los niveles de IL-1 y TNF-, comparado
con los grupos carentes de citocromo, iii) disminuye daño renal, debido a que disminuye los
niveles del factor de transcripción NF-B en el núcleo de células de riñón, esta proteína es un
factor de transcripción importante en mecanismos renales proinflamatorios activados en
respuesta a hipertensión arterial (Qu y col., 2014).
4.6. Antecedentes
El HGNA se considera dentro de las enfermedades hepáticas crónicas más comunes cuya
distribución a nivel mundial está íntimamente relacionada con la obesidad, DMT2, RI y SM
(LaBrecque y col., 2012; Dietrich y Hellerbrand, 2014). La obesidad y DMT2 tienen una
prevalencia alarmante, además de mostrar una tendencia a seguir incrementando (ENSANUT-
MC, 2016; OMS, 2016a). Así mismo, la prevalencia de HGNA se ha elevado a más del 30% en
adultos en países desarrollados, con una incidencia que va en aumento, atribuible a la asociación
del HGNA con obesidad y DMT2 (Dietrich y Hellerbrand, 2014).
47
La importancia de un adecuado tratamiento para la enfermedad de HGNA radica en su
prevalencia, en el daño que genera en el organismo, así como su posible evolución a cirrosis o
cáncer hepático y por supuesto en su importancia como factor de riesgo de otras enfermedades,
entre éstas las cardiovasculares (Dietrich y Hellerbrand, 2014; Adams y col., 2017; Brea y col.,
2017). A pesar de ello, en la actualidad no existe un tratamiento específico para la enfermedad
y los tratamientos que se prescriben se enfocan en el manejo de los factores de riesgo.
4.6.1. Efecto de la metformina en hígado graso
La metformina es un agente sensibilizante de insulina, la cual ha sido evaluada en un
estudio in vitro en células HepG2 (Ramachandran y Saraswathy, 2014) donde mostró ejercer
protección hepática contra daño inducido por acetaminofén, como consecuencia de haber
producido una sobre regulación del factor de transcripción Nrf2 y con esto un incremento de los
elementos de respuesta antioxidante, tales como la GPx y glutatión reductasa (GR). También ha
inducido supresión de estrés oxidativo hepático en ratas Sprague-Dawley macho, mediante
disminución de MDA, e incremento de SOD, GSH y GPx; además, de disminuir daño hepático
en ratas con EHNAS y cirrosis (Xu y col., 2016).
Por otra parte, se ha reportado que metformina revierte hepatomegalia, esteatosis y
alteraciones de pruebas hepáticas en modelos de hígado graso; así mismo disminuye ALT o
AST y TNF- en ratas Sprague-Dawley macho (Raso y col., 2009). Mientras que Liu y col.,
2014 y Woo y col., 2014 realizaron estudios en ratones C57BL/6 y Liu y col. además en ratones
ob/ob (deficientes de leptina), tratados con metformina (75 mg∙kg-1 por día y 150 mg∙kg-1 por
día respectivamente) durante cuatro semanas. En el caso de Liu y col. encontraron que la
metformina previene el desarrollo de grasa en hígado en ratones ob/ob, y disminuye
significativamente el peso corporal y los niveles de TG, colesterol LDL y glucosa en suero en
48
ratones ob/ob. En tanto que Woo y col. demostraron que disminuyó la RI, intolerancia a la
glucosa, la esteatosis hepática inducida por la dieta alta en grasa; además disminuyó el proceso
inflamatorio en hígado, debido a que la metformina disminuyó significativamente los niveles de
mRNA de IL-6, IL-1 y TNF- en hígado. Además, ha mostrado protección contra fibrosis
inducida por tetracloruro de carbono (CCl4) por supresión de TGF-1 (Fan y col., 2017).
Algunos estudios realizados en seres humanos demuestran que el tratamiento con
metformina disminuye significativamente ALT y peso corporal, sin embargo, no se observa
mejoría en histología hepática; otros estudios indican que la metformina únicamente tiene efecto
en reducción del IMC e incremento en la sensibilidad hepática a insulina, sin ejercer cambios
significativos en transaminasas o esteatosis hepática no alcohólica (Haukeland y col., 2009;
Doycheva y Loomba, 2014).
A pesar de los estudios realizados de metformina son pocos los elaborados en HGNA y
sus resultados no son concluyentes; por tal motivo, los investigadores han continuado la
búsqueda de moléculas farmacológicas con posible acción terapéutica, entre éstas, destaca el
estudio de la 4-HC.
4.6.2. Toxicidad de 4-HC
En el laboratorio de “Productos Naturales” de la Facultad de Ciencias Químico Biológicas
de la Universidad Autónoma de Sinaloa, se han sintetizado diferentes hidroxichalconas, entre
las que se encuentra la 4-HC, con la que se han realizado estudios para evaluar su toxicidad
aguda y subcrónica in vivo, así como in vitro. El primer caso corresponde a un estudio realizado
por Armenta-Gutiérrez (tesis de maestría) en el que se evaluó la toxicidad in vivo de la 4-HC
por el método de Lorke para determinar la dosis letal 50 (DL50), para ello utilizaron ratones
Balb/C macho, a quienes administraron dosis de 10, 100, 1000, 1600, 2900 y 5000 mg∙kg-1 de
49
4-HC, después de 24 h se registró el número de sobrevivientes. Encontrando que, la 4-HC no
presentó toxicidad in vivo entre el rango de dosis evaluadas, por lo que se consideró como
compuesto no tóxico (Armenta-Gutiérrez, 2016).
El segundo caso, corresponde a un estudio realizado por Santos-Ballardo (tesis de
licenciatura), en dicho estudio se evaluó la toxicidad subcrónica de la 4-HC administrada a la
dosis de 0.125, 0.250 y 0.5 g∙kg-1; vía p.o. diariamente durante 7 semanas, en ratas Wistar
macho. Encontrando que la 4-HC no causó sintomatología letal o que ponga en riesgo la vida
del animal de experimentación. Sin embargo, generó alteraciones en algunos parámetros de
perfil hepático, como en fosfatasa alcalina (FA) y AST, y engrosamiento en endotelio de túbulos
contorneados distales y proximales; sin embargo, estas alteraciones no se atribuyeron
completamente a la administración de la 4-HC, si no al vehículo utilizado dimetilsulfóxido
(DMSO) 5%, por lo que sugieren que la 4-HC es biosegura a nivel hepático y renal a las dosis
y tiempos evaluados (Santos-Ballardo, 2016).
Recientemente, se realizó un estudio in vitro, por Félix-Zavala (tesis de licenciatura), en
que se evaluó la actividad hemolítica de 4-HC en eritrocitos humanos y múridos, utilizando
concentraciones de 10, 100, 400 y 800 M, evaluado a los cero, 60, 120 y 180 min. Reportando
que la 4-HC ejerció una actividad máxima de hemolisis de 23% a los 180 min en eritrocitos
múridos y humanos. Considerando a la 4-HC como parcialmente hemolítica (Félix-Zavala,
2018).
50
4.6.3. Efectos farmacológicos de la 4-HC y análogos
4.6.3.1. Acción antiparasitaria
Desde hace tiempo se conoce que las chalconas poseen actividad antimicrobiana, entre las
que se encuentran la actividad antibacteriana, antifúngica y antiparasitaria (Nowakowska, 2007;
Singh y col., 2014). De esta última, en nuestro grupo de trabajo se han realizado estudios que
indican que la 4-HC presenta actividad antiparasitaria.
En 2018 se reportó un estudio in vitro en parásitos adultos de Hymenolepis nana, donde
la 4-HC generó parálisis en el parásito a los 60 s y muerte a los 10 min de ser adicionado al
medio a 20 mg∙mL-1, siendo tiempos muchos menores a los obtenidos por el praziquantel a 20
mg∙mL-1, el cual es el fármaco utilizado en clínica (Díaz-Carrillo y col., 2018). Ese mismo año,
Beltrán-Aguilar (tesis de licenciatura) evaluó in vitro el efecto de 4-HC contra Trypanosoma
cruzi y Giardia duodenalis, observando que la 4-HC presentó actividad antiprotozoaria contra
T. cruzi con una concentración de 940.4 g∙mL-1, y contra G. duodenalis con una concentración
de 7.3 g∙mL-1 (Beltrán-Aguilar, 2018).
4.6.3.2. Acción antineoplásica
Se ha reportado que varias chalconas pueden inhibir diferentes etapas del proceso de
carcinogénesis, desde estadios tempranos, como lo es el inicio de la formación de tumor, a través
de promoción, progresión, angiogénesis e invasión, hasta estadios muy avanzados que llevan a
metástasis. Así mismo, se ha visto que están implicadas en la inducción de muerte celular en
células transformadas (Orlikova y col., 2011).
En este sentido, Varinska y col., demostraron que la 4-HC (22 g∙mL-1) suprime la
expresión del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), lo que le permite tener
51
capacidad de inhibir la migración celular y disminuir la proliferación endotelial celular, inhibe
la fosforilación de Akt y de la cinasa regulada por señal extracelular (ERK) inducidas por VEGF
en células endoteliales de cordón umbilical de ser humano, aunque en este estudio no se observó
la inhibición de la vía de NFB, por lo que sugieren que la 4-HC tiene efecto antigénico
específico (Varinska y col., 2012).
Por otra parte, Loa y col. (2009) evaluaron la actividad citotóxica, sobre células HepG2
(carcinoma hepatocelular humano), de varios flavonoides y chalconas, entre ellas la 4-HC. La
4-HC presentó actividad citotóxica sobre células HepG2 con una concentración inhibidora 50
(IC50) de 67.77 M.
Pilatova y col. demostraron que la 4-HC ejerce actividad citotóxica contra células Jurkat
(leucemia linfoblástica-T aguda humana) con una concentración de 10-5 y 10-4 mol∙L-1, y contra
células HeLa (cáncer cervicouterino humano) con la concentración de 10-4 mol∙L-1, en el ensayo
de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT) después de 72 h de incubación
(Pilatova y col., 2010). Así mismo, nuestro equipo de trabajo realizó la evaluación de la
actividad citotóxica de la 4-HC en células HeLa mediante el ensayo de MTT, presentando
actividad citotóxica a las concentraciones de 100 M (53.29%), 250 M (61.13%) y 500 M
(77.4%) a las 24 h de incubación; con una IC50 de 128.5 M sobre células tumorales HeLa
(Escobar-Almazán, 2015).
4.6.3.3. Acción antioxidante y antiinflamatoria
Las chalconas han mostrado reducir de forma significativa los niveles de TNF-, un
mediador crucial del proceso inflamatorio, especialmente en condiciones crónicas
(Nowakowska, 2007; Singh y col., 2014; Fang y col., 2015), e inhibición de IL-6 (Singh y col.,
52
2014). Esta acción favorece, en ratones con diabetes mellitus, la disminución de daño renal y
cardiaco causado por la hiperglucemia (Fang y col., 2015). En este sentido, otro grupo de
investigadores (Qu y col., 2014) estudiaron el efecto de la 4-HC (10, 20, 40 mg∙kg-1, vía p.o.;
dos veces al día por 35 días) en ratones carentes de citocromo. Ellos demostraron que la 4-HC
tiene actividad antiinflamatoria, debido a que disminuye los niveles de IL-1 y TNF- en
ratones carentes de citocromo, comparado con ratones sin tratamiento, siendo 40 mg∙kg-1 la
dosis a que obtuvieron mayor efecto antiinflamatorio.
Quian y col. evaluaron el efecto antioxidante de varias chalconas, entre las que se
encuentran la 4-HC y la 4’-HC. Para esto determinaron las bases de su cinética de reacción como
acarreadoras de radicales libres (scavenging, en inglés) a través del radical galvinilo (GO∙) en
etanol y en acetato de etilo a 25°C. El GO∙ es ampliamente utilizado para evaluación de la
habilidad de los polifenoles para transferir átomos a radicales, como un mecanismo de
protección antioxidante. Quian y col. encontraron que la 4-HC pose mayor actividad
antioxidante que la 4’-HC, sugiriendo que el grupo hidroxilo en el anillo B es más activo que
en el anillo A (Quian y col., 2011).
Por otra parte, Armenta-Gutiérrez evaluó la actividad antioxidante y antiinflamatoria de
la 4-HC en ratas Wistar macho con las dosis de 0.02, 0.2 y 2 g∙kg-1, vía p.o. Dichas dosis fueron
administradas diariamente durante una semana, y 2 h después de la última dosis se administró
CCl4 (0.5 mL∙kg-1, vía i.p.) para inducir hepatitis tóxica. Los resultados demostraron que la 4-
HC presentó buena actividad antioxidante a una dosis de 0.2 g∙kg-1 de peso, debido a que inhibió
los niveles de MDA, metabolito de reacción de ROS, y aumentó los niveles de GSH, un
antioxidante celular. Además presentó buena actividad antiinflamatoria a esa misma dosis, ya
que se observó inhibición de los niveles de IL-6 (citocina proinflamatoria) y aumentó los de IL-
53
10 (citocina antiinflamatoria). Por lo anterior se propone a la 4-HC como un potencial agente
farmacológico antiinflamatorio, hepatoprotector y de utilidad de enfermedades que provocan
estrés oxidativo, como diabetes mellitus, Alzheimer, cirrosis hepática alcohólica y no
alcohólica, entre otras (Armenta-Gutiérrez, 2016).
4.6.3.4. Acción hepatoprotectora de hidroxichalconas
Pese a que existen pocos estudios realizados en cuanto al efecto hepatoprotector de las
hidroxichalconas, se deben considerar los estudios existentes del efecto de los flavonoides en
este rubro, debido a que las chalconas son precursores de los flavonoides. Al respecto, se han
realizado estudios in vitro e in vivo. Los cultivos primarios celulares de hepatocitos humanos
son considerados modelos de cultivos celulares óptimos para el estudio de determinantes de la
enfermedad del HGNA, donde la principal línea utilizada es HepG2, en la que se induce
esteatosis mediante la administración de altas concentraciones (25-30 mM) de glucosa, la cual,
a través de múltiples procesos, que incluyen glucólisis y generación de acetyl-CoA en ciclo de
Krebs llevan al desarrollo de lipogénesis de novo. En estudios in vitro, diversos polifenoles (por
ejemplo, luteolina, rutina), han mostrado poder disminuir la regulación de SREBP-1c, el cual es
importante en lipogénesis, así mismo, los polifenoles pueden disminuir la actividad de acetyl-
CoA carboxilasa, teniendo como consecuencia una disminución en los lípidos en células
HepG2; procianidina B1 también ha mostrado disminuir TG en estos cultivos celulares
(Rodriguez-Ramiro y col., 2016).
En estudios in vivo realizados en animales con modelo de HGNA se ha observado que los
polifenoles pueden disminuir la severidad de las consecuencias de la enfermedad de HGNA,
encontrando que disminuyen la acumulación de grasa en hígado al observar biopsias teñidas con
hematoxilina y eosina de Mayer (H&E), aunque se ha observado que esa reducción depende del
54
modelo animal y la dosis de los compuestos fenólicos utilizada (Rodriguez-Ramiro y col.,
2016).
Algunos ejemplos de flavonoides con efecto hepatoprotector son los siguientes: la
genisteína al ser consumida por ratones C57BL/6J junto con una dieta alta en grasa (36%)
durante 12 semanas en dosis de 1 g∙kg-1 de dieta, 2 g∙kg-1 de dieta o 4 g∙kg-1 de dieta, ha mostrado
disminuir el peso corporal, masa grasa, lípidos totales, TG, así como disminuir los niveles de
ALT e hipertrofia de adipocitos, además de incrementar la expresión de PPAR, AMPK y
adiponectina y disminuir la expresión de SREBP-1c y PPAR (Kim y col., 2010). La quercetina,
consumida por ratones C57BL/6J con dieta deficiente de colina y metionina, con dosis de 50
mg∙kg-1 por día durante 2 semanas (Marcolin y col., 2012) o 4 semanas (Marcolin y col., 2012;
Marcolin y col., 2013), disminuye la esteatosis hepática, el grado de inflamación y balonización
de los hepatocitos, así mismo, disminuye de manera significativa los niveles de ALT y AST.
Sus efectos se han asociado a su capacidad de activar PPAR, PPAR y adiponectina; así como
inhibición de lipogénesis y estimulación de oxidación de AG (Van De Wier y col., 2017).
Mientras, el resveratrol, ha sido probado con diferentes dosis (10, 30, 50 y/o 100 mg∙kg-1 de
peso por día) en diferentes modelos animales, como en ratas Wistar con una dieta alta en grasas,
ratas Sprague-Dawley con una dieta alta en fructosa o sacarosa, en ratas Zucker (fa/fa) con dieta
estándar o en ratones C56BL/6J con una dieta alta en grasa; mostrando ejercer disminución de
esteatosis hepática y TG, mientras que en algunos casos además, reportan disminución de los
niveles de ALT, AST y FA, así como de RI y peso corporal (Rodriguez-Ramiro y col., 2016).
Recientemente, en una revisión realizada por Van de Wier y colaboradores, sobre el efecto
que ejercen los flavonoides silimarina, flavonides de la soya y del té verde; reportaron que, la
silimarina estimula la oxidación de AG libres e incrementa la acción de PPAR, además de
55
disminuir la RI y en la enfermedad de HGNA presenta efectos antiinflamatorios al disminuir la
expresión de TNF- e inhibir al factor nuclear -B (NF-B), también disminuye los niveles
séricos de ALT y en histologías se presenta disminución de esteatosis e inflamación (Van De
Wier y col., 2017). En los flavonoides de la soya se encuentran la genisteína, daidzeína y
gliciteína; siendo la genisteína la más abundante; mientras que en los flavonoides del té verde,
se encuentran las catequinas, siendo la más abundante la epigalocatequina-galato; estos
flavonides han mostrado ejercer disminución de niveles séricos de lípidos y de ALT, así como
disminución de esteatosis. Las catequinas además han mostrado disminuir inflamación, lo cual
es asociado al efecto de flavonoides de la soya sobre la estimulación de oxidación de AG libres,
inhibición de lipogénesis y estimulación de actividad de PPAR, PPAR, adiponectina y
leptina, así como al efecto de flavonides de las catequinas para disminuir la peroxidación
lipídica, inhibir la actividad de NF-B y disminuir citocinas proinflamatorias. Sin embargo, en
estudios clínicos se han observado algunos efectos adversos como fatiga y dolor de cabeza
moderado (Van De Wier y col., 2017).
En cuanto a la 4-HC, se realizó un estudio en ratones macho albinos a los que se les indujo
daño hepático con acetaminofén (640 mg∙kg-1; vía p.o.) y se les administraron 4’-HC y 4-HC
(25, 50 y 100 mg∙kg-1) por dos días antes de la administración de acetaminofén. Los resultados
mostraron que las hidroxichalconas a la dosis de 50 mg∙kg-1 ejercieron protección contra el
efecto letal del acetaminofén. Tanto la 4’-HC como la 4-HC a la dosis de 50 mg∙kg-1
disminuyeron significativamente el incremento de las enzimas ALT y AST (Ebadollahi-Natanzi
y col., 2011).
También se ha observado que, la 4-HC (2 g∙kg-1, vía p.o.) ejerció efecto hepatoprotector
en ratas Wistar macho con daño hepático agudo inducido con CCL4 (0.05 ml∙kg-1, vía i.p.). Esto
56
debido a que la 4-HC al darse previo a la inducción de daño hepático, redujo los niveles séricos
de FA, AST y ALT; así mismo, evitó el incremento de IL-6 e incrementó IL-10 (Castillo-
Romero, 2017).
En resumen, la 4-HC no ha ejercido toxicidad aguda o subcrónica en estudios in vivo, por
el contrario, ha mostrado actividad antioxidante (in vitro e in vivo), antiinflamatoria (in vivo), y
hepatoprotectora (in vivo), previo a inducción de daño con acetaminofén y CCl4. En conjunto,
estos datos nos permiten inferir que podría ser una molécula farmacológica con potencial
actividad terapéutica en el tratamiento de HGNA.
57
V. JUSTIFICACIÓN
El HGNA se considera dentro de las enfermedades hepáticas crónicas más comunes, cuya
distribución mundial está íntimamente relacionada con DMT2 y obesidad. Los niveles de
prevalencia de DMT2 y obesidad son alarmantes a nivel mundial, nacional y regional, y en los
tres padecimientos indicados se observa una tendencia a incrementar tanto la incidencia como
la prevalencia. Considerando que el HGNA puede evolucionar a cirrosis hepática e incluso a
CHC y que es considerado factor de riesgo para enfermedades cardiovasculares, es de vital
importancia la existencia de un tratamiento adecuado. Sin embargo, en la actualidad se carece
de un tratamiento específico para el HGNA y los tratamientos que se prescriben se enfocan en
el manejo de los factores de riesgo, más no a resolver la EHNA. Se ha analizado el efecto
farmacológico de la metformina tanto en roedores como en seres humanos; sin embargo, son
pocos los estudios realizados y sus resultados no son concluyentes. Por otra parte, no se ha
reportado el efecto de 4-HC en animales o seres humanos con HGNA. No obstante, el hecho de
que ha mostrado ejercer efectos antioxidantes, antiinflamatorios y hepatoprotectores, permite
inferir que esta hidroxichalcona podría ejercer efectos benéficos en la enfermedad de HGNA,
disminuyendo el proceso inflamatorio característico de la progresión de la enfermedad, que es
un preámbulo al desarrollo de fibrosis y posible cirrosis o carcinoma hepático.
58
VI. HIPÓTESIS
El tratamiento con metformina y 4-hidroxichalcona ejerce un efecto terapéutico que
permite disminuir la progresión de hígado graso no alcohólico en ratas Wistar macho con
obesidad y resistencia a insulina, así como disminuir el proceso de formación de fibrosis
hepática asociada a la inflamación crónica.
59
VII. OBJETIVOS
7.1. Objetivo general
Determinar el efecto del tratamiento con metformina y 4-hidroxichalcona sobre el
desarrollo de hígado graso no alcohólico en ratas Wistar macho en un modelo de obesidad y
resistencia a insulina, así como su participación en el proceso de formación de fibrosis hepática
asociada a la inflamación crónica.
7.2. Objetivos específicos
7.2.1. Desarrollar el modelo de hígado graso no alcohólico en un modelo animal de obesidad y
resistencia a insulina.
7.2.2. Determinar el efecto del tratamiento con metformina y 4-hidroxichalcona en la progresión
de la enfermedad de hígado graso no alcohólico, en cambios de funcionamiento hepático
y desarrollo de esteatosis en ratas Wistar macho.
7.2.3. Determinar el efecto del tratamiento con metformina y 4-hidroxichalcona en proceso
inflamatorio a nivel sistémico en ratas Wistar macho sanas o con hígado graso no
alcohólico.
7.2.4. Determinar el efecto del tratamiento con metformina y 4-hidroxichalcona en el progreso
de desarrollo de fibrosis a nivel hepático en ratas Wistar macho sanas o con hígado graso
no alcohólico.
60
VIII. MATERIALES Y MÉTODOS
8.1. Tipo de estudio
Es un estudio de tipo longitudinal, prospectivo, correlacional, con diseño experimental,
controlado no aleatorio, cualitativo y cuantitativo (Hernández-Sampieri y col., 2006).
8.2. Síntesis de 4-HC
Los reactivos para la síntesis de la 4-HC fueron p-hidroxibenzaldehído, 1,4-dioxano, y el
catalizador BF3∙Et2O (trifloruro dieterato de boro) grado reactivo, de la marca Sigma Aldrich;
mientras la acetofenona de la marca Merk grado reactivo.
La síntesis de 4-HC se realizó con la metodología de Narender y Redy (Narender y Papi
Reddy, 2007), la cual es una condensación aldólica, en que se utiliza un ácido de Lewis
(BF3∙OEt2) como catalizador. En un matraz de fondo redondo con capacidad de 50 mL, se
colocó el correspondiente p-hidroxibenzaldehído (1.2 g), acetofenona (1 mL), 1,4-dioxano (4
mL) como disolvente y BF3∙OEt2 (0.6 mL) como catalizador. La mezcla se mantuvo en agitación
constante durante 12 h a temperatura ambiente. Posteriormente, se agregó agua acidificada a la
reacción (10 mL). La fase orgánica se extrajo con acetato de etilo, de la cual se eliminaron los
residuos de agua con sulfato de sodio (Na2SO4) anhidro y se concentró bajo presión reducida
empleando un rotavapor (Rotavapor Guchi R-215). Se purificó el compuesto a través de
cromatografía en columna abierta y se empleó gel de sílice 60 como fase estacionaria, 230-400
mesh.
61
8.3. Confirmación molecular a través de técnicas analíticas
8.3.1. Cromatografía en capa fina
Para monitorear el progreso de la reacción e identificación del compuesto se utilizó
cromatografía en capa fina (TLC, por sus siglas en inglés) y se llevó a cabo utilizando placas de
gel de sílice 60 con indicador F254 sobre soporte de aluminio. Las placas fueron reveladas por
exposición a luz UV de 254nm y 365nm, y fueron analizadas visualmente.
8.3.2. Espectroscopía de infrarrojo
Los espectros de infrarrojo se obtuvieron en el espectrofotómetro Cary 660 FTIR/ATR
(Agilent Technologies, Alemania) equipado con un aditamento de ATR, en el laboratorio de
Química de Productos Naturales en la Facultad de Ciencias Químico Biológicas de la UAS. Las
muestras sólidas se colocaron de manera directa en el equipo. Se detallan los valores de las
absorciones más características del compuesto en cm-1.
8.3.3. Resonancia magnética nuclear
Los espectros de resonancia magnética nuclear de hidrógeno (RMN-1H), se realizaron en
un espectrómetro (Varian, Mercury de 200 MHz, USA) en el Centro de Graduados e
Investigación en Química del Instituto Nacional de México, Tijuana Baja California, México.
Los diferentes valores de desplazamiento químico (), se expresan en partes por millón (ppm).
Los valores de las constantes de acoplamiento (J), se expresan en Hertzios (Hz). La 4-HC fue
disuelta en DMSO deuterado (DMSO-d6).
8.4. Animales de experimentación
Se utilizaron un total de 96 ratas Wistar macho con un peso inicial de 80 g ± 10 g (cuatro
semanas de edad). Las ratas Wistar macho fueron donadas por las instalaciones de investigación
62
animal ubicada en CINVESTAV Unidad-Coapa, Ciudad de México. Los animales fueron
alojados en cajas de acrílico en un cuarto con temperatura controlada (22 ± 2°C), y períodos de
luz-oscuridad 12/12 h, con libre acceso (ad libitum), a alimento (Rab Diet 5012) y agua
purificada.
Todos los animales, procedimientos y el protocolo de investigación fueron realizados
siguiendo los lineamientos establecidos en la Norma Oficial Mexicana para el Uso y el Bienestar
de los Animales de Laboratorio (NOM-062-ZOO-1999), y de acuerdo con la Guía para el
cuidado y Uso de Animales de Laboratorio en Estados Unidos.
8.5. Protocolo experimental
Los 96 animales de experimentación fueron divididos en dos grupos. (1) El primero
(n=48) para establecer en el modelo animal la enfermedad de HGNA, y (2) el segundo (n=48)
para determinar el efecto del tratamiento con metformina (200 mg∙kg-1, vía p.o.), 4-HC (80
mg∙kg-1, vía p.o.), o su vehículo, solución salina (1 ml por día, vía p.o.).
Grupo 1. Los animales (n=48) fueron divididos en cuatro grupos, el primero de éstos
(n=18), recibió agua pura y los animales fueron sacrificados después de 12, 16 o 20 semanas
(n=6 cada uno); el segundo grupo (n=18), recibió agua con sacarosa al 30% y los animales
fueron sacrificados después de 12, 16 o 20 semanas (n=6 cada uno). El tercer y cuarto grupo
(n=6 cada uno), recibieron respectivamente agua con sacarosa al 40 y 50% y los animales fueron
sacrificados a las 20 semanas (figura 5).
Grupo 2. Para la determinación del efecto de los distintos tratamientos (n=48), el segundo
grupo se dividió en dos grupos, el primero que recibió agua pura (sanos, n=24) y el segundo que
recibió agua con sacarosa al 50% (con HGNA, n=24) durante 20 semanas; pasado este tiempo,
ambos grupos fueron subdivididos en cuatro grupos, que recibieron durante 5 semanas, los
63
siguientes tratamientos: (a) solución salina (1 ml por día, vía p.o.) (n=12), (b) metformina (200
mg∙kg-1 por día, vía p.o.) (n=12), (c) 4-HC (80 mg∙kg-1 por día, vía p.o.) (n=12), y (d)
metformina (200 mg∙kg-1 por día, vía p.o.) y 4-HC (80 mg∙kg-1 por día, vía p.o.) (n=12) (figura
6). Las dosis de 4-HC (Qu y col., 2014) y metformina (Kabiri y col., 2014; Saad y col., 2015)
se siguieron de acuerdo a lo previamente reportado.
En todos los grupos se determinó semanalmente el peso corporal, consumo de alimento y
PTGO. Posterior a los tratamientos, los animales fueron sacrificados y se recolectaron las
muestras sanguíneas, hepáticas y de tejido adiposo. Finalmente, se determinó el porcentaje de
tejido hepático y adiposo, así como los niveles séricos de enzimas hepáticas (FA, AST, ALT),
se realizaron pruebas histopatológicas con tinción de H&E, y con tricrómica de Masson (TM).
Así mismo, fueron determinados los niveles séricos de las citocinas IL-6, IL-10, TGF-y TNF-
(figuras 5 y 6).
8.6. Inducción de obesidad y RI
Como se ha reportado previamente (Balderas-Villalobos y col., 2013), los animales
tuvieron acceso ad libitum a agua pura o a agua adicionada con sacarosa al 30%, por un periodo
de 12, 16 y 20 semanas. Así como a agua adicionada con sacarosa al 40% y 50% durante 20
semanas. Todos los grupos tuvieron acceso ad libitum a alimento comercial para rata (Rab Diet
5012).
64
Figura 5. Protocolo experimental de grupo 1 para establecer el desarrollo de HGNA. 48
ratas Wistar macho (edad inicial de 4 semanas y peso de 80±10g) fueron divididas en cuatro
grupos que recibieron: 1) agua pura y fueron sacrificados después de 12, 16 o 20 (n=6 cada uno)
semanas (líneas azules); 2) agua con sacarosa al 30% y fueron sacrificados después de 12, 16 o
20 (n=6 cada uno) semanas (líneas rojas); 3 y 4) agua con sacarosa al 40% (línea marrón, n=6)
y al 50% (línea negra, n=6) respectivamente, y fueron sacrificados a las 20 semanas. Se
monitoreó el peso corporal y consumo de alimento semanalmente, se realizaron PTGO
semanalmente, iniciando 4 semanas previas al sacrificio y finalizando un día previo al sacrificio.
Posterior al sacrificio se obtuvieron muestras sanguíneas, de tejido hepático y adiposo. Se
determinó el porcentaje (%) en peso de tejido adiposo y hepático, niveles séricos de enzimas
hepáticas, tinciones histológicas, y determinación de niveles séricos de IL-6, TNF- y TGF-.
65
Figura 6. Protocolo experimental del grupo 2 para determinar el efecto de los
tratamientos. Se utilizaron 48 ratas Wistar macho (edad inicial de 4 semanas y peso de
80±10g). Se dividieron en dos grupos: 1) recibió agua pura (sanos; n=24; líneas azules) y 2)
recibió agua con sacarosa al 50% (con HGNA, n=24; líneas roja; rosa, verde y morada) durante
20 semanas; transcurrido este tiempo, ambos grupos fueron divididos en 4 grupos, que
recibieron durante 5 semanas, los siguientes tratamientos: (a) solución salina (n=12; 1 ml por
día, vía p.o.), (b) metformina (n=12; 200 mg∙kg-1 por día, vía p.o.), (c) 4-HC (n=12; 80 mg∙kg-
1 por día, vía p.o.), y (d) metformina (200 mg∙kg-1 por día, vía p.o.) y 4-HC (80 mg∙kg-1 por día,
vía p.o.) (n=12). Se monitoreó el peso corporal y consumo de alimento semanalmente, se
realizaron 3 PTGO (previa al inicio del tratamiento, al día 17 y día 35). Los animales fueron
sacrificados un día después de finalizar el tratamiento. Una vez sacrificados se obtuvieron
muestras sanguíneas, de tejido hepático y adiposo. Posteriormente se determinó el porcentaje
66
(%) de peso del tejido adiposo y hepático, niveles séricos de enzimas hepáticas, se realizaron
pruebas histopatológicas, y determinación de niveles séricos de IL-6, IL-10, TNF- y TGF-
inicio de los tratamientos.
67
8.7. Determinación de consumo de alimento y masa corporal
Para la determinación del consumo de alimento, en cada grupo experimental, se colocaron
500 g de alimento y cada semana se pesó el residuo, utilizando una balanza electrónica de
precisión (Bapre-3, Rhino), y por diferencia se obtuvo el consumo de alimento. Una vez
obtenido este dato, se sumó el consumo semanal de cada grupo y se dividió entre el total de
semanas de estudio, para obtener el consumo semanal promedio del alimento.
En la determinación de masa corporal, se pesaron las ratas de forma individual utilizando
una balanza electrónica (Bapre-3, Rhino), con el propósito de conocer la ganancia de masa
corporal semanalmente.
8.8. Evaluación de homeostasis de glucosa
La PTGO, es una prueba que mide la capacidad que tiene el organismo para metabolizar
la glucosa, de manera que en sujetos o animales con alteraciones en el metabolismo de hidratos
de carbono, dicha capacidad se encuentra alterada, tal como sucede en el caso particular de
sujetos con RI (disminuida) (Trujillo-Arriaga, 2007).
En los grupos en los que se estandarizó el modelo animal para el desarrollo de la
enfermedad de HGNA, se determinó semanalmente la tolerancia a la glucosa iniciando la cuarta
semana previa al sacrificio y finalizando un día previo al sacrificio (figura 5). Mientras que en
los grupos que recibieron el tratamiento con metformina y/o 4-HC se determinó la tolerancia a
la glucosa, un día antes de iniciar el tratamiento, a los 17 días y al finalizar el tratamiento; esto
mediante la PTGO (figura 6).
Para realizar la PTGO, los animales se dejaron en ayuno de 12 h y se obtuvo una muestra
de sangre para determinar la glucemia (concentración de glucosa en sangre), considerada como
68
el tiempo cero. Después, se administró una solución de glucosa (2 g∙kg-1, vía p.o.), seguido de
toma de muestra de sangre para determinar los niveles de glucosa a los 30, 60, 120 y 240 minutos
(Antunes y col., 2016). Para la toma de muestra de sangre se realizó una punción capilar en la
cola, se obtuvo una gota de sangre que fue colocada en tiras reactivas para determinar la
concentración de glucosa con el equipo Accu-Chek Performa. Los niveles de glucosa se
expresan en mg∙dL-1.
8.9. Determinación de tejido adiposo intraabdominal
Debido a que la acumulación preferencial de grasa en la zona torácico-abdominal del
cuerpo se asocia a un mayor riesgo de enfermedad cardiovascular y metabólica (Moreno, 2012),
se consideró importante determinar el porcentaje en peso de tejido adiposo intraabdominal
(también llamado tejido adiposo visceral).
Para determinar el porcentaje de peso de tejido adiposo visceral, después del sacrificio de
los animales, se extrajo el tejido adiposo, ubicado en la cavidad torácico-abdominal, y fue
pesado. Considerando el peso corporal del animal de experimentación, se determinó el
porcentaje de peso de tejido adiposo, mediante la siguiente fórmula:
% en peso de tejido adiposo= [(g de tejido
g peso corporal) ×100]
8.10. Evaluación de daño hepático
Para determinar el daño a nivel hepático, después de ser sacrificados los animales, se
extrajo el hígado y se pesó, considerando el peso corporal del animal de experimentación, se
determinó el porcentaje de peso del hígado, mediante la siguiente fórmula:
% en peso de hígado= [(g de tejido
g peso corporal) ×100]
69
Adicionalmente, se cuantificó la actividad sérica de las enzimas FA, AST y ALT.
8.10.1. Determinación de enzimas hepáticas
8.10.1.1. Determinación de FA sérica
La actividad sérica de la FA (Shaw y col., 1983) fue determinada utilizando un kit
comercial (ALP 405 AA, Wiener Laboratories, Rosario, Argentina) y siguiendo las indicaciones
del fabricante. De manera breve, 3 L de suero fueron mezclados con 300 L de solución de
trabajo. La solución de trabajo fue preparada con 4 volúmenes de reactivo A y un volumen de
reactivo B. Se dejó transcurrir la reacción por 3 minutos a 37 °C, después la absorbancia fue
leída a una de 405 nm en un lector de placas (EliRead). Los valores de FA son expresados
como unidades internacionales por litro (UI/L).
8.10.1.2. Determinación de AST y ALT séricas
La actividad sérica de AST (Bergmeyer y col., 1986) y ALT (Murray, 1984) fue
determinada utilizando kits comerciales (GPT AA y GTO AA, Wiener Laboratories, Rosario,
Argentina) siguiendo las indicaciones del fabricante. De manera breve, 40 L de suero fueron
mezclados con 400 L de solución de trabajo. La solución de trabajo fue preparada con 4
volúmenes de reactivo A y un volumen de reactivo B. Se dejó transcurrir la reacción por 3
minutos, después la absorbancia fue leída utilizando un espectrofotómetro con filtro de 340 nm
(Spectronic Genesys 5) a 37 °C. Los valores de ALT y AST son expresados como unidades
internacionales por litro (UI/L).
70
8.11. Análisis histopatológico del hígado
8.11.1. Preparación de tejido
La preparación de las muestras para histología se realizó de acuerdo a las instrucciones
del manual de métodos histotecnológicos del Instituto de Patología de las Fuerzas Armadas de
los Estados Unidos de América (Edna y col., 1992) con algunas modificaciones. Después de la
eutanasia, el hígado fue extraído y uno de los lóbulos fue fijado en solución amortiguadora de
formalina: formaldehido 10% 100 mL∙L-1 (J.T. Baker), NaH2PO4 4 g/L (Vetec), Na2HPO4 6.5
g∙L-1 (Fermont); pH= 7.4. Las muestras incluidas del tejido fueron cortadas en piezas de 0.5 cm
x 2.0 cm, posteriormente fueron deshidratados y embebidos en parafina (Leica Paraplast).
Posteriormente, las muestras fueron cortadas usando un micrótomo (Leica RM2125 RTS) con
un grosor de 5-7 m. Los cortes fueron colocados en dos porta objetos, un corte por cada uno y
teñidos con H&E o TM.
8.11.2. Tinción de H&E de Mayer en tejido hepático
Para la realización de la tinción de H&E se utilizó una modificación de la técnica reportada
en el manual de métodos histotecnológicos del Instituto de Patología de las Fuerzas Armadas
de los Estados Unidos de América (Edna y col., 1992). Las muestras de tejido hepático en porta
objeto, previamente tratadas, fueron hidratadas con 2 incubaciones en alcohol al 96% por 2
minutos cada uno y una incubación en agua destilada. Posteriormente, fueron teñidas en
solución de hematoxilina de Mayer (50 g alumbre de potasio [Sigma], 1 g cristales de
hematoxilina [Sigma], 0.2 g yodato de sodio [Sigma], 1 g ácido cítrico [Sigma], 50 g hidrato de
cloral [Sigma], 100 mL agua destilada) por 3 a 5 minutos, para una coloración nuclear. Se
lavaron con agua destilada por 1 minuto, seguido por dos inmersiones en alcohol ácido, el cual
también fue lavado. Después, se realizó incubación con bicarbonato de sodio al 0.1% como
71
solución mordiente, por 3 minutos y nuevamente fueron lavados con agua destilada y se
realizaron de 10 a 15 inmersiones en alcohol al 96%. A continuación, se realizaron de 5 a 10
inmersiones en eosina-floxina (100 mL de solución de eosina: 1 g eosina Y hidrosoluble
[Sigma], 100 mL agua destilada; 10 mL de solución floxina: 1 g floxina B [J. T. Baker], 100
mL agua destilada; 780 mL etanol al 95% [Fluka], 4 mL ácido acético glacial [J. T. Baker]) para
generar contraste. Finalmente, fueron deshidratadas con inmersiones secuenciales en alcohol al
96% (10 a 15 inmersiones), alcohol al 96% (4 a 5 inmersiones), alcohol al 100% (5 a 10
inmersiones) y xilol (5 a 10 inmersiones; por 2). Al finalizar la tinción, las muestras fueron
selladas con Entellan New (Merk Millipore) para su preservación y evaluación por microscopía
de campo claro y análisis histológico en un microscopio óptico Primo Star (Zess, Alemania).
8.11.3. Determinación del grado de HGNA
La determinación del grado de HGNA en su desarrollo (de 0 a 8) fue medida de acuerdo
al sistema de puntuación histológica de la red de investigación clínica de la EHNA (LaBrecque
y col., 2012) (Cuadro 1). Para realizar este procedimiento se utilizaron las laminillas de tejido
hepático teñidas con H&E, a las cuales se les tomaron imágenes con aumento de 40x y fueron
digitalizadas usando una cámara de video utilizando el microscopio Primo Star (Zeiss,
Alemania), y el programa Zen2 Blue Edition (Zeiss, Alemania). Posteriormente, se realizó el
conteo del número de hepatocitos sin esteatosis, con esteatosis y células balonadas presentes en
50 campos en muestras teñidas con H&E, analizados con aumento de 40x. Para determinar el
porcentaje de hepatocitos con esteatosis se empleó la fórmula:
% de hepatocitos con esteatosis=hepatocitos con esteatosis × 100
total de hepatocitos
72
Mientras que para determinar el promedio de células balonadas, primero se contaron
células balonadas en las muestras por cada grupo, posteriormente se obtuvo una media de
presencia de éstas por grupo y finalmente se determinó el promedio (media) de células balonadas
por campo, mediante la fórmula:
Media de células balonadas por campo=media de células balonadas por grupo
50
8.11.4. Tinción TM en tejido hepático
Para la realización de la tinción TM se precalentó la solución de Bouin (50 mL ácido
acético glacial [J.T. Baker], 250 mL formaldehido 37% [Sigma], 750 mL ácido pícrico [J. T.
Baker]) que sirvió para hidratar las muestras, se incubaron las laminillas a 60 °C durante 10-20
minutos. Posteriormente, se lavaron con agua corriente hasta que se aclaró la laminilla y se lavó
con agua destilada. Se tiñeron con solución de hematoxilina de Weigert’s (100 mL solución
matriz A: 1 g hematoxilina [Sigma], 100 mL etanol 95% [Fluka], 100 mL solución matriz B: 4
mL cloruro férrico 29% [Sigma], 1 mL ácido clorhídrico 1 M [J. T. Baker]) por 5-10 minutos.
Posteriormente, las laminillas se lavaron con agua corriente durante 5 minutos y se enjuagaron
con agua destilada. Se tiñeron con solución de fuscina ácida-escarlata de Biebrich (90 mL
escarlata de biebrich 1% [Sigma], 10 mL fuscina ácida [Sigma], 1 mL ácido acético glacial [J.
T. Baker]) por 5-10 minutos y después se enjuagaron con agua destilada. Se diferenció con
solución de ácido fosfotúngstico-fosfomolíbdico (5 mL ácido fosfomolíbdico [Sigma], 5 mL
ácido fosfotúngstico [Sigma], 200 mL agua destilada) por 5 minutos. Sin enjuagar, se contrastó
con azul de anilina (2.5 g azul anilina [Sigma], 2 mL ácido acético glacial [J. T. Baker], 200 mL
agua destilada) por 5 minutos y se enjuagó con agua destilada. Se adicionó ácido acético al 1%
y se dejó durante 3 minutos. Se deshidrataron y aclararon con etanol al 95% (Fluka)
73
sumergiendo tres veces, seguido de alcohol absoluto (Fluka) sumergiendo tres veces y xileno
(J. T. Baker) sumergiendo una vez. Finalmente, se montaron en medio resinoso y se observaron
en un microscopio óptico Primo Star (Zeiss, Alemania).
8.11.5. Determinación del estadio de fibrosis
Para determinar el estadio de fibrosis se utilizaron las láminas de tejido hepático que
fueron teñidas con TM, de las cuales se capturaron imágenes con aumento de 10x y 40x. Usando
una cámara Primo Star (Zeiss, Alemania), y el programa Zen2 Blue Edition (Zeiss, Alemania),
se digitalizaron y analizaron secciones de las laminillas teñidas con TM. Se consideró lo
establecido previamente (Diehl y Day, 2017), que va de F0 (sin fibrosis) a F4 (cirrosis).
8.12. Determinación sérica de citocinas
Al finalizar el tratamiento con 4-HC, metformina y co-tratamiento, los niveles séricos de
IL-6, IL-10, TGF- y TNF- fueron determinados mediante la técnica de ELISA (Hernandez
Cruz y col., 2008); utilizando kits de Elabscience (Houston, TX, USA9): kit Rat IL-6 ELISA (#
de catálogo E-EL-R0015), kit Rat IL-10 Elisa (# de catálogo E-EL-R0016), kit Rat TGF-1
ELISA (# de catálogo E-EL-R0084) y el kit Rat TNF- ELISA (# de catálogo E-EL-R0019),
siguiendo los protocolos provistos por fabricante. Brevemente, 100 L de muestra fueron
adicionados a cada pozo, se dejaron incubar por 90 minutos a 37 °C, después el líquido fue
removido y se adicionaron 100 L de anticuerpo de detección biotinilado e incubó por 1 h a 37
°C. Cada pozo fue aspirado y lavado 3 veces, posteriormente se adicionaron 100 L de HRP
conjugado y se incubó por 30 minutos a 37 °C. Posteriormente se realizaron 5 lavados, se
adicionaron 90 L de reactivo sustrato e incubó por 15 minutos a 37 °C. Finalmente, se
adicionaron 50 L de solución de detección. Las placas de 96 pozos fueron leídas en un lector
74
de placas BioTek Elx808 (Winooski, VT, USA) con una de 450 nm. Las concentraciones
fueron determinadas usando curvas estándar de cada una de las citocinas y expresadas como
pg∙mL-1.
8.13. Análisis estadístico
Para determinar el efecto del tratamiento con vehículo, 4-HC, metformina, y metformina
más 4-HC, sobre las variaciones en peso corporal, consumo de alimento, tolerancia a la glucosa,
valores de enzimas hepáticas (FA, AST, ALT) séricas, valores de porcentaje en peso de tejido
adiposo y de hígado, y en niveles séricos de IL-6, TNF-, IL-10 y TGF-los valores obtenidos
fueron sometidos a un análisis estadístico en que se determinó la media ± error estándar de la
muestra (e.e.m.) de los valores de los parámetros analizados.
Los resultados fueron analizados utilizando el programa estadístico Sigma Plot, versión
12.0. Para enzimas hepáticas, para valores de consumo de alimento, porcentaje en peso de tejido
adiposo e hígado, así como para niveles séricos de citocinas se realizó análisis de varianza
(ANOVA) de una vía; y para tolerancia a la glucosa y peso corporal se utilizó ANOVA de dos
vías de medidas repetidas. En todos los casos, para comparar los diferentes grupos, se utilizó la
prueba post-hoc de Tukey. Se consideró un nivel de significancia estadística para p<0.05.
75
IX. RESULTADOS
9.1. Síntesis y confirmación molecular de 4-HC
9.1.1. Síntesis de la 4-HC
Se sintetizaron 65 gramos de 4-HC. La síntesis del compuesto se llevó a cabo por medio
de una condensación aldólica catalizada por un ácido de Lewis (BF3∙OEt2). En la figura 7 se
muestra el mecanismo de reacción, la síntesis de la 4-HC implica la enolización de la
acetofenona (1), formándose un complejo entre el átomo de boro del catalizador y el oxígeno
del carbonilo obteniendo una carga formal positiva estabilizada por efectos de resonancia (2),
después ocurre un ataque nucleofílico del enol al carbonilo del p-hidroxibenzaldehído (3),
formándose así una -hidroxicetona intermedia (4). La etapa final implica la deshidratación
(eliminación de una molécula de agua), obteniéndose la 4-HC (5). El tiempo de reacción de la
4-HC fue de aproximadamente 12 h y el rendimiento promedio del 58% con base al producto
aislado.
9.1.2. Espectrometría de infrarrojo
Una de las técnicas utilizadas para confirmación molecular de la 4-HC fue la
espectrometría de infrarrojo, la cual tiene como objetivo identificar los grupos funcionales
presentes en una molécula. La señal del grupo Ar-OH se observó en la región de 3203 cm-1, el
carbonilo (C=O) correspondiente a un sistema ,-insaturado se presentó en la región 1645 cm-
1, la señal de los dobles enlaces (C=C) tanto de los anillos A y B como del sistema ,-insaturado
se observó en la región 1595 cm-1 y finalmente, la señal de flexión para el enlace del C-4 (C-O-
H) se observó en la región de 1280 y 1270 cm-1, respectivamente (figura 8).
76
Figura 7. Mecanismo de reacción de la 4-HC empleando BF3∙OEt2 como catalizador. En la
síntesis de la 4-HC se produce la enolización de la acetofenona (1), formándose un complejo
entre el átomo de boro del catalizador y el oxígeno del carbonilo (2), después ocurre un ataque
nucleofílico del enol al carbonilo del p-hidroxibenzaldehído (3), y como consecuencia se forma
una -hidroxicetona (4). Posteriormente, ocurre la eliminación de una molécula de agua, para
finalmente obtenerse la 4-HC (5).
77
Figura 8. Espectro de infrarrojo de la 4-HC. Las principales señales son las del grupo Ar-
OH a 3203 cm-1, el grupo C=O (-insaturado) a 1645 cm-1, los enlaces C=C a 1595 cm-1 y el
enlace de C-O a 1280 y 1270 cm-1.
Número de onda (cm-1)
% T
rans
mit
anci
a
78
9.1.3. RMN-1H
En la figura 9, se muestra el espectro obtenido, mostrándose los desplazamientos
químicos () de los hidrógenos de la 4-HC. En el espectro se observó un singulete a 10.0 ppm
que integra para un hidrógeno, correspondiente al grupo hidroxilo, también se observó un
multiplete entre 8.13-8.09 ppm correspondiente a los dos hidrógenos del anillo B en posición
orto respecto al grupo hidroxilo; un multiplete de 7.75-7.52 ppm, que corresponde a los cinco
hidrógenos del anillo A más los dos hidrógenos del sistema ,-insaturado. Finalmente, un
multiplete entre 6.87-6.63 ppm, correspondiente a los dos hidrógenos del anillo B del sistema
. En la figura 9B, se muestra una amplificación del espectro para los multipletes. También,
se observó un singulete en 3.36 ppm que corresponde a agua generada en la preparación de la
muestra y un quintuplete en 2.51 ppm, correspondiente a la señal del disolvente DMSO-d6
(figura 9A).
9.2. Estandarización de modelo animal de desarrollo de HGNA en ratas Wistar macho
Con la intención de estandarizar el modelo animal de HGNA en ratas Wistar macho, se
evaluó el efecto de la ingesta de sacarosa al 30% (durante 12, 16 y 20 semanas), 40% y 50%
(durante 20 semanas) para determinar en qué momento se desarrollaría el HGNA.
79
A
B
Figura 9. Espectro de RMN-1H de la 4-HC. A) Espectro de RMN 1H de la 4-HC. Las
principales señales en el espectro son un sigulete a 10.0 ppm del Ar-OH; un multiplete entre
8.13-8.09 ppm, 2H del anillo B (en posición orto del grupo Ar-OH); un multiplete entre 7.75-
7.52 ppm, correspondiente a los 5H del anillo A, y un multiplete entre 6.87-6.63 correspondiente
a los 2H del anillo B (en posición orto respecto al carbonilo). B) Amplificación de la región
aromática del espectro.
80
9.2.1. Efecto del consumo de agua con sacarosa en consumo de alimento
Como se muestra en la figura 10, el consumo de sacarosa al 30% durante 12
(394.96±16.19 g), 16 (369.55±17.18 g) y 20 (328.32±11.67 g) semanas indujo una disminución
significativa (p<0.001 para cada uno, figura 10A) en el consumo semanal promedio de alimento
de la segunda semana a la última, comparados con todos los grupos que consumieron agua pura
(considerados como grupo control), es decir, de 12 (936.23±14.91 g), 16 (864.95±14.4 g) y 20
(963.56±16.99 g) semanas. Por otra parte, tanto el consumo de agua con sacarosa al 30%
(328.32±11.67 g), 40% (573.09±10.45 g) y 50% (424.30±11.6 g) durante 20 semanas,
disminuyeron de manera significativa el consumo semanal promedio de alimento comparado
con su respectivo grupo control (p<0.001 para cada uno, figura 10B).
El consumo de alimento fue significativamente mayor en el grupo con consumo de agua
con sacarosa al 40% comparado con el grupo que consumió agua con sacarosa al 30% (p<0.001)
y al 50% (p<0.001). Mientras que el consumo de alimento en el grupo con consumo de agua
con sacarosa al 50% fue mayor que el del grupo con sacarosa al 30% (p<0.001).
9.2.2. Efecto del consumo de sacarosa en peso corporal
A pesar de la disminución en el consumo de alimento, el consumo de agua con sacarosa
al 30% no generó cambios significativos en el peso corporal de los animales que fueron tratados
durante 12 (p= 0.973; figura 10C), 16 (p= 0.459; figura 10D) y 20 (p=0.594; figura 10E)
semanas, comparados con sus respectivos grupos control. En contraste, el consumo de sacarosa
al 40% durante 20 semanas incrementó significativamente el peso corporal desde la semana 9 a
la 20 (p<0.05; figura 10E) comparado con su grupo control. Además, los animales que
consumieron agua con sacarosa al 40% tuvieron mayor peso corporal desde la semana 6 a la 20
comparado con el grupo que consumió agua con sacarosa al 30% (p<0.05, figura 10E), y de la
81
semana 6 a la 17 comparado con el grupo que consumió agua con sacarosa al 50% (p<0.05,
figura 10E).
Finalmente, los animales con ingesta de agua con sacarosa al 50% tuvieron mayor peso
corporal de la semana 16 a la 20 (p<0.05, figura 10E) comparado con el grupo control, y de la
semana 13 a la 20 (p<0.05, figura 10E) comparado con el grupo con ingesta de agua con
sacarosa al 30%.
9.2.3. Efecto del consumo de sacarosa en tolerancia a la glucosa oral
Los grupos con ingesta de agua con sacarosa al 30% durante 12 semanas (figura 11A-E)
incrementaron significativamente los niveles de glucosa en sangre, al minuto 30 y 60 en la
semana ocho (p<0.01; figura 11A), nueve (p<0.01; figura 11B) y diez (p<0.01; figura 11C)
comparado con su grupo control. Mientras que el consumo de sacarosa al 30% solo incrementó
glucemia al minuto 30 en la semana once (p<0.01; figura 11D) y doce (p<0.001; figura 11E)
comparado con el grupo control.
En cuanto a los grupos que consumieron agua con sacarosa al 30% durante dieciséis
semanas (figura 11F-J), ésta incrementó significativamente los niveles de glucosa en sangre, al
minuto 30 en la semana doce (p<0.05; figura 11F) y al minuto 60 en la semana catorce (p<0.05;
figura 11H), y disminuyó al minuto 12 en ambas semanas (figura 11F, 11H) comparado con
su grupo control. Mientras que no produjo cambios en glucemia a la semana trece (p=0.102;
figura 11G), quince (p=0.107; figura 11I) y dieciséis (p=0.302; figura 11J) comparado con su
grupo control.
82
0
200
400
600
800
1000
12 16 20
abcd
abc
abc
ac
20
c
c
c
fh
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 101112
0
100
200
300
400
500
600
700
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10111213141516 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011121314151617181920
%# %
# %# %
#*
%#* %
#* %#* %
#*
#
%#*
##
%#*
#*
%#*
#
%#*
*#
#*
*
#* #*
#*# *
Agua pura Sacarosa 30% Sacarosa 40% Sacarosa 50%
Agua pura Sacarosa 30% Sacarosa 40% Sacarosa 50%
Pes
o co
rpor
al (g
)
Puntos de evaluación (semanas)
A B
20 semanas16 semanas12 semanasC D E
Con
sum
o se
man
al d
e al
imen
to (
g)
Tiempo de evaluación (semana)
Figura 10. Efecto del consumo de agua con sacarosa sobre el consumo de alimento y peso
corporal. El panel superior muestra el efecto de sacarosa al 30% en consumo de alimento en
diferentes tiempos (A) y el efecto de sacarosa al 30%, 40% y 50% en consumo de alimento
durante 20 semanas (B). Cada barra representa la media ± e.e.m. de n=6 para cada grupo, del
consumo semanal promedio de alimento. a, p<0.05 vs agua pura (12 semanas); b, p<0.05 vs
agua pura (16 semanas); c, p<0.05 vs agua pura (20 semanas); f, p<0.05 vs sacarosa 30% (20
semanas); h, p<0.05 vs sacarosa 50% (20 semanas). Mientras, el panel inferior muestra el efecto
del consumo de agua con sacarosa al 30% en peso corporal durante 12 (C) y 16 (D) semanas, y
el efecto del consumo de agua con sacarosa al 30%, 40% y 50% en peso corporal durante 20
semanas (E). *, p<0.05 vs agua pura; #, p<0.05 vs sacarosa 30% (20 semanas); %, p<0.05 vs
sacarosa 50% (20 semanas).
83
Por otra parte, considerando los grupos que consumieron agua con sacarosa al 30%, 40%
y 50% durante veinte semanas (figura 11K-O), observamos que la ingesta de sacarosa al 30%
incrementó significativamente los niveles de glucosa en sangre al minuto 30, 60 y 120 en la
semana dieciséis (p<0.05; figura 11K) y al minuto 60 en la semana veinte (p=0.035; figura
11O). Sin embargo, en las semanas diecisiete, dieciocho y diecinueve, la ingesta de sacarosa al
30% no indujo cambios en la glucemia (figura 11L, 11M, 11N; respectivamente) comparado
con el grupo control. Mientras que la ingesta de sacarosa al 40% incrementó significativamente
glucemia al minuto 60 de la semana dieciséis (p<0.05; figura 11K); al minuto 30 y 60 en la
semana diecisiete (p<0.05; figura 11L); al minuto 60 y 120 en la semana dieciocho (p<0.05;
figura 11M); al minuto 30 en la semana diecinueve (p=0.033; figura 11N) y al minuto 60 en la
semana veinte (p<0.001; figura 11O) comparado con el grupo control.
Comparado con sacarosa al 50%, la ingesta de sacarosa al 40% incrementó
significativamente los niveles de glucosa en sangre al minuto 30 y 60 en la semana diecisiete
(p<0.05; figura 11L) y al minuto 30 en la semana veinte (p=0.019; figura 11O). Finalmente, el
consumo de agua con sacarosa al 50% incrementó significativamente la glucemia al minuto 30
en la semana dieciséis (p<0.001; figura 11K) al minuto 120 en la semana dieciocho (p<0.001;
figura 11M) y veinte (p=0.025; figura 11O) comparado con el grupo control.
84
0 30 60 120 240
0
50
100
150
200
250
**
0 30 60 120 240
* *
0 30 60 120 240
* *
0 30 60 120 240
*
0 30 60 120 240
*
0 30 60 120 240
0
50
100
150
200
250
*
*
0 30 60 120 240 0 30 60 120 240
*
*
0 30 60 120 240 0 30 60 120 240
0 30 60 120 240
0
50
100
150
200
250&* *
#
*
0 30 60 120 240
%#
%#
0 30 60 120 240
##&
0 30 60 120 240
#
0 30 60 120 240
%#
*&
Glu
cosa
en
sang
re (m
g*dL
-1)
Tiempo (min)
A B C D E
F G H I J
Semana 8 Semana 9 Semana 10 Semana 11 Semana 12
Semana 12 Semana 13 Semana 14 Semana 15 Semana 16
K L M N OSemana 16 Semana 17 Semana 18 Semana 19 Semana 20
Agua pura Sacarosa 30% Sacarosa 40% Sacarosa 50%
·
Figura 11. Curso temporal de PTGO en grupos con ingesta de sacarosa por diferentes
tiempos y con diferentes concentraciones. El panel superior muestra PTGO del grupo control
(agua pura) y grupo con sacarosa al 30% durante 12 semanas (A-E). El panel del medio muestra
PTGO del grupo control y el grupo con sacarosa al 30% durante 16 semanas (F-J). El panel
inferior muestra PTGO del grupo control y grupos con consumo de sacarosa al 30%, 40% y
50%, durante 20 semanas (K-O). Cada punto representa la media ± e.e.m. de n=6 para cada
grupo, al minuto 30, 60, 120 y 240 cuando fueron determinados los niveles de glucosa en sangre
posteriores a la administración de glucosa (2 mg∙kg-1, vía p.o.). El tiempo cero representa los
valores basales de glucosa en ayuno. *, p<0.05 sacarosa al 30% vs agua pura; #, p<0.05 sacarosa
85
al 40% vs agua pura; &, p<0.05 sacarosa al 50% vs agua pura; %, p<0.05 sacarosa al 40% vs
sacarosa al 50%.
86
9.2.4. Efecto del consumo de sacarosa sobre porcentaje de peso del tejido hepático y
adiposo
El consumo de agua con sacarosa al 30% no modificó el porcentaje en peso de hígado
(p=0.099; figura 12A) en todos los puntos evaluados, comparado con su respectivo grupo
control (2.6±0.07 vs 2.8±0.07% (12 semanas); 2.6±0.09 vs 2.5±0.04% (16 semanas); 2.5±0.09
vs 2.6±0.05% (20 semanas)). Por otra parte, la ingesta de agua con sacarosa al 40% (2.8±0.07
vs 2.5±0.09%; p=0.044; figura 12B) y sacarosa al 50% (2.8±0.07 vs 2.5±0.09%; p=0.014;
figura 12B) incrementaron significativamente el porcentaje en peso del hígado comparado con
el grupo que consumió agua con sacarosa al 30% durante 20 semanas. Observando que a mayor
ingesta de sacarosa, mayor porcentaje en peso de hígado.
En contraste, la ingesta de agua con sacarosa al 30% incrementó significativamente los
valores de porcentaje en peso de tejido adiposo a las 12 (5.4±0.3 vs 4.2±0.5%; p=0.033; figura
12C) y 16 (5.2±0.6 vs 3.0±0.3%; p<0.001; figura 12C) semanas, comparados con sus
respectivos grupos control. La ingesta de sacarosa al 30% durante 20 semanas incrementó
significativamente el porcentaje en peso de tejido adiposo intraabdominal comparado con los
grupos control de todos los tiempos evaluados, es decir a las 12 (6.7±0.6 vs 4.2±0.5%; p=0.007),
16 (6.7±0.6 vs 3.0±0.3%; p<0.001) y 20 (6.7±0.6 vs 1.4±0.4%; p<0.001) semanas (figura 12C).
Además, cuando se comparó la ingesta de sacarosa a diferentes concentraciones con el
grupo control a las 20 semanas, se observó que todas las concentraciones de sacarosa,
incrementaron significativamente el porcentaje en peso de tejido adiposo intraabdominal
comparados con el grupo control (1.4±0.4 vs 6.7±0.6% (30%), vs 6.2±0.6% (40%) y vs
5.6±0.6% (50%); p<0.001; figura 12D).
87
0
1
2
3
4
12 16 20 20
f f
0
2
4
6
8
12 16 20
abc
bc
bc
a
20
cc
c
% D
e pe
so d
el h
ígad
o%
De
peso
del
tej
ido
adip
oso
Agua pura Sacarosa 30% Sacarosa 40% Sacarosa 50%
Tiempo de evaluación (semana)
A B
C D
Figura 12. Efecto del consumo de agua con sacarosa sobre porcentaje (%) del peso de
tejido hepático y adiposo. En el panel superior se muestra el efecto del consumo de sacarosa
al 30% durante 12, 16 y 20 semanas (A) y del consumo de sacarosa al 30%, 40% y 50% durante
20 semanas (B) en porcentaje del peso del hígado. En el panel inferior se muestra el efecto del
consumo de sacarosa al 30% durante 12, 16 y 20 semanas (C) y del consumo de sacarosa al
30%, 40% y 50% durante 20 semanas (D) en porcentaje del peso de tejido adiposo. a, p<0.05 vs
agua pura durante 12 semanas; b, p<0.05 vs agua pura durante 16 semanas; c, p<0.05 vs agua
pura durante 20 semanas; f, p<0.05 vs sacarosa al 30% durante 20 semanas.
88
9.2.5. Efecto del consumo de sacarosa sobre los niveles séricos de enzimas hepáticas
Nuestros resultados muestran que los niveles séricos de FA, AST y ALT tuvieron
variación dependiendo de la edad de las ratas (figura 13A-C), observando que los niveles
séricos de FA en el grupo control a las 20 semanas fueron significativamente menores que los
del grupo control a las 16 semanas (95.4±6.8 vs 155.9±8.5 UI/L; p=0.008; figura 13A); los
niveles séricos de AST en los grupos controles disminuyeron a través del tiempo de evaluación
(figura 13B); mientras que los de ALT incrementaron (figura 13C). Además, la ingesta de agua
con sacarosa al 30% provocó una tendencia a incrementar los niveles de FA, aunque no fue
estadísticamente significativa en ninguno de los tiempos evaluados; es decir, a la semana 12
(180.7±12.7 vs 132.8±15.8 UI/L; p=0.053; figura 13A); 16 (159.7±11.8 vs 155.9±8.5 UI/L;
p=1.0; figura 13A); y 20 (142.4±9.4 vs 95.4±6.8 UI/L; p=0.06; figura 13A) comparado con
cada grupo control. Mientras que los niveles séricos de FA del grupo control de 20 semanas
fueron significativamente menores comparados con el grupo que ingirió agua con sacarosa al
30% durante 12 (95.4±6.8 vs 180.7±12.7 UI/L; p<0.001; figura 13A) y 16 (95.4±6.8 vs
159.8±11.8 UI/L; p=0.004; figura 13A) semanas. Sin embargo, cuando se comparó el efecto de
todas las concentraciones de sacarosa durante veinte semanas, se observó que la ingesta de
sacarosa al 30% incrementó significativamente los niveles de FA comparados con el grupo
control (142.4±9.4 vs 95.4±6.8 UI/L; p=0.042; figura 13D).
En contraste, la ingesta de sacarosa al 30% disminuyó significativamente los niveles
séricos de AST (p<0.01, figura 13B) a la semana 12 (28.2±5.4 UI/L) comparado con el grupo
control de 12 (61.5±8.3 UI/L) y 16 (59.1±4.5 UI/L) semanas; a la semana 16 (20.3±4.1 UI/L)
comparado con el grupo control de 12, 16 (p<0.001; figura 13B) y 20 (20.9±4.1 vs 45±3 UI/L;
p=0.018; figura 13B) semanas; y a la semana 20 (26.0±2.7 UI/L) comparado con el grupo
89
control de 12 y 16 semanas (p<0.001; figura 13B). Cuando se comparó el efecto de la ingesta
de sacarosa al 30%, 40% y 50% durante veinte semanas, entre ellos y con el control, los datos
mostraron que la ingesta de sacarosa al 30% disminuyó significativamente los niveles séricos
de AST (p=0.001; figura 13E) comparado con el grupo control, sin embargo estos fueron
significativamente menores a los niveles séricos de AST que los de los grupos que consumieron
sacarosa al 40% (26.0±2.7 vs 44.6±3.0 UI/L; p=0.001; figura 13E) y 50% (26.0±2.7 vs 48.1±3.1
UI/L; p<0.001; figura 13E).
Finalmente, la ingesta de sacarosa al 30% disminuyó los niveles séricos de ALT
comparados con su respectivo grupo control, sin embargo, esta disminución no fue
estadísticamente significativa en ninguno de los tiempo evaluados; esto es, a la semana 12
(7.2±1.4 vs 11.2±0.9 UI/L; p=0.465; figura 13C), 16 (7.2±1.7 vs 13.5±1.5 UI/L; p=0.074;
figura 13C) y 20 (12.6±1.4 vs 15.1±2.1 UI/L; p=0.860; figura 13C). Aunque, los niveles séricos
de ALT del grupo control de 20 semanas fueron significativamente mayores que los del grupo
con ingesta de sacarosa al 30% durante 12 (15.1±2.1 vs 7.2±1.4 UI/L; p=0.012; figura 13C) y
16 (15.1±2.1 vs 7.2±1.7 UI/L; p=0.012; figura 13C) semanas. Cuando se realizó la comparación
entre los grupos con ingesta de las diferentes concentraciones de sacarosa, a pesar de observar
una tendencia a ir en aumento conforme se elevó la concentración de sacarosa en agua, los
niveles séricos de ALT no fueron significativamente diferentes comparados entre sí (p=0.344;
figura 13F).
90
020406080
100120140160180200220
12 16 20
c
cc
0
20
40
60
80
12 16 20
aa abb bc
0
5
10
15
20
25
12 16 20
de
020406080
100120140160180200220
20
c
0
20
40
60
80
100
20
f f
c
0
5
10
15
20
25
20
Agua pura Sacarosa 30% Sacarosa 40% Sacarosa 50%
AST
(UI/
L)
FA
(UI/
L)
AL
T (U
I/L
)
AST
(UI/
L)
AL
T (U
I/L
)Tiempo de evaluación (semana)
FA
(UI/
L)
A B C
D E F
Figura 13. Efecto del consumo de agua con sacarosa sobre los niveles séricos de enzimas
hepáticas. El panel superior muestra el efecto del consumo de sacarosa al 30% durante 12, 16
y 20 semanas (A-C) y el panel inferior muestra el efecto del consumo de sacarosa al 30%, 40%
y 50% durante 20 semanas (D-F), sobre los niveles séricos de FA (A, D), AST (B, E) y ALT
(C, F). Cada barra representa la media ± e.e.m. de n=6 para cada grupo, por cada semana. a,
p<0.05 vs agua pura durante 12 semanas; b, p<0.05 vs agua pura durante 16 semanas; c, p<0.05
vs agua pura durante 20 semanas; d, p<0.05 vs sacarosa al 30% durante 12 semanas; e, p<0.05
vs sacarosa al 30% durante 16 semanas; f, p<0.05 vs sacarosa al 30% durante 20 semanas.
91
9.2.6. Efecto del consumo de sacarosa sobre la morfología del tejido hepático
Las muestras de tejido hepático fueron teñidas mediante tinción de H&E, con el objetivo
de obtener un contraste de las preparaciones microscópicas facilitando así la observación de
células y estructuras del tejido hepático, para determinar cambios ocasionados por el consumo
de agua con sacarosa en los diferentes tiempos y concentraciones evaluados.
En los cortes histológicos de los grupos controles, se observó parénquima hepático con
arquitectura normal, caracterizada por presencia de filas de hepatocitos, con escasa o nula
presencia de células inflamatorias y ausencia de esteatosis (figura 14A-C). También se
observaron hepatocitos viables (figura 14A) característicos por su forma poliédrica y con un
núcleo ovoide con cromatina laxa. Así mismo, se observaron venas centrolobulillares, donde se
logra distinguir como los sinusoides hepáticos convergen alrededor de la misma, con escasa o
nula presencia de esteatosis microvesicular alrededor de las venas centrales de tejido hepático
(figura 14B). Mientras que todas las estructuras porta, compuestas por vénulas, arteriolas
hepáticas y canalículos biliares, no mostraron ninguna alteración (figura 14C). Estos resultados
son considerados como normales (Kierszenbaum, 2008).
El grupo que consumió sacarosa al 30% durante 12 semanas (figura 14D-F) mostró
características similares a las presentadas por el grupo control (figura 14A-C); estos fueron,
hepatocitos con arquitectura normal en parénquima (figura 14D) con ausencia de esteatosis
(<5%) e infiltrado inflamatorio; venas centrales (figura 14E) y estructuras porta (figura 14F).
Sin embargo, el grupo tratado con sacarosa al 30% durante 16 semanas (figura 14G-H)
presentó en parénquima hepático (figura 14G) y alrededor de venas centrales (figura 14H) y
estructura porta (figura 14I) moderada esteatosis microvesicular (media de 45.7%), con
ausencia de infiltrado inflamatorio; posicionándolo en el grado 2 en el desarrollo de HGNA
92
(LaBrecque y col., 2012). Además, el grupo que consumió sacarosa al 30% durante veinte
semanas (figura 14J-L) presentó en parénquima hepático (figura 14J) severa esteatosis
microvesicular (69.7%) y limitada esteatosis macrovesicular (0.6%); en venas centrales (figura
14K) y estructuras porta (figura 14L) limitada esteatosis microvesicular, con ausencia de
infiltrado inflamatorio; con una esteatosis media de 70.3% posicionándolo en grado 3 en
desarrollo de HGNA.
Por otra parte, el grupo con consumo de agua con sacarosa a 40% durante 20 semanas
(figura 14M-O) presentó en parénquima hepático (figura 14M) severa esteatosis
microvesicular (71.1%) y limitada esteatosis macrovesicular (5.8%), en venas centrales (figura
14N) y estructuras porta (figura 14O) moderada esteatosis microvesicular, con una esteatosis
media de 77.5%; este grupo también presentó en promedio una célula balonada por campo y un
infiltrado inflamatorio por muestra; posicionándolo en grado 5 en el desarrollo de HGNA.
Finalmente, el grupo con ingesta de sacarosa al 50% durante 20 semanas (figura 14P-R)
presentó en parénquima hepático (figura 14P) severa esteatosis microvesicular (70.5%) y
moderada esteatosis macrovesicular (21.8%), en venas centrales (figura 14Q) y estructuras
porta (figura 14R) moderada esteatosis macrovesicular, con esteatosis media de 92.3%; un
promedio de dos células balonadas por campo y un infiltrado inflamatorio por muestra,
posicionándolo en grado 6 en el desarrollo de HGNA. Para estos últimos dos grupos se considera
que desarrollaron EHNAS, de acuerdo a nuestros resultados histopatológicos. El grupo con
consumo de sacarosa al 50% desarrolló el grado más alto de HGNA.
93
Figura 14. Efecto del consumo de agua con sacarosa sobre la morfología de tejido hepático.
Los tejidos fueron teñidos con H&E y observados con aumento de 40X. Parénquima hepático
94
(A, D, G, J, M, P). Venas centrales (B, E, H, K, N, Q). Estructura porta (C, F, I, L, O, R). Grupo
control que consumió agua pura ad libitum (A-C). Grupo con consumo de sacarosa al 30%
durante 12 (D-F), 16 (G-I), y 20 (J-L) semanas. Grupo con consumo de sacarosa al 40% (M-O)
y al 50% (P-R) durante 20 semanas. Las flechas señalan algunos hepatocitos con esteatosis
microvesicular; los cuadrados enmarcan algunos hepatocitos con esteatosis macrovesicular y
los círculos enmarcan células balonadas. En todas las imágenes la escala de barra es de 50 m.
95
9.2.7. Efecto del consumo de sacarosa sobre los cambios en la formación de colágeno en
tejido hepático
Las muestras de tejido hepático fueron teñidas mediante tinción de TM, con el objetivo
de obtener un contraste de las preparaciones microscópicas facilitando así la observación de
presencia de colágeno, para determinar cambios en su cantidad y distribución en el tejido
hepático, asociado al desarrollo de fibrosis; para determinar el estadio de fibrosis nos basamos
en reportes previos (Diehl y Day, 2017).
Cuando todas las muestras fueron teñidas con TM, se hizo evidente que no se presentaron
cambios en la cantidad y distribución de colágeno en histologías hepáticas en grupos con
consumo de sacarosa al 30% (figura 15D-L) y 40% (figura 15M-O) comparados con el grupo
control (figura 15A-C). Esto es, que todos estos grupos mostraron la presencia de colágeno en
estructuras portas y en venas hepáticas de forma normal; sin mostrar acumulación significativa
de colágeno en parénquima hepático (F0), sin embargo, el grupo con consumo de agua con
sacarosa al 50% durante 20 semanas (figura 15P-Q) fue el único que desarrolló fibrosis portal
con algunas fibras septa (F2).
9.2.8. Efecto del consumo de sacarosa en niveles séricos de citocinas
El consumo de sacarosa al 30% no modificó los niveles séricos de IL-6 (p=0.034; figura
16A), TNF- (p=0.291; figura 16B) y TGF- (p=0.121; figura 16C) en ninguno de los tiempos
evaluados, comparado con cualquiera de los otros grupos; con excepción del consumo de
sacarosa al 30% durante veinte semanas que incrementó significativamente los niveles séricos
de IL-6 comparado con el grupo con consumo de sacarosa al 30% durante doce semanas
(62.86±5.35 vs 52.00±1.09 pg∙mL-1; p=0.036; figura 16A).
96
Figura 15. Efecto del consumo de agua con sacarosa sobre los cambios de colágeno en
tejido hepático. Los tejidos fueron teñidos con TM y observados con aumento de 40X.
97
Parenquima hepático (A, D, G, J, M, P). Venas centrales (B, E, H, K, N, Q). Estructura porta
(C, F, I, L, O, R). Grupo control que consumió agua pura ad libitum (A-C). Grupo con consumo
de sacarosa al 30% durante 12 (D-F), 16 (G-I), y 20 (J-L) semanas. Grupo con consumo de
sacarosa al 40% (M-O) y al 50% (P-R) durante 20 semanas. Las flechas señalan fibrosis septa.
En todas las imágenes la escala de barra es de 50 m.
98
Por otra parte, considerando los grupos con consumo de sacarosa al 30%, 40% y 50%
durante veinte semanas (figura 16D-F), observamos que la ingesta de sacarosa al 40%
incrementó significativamente los niveles séricos de IL-6 (p<0.001; figura 16D) y TNF-
(p<0.001; figura 16E) comparado con el grupo control y con el grupo que consumió sacarosa
al 30%. Mientras que el consumo de sacarosa al 50% incrementó significativamente los niveles
séricos de IL-6 comparado con el grupo control (p<0.001; figura 16D) y con los grupos que
consumieron sacarosa al 30% (p<0.001; figura 16D) y sacarosa al 40% (p=0.018; figura 16D).
También, el consumo de sacarosa al 50% incrementó significativamente los niveles séricos de
TNF- (p<0.001; figura 16E) y TGF- (p<0.001; figura 16F) comparado con el grupo control
y con los grupos que consumieron sacarosa al 40% y 50%.
9.3. Efecto del tratamiento con metformina y 4-HC en ratas sanas o con HGNA
De acuerdo con los resultados obtenidos, se decidió utilizar agua con sacarosa al 50%
durante 20 semanas para la inducción de la enfermedad de HGNA y agua pura para los animales
sanos. Posterior a esas 20 semanas de inducción se inició con la administración de los
tratamientos a evaluar. La administración de los tratamientos fue por cinco semanas y durante
ese tiempo los animales continuaron con el consumo de agua con sacarosa al 50% (con HGNA)
o agua pura (sanos), dependiendo del grupo. Para el análisis del efecto de la administración de
los tratamientos, se realizaron las comparaciones considerando todos los grupos, y para saber el
efecto entre sanos o entre aquellos con HGNA, también se realizaron las comparaciones por
separado.
99
0
20
40
60
80
&
12 16 20
0
20
40
60
80
12 16 20
0
100
200
300
400
12 16 20
0
20
40
60
80
100
120
%a
%a¡
200
20
40
60
80
100
120
%a
%a¡
200
200
400
600
800%a¡
20
Agua pura Sacarosa 30% Sacarosa 40% Sacarosa 50%
Tiempo de evaluación (semanas)
IL-6
(pg
*mL
-1)
IL-6
(pg
*mL
-1)
TN
F-
(pg
*mL
-1)
TN
F-
(pg
*mL
-1)
TG
F-
(pg
*mL
-1)
TG
F-
(pg
*mL
-1)
A B C
D E F
Figura 16. Efecto del consumo de agua con sacarosa sobre los niveles séricos IL-6, TNF-
y TGF-. El panel superior muestra el efecto del consumo de sacarosa al 30% durante 12, 16 y
20 semanas (A-C) y el panel inferior muestra el efecto del consumo de sacarosa al 30%, 40% y
50% durante 20 semanas (D-F), en los niveles séricos de IL-6 (A, D), TNF- (B, E) y TGF-
(C, F). Cada barra representa la media ± e.e.m. de n=6 para cada grupo, por cada semana. %,
p<0.05 vs agua pura durante 20 semanas; &, p<0.05 vs sacarosa 30% durante 12 semanas; a,
p<0.05 vs sacarosa al 30% durante 20 semanas; ¡, p<0.05 vs sacarosa al 40% durante 20
semanas.
100
9.3.1. Efecto del tratamiento con metformina y 4-HC en ratas sanas o con HGNA sobre el
consumo de alimento y peso corporal
En la figura 17 se muestra el efecto del tratamiento con metformina y 4-HC en consumo
semanal promedio de alimento durante las cinco semanas de duración de los tratamientos.
Observando que todos los grupos con ingesta de sacarosa al 50% disminuyeron
significativamente el consumo de alimento sólido comparado con todos los grupos que
consumieron agua pura (p<0.001, figura 17A), y el tratamiento con ingesta de sacarosa al 50%
y co-tratamiento disminuyó significativamente el consumo de alimento sólido comparado con
el grupo con ingesta de sacarosa al 50% y tratamiento con solución salina (285.57±12.21 vs
438.6±20.59 g; p=0.046; figura 17A).
Por otra parte, entre los grupos con ingesta de agua pura, el tratamiento con metformina
incrementó significativamente el consumo de alimento comparado con el grupo al que se le
administró solución salina (1330.04±39.89 vs 1136.96±44.51 g; p=0.004; figura 17B); en
contraste el tratamiento en conjunto de metformina y 4-HC disminuyó significativamente el
consumo de alimento comparado con: (1) el grupo al que se le administró solución salina
(945.26±39.01 vs 1136.96±44.51 g; p=0.004; figura 17B); (2) el grupo con tratamiento de
metformina (945.26±39.01 vs 1330.04±39.089 g; p<0.001; figura 17B); y (3) el grupo con
tratamiento con 4-HC (945.26±39.01 vs 1233.94±46.92 g; p<0.001; figura 17B).
101
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
Agua pura Sacarosa 50%
*#%&
*#%&
*#%&
*#%&
*#%
*
$
Agua pura
*
*#%
Sacarosa 50%
$+!
Agua pura + solc. sal. Agua pura + metformina Agua pura + 4-HC Agua pura + metformina + 4-HC
Sacarosa 50%+ solc. sal. Sacarosa 50% + metformina Sacarosa 50% + 4-HC sacarosa 50% + metformina + 4-HCC
onsu
mo
sem
anal
pro
med
io d
e al
imen
to (
g) A B C
Figura 17. Efecto del tratamiento con metformina y 4-HC sobre el consumo de alimento.
En el gráfico (A) se presentan las comparaciones del efecto del tratamiento con solución salina
(solc. sal., 1 mL por día; vía p.o.), metformina (200 mg∙kg-1 por día; vía p.o.), 4-HC (80 mg∙kg-
1 por día; vía p.o.) y el conjunto de metformina y 4-HC, tanto en los grupos con ingesta de agua
pura como con ingesta de sacarosa al 50%. En gráfico (B) se presentan las comparaciones del
efecto de los tratamientos en los grupos con ingesta de agua pura. En el gráfico (C) presentan
las comparaciones del efecto de los tratamientos en los grupos con ingesta de agua con sacarosa
al 50%. Cada barra representa la media ± e.e.m. de n=6 para cada grupo, del consumo semanal
promedio de alimento durante las cinco semanas de tratamientos. *, p<0.05 vs agua pura + solc.
sal.; #, p<0.05 vs agua pura + metformina; %, p<0.05 vs agua pura + 4-HC; &, p<0.05 vs agua
pura + metformina + 4-HC; $, p<0.05 vs sacarosa 50% + solc. sal.; +, p<0.05 vs sacarosa 50%
+ metformina; !, p<0.05 vs sacarosa 50% + 4-HC.
102
Mientras que, en los grupos con ingesta de sacarosa al 50%, los tratamientos con
metformina (366.86±16.95 vs 438.6±20.59 g; p=0.072; figura 17C) y 4-HC (363.72±24.13 vs
438.6±20.59 g; p=0.058; figura 17C) comparado con el grupo al que se le administró solución
salina, mostraron una tendencia a disminuir el consumo de alimento aunque no fue
estadísticamente significativa. En contraste el tratamiento en conjunto con metformina y 4-HC
disminuyó el consumo de alimento de manera significativa comparado con el grupo con
tratamiento con: solución salina (285.57±12.21 vs 438.6±20.59 g; p<0.001; figura 17C),
metformina (285.57±12.21 vs 366.86±16.95 g; p=0.036; figura 17C) y 4-HC (285.57±12.21 vs
363.72±24.13 g; p=0.046; figura 17C).
Por otra parte, en la figura 18 se muestra el efecto del tratamiento con metformina y 4-
HC sobre el peso corporal durante las 25 semanas de experimentación. Al compararse todos los
grupos (figura 18A), se observó que los grupos con HGNA (con ingesta de sacarosa 50%)
presentaron menor peso corporal en las semanas previas al tratamiento, pero posteriormente se
igualaron al peso de los grupos sanos (con ingesta de agua pura), a excepción del grupo que
recibió tratamiento con metformina y 4-HC ya que este tratamiento generó una disminución en
peso corporal contra todos los grupos sanos en las semanas de tratamiento. Es decir, el grupo
con HGNA con tratamiento con solución salina presentó peso corporal significativamente
menor comparado: (1) con el grupo sano con solución salina en las semanas 5 (p<0.001) y 10
(p=0.007); (2) con el grupo sano con metformina en las semanas 5 (p<0.001), 10 (p<0.001) y
15 (p=0.03); (3) con el grupo sano con 4-HC en la semana 5 (p<0.001) y 10 (p=0.024); y (4)
con el grupo sano con metformina y 4-HC en la semana 5 (p=0.004) (figura 18A). El grupo con
HGNA con tratamiento con metformina presentó peso corporal significativamente menor,
comparado: (1) con el grupo sano con solución salina en la semana 10 (p=0.005); (2) con el
103
grupo sano con metformina en las semanas 5 (p=0.001), 10 (p<0.001) y 15 (p=0.004); (3) con
el grupo sano con 4-HC en la semana 10 (p=0.017); y (4) con el grupo sano con metformina y
4-HC en la semana 10 (p=0.042) (figura 18A). El grupo con HGNA con tratamiento con 4-HC
presentó peso corporal significativamente menor, comparado: (1) con el grupo sano con
solución salina en las semanas 5 (p=0.011), 10 (p=0.001) y 15 (p=0.047); (2) con el grupo sano
con metformina en las semanas 5 (p<0.001), 10 (p=0.001) y 15 (p<0.001); y (3) con el grupo
sano con 4-HC en las semanas 5 (p=0.013), 10 (p=0.005) y 15 (p=0.008) (figura 18A).
Por su parte, el grupo con HGNA y tratamiento con metformina y 4-HC presentó peso
corporal significativamente menor, comparado: (1) con el grupo sano con solución salina en las
semanas 5 (p=0.003), 10 (p<0.001), 15 (p<0.001), 24 (p=0.031), y 25 (p=0.01); (2) con el grupo
sano con metformina en las semanas 5, 10 y 15 (p<0.001), 20, 21 y 22 (p<0.05), 24 y 25
(p<0.001); (3) con el grupo sano con 4-HC en las semanas 5 (p=0.003), 10 y 15 (p<0.001), y
de 21 a 25 (p<0.05); (4) con el grupo sano con metformina y 4-HC en las semanas 5 (p=0.022),
10 (p<0.001), 15 (p=0.004); (5) con grupo con HGNA con solución salina en las semanas 22
(p=0.028), 23 (p=0.007), 24 y 25 (p<0.001); (6) con grupo con HGNA con metformina en las
semanas 22 a 25 (p<0.05); y (7) con grupo con HGNA con 4-HC en las semanas 24 y 25
(p<0.05) (figura 18A).
Además, cuando se realizó la comparación entre los grupos sanos (figura 18B), se observó
que el tratamiento con metformina disminuyó significativamente el peso corporal en la semana
23 (p<0.05) comparado con el grupo con tratamiento con 4-HC. Mientras que el tratamiento en
conjunto con metformina y 4-HC disminuyó significativamente el peso corporal en las semanas
10 y 25 (p<0.05) comparado con el grupo con el tratamiento con metformina.
104
0 1 5 10 15 20 21 22 23 24 25
0
100
200
300
400
500
600
* # % &* # %
* # % &* # %
* # % &* # %# # % # % * # %
+ ! $
#
* # % &
# #
+ $%+$
* # %+ ! $
0 1 5 10 15 20 21 22 23 24 25
&
%
&
0 1 5 10 15 20 21 22 23 24 25
+ +! $$
+ !$
+ !$
Auga pura + solc. sal. Agua pura + metformina Agua pura + 4-HC Agua pura + metformina + 4-HC
Sacarosa 50% + metformina + 4-HCSacarosa 50% + metformina Sacarosa 50% + 4-HCSacarosa 50% + solc. sal.
Puntos de evaluación (semana)
Pes
o co
pora
l (g)
A B C
Figura 18. Efecto del tratamiento con metformina y 4-HC sobre el peso corporal. En el
gráfico (A) se presentan las comparaciones del efecto del tratamiento con solc. sal. (1 mL por
día; vía p.o.), metformina (200 mg∙kg-1 por día; vía p.o.), 4-HC (80 mg∙kg-1 por día; vía p.o.) y
el conjunto de metformina y 4-HC, tanto en los grupos con ingesta de agua pura como con
ingesta de sacarosa al 50%. En gráfico (B) se presentan las comparaciones del efecto de los
tratamientos en los grupos con ingesta de agua pura. En el gráfico (C) presentan las
comparaciones del efecto de los tratamientos en los grupos con ingesta de agua con sacarosa al
50%. Cada punto representa la media ± e.e.m. de n=6 para cada grupo, del consumo semanal
promedio de alimento durante las cinco semanas de tratamientos. En cada gráfico el cuadro azul,
enmarca los puntos de los pesos corporales de las semanas previas a iniciar con los tratamientos;
mientras que el cuadro amarillo, enmarca los puntos de los pesos corporales semanales durante
los tratamientos. *, p<0.05 vs agua pura + solc. sal.; #, p<0.05 vs agua pura + metformina; %,
p<0.05 vs agua pura + 4-HC; &, p<0.05 vs agua pura + metformina + 4-HC; $, p<0.05 vs
sacarosa 50% + solc. sal.; +, p<0.05 vs sacarosa 50% + metformina; !, p<0.05 vs sacarosa 50%
+ 4-HC.
105
Finalmente, cuando se realizó la comparación entre los grupos con HGNA (figura 18C),
se observó que el grupo con tratamiento con metformina y 4-HC disminuyó significativamente
el peso corporal comparado: (1) con el grupo con tratamiento con solución salina en las semanas
22 a 25 (p<0.01); (2) con el grupo con tratamiento con metformina en las semanas 22 a 25
(p<0.05); y (3) con el grupo con tratamiento con 4-HC en las semanas 22 (p=0.047), 24
(p=0.013) y 25 (p=0.008).
9.3.2. Efecto del tratamiento con metformina y 4-HC en ratas sanas o con HGNA sobre la
tolerancia a la glucosa
En la figura 19 se presenta el efecto del tratamiento con metformina y 4-HC entre todos
los grupos, un día previo al tratamiento (figura 19A), el día 17 del tratamiento (figura 19B) y
el día 35 del tratamiento (figura 19C). Donde un día antes de iniciar los tratamientos, el grupo
con HGNA y tratamiento con solución salina presentó niveles de glucosa en sangre
significativamente mayores al minuto 60 comparado: (1) con el grupo sano con metformina
(p=0.006), (2) con el grupo sano con 4-HC (p=0.007) y (3) con el grupo sano con metformina y
4-HC (p=0.038). Mientras que el grupo con HGNA y tratamiento con metformina y 4-HC
presentó niveles de glucosa en sangre significativamente mayores al minuto 60 comparado con:
(1) el grupo sano con solución salina (p=0.001); (2) el grupo sano con metformina, (3) el grupo
sano con 4-HC (p<0.001); (4) el grupo sano con metformina y 4-HC, (5) el grupo con HGNA
con 4-HC (p<0.01) (figura 19A).
Mientras que el día 17 de tratamiento, sólo el grupo con HGNA y tratamiento con
solución salina presentó incremento en glucemia al minuto 60 comparado con el grupo sano con
solución salina (p=0.028; figura 19B). En tanto que en el día 35 no se observaron cambios en
los niveles de glucosa en sangre entre ninguno de los grupos evaluados (p=0.639; figura 19C).
106
0 30 60 120 240
0
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150
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# % &
* # % & !
0 30 60 120 240
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*
0 30 60 120 240
0
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100
150
200
Agua pura + solc. sal. Agua pura +metformina Agua pura + 4-HC Agua pura + metformina + 4-HC
Sacarosa 50%+ solc. sal. Sacarosa 50% + metformina + 4-HCSacarosa 50% + metformina Sacarosa 50% + 4-HC
Glu
cosa
en
sang
re (
mg*
dL-1
)
Tiempo (min)
Previo a tratamiento Día 17 de tratamiento Día 35 de tratamiento
A B C
Figura 19. Efecto del tratamiento con metformina y 4-HC sobre la tolerancia a glucosa
oral. Se presentan las comparaciones del efecto del tratamiento con solc. sal. (1 mL por día; vía
p.o.), metformina (200 mg∙kg-1 por día; vía p.o.), 4-HC (80 mg∙kg-1 por día; vía p.o.) y el
conjunto de metformina y 4-HC, tanto en los grupos con ingesta de agua pura como con ingesta
de sacarosa al 50%. En gráfico (A) se muestran los cursos temporales de PTGO realizados un
día antes de iniciar los tratamientos; en el gráfico (B) se muestran los cursos temporales de
PTGO realizados a la mitad del tratamiento (día 17) y en gráfico (C) se muestran los cursos
temporales de PTGO realizados el último día del tratamiento (día 35). Cada punto representa la
media ± e.e.m. de n=6 para cada grupo, al min 30, 60, 120 y 240 cuando fueron determinados
los niveles de glucosa en sangre posteriores a la administración de glucosa (2 mg∙kg-1, vía p.o.).
El tiempo cero representa los valores basales de glucosa en ayuno. *, p<0.05 vs agua pura +
solc. sal.; #, p<0.05 vs agua pura + metformina; %, p<0.05 vs agua pura + 4-HC; &, p<0.05 vs
agua pura + metformina + 4-HC; !, p<0.05 vs sacarosa 50% + 4-HC.
107
Probablemente algunas diferencias no se hacen notorias en esta comparación al ser
muchos los grupos de estudio; por ello, se realizó la comparación entre los grupos sanos y con
HGNA para corroborar si el tratamiento ejerció efecto en alguno de los puntos evaluados (un
día previo, día 17 y día 35 de tratamiento) (figura 20). El grupo con HGNA y tratamiento con
solución salina incrementó significativamente la glucemia al minuto 60, un día previo al
tratamiento (p=0.028; figura 20A) y el día 17 del tratamiento (p=0.003; figura 20C), sin
cambios en el día 35 del tratamiento (p=0.406; figura 20I) comparado con el grupo sano con
solución salina.
El grupo con HGNA y tratamiento con metformina comparado con el grupo sano con
metformina, presentó incrementó significativo en glucemia un día previo al tratamiento, en el
minuto 60 (p=0.012; figura 20B) y 120 (p=0.032; figura 20B). No se observaron cambios en
glucemia el día 17 del tratamiento (p=0.771; figura 20F); y el día 35 del tratamiento presentó
una disminución en glucemia al minuto 30 (p<0.001; figura 20J) y un incremento al minuto 60
(p<0.001; figura 20J). Lo que indica que el tratamiento con metformina disminuyó la
intolerancia a la glucosa, establecido con el consumo de sacarosa al 50%.
El grupo con HGNA y tratamiento con 4-HC comparado con el grupo sano y tratamiento
con 4-HC no presentó cambios en glucemia ni al día previo al tratamiento (p=0.83; figura 20C),
al día 17 del tratamiento (p=0.591 figura 20G), ni tampoco al día 35 del tratamiento (p=0.145;
figura 20K). En este caso no es posible conocer si la 4-HC ejerce algún efecto en disminución
de intolerancia a la glucosa, ya que el grupo con consumo de sacarosa al 50% no desarrolló
intolerancia a la glucosa antes de iniciar con el tratamiento.
El grupo con HGNA y tratamiento con metformina y 4-HC comparado con el grupo sano
y tratamiento con metformina y 4-HC, presentó incremento significativo en glucemia un día
108
previo al tratamiento, en el minuto 60 (p<0.001; figura 20D). No se observaron cambios en
glucemia el día 17 del tratamiento (p=0.502; figura 20H); ni en el día 35 del tratamiento
(p=0.611; figura 20L). Lo que indica que el tratamiento con metformina y 4-HC disminuyó la
intolerancia a la glucosa, inducido por el consumo de sacarosa al 50%.
Finalmente se hizo una comparación en cada grupo en los niveles de glucosa en sangre en
los distintos puntos evaluados (un día previo a tratamiento, el día 17 y el día 35 del tratamiento)
(figura 21). Los resultados mostraron que no existen cambios en la glucemia, en los grupos
sanos con tratamiento con solución salina (p=0.716; figura 21A), con 4-HC (p=0.308; figura
21C) y con metformina y 4-HC (p=0.587; figura 21D). En contraste en el grupo sano con
metformina se observó una disminución en glucosa en sangre al minuto 60 del día 35 comparado
con el día 17 de tratamiento (p=0.002; figura 21B); haciendo notorio el efecto de la metformina
en metabolismo de glucosa.
Por otra parte, en el grupo con HGNA con tratamiento con solución salina se observó una
disminución en la glucemia al minuto 60 del día 35 comparado con el día 17 (p=0.042; figura
21E) y con el día previo al tratamiento (p=0.013; figura 21E). Tal vez debido a un efecto
compensador en el organismo, de producción de mayor cantidad de insulina para regular los
niveles de glucosa en sangre, y esto podría indicar presencia de RI, aunque para comprobar esto,
es necesario medir niveles de insulina.
En el caso el grupo con HGNA con tratamiento con metformina se observó una
disminución significativa en la glucemia al minuto 30 y 60 del día 35 comparado con el día 17
(p=0.001; figura 21F) y con el día previo al tratamiento (p<0.001; figura 21F).
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*
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*
*
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Agua pura + solc. sal. Agua pura +metformina Agua pura + 4-HC Agua pura + metformina + 4-HCSacarosa 50% + solc. sal. Sacarosa 50% + metformina + 4-HCSacarosa 50% + metformina Sacarosa 50% + 4-HCPrevio a tratamiento
Día 17 de tratamiento
Glu
cosa
en
sang
re (m
g*dL
-1)
Tiempo (min)
Día 35 de tratamiento
A B C D
E F G H
I J K L
Figura 20. Efecto del tratamiento con metformina y 4-HC sobre la tolerancia a glucosa
oral entre grupos con ingesta de agua pura y de sacarosa al 50%, para cada tratamiento.
Se presentan los cursos temporales de PTGO de las comparaciones del efecto del tratamiento
con solc. sal. (1 mL por día; vía p.o.) (A, E, I), metformina (200 mg∙kg-1 por día; vía p.o.) (B,
F, J), 4-HC (80 mg∙kg-1 por día; vía p.o.) (C, G, K) y el co-tratamiento (D, H, L), de manera
independiente entre grupos con ingesta de agua pura o con sacarosa al 50% para cada
tratamiento. En el panel superior (A-D) se muestran las PTGO del día previo a los tratamientos;
en panel medio (E-H) del día 17 de los tratamientos; y en el panel inferior (I-L) del día 35 de
los tratamientos. Cada punto representa la media ± e.e.m. de n=6 para cada grupo, al min 30,
60, 120 y 240 cuando fueron determinados los niveles de glucosa en sangre posteriores a la
administración de glucosa (2 mg∙kg-1, vía p.o.). El tiempo cero representa los valores basales de
glucosa en ayuno. *, p<0.05 vs agua pura.
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#
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*#
0 30 60 120 240
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* #
0 30 60 120 240
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0 30 60 120 240
0
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150
200
*
**
*
Previo a tratamiento Día 17 de tratamiento Día 35 de tratamiento
Glu
cosa
en
sang
re (
mg*
dL-1
)Agua pura
Solución salina Metformina 4-Hidroxichalcona Metformina + 4-HC
Sacarosa al 50%
Tiempo (min)
Tiempo (min)
A B C D
E F G H
Figura 21. Efecto del tratamiento con metformina y 4-HC sobre la tolerancia a glucosa
oral a lo largo del tratamiento. En el panel superior (A-D) se muestran los cursos temporales
de las pruebas de tolerancia a la glucosa oral (PTGO) de los grupos con ingesta de agua pura y
en panel inferior (E-H) se muestran los cursos temporales de PTGO de los grupos con ingesta
de sacarosa al 50%. Se presentan las comparaciones del efecto del tratamiento con solc. sal. (1
mL por día; vía p.o.) (A, E), metformina (200 mg∙kg-1 por día; vía p.o.) (B, F), 4-HC (80 mg∙kg-
1 por día; vía p.o.) (C, G) y el conjunto de metformina y 4-HC (D, H). Cada punto representa la
media ± e.e.m. de n=6 para cada grupo, al min 30, 60, 120 y 240 cuando fueron determinados
los niveles de glucosa en sangre posteriores a la administración de glucosa (2 mg∙kg-1, vía p.o.).
El tiempo cero representa los valores basales de glucosa en ayuno. *, p<0.05 vs día previo a
tratamiento; #, p<0.05 vs día 17 de tratamiento.
111
Mientras que en el grupo con HGNA con tratamiento con 4-HC no se observaron cambios
en ninguno de los tiempos de evaluación (p=0.99; figura 21G). Con estos resultados y los
mostrados en figura 20, sugerimos que la 4-HC no ejerció efecto en el metabolismo de glucosa;
pero se requieren más estudios para poder confirmar esto.
En contraste, el grupo con HGNA con tratamiento con metformina y 4-HC presentó
disminución significativa en los niveles de glucosa en sangre al minuto 30 comparado del día
17 (p=0.006) y 35 (p<0.001) comparado con el día previo al tratamiento; y al minuto 60 de día
17 (p=0.018) y 35 (p=0.008) comparado con el día previo al tratamiento (figura 21H). Esto
pudiera ser, debido al efecto de la metformina sobre el metabolismo de glucosa.
9.3.3. Efecto del tratamiento con metformina y 4-HC en ratas sanas o con HGNA sobre el
porcentaje de peso del tejido hepático y adiposo
En la figura 22 se muestra el efecto del tratamiento con meftormina y 4-HC sobre el
porcentaje de peso del hígado. Donde al comparar todos los grupos, se observa que el grupo con
ingesta de sacarosa al 50% y tratamiento con solución salina, presentó incremento significativo
comparado con el grupo con ingesta de agua pura y tratamiento con solución salina (3.01±0.06
vs 2.66±0.04%; p=0.036; figura 22A) y con el grupo con ingesta de agua pura y tratamiento
con metformina (3.01±0.06 vs 2.65±0.1%; p=0.031 figura 22A).
Cuando se realizó la comparación entre los grupos sanos, no se observaron cambios
inducidos por los tratamientos (p=0.754; figura 22B). Mientras que al realizar la comparación
entre los grupos ingesta de sacarosa al 50%, se observa que el tratamiento con 4-HC disminuyó
significativamente el porcentaje en peso de hígado comparado con el grupo con tratamiento de
solución salina (2.64±0.08 vs 3.01±0.06%; p=0.025; figura 22C); esto también se observó en
la comparación entre todos los grupos (p=0.024; figura 22A).
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0
1
2
3
4
Agua pura Sacarosa 50%
*#$
Agua pura Sacarosa 50%
$
% D
e pe
so d
el h
ígad
o
Agua pura + solc. sal. Agua pura + metformina Agua pura + 4-HC Agua pura + metformina + 4-HC
Sacarosa 50% + metformina + 4-HCSacarosa 50% + solc. sal. Sacarosa 50% + metformina Sacarosa 50% + 4-HC
A B C
Figura 22. Efecto del tratamiento con metformina y 4-HC sobre el porcentaje (%) de peso
del hígado. En el gráfico (A) se presentan las comparaciones del efecto del tratamiento con solc.
sal. (1 mL por día; vía p.o.), metformina (200 mg∙kg-1 por día; vía p.o.), 4-HC (80 mg∙kg-1 por
día; vía p.o.) y el conjunto de metformina y 4-HC, tanto en los grupos con ingesta de agua pura
como con ingesta de sacarosa al 50%. En gráfico (B) se presentan las comparaciones del efecto
de los tratamientos en los grupos con ingesta de agua pura. En el gráfico (C) presentan las
comparaciones del efecto de los tratamientos en los grupos con ingesta de agua con sacarosa al
50%. Cada barra representa la media ± e.e.m. de n=6 para cada grupo, del consumo semanal
promedio de alimento durante las cinco semanas de tratamientos. *, p<0.05 vs agua pura + solc.
sal.; #, p<0.05 vs agua pura + metformina; $, p<0.05 vs sacarosa 50% + solc. sal.
113
Por otra parte, en la figura 23 se muestra el efecto del tratamiento con metformina y 4-
HC sobre el porcentaje de peso del tejido adiposo. Al realizar la comparación entre todos los
grupos (figura 23A), se observó un incremento significativo en el porcentaje de peso del tejido
adiposo en todos los grupos con ingesta de sacarosa al 50% comparado con los grupos con
ingesta de agua pura. Esto es, el grupo con ingesta de sacarosa al 50% con solución salina
presentó incremento significativo en % en peso de tejido adiposo, comparado con los grupos
con ingesta de agua pura que tuvieron tratamiento con solución salina (4.62±0.47 vs 2.3±0.47%;
p=0.027); metformina (4.62±0.47 vs 1.42±0.25%; p<0.001) y 4-HC (4.62±0.47 vs 1.9±0.27%;
p=0.005).
Mientras, el grupo con ingesta de sacarosa al 50% con metformina presentó incremento
significativo en % en peso de tejido adiposo, comparado con los grupos con ingesta de agua
pura que tuvieron tratamiento con solución salina (5.17±0.77 vs 2.3±0.47%; p=0.003);
metformina (5.17±0.77 vs 1.42±0.25%; p<0.001); 4-HC (5.17±0.77 vs 1.9±0.27%; p<0.001) y
con metformina y 4-HC (5.17±0.77 vs 2.59±0.54%; p=0.01).
En tanto que, el grupo con ingesta de sacarosa al 50% y tratamiento con 4-HC
(5.07±0.46%) presentó incremento significativo en % en peso de tejido adiposo, comparado con
los grupos con ingesta de agua pura que tuvieron tratamiento con solución salina (p=0.004);
metformina (p<0.001); 4-HC (p<0.001) y metformina y 4-HC (p=0.015). Así como, en el grupo
con ingesta de sacarosa al 50% y tratamiento con metformina y 4-HC (4.21±0.39), comparado
con los grupos sanos con tratamiento con metformina (p=0.004) y con 4-HC (p=0.028).
114
0
1
2
3
4
5
6
Agua pura Sacarosa 50%
*#%
*#%&
*#%&
#%
Agua pura Sacarosa 50%
% D
e pe
so d
el t
ejid
o ad
ipos
o
Agua pura + solc. sal. Agua pura + metformina Agua pura + 4-HC Agua pura + metformina + 4-HC
Sacaosa 50% + metformina + 4-HCSacarosa 50% + solc. sal. Sacarosa 50% + metformina Sacarosa 50% + 4-HC
A B C
Figura 23. Efecto del tratamiento con metformina y 4-HC sobre el porcentaje (%) de
peso del tejido adiposo. En el gráfico (A) se presentan las comparaciones del efecto del
tratamiento con solc. sal. (1 mL por día; vía p.o.), metformina (200 mg∙kg-1 por día; vía p.o.),
4-HC (80 mg∙kg-1 por día; vía p.o.) y el conjunto de metformina y 4-HC, tanto en los grupos
con ingesta de agua pura como con ingesta de sacarosa al 50%. En gráfico (B) se presentan las
comparaciones del efecto de los tratamientos en los grupos con ingesta de agua pura. En el
gráfico (C) presentan las comparaciones del efecto de los tratamientos en los grupos con
ingesta de agua con sacarosa al 50%. Cada barra representa la media ± e.e.m. de n=6 para cada
grupo, del consumo semanal promedio de alimento durante las cinco semanas de tratamientos.
*, p<0.05 vs agua pura + solc. sal.; #, p<0.05 vs agua pura + metformina; %, p<0.05 vs agua
pura + 4-HC; &, p<0.05 vs agua pura + metformina + 4-HC.
115
Cuando se realizó la comparación entre los grupos sanos no se observaron cambios en
porcentaje en peso de tejido adiposo inducidos por alguno de los tratamientos (p=0.22; figura
23B). Tampoco se observaron cambios significativos en porcentaje en peso de tejido adiposo
inducidos por los tratamientos en los grupos con ingesta de sacarosa al 50% (p=0.585; figura
23C).
9.3.4. Efecto del tratamiento con metformina y 4-HC en ratas sanas o con HGNA sobre la
actividad de enzimas hepáticas
En la figura 24 se muestra el efecto del tratamiento con metformina y 4-HC en niveles
séricos de FA. Al realizar la comparación entre todos los grupos, no se observaron diferencias
significativas (p=0.101; figura 24A). Tampoco se observaron cambios en la comparación entre
los grupos sanos (p=0.32; figura 24B), aunque se observa una tendencia a disminuir los niveles
séricos de FA en los grupos tratados con metformina (65.5±7.7 vs 69.28±6.6 UI/L) y 4-HC
(60.0±7.9 vs 69.28±6.6 UI/L) comparados con el grupo tratado con solución salina.
Mientras, en la comparación entre los grupos con HGNA, el tratamiento con metformina
más 4-HC disminuyó significativamente los niveles séricos de FA comparados con el grupo
tratado con solución salina (64.94±4 vs 83.7±4.3 UI/L; p=0.022; figura 24C); y si bien no se
observa disminución significativa, si se observa una tendencia a disminuir los niveles de FA con
los tratamientos de metformina (77.81±2.7 vs 83.7±4.3 UI/L; p=0.745; figura 24C) y 4-HC
(74.52±5.4 vs 83.7±4.3 UI/L; p0=0.419; figura 24C).
116
0
20
40
60
80
100
Agua pura Sacarosa 50% Agua pura Sacarosa 50%
$
Agua pura + solc. sal. Agua pura + metformina Agua pura + 4-HC Agua pura + metformina + 4-HC
Sacarosa 50% + solc. sal. Sacarosa 50% + metformina Sacarosa 50% + 4-HC Sacarosa 50% + metformina + 4-HCF
osfa
tasa
alc
alin
a sé
rica
(UI*
L-1
)A B C
Figura 24. Efecto del tratamiento con metformina y 4-HC sobre los niveles séricos de FA.
En el gráfico (A) se presentan las comparaciones del efecto del tratamiento con solc. sal. (1 mL
por día; vía p.o.), metformina (200 mg∙kg-1 por día; vía p.o.), 4-HC (80 mg∙kg-1 por día; vía
p.o.) y el conjunto de metformina y 4-HC, tanto en los grupos con ingesta de agua pura como
con ingesta de sacarosa al 50%. En gráfico (B) se presentan las comparaciones del efecto de los
tratamientos en los grupos con ingesta de agua pura. En el gráfico (C) presentan las
comparaciones del efecto de los tratamientos en los grupos con ingesta de agua con sacarosa al
50%. Cada barra representa la media ± e.e.m. de n=6 para cada grupo, del consumo semanal
promedio de alimento durante las cinco semanas de tratamientos. $, p<0.05 vs sacarosa 50% +
solc. sal.
117
En la figura 25 se observa el efecto del tratamiento con metformina y 4-HC en niveles
séricos de AST. Observando que al realizar la comparación entre todos los grupos (figura 25A),
se presentó una disminución significativa en niveles séricos de AST en todos los grupos con
ingesta de sacarosa al 50% comparado con los grupos con ingesta de agua pura. Esto es, el grupo
con ingesta de sacarosa al 50% con solución salina presentó disminución significativa en AST,
comparado con los grupos con ingesta de agua pura que tuvieron tratamiento con solución salina
(17.39±2.2 vs 37.58±3.9 UI/L; p<0.001); metformina (17.39 ± 2.2 vs 46.42±3.4 UI/L; p<0.001);
4-HC (17.39±2.2 vs 35.08±2.7 UI/L; p=0.002) y metformina más 4-HC (17.39±2.2 vs 38.32±3.3
UI/L; p<0.001).
El grupo con ingesta de sacarosa al 50% y tratamiento con metformina (17.24±1.7 UI/L)
presentó una disminución significativa en AST, comparado con todos los grupos con ingesta de
agua pura (p<0.01). El grupo con ingesta de sacarosa al 50% con 4-HC (23.58±1.9 UI/L)
presentó disminución significativa en AST, comparado con los grupos con ingesta de agua pura
que tuvieron tratamiento con solución salina (p=0.028); metformina (p<0.001); y metformina y
4-HC (p=0.017). Así como, en el grupo con ingesta de sacarosa al 50% y tratamiento con
metformina y 4-HC (20.34±3.3 UI/L), comparado con todos los grupos con ingesta de agua pura
(p<0.05).
Sin embargo, cuando se realizó la comparación entre los grupos con ingesta de agua pura
(p=0.122; figura 25B) o entre los grupos con ingesta de sacarosa al 50% (p=0.219; figura 25C)
no se observaron diferencias estadísticamente significativas, ejercidas por los tratamientos con
metformina y/o 4-HC.
118
0
10
20
30
40
50
60
Agua pura Sacarosa 50%
*#%&
*#%&
*#&
*#%&
Agua pura Sacarosa 50%
Agua pura + solc. sal. Agua pura + metformina Agua pura + 4-HC Agua pura + metformina + 4-HC
Sacarosa 50% + solc. sal. Sacarosa 50% + metformina Sacarosa 50% + 4-HC Sacarosa 50% + metformina + 4-HCA
ST s
éric
a (U
I*L
-1)
A B C
Figura 25. Efecto del tratamiento con metformina y 4-HC sobre los niveles séricos de AST.
En el gráfico (A) se presentan las comparaciones del efecto del tratamiento con solc. sal. (1 mL
por día; vía p.o.), metformina (200 mg∙kg-1 por día; vía p.o.), 4-HC (80 mg∙kg-1 por día; vía
p.o.) y el conjunto de metformina y 4-HC, tanto en los grupos con ingesta de agua pura como
con ingesta de sacarosa al 50%. En gráfico (B) se presentan las comparaciones del efecto de los
tratamientos en los grupos con ingesta de agua pura. En el gráfico (C) presentan las
comparaciones del efecto de los tratamientos en los grupos con ingesta de agua con sacarosa al
50%. Cada barra representa la media ± e.e.m. de n=6 para cada grupo, del consumo semanal
promedio de alimento durante las cinco semanas de tratamientos. *, p<0.05 vs agua pura + solc.
sal.; #, p<0.05 vs agua pura + metformina; %, p<0.05 vs agua pura + 4-HC; &, p<0.05 vs agua
pura + metformina + 4-HC.
119
En la figura 26 se observa el efecto del tratamiento con metformina y 4-HC en niveles
séricos de ALT. Al realizar la comparación entre todos los grupos (figura 26A), se observó una
disminución significativa en niveles séricos de ALT en el grupo con ingesta de sacarosa al 50%
con tratamiento con metformina comparado con los grupos con ingesta de agua pura que
tuvieron tratamiento con metformina (6.48±0.44 vs 14.15±0.6 UI/L; p=0.002); 4-HC (6.48±0.44
vs 12.97±1.8 UI/L; p=0.015); y metformina más 4-HC (6.48±0.44 vs 12.67±2.5 UI/L; p=0.023).
Sin embargo, cuando se realizó la comparación entre los grupos con ingesta de agua pura
no se observaron diferencias estadísticamente significativas, ejercidas por los tratamientos con
metformina y/o 4-HC (p=0.801; figura 26B). En contraste, en la comparación entre los grupos
con ingesta de sacarosa al 50%, el tratamiento con metformina disminuyó significativamente
los niveles séricos de ALT comparado con el tratamiento con solución salina (6.48±0.44 vs
9.73±00.8 UI/L; p=0.035; figura 26C) y 4-HC (6.48±0.44 vs 11.64±0.9 UI/L; p<0.001; figura
26C).
9.3.5. Efecto del tratamiento con metformina y 4-HC en ratas sanas o con HGNA sobre la
morfología hepática
Las muestras teñidas con H&E fueron observadas a 40X y se cuantificó considerando 50
campos; se capturaron imágenes de parénquima, vena central y estructura porta con el mismo
aumento. En los cortes histológicos de los grupos con ingesta de agua pura (figura 27), se
observó parénquima hepático con arquitectura normal; esto fue en los grupos tratados
metformina (figura 28D-F), 4-HC (figura 28G-I) y metformina con 4-HC (figura 28J-L);
presentando grado 0 de esteatosis, mientras que el grupo con tratamiento con solución salina
(figura 28A-C) presentó escasa esteatosis microvesicular (5.48%) considerado como grado 1
de esteatosis.
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0
5
10
15
20
Agua pura Sacarosa 50%
#%&
Agua pura Sacarosa 50%
$!
AL
T s
éric
a (U
I*L
-1)
Agua pura + solc. sal. Agua pura + metformina Agua pura + 4-HC Agua pura + metformina + 4-HC
Sacarosa 50% + solc. sal. Sacarosa 50% + metformina Sacarosa 50% + 4-HC Sacarosa 50% + metformina + 4-HC
A B C
Figura 26. Efecto del tratamiento con metformina y 4-HC sobre los niveles séricos de ALT.
En el gráfico (A) se presentan las comparaciones del efecto del tratamiento con solc. sal. (1 mL
por día; vía p.o.), metformina (200 mg∙kg-1 por día; vía p.o.), 4-HC (80 mg∙kg-1 por día; vía
p.o.) y el conjunto de metformina y 4-HC, tanto en los grupos con ingesta de agua pura como
con ingesta de sacarosa al 50%. En gráfico (B) se presentan las comparaciones del efecto de los
tratamientos en los grupos con ingesta de agua pura. En el gráfico (C) presentan las
comparaciones del efecto de los tratamientos en los grupos con ingesta de agua con sacarosa al
50%. Cada barra representa la media ± e.e.m. de n=6 para cada grupo, del consumo semanal
promedio de alimento durante las cinco semanas de tratamientos. #, p<0.05 vs agua pura +
metformina; %, p<0.05 vs agua pura + 4-HC; &, p<0.05 vs agua pura + metformina + 4-HC; $,
p<0.05 vs sacarosa 50% + solc. sal.; !, p<0.05 vs sacarosa 50% + 4-HC.
121
Figura 27. Efecto del tratamiento con metformina y 4-HC en ratas sanas sobre la
morfología del tejido hepático. Los tejidos fueron teñidos con H&E y observados a 40X.
Parénquima hepático (A, D, G, J). Venas centrales (B, E, H, K). Estructura porta (C, F, I, L).
Grupo con tratamiento con solución salina (1 mL por día, vía p.o.) (A-C); metformina (200
mg∙kg-1 por día; vía p.o.) (D-F), 4-HC (80 mg∙kg-1 por día; vía p.o.) (G-I), y metformina + 4-
HC (J-L). En todas las imágenes la escala de barra es de 50 m.
122
En la figura 28 se muestran las histologías del tejido hepático teñidas con H&E de los
grupos con HGNA (ingesta de sacarosa al 50%). Donde el grupo tratado con solución salina
(figura 28A-C) presentó severa esteatosis microvesicular (65.48%) y escasa esteatosis
macrovesicular (8.74%) principalmente en estructuras porta (figura 28C) y parénquima (figura
28A), con una media de esteatosis de 74.22%; así como muchas células balonadas (2 por campo)
y presencia de varios infiltrados inflamatorios (4 por muestra), posicionándolo en grado 7 de
desarrollo de HGNA (EHNAS). Mientras que el tratamiento con metformina (figura 28D-F),
disminuyó el grado de esteatosis inducido por la ingesta de sacarosa al 50%, presentando severa
esteatosis micro-vesicular (52.25%) y escasa macrovesicular (9.48%) principalmente en
estructuras porta (figura 28F) y parénquima (figura 28D), con una media de 67.91%; así como
algunas células balonadas (1 por campo) y presencia de infiltrado inflamatorio (1 por muestra)
posicionándolo en grado 5 de desarrollo de HGNA (EHNAS).
Sin embargo, el tratamiento con 4-HC (figura 28G-I) disminuyó aún más el grado de
daño hepático inducido por la ingesta de sacarosa al 50%, presentando moderada esteatosis
microvesicular (55.16%) y escasa esteatosis macrovesicular (5.56%), principalmente en
estructuras porta (figura 28I) y parénquima (figura 28G), con una media de 60.66%; sin
presencia de células balonadas o infiltrado inflamatorio; posicionándolo en grado 2 de desarrollo
de HGNA (EHNA). Un efecto similar, se observó con el tratamiento en conjunto de metformina
y 4-HC (figura 28J-L), el cual presentó moderada esteatosis microvesicular (47.73%) y ligera
esteatosis macrovesicular (11.93%), principalmente en estructuras porta (figura 28L) y
parénquima (figura 28J), con una media de esteatosis de 59.66%; sin presencia de células
balonadas, pero con un infiltrado inflamatorio por muestra; posicionándolo en grado 3 de
desarrollo de HGNA (EHNA).
123
Figura 28. Efecto del tratamiento con metformina y 4-HC en ratas con HGNA sobre la
morfología del tejido hepático. Los tejidos fueron teñidos con H&E y observados a 40X.
Parénquima hepático (A, D, G, J). Venas centrales (B, E, H, K). Estructura porta (C, F, I, L).
Grupo con tratamiento con solución salina (1 mL por día, vía p.o.) (A-C); metformina (200
mg∙kg-1 por día; vía p.o.) (D-F), 4-HC (80 mg∙kg-1 por día; vía p.o.) (G-I), y metformina + 4-
HC (J-L). Las flechas señalan hepatocitos con esteatosis microvesicular; los cuadrados
enmarcan hepatocitos con esteatosis macrovesicular y los círculos enmarcan células balonadas.
En todas las imágenes la escala de barra es de 50 m.
124
9.3.6. Efecto del tratamiento con metformina y 4-HC en ratas sanas o con HGNA sobre
los cambios en formación de colágeno en tejido hepático
Cuando todas las muestras fueron teñidas con TM, se hizo evidente que no se presentaron
cambios en la cantidad y distribución de colágeno como consecuencia del tratamiento con
solución salina (figura 29A-C), metformina (figura 29D-F), 4-HC (figura 29G-I) o con
metformina y 4-HC (figura 29J-L) en histologías hepáticas en los grupos con ingesta de agua
pura. Es decir, estos grupos mostraron la presencia de colágeno en estructuras portas y en venas
hepáticas de forma normal; sin mostrar acumulación significativa de colágeno en parénquima
hepático (F0).
En la figura 30 se presentan las histologías de tejido hepático teñidas con TM de los
grupos con HGNA (ingesta de sacarosa al 50%). Se observa que el grupo tratado con solución
salina (figura 30A-C) presentó colágeno en espacios perisinuoidales en tres ratas (F1), así como
fibras septas en espacio portal (F2) en dos ratas y solo una no mostró alteraciones en cantidad y
distribución de colágeno. Mientras que el tratamiento con metformina (figura 30D-F),
disminuyó el grado de fibrosis inducido por la ingesta de sacarosa al 50%, debido a que tres
ratas presentaron fibrosis en espacio portal sin septas (F1) y las tres ratas restantes no
desarrollaron fibrosis.
Sin embargo, el efecto del tratamiento con 4-HC (figura 30G-I) en fibrosis fue más
notorio que el presentado por el tratamiento con metformina, esto debido a que solo una rata
presentó fibrosis portal sin septas (F1) y las cinco restantes no desarrollaron fibrosis.
125
Figura 29. Efecto del tratamiento con metformina y 4-HC en ratas sanas sobre los cambios
de colágeno en tejido hepático. Los tejidos fueron teñidos con TM y observados a 10X.
Parénquima hepático (A, D, G, J). Venas centrales (B, E, H, K). Estructura porta (C, F, I, L).
Grupo con tratamiento con solución salina (1 mL por día, vía p.o.) (A-C); metformina (200
mg∙kg-1 por día; vía p.o.) (D-F), 4-HC (80 mg∙kg-1 por día; vía p.o.) (G-I), y metformina + 4-
HC (J-L). En todas las imágenes la escala de barra es de 200 m.
126
Figura 30. Efecto del tratamiento con metformina y 4-HC en ratas con HGNA sobre los
cambios de colágeno en tejido hepático. Los tejidos fueron teñidos con TM y observados a
10X. Parénquima hepático (A, D, G, J). Venas centrales (B, E, H, K). Estructura porta (C, F, I,
L). Grupo con tratamiento con solución salina (1 mL por día, vía p.o.) (A-C); metformina (200
mg∙kg-1 por día; vía p.o.) (D-F), 4-HC (80 mg∙kg-1 por día; vía p.o.) (G-I), y metformina + 4-
HC (J-L). Los círculos enmarcar fibrosis perisinusoidal, mientras que las flechas señalan fibras
septas. En todas las imágenes la escala de barra es de 200 m.
127
Mientras que el efecto del tratamiento en conjunto de metformina y 4-HC (figura 30J-L)
se encuentra en un punto intermedio entre el de los tratamientos dados por separado, debido a
que se observó presencia de fibrosis sin septas (F1) en dos ratas, mientras que las cuatro restantes
no desarrollaron fibrosis (F0).
9.3.7. Efecto del tratamiento con metformina y 4-HC en ratas sanas o con HGNA sobre
los niveles séricos de citocinas
En la figura 31 se muestra el efecto del tratamiento con metformina y 4-HC sobre los
niveles séricos de IL-6 (figura 31A- C) y TNF- (figura 31D- F). Al realizar la comparación
entre todos los grupos, se observa que el consumo de sacarosa al 50%, independientemente del
tratamiento recibido, incrementó de manera significativa (figura 31A; p<0.001) los niveles
séricos de IL-6 comparado con los grupos con consumo de agua pura, con los diferentes
tratamientos.
Sin embargo, cuando se realizó la comparación entre los grupos con ingesta de agua pura
no se observaron diferencias estadísticamente significativas, ejercidas por los tratamientos con
metformina y/o 4-HC (p=0.392; figura 31B). En contraste, en la comparación entre los grupos
con ingesta de sacarosa al 50%, el tratamiento con 4-HC fue el único que disminuyó
significativamente los niveles séricos de IL-6 comparado con el tratamiento con solución salina
(94.17±3.11 vs 114.66±4.19 pg∙mL-1; p<0.001; figura 31C).
Por otra parte, al realizar la comparación de los niveles séricos de TNF- considerando
todos los grupos (figura 31D), se observa que el consumo de sacarosa al 50% y tratamiento con
solución salina presentó niveles séricos de TNF-significativamente mayores, comparado con
todos los grupos con ingesta de agua pura (p<0.001), así como con los grupos con consumo de
128
sacarosa al 50% y tratamiento con 4-HC (132.27±3.87 vs 95.13±3.7 pg∙mL-1; p<0.001) o el
tratamiento en conjunto de metfomina y 4-HC (132.27±3.87 vs 108.33±3.7 pg∙mL-1; p=0.002).
El consumo de sacarosa al 50% y tratamiento con monoterapia de metformina o con tratamiento
en conjunto de metformina y 4-HC presentaron niveles séricos de TNF- significativamente
mayores comparados con todos los grupos con ingesta de agua pura (p<0.001). El consumo de
sacarosa al 50% y tratamiento con 4-HC presentó incremento en niveles séricos de TNF-
comparado con el grupo con ingesta de agua pura y tratamiento con solución salina (95.13±3.7
vs 75.23±2.5 pg∙mL-1; p=0.014), mientras que presentó disminución significativa en este
parámetro comparado con el grupo con ingesta de sacarosa al 50% y tratamiento con metformina
(95.13±3.7 vs 123.6±2.7 pg∙mL-1; p<0.001).
Cuando se realizó la comparación entre los grupos con ingesta de agua pura no se
observaron diferencias significativas inducidas por ninguno de los tratamientos (p=0.894;
figura 31E). Mientras que al realizar la comparación entre los grupos con ingesta de sacarosa
al 50% (figura 31F), se observó que el tratamiento con 4-HC disminuyó significativamente los
niveles séricos de TNF- comparado con los grupos tratados con: solución salina (95.13±3.7 vs
132.27±3.9 pg∙mL-1; p<0.001), metformina (95.13±3.7 vs 123.6±2.7 pg∙mL-1; p<0.001) y
tratamiento en conjunto de metformina y 4-HC (95.13±3.7 vs 108.33±2.4 pg∙mL-1; p=0.041).
Mientras que el tratamiento en conjunto con metformina y 4-HC disminuyó significativamente
los niveles séricos de TNF- comparado con los grupos tratados con solución salina (108.33±2.4
vs 132.27±3.9 pg∙mL-1; p<0.001) o con monoterapia de metformina (108.33±2.4 vs 123.6±2.7
pg∙mL-1; p=0.016).
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Agua pura Sacarosa 50%
*#%&!
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Agua pura Sacarosa 50%
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80
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120
140
Sacarosa 50%
$$
+ +a
Agua pura + solc. sal. Agua pura + metformina Agua pura + 4-HC Agua pura + metformina + 4-HC
Sacarosa 50% + solc. sal. Sacarosa 50% + metformina Sacarosa 50% + 4-HC Sacarosa 50% + metformina + 4-HC
IL-6
sér
ica
(pg*
mL
-1)
TN
F-
sér
ica
(pg*
mL
-1)
A B C
D E F
Figura 31. Efecto del tratamiento con metformina y/o 4-HC sobre los niveles séricos de IL-
6 y TNF-. El panel superior muestra el efecto de los tratamientos en los niveles séricos de IL-
6 (A-C), el panel inferior el efecto de los tratamientos en los niveles séricos de TNF-(D-F).
En los gráficos (A y D) se presentan las comparaciones del efecto del tratamiento con solc. sal.
(1 mL por día; vía p.o.), metformina (200 mg∙kg-1 por día; vía p.o.), 4-HC (80 mg∙kg-1 por día;
vía p.o.) y el conjunto de metformina y 4-HC, tanto en los grupos con ingesta de agua pura como
con ingesta de sacarosa al 50%. Los gráficos B y E muestran las comparaciones del efecto de
los tratamientos en los grupos con ingesta de agua pura. En los gráficos C y F se presentan las
comparaciones del efecto de los tratamientos en los grupos con ingesta de agua con sacarosa al
50%. Cada barra representa la media ± e.e.m. de n=6 para cada grupo. *, p<0.05 vs agua pura +
130
solc. sal.; #, p<0.05 vs agua pura + metformina (metf), %, p<0.05 vs agua pura + 4-HC, &,
p<0.05 vs agua pura + metf + 4-HC; $, p<0.05 vs sacarosa (sac) 50% + solc. sal.; +, p<0.05 vs
sac 50% + metformina; !, p<0.05 vs sac 50% + 4-HC; a, p<0.05 vs sac 50% + metf + 4-HC.
131
En la figura 32 se muestra el efecto del tratamiento con metformina y 4-HC en niveles
séricos de TGF- (figura 32A-C) e IL-10 (figura 32D- F). Al realizar la comparación entre
todos los grupos, se observó que el consumo de sacarosa al 50%, independientemente del
tratamiento recibido, incrementó de manera significativa (figura 32A; p<0.001) los niveles
séricos de TGF- comparado con los grupos con consumo de agua pura, con los diferentes
tratamientos. Además, el grupo con ingesta de sacarosa al 50% y tratamiento con solución salina
presentó niveles séricos de TGF- significativamente mayores con los grupos con ingesta de
sacarosa al 50% y tratamiento con: monoterapia de metformina (648.24±5.7 vs 590.66±14.3
pg∙mL-1; p= 0.004) o tratamiento en conjunto de metformina y 4-HC (648.24±5.7 vs
564.02±6.24 pg∙mL-1; p< 0.001).
Al realizar la comparación entre los grupos con ingesta de agua pura no se observaron
diferencias significativas inducidas por ninguno de los tratamientos (p=0.311; figura 32B).
Mientras que al realizar la comparación entre los grupos con ingesta de sacarosa al 50% (figura
32C), se observó que el tratamiento con 4-HC disminuyó significativamente los niveles séricos
de TGF- comparado con los grupos tratados con: solución salina (494.44±16.1 vs 648.24±5.7
pg∙mL-1; p<0.001), metformina (494.44±16.1 vs 590.66±14.3 pg/m pg∙mL-1L; p<0.001) y
tratamiento en conjunto de metformina y 4-HC (494.44±16.1 vs 564.02±6.2 pg∙mL-1; p=0.002).
Por otra parte, el tratamiento con monoterapia de metformina (590.66±14.28 vs 648.24±5.7
pg∙mL-1; p=0.011) y el tratamiento en conjunto con metformina y 4-HC (564.02±6.24 vs
648.24±5.7 pg∙mL-1; p<0.001) disminuyeron significativamente los niveles séricos de TGF-
comparado con el grupo con tratamiento con solución salina.
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Agua pura Sacarosa 50%
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*#%&!
0
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100
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600
700
Sacarosa 50%
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$$
0
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Agua pura Sacarosa 50%
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0
100
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300
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Agua pura
0
100
200
300
400
500
Sacarosa 50%
$$ $
Agua pura + solc. sal. Agua pura + metformina Agua pura + 4-HC Agua pura + metformina + 4-HC
Sacarosa 50% + solc. sal. Sacarosa 50% + metformina Sacarosa 50% + 4-HC Sacarosa 50% + metformina + 4-HC
TG
F-
sér
ica
(pg*
mL
-1)
IL-1
0 sé
rica
(pg
*mL
-1)
A B C
D E F
Figura 32. Efecto del tratamiento con metformina y 4-HC sobre los niveles séricos de TGF-
e IL-10. El panel superior muestra el efecto de los tratamientos en los niveles séricos de TGF-
(A-C) y en el panel inferior el efecto de los tratamientos en los niveles séricos de IL-10. En
los gráficos (A y D) se presentan las comparaciones del efecto del tratamiento con solc. sal. (1
mL por día; vía p.o.), metformina (200 mg∙kg-1 por día; vía p.o.), 4-HC (80 mg∙kg-1 por día; vía
p.o.) y el conjunto de metformina y 4-HC, tanto en los grupos con ingesta de agua pura como
con ingesta de sacarosa al 50%. Los gráficos B y E muestran las comparaciones del efecto de
los tratamientos en los grupos con ingesta de agua pura. En los gráficos C y F se presentan las
comparaciones del efecto de los tratamientos en los grupos con ingesta de agua con sacarosa al
50%. Cada barra representa la media ± e.e.m. de n=6 para cada grupo. *, p<0.05 vs agua pura +
solc. sal.; #, p<0.05 vs agua pura + metformina (metf), %, p<0.05 vs agua pura + 4-HC, &,
133
p<0.05 vs agua pura + metf + 4-HC; $, p<0.05 vs sacarosa (sac) 50% + solc. sal.; +, p<0.05 vs
sac 50% + metformina; !, p<0.05 vs sac 50% + 4-HC; a, p<0.05 vs sac 50% + metf + 4-HC.
134
Por otra parte, al realizar la comparación entre todos los grupos, se observó que el
consumo de sacarosa al 50%, independientemente del tratamiento recibido, disminuyó de
manera significativa (figura 32D; p<0.01) los niveles séricos de IL-10 comparado con los
grupos con consumo de agua pura, con los diferentes tratamientos. Además, el grupo con ingesta
de sacarosa al 50% y tratamiento con solución salina presentó niveles séricos de IL-10
significativamente menores, comparado con los grupos con ingesta de sacarosa al 50% y
tratamiento con: metformina y 4-HC (255.22±4.42 vs 304.95±10.2 pg∙mL-1; p= 0.005; figura
32D) o tratamiento con 4-HC (255.22±4.42 vs 313.63±6.5 pg∙mL-1; p< 0.001; figura 32D).
Cuando se realizó la comparación entre los grupos con ingesta de agua pura no se
observaron diferencias significativas inducidas por ninguno de los tratamientos (p=0.04; figura
32E). Mientras que al realizar la comparación entre los grupos con ingesta de sacarosa al 50%
(figura 32F), se observó los tratamientos con metformina (286.48±9.1 vs 255.22±4.4 pg∙mL-1;
p=0.05), 4-HC (313.63±6.5 vs 255.22±4.4 pg∙mL-1; p<0.001) y tratamiento en conjunto de
metformina y 4-HC (304.95±10.2 vs 255.22±4.4 pg∙mL-1; p=0.001), incrementaron
significativamente los niveles séricos de IL-10 comparados con el grupo tratado con solución
salina.
135
X. DISCUSIÓN
10.1. Síntesis y confirmación molecular de 4-HC
La síntesis de 4-HC se realizó por medio de una condensación aldólica catalizada por un
ácido de Lewis (BF3∙OEt2), siguiendo la metodología de Narender y Papi Reddy (2007).
Para su confirmación molecular se empleó la espectrometría de infrarrojo, la cual tiene
como objetivo identificar los grupos funcionales presentes en la molécula, estos se denotan por
su longitud de onda o por su frecuencia, esta última se expresa en números de onda, cm-1
(Morrison y Boyd, 1998). Las señales de flexión observadas de los grupos funcionales de la
molécula de estudio corresponden a lo previamente reportado (Begum y col., 2018).
Por otra parte, la espectrometría de RMN, es el estudio de estructura molecular a través
de la medida de las interacciones de una oscilación de campo electromagnético de una variedad
de núcleos situados bajo la acción de un fuerte campo magnético externo (Macomber, 1998).
Esta técnica es considerada la que mayor información estructural proporciona, debido a que se
observan los núcleos de los átomos y se puede conocer la influencia de cada entorno molecular
sobre cada uno de los átomos. Siendo la RMN de hidrógeno (1H) la más utilizada en la actualidad
en investigación, debido a que se le atribuye una sensibilidad magnética de valor relativo 1
(100%) (Macomber, 1998; Lambert y Mazzola, 2003; Silverstein y col., 2005). De acuerdo a lo
antes mencionado, es que se obtuvo el espectro de RMN-1H como técnica para confirmación
molecular de la 4-HC, donde las señales observadas corresponden con lo previamente reportado
en la literatura (Lambert y Mazzola, 2003; Begum y col., 2018).
136
10.2. Efecto del consumo de sacarosa sobre el desarrollo de la enfermedad de HGNA en
ratas Wistar macho
Con la intención de estandarizar el modelo animal de HGNA en ratas Wistar macho, se
consideró que previamente se ha utilizado agua adicionada con sacarosa al 30% para inducir
SM (Lima-Mendoza y col., 2014) y debido a que la enfermedad de HGNA, actualmente es
considerada la afección hepática del SM, en este estudio se evaluó el efecto del consumo de
sacarosa al 30% con distintos tiempos de duración del tratamiento (12, 16 y 20 semanas), así
como el efecto del consumo de sacarosa al 40% y 50% durante 20 semanas para determinar en
qué momento se ha desarrollado el HGNA.
10.2.1. Efecto de la ingesta de sacarosa sobre el consumo de alimento y peso corporal
Todas las concentraciones de sacarosa durante 20 semanas disminuyeron
significativamente el consumo de alimento comparado con su respectivo grupo control. Estos
resultados coinciden con lo reportado por Lima-Mendoza y col. (2014), en ratas Wistar hembra
tratadas con sacarosa al 30% durante 16 semanas; así como con lo reportado por Pakard y col.
(2014) en ratas Long-Evans macho tratados con sacarosa al 30% o sacarina al 0.1% por 21 días;
en ambos casos se reportó una disminución significativa en el consumo de alimento en las ratas
que consumieron agua con sacarosa al 30% comparado con el grupo control.
Lo anterior, se atribuye a que el consumo de bebidas con alto contenido de hidratos de
carbono (altas en sacarosa) y con sabor dulce, reducen significativamente el apetito e
incrementan saciedad (Kilpatrick y col., 2014), llevando a una disminución en el consumo de
otros nutrimentos que se encuentran en el alimento sólido. Además, de que el consumo de
alimentos o bebidas azucaradas producen sensaciones agradables en el cerebro, es decir, se
incrementan las respuestas hedónicas, llevando a un deseo de mayor consumo de este tipo de
137
alimentos; este tipo de respuestas es mayor con soluciones que poseen mayor concentración de
azúcar (Kampov-Polevoy y col., 2006). Por ello, nosotros esperábamos que la disminución en
el consumo de alimento fuera directamente proporcional a la concentración de sacarosa ingerida
en el agua; sin embargo, nuestros resultados mostraron un menor consumo de alimento en el
grupo con consumo de agua con sacarosa al 30% comparado con los grupos con consumo de
agua con sacarosa al 40 y 50%.
A pesar, de la disminución en consumo de alimento, la ingesta de sacarosa al 30% no
modificó el peso corporal, en contraste la ingesta de sacarosa al 40% y 50% incrementaron el
peso corporal comparado con su grupo control. El efecto de la ingesta de sacarosa al 30% en el
peso corporal comparado con el grupo que tuvo libre acceso a agua pura, coincide con lo
reportado por Lima-Mendoza y col. (2014) en ratas Wistar hembra ovariectomizadas, las cuales
no presentaron diferencias en peso corporal con respecto a los controles a pesar de un menor
consumo de alimento. Lo que pudiera estar siendo ocasionado, debido a que la falta de consumo
de alimento es sustituida por los hidratos de carbono ingeridos en el agua de libre acceso con
sacarosa al 30%.
Mientras, que los resultados del efecto del consumo de agua con sacarosa al 40% y 50%
son similares a los obtenidos por Lima-Mendoza y col. (2014), quienes reportaron un
incremento significativo de peso corporal a partir de la octava semana en ratas Wistar hembras
que recibieron agua con sacarosa al 30% durante 16 semanas. También, son similares con lo
reportado por Balderas-Villalobos y col. (2013), quienes reportaron un incremento de peso
corporal, sin llegar a ser significativo, en ratas Wistar macho tratadas con sacarosa al 30%
durante 16 a 18 semanas.
138
En conjunto, estos resultados sugieren que es requerido el consumo elevado de sacarosa
más la ingesta de otros nutrimentos encontrados en el alimento sólido, para poder observar un
incremento en el peso corporal.
10.2.2. Efecto del consumo de sacarosa sobre los niveles de glucosa en sangre
El efecto del consumo de sacarosa al 30%, 40% y 50% durante 20 semanas, sugieren que
se desarrolló intolerancia a la glucosa, e indirectamente sugieren la presencia de RI. Estos
resultados son similares a reportes previos en ratas Long-Evans, las cuales consumieron
sacarosa al 30% o sacarina al 0.1% durante 21 días (Packard y col., 2014), o en ratas Zucker
(Davidson y col., 2014), quienes reportaron un incremento en los niveles de glucosa en PTGO
con intolerancia a la glucosa, sugiriendo que el consumo crónico de sacarosa lleva al desarrollo
de intolerancia a la glucosa oral.
10.2.3. Efecto del consumo de sacarosa sobre el desarrollo de tejido adiposo
intraabdominal
Nuestros resultados demuestran que la ingesta de sacarosa al 30%, 40% y 50%, llevan al
desarrollo de obesidad, debido al incremento en tejido adiposo intraabdominal. También se
observó que, a mayor tiempo de ingesta de sacarosa al 30%, mayor será el incremento en el
porcentaje en tejido adiposo intraabdominal. Sugiriendo que independientemente de la
concentración de sacarosa ingerida durante veinte semanas, el efecto será similar en el
incremento de porcentaje en peso de tejido adiposo comparado con el grupo control.
Los resultados obtenidos del efecto de sacarosa con las diferentes concentraciones en
porcentaje de peso de tejido adiposo del área abdominal, coinciden con lo reportado por
Balderas-Villalobos y col. (2013), quienes observaron, un incremento de grasa intraabdominal
139
en ratas Wistar macho tratadas con sacarosa al 30% durante 16 a 18 semanas comparado con el
grupo control. También, coinciden con los resultados reportados por Marin y col. (2016),
observando un incremento significativo en el peso del tejido adiposo en ratones macho C57Bl/6
(agua con 42 g/L fructosa/sacarosa), a partir de las ocho semanas de tratamiento, comparado
con el grupo control.
El incremento de tejido adiposo intraabdominal observado como consecuencia del
consumo bebidas altas en sacarosa, se ha asociado a diferentes mecanismos biológicos
involucrados, que incluyen: i) el consumo de bebidas azucaradas causa exceso de ingesta
calórica; ii) los líquidos dulces causan menor termogénesis llevando a un incremento en el
balance de energía positiva y como consecuencia a un incremento en el peso; iii) el consumo de
líquidos con sacarosa puede llevar al desarrollo de RI y con esto favorecer el incremento de
peso corporal y de circunferencia de cintura, pudiendo llevar al desarrollo de obesidad
(Odegaard y col., 2012; Olsen y col., 2012). Además, se ha sugerido que consumo elevado de
sacarosa afecta de forma negativa en el balance de producción de radicales libres y defensa
antioxidante, los cuales llevan a una mayor susceptibilidad a peroxidación de lípidos, causando
daño en el organismo (Busserolles y col., 2002). Esto se relaciona con el fenómeno observado
en seres humanos, en que se ha visto asociado el consumo frecuente de bebidas endulzadas con
un incremento en tejido adiposo visceral llevando a un mayor riesgo en el desarrollo de RI y
enfermedades cardiovasculares (Odegaard y col., 2012).
10.2.4. Efecto del consumo de sacarosa sobre el daño hepático
10.2.4.1. Efecto del consumo de sacarosa sobre el porcentaje de peso del hígado
En el presente estudio, el consumo de sacarosa no modificó el porcentaje en peso de
hígado comparado con sus grupos control, aunque, la ingesta de sacarosa al 30% y 40%
140
incrementaron significativamente el porcentaje en peso de hígado comparado con el grupo con
ingesta de sacarosa al 30% durante 20 semanas. Estos resultados coinciden con lo reportado por
Marin y col. (2016), quienes tampoco encontraron cambios en el peso del hígado en ratones
C57Bl/6, de 3 semanas de vida, que recibieron agua con 42 g/L fructosa/sacarosa durante 4 y 8
semanas, tanto en machos como en hembras. Sin embargo, ellos encontraron un incremento
significativo en el peso del hígado en los machos con 12 y 16 semanas de consumo de agua con
fructosa/sacarosa, comparado con sus respectivos grupos control (Marin y col., 2016). Esto es
debido a que en esos tiempos de evaluación los ratones presentaban esteatosis severa así como
inflamación y fibrosis, lo cual llevó a un incremento en el peso del hígado; en el caso de los
tiempos evaluados en que no se presenta la diferencia en peso, es porque el proceso de esteatosis
era menor y no presentaban inflamación, como en el caso de los grupos que nosotros evaluamos
con ingesta de agua con sacarosa al 30% donde tampoco vimos incremento en porcentaje en
peso del hígado, y en los grupos con ingesta de agua con sacarosa al 40% y 50% donde sí
obervamos incremento en porcentaje en peso del hígado.
10.2.4.2. Efecto del consumo de sacarosa sobre la actividad de enzimas hepáticas
En cuanto a las enzimas hepáticas (FA, AST y ALT), se observó que los grupos control
presentaron diferentes niveles de estas enzimas, dependiendo de la edad de las ratas, con un
comportamiento similar al observado en humanos. En este sentido, es importante mencionar las
características principales de estas enzimas, la FA está involucrada en el transporte de
metabolitos a través de las membranas celulares, se encuentra en orden decreciente de
abundancia en placenta, mucosa ileal, riñón, hueso e hígado. Mientras, la AST y ALT se
encuentran distribuidas ampliamente en las células del cuerpo. La AST se encuentra en corazón,
hígado, músculo esquelético y riñón; en las células se ubica en citoplasma y en mitocondria. La
141
ALT es exclusivamente citoplásmica y se encuentra primariamente en hígado y riñón, con
cantidades menores en corazón y músculo esquelético (Dufour, 2005).
Los resultados observados en los grupos control coinciden con reportes previos en
humanos. Debido a que en personas sanas, los niveles de FA se ven incrementados de la niñez
hasta pubertad donde alcanza el pico máximo, posteriormente empieza a declinar y a los 20 años
llega a los valores más bajos, los cuales se mantienen hasta los 40 años y después vuelven a
incrementar ligeramente; en tanto que los valores de ALT y AST varían con la edad; en ALT se
van incrementando de los 10 a los 40 años y después de los 40 años disminuyen; mientras que
los de AST van disminuyendo de los 10 a los 30 años y después de los 50 años incrementan
(Dufour, 2005).
Por otra parte, la ingesta de sacarosa al 30% durante veinte semanas incrementó
significativamente FA comparado con el grupo control; en contraste la ingesta de sacarosa al
40% y 50% no modificaron estadísticamente los niveles de FA, aunque mostraron una tendencia
a incrementarse cuando fueron comparados con el grupo control. En este sentido, estudios
previos en seres humanos han demostrado que los niveles de FA se incrementan durante un
proceso inicial de daño hepático, aunque estos incrementos no son estadísticamente
significativos con respecto del grupo sano (Hall y col., 2017). Además, el hecho de que los
niveles de FA vayan disminuyendo con el tiempo en los grupos con sacarosa al 30%, puede ser
debido a un mayor grado de desnutrición en los animales, como en reportes previos por Planells
y col. (1997), en ratas Wistar con una dieta deficiente de magnesio y por Cho y col. (2007) en
ratas Sprague-Dawley con una dieta deficiente en zinc, que a su vez se relaciona con deficiencia
en magnesio.
142
En tanto, que un incremento en los niveles séricos de AST y ALT comparados con sanos
ha sido observado en modelos múridos de HGNA con daño severo (Marcolin y col., 2012;
Rodriguez-Ramiro y col., 2016) o casos clínicos en humanos (Hall y col., 2017); lo cual se
atribuye a la existencia de un proceso de necrosis en hepatocitos que a su vez provoca que las
enzimas sean liberadas hacia circulación sanguínea. En contraste, nosotros encontramos una
disminución en los niveles de transaminasas en grupos con ingesta de sacarosa al 30%
comparados con su respectivo grupo control; pero el consumo de sacarosa al 40% y 50%
incrementó significativamente AST y con una tendencia a incrementar los niveles séricos de
ALT comparados con sacarosa al 30%, durante 20 semanas. Esto fue similar a lo reportado por
Hall y col. (2017), quienes observaron que humanos con estadios tempranos de HGNA
presentan disminución en los niveles de transaminasas y no se distingue un incremento de ellos
hasta que la esteatosis hepática es >20%.
Con nuestros resultados se sugiere que la disminución de los niveles de transaminasas
puede deberse a que en este modelo de rata, el daño en hígado es inducido proporcionando agua
con sacarosa, llevando a un menor consumo de alimento sólido con los nutrimentos esenciales
para su desarrollo. En este sentido, se ha reportado que muchas formas de daño hepático
disminuyen la actividad de la forma citosólica y mitocondrial de AST en los hepatocitos y en
alcohólicos es común una disminución de la actividad de ALT, que es atribuible a deficiencia
de vitamina B6 (piridoxina, piridoxal, piridoxamina), vitamina que es importante en la
formación de 5’-fosfato de piridoxal que a su vez es importante en la actividad catalítica de
ambas enzimas (Dufour, 2005). En nuestro estudio, no se induce daño hepático con ingesta de
alcohol, sin embargo, las ratas al disminuir su consumo de alimento sólido como consecuencia
del consumo de agua con sacarosa disminuyen el consumo de piridoxal presente en su dieta
143
sólida, lo que puede estarlas llevando a una deficiencia de esta vitamina y como consecuencia
llevar a una menor actividad de las transaminasas. En el caso del consumo de sacarosa al 40%
y 50% mostraron una tendencia a incrementar los niveles séricos de las transaminasas
dependiente de la concentración; esto puede deberse a que estos grupos consumieron mayor
cantidad de alimento sólido y presentaron mayor grado de daño hepático.
10.2.4.3. Efecto del consumo de alimento sobre la esteatosis y fibrosis
El grado de esteatosis hepática observado como consecuencia del consumo de agua con
sacarosa al 30%, en los diferentes tiempos evaluados, es similar a lo reportado por Fakhoury-
Sayegh y col. (2015), quienes utilizaron ratas Wistar macho alimentadas con una dieta alta en
sacarosa durante 16 semanas. Los resultados mostraron, presencia media de esteatosis micro y
macrovesicular, sin presencia de fibrosis o células inflamatorias. Aunque nuestro grupo con
ingesta de sacarosa al 30% durante 20 semanas presentó una esteatosis hepática menor a la
reportada por otros investigadores que inducen HGNA con dieta alta en sacarosa (Marin y col.,
2016), o por diferentes modificaciones en la dieta (Kawasaki y col., 2009; Lau y col., 2017). Lo
cual puede deberse a las diferentes condiciones de experimentación; es decir, la edad inicial de
inducción, tipo de roedor, tipo de modificación en la dieta y tiempo de inducción.
Por otra parte, los resultados obtenidos en histologías hepáticas en el grupo tratado con
sacarosa al 40% y 50% son similares a lo reportado por Marin y col. (2016) quienes utilizaron
ratones C57Bl/6 y observaron la presencia de los efectos de daño en hígado en relación a
esteatosis, inflamación y fibrosis debidas al consumo de fructosa/sacarosa en diferentes tiempos;
el grado de esteatosis presentado por nuestro grupo con sacarosa al 40% es un grado intermedio
al reportado por ellos a las 8 y 12 semanas de inducción; mientras que nuestro grupo con
sacarosa al 50% presentó un grado de esteatosis similar a lo reportado por ellos a las 16 semanas.
144
10.2.5. Efecto del consumo de sacarosa sobre el proceso inflamatorio
Nuestros resultados relacionados con los niveles séricos de citocinas (IL-6, TNF-), se
asocian a un proceso de inflamación en obesidad (Basaranoglu y col., 2013), y a la progresión
de EHNA a EHNAS (Basaranoglu y col., 2013; Dietrich y Hellerbrand, 2014; Sanches y col.,
2015). Además, es bien conocido que el TNF- incrementa la permeabilidad y la adherencia de
leucocitos a la monocapa endotelial, por la inducción de E-selectina, ICAM-1, y VCAM-1; y
también activa la quimiotaxis de leucocitos (Chimen y col., 2017). Esto último se correlaciona
con nuestros resultados en histologías en los grupos con ingesta de sacarosa al 40% y 50%, que
presentaron infiltrados inflamatorios en hígado, así como niveles elevados de TNF-.
Por otra parte, el incremento de TGF- se relaciona con activación de las células de
Kupffer, lo cual es un factor importante para activación de células de Ito y como consecuencia
el desarrollo de fibrosis (Chiang y col., 2011; Peverill y col., 2014; Diehl y Day, 2017), tal como
lo observamos en nuestro grupo con ingesta de sacarosa al 50%.
10.2.6. Posible mecanismo de acción del consumo de sacarosa
En conjunto (Cuadro 2) estos resultados indican que la ingesta de sacarosa al 30%, 40%
y 50% disminuye el consumo de alimento, debido a que las bebidas azucaradas y altas
concentraciones en hidratos de carbono, actúan a nivel de sistema nervioso central llevando a
un incremento en leptina (hormona anorexigénica) (Pandit y col., 2012; Kilpatrick y col., 2014),
y en dopamina, esta última participa en circuitos de recompensa que a su vez permite el
desarrollo de sensaciones placenteras e incremento en respuestas hedónicas (Kampov-Polevoy
y col., 2006) (Figura 33). Esto ha sido reportado previamente por diversos investigadores (la
Fleur y col., 2010; Castellanos Jankiewicz y col., 2015; Harris, 2018), quienes observaron un
145
incremento en los niveles séricos de leptina en ratas Wistar como efecto del consumo de
sacarosa al 30%.
La disminución en la ingesta de alimento sólido, llevó a un menor consumo de
nutrimentos como proteínas, vitaminas y minerales; pero a un mayor consumo de hidratos de
carbono; teniendo como consecuencia que el consumo calórico fuera similar en el grupo control
comparado con el que consumió sacarosa al 30%, y por lo tanto el peso de los animales fue
similar; pero el consumo calórico fue mayor en los grupos con consumo de sacarosa al 40% y
50%, por lo tanto el peso corporal fue mayor en estos grupos, comparados con el grupo control.
Además, un menor consumo de alimento sólido lleva a que los animales presenten deficiencia
en algunos nutrimentos y eso puede explicar la disminución en los niveles de ALT y AST en
los grupos con consumo de sacarosa al 30%, con respecto de sus grupo control (Dufour, 2005)
(figura 33).
Por otra parte, es importante mencionar que la sacarosa es un disacárido compuesto por
glucosa y fructosa, el cual es hidrolizado por la enzima sacarasa en intestino delgado
(Basaranoglu y col., 2013; Schultz y col., 2015). Por lo tanto, se debe considerar el efecto de
ambos monosacáridos. Al respecto, es bien conocido que la glucosa es transportada al interior
celular por GLUT-4, el cual es un transportador dependiente de insulina; mientras que la
fructosa es transportada al interior celular por un transportador mediado por difusión facilitada
(GLUT-5).
146
Cuadro 2. Resumen de resultados del efecto del consumo de sacarosa. Se coloca entre
paréntesis el número de semanas de duración de inducción de HGNA. N.S.: no significativo.
PARÁMETRO ANALIZADO
SACAROSA 30% SACAROSA 40%
SACAROSA 50%
12 semanas 16 semanas 20 semanas 20 semanas 20 semanas
Peso corporal -- -- -- ↑ vs control (20)
↑ vs 30% sacarosa (20)
↑ vs control (20)
↑ vs 30%
sacarosa (20)
PTGO Intolerancia
a glucosa --
Intolerancia a glucosa
↑ vs control y vs 30% sacarosa (20)
↑ vs control (20)
% En peso en hígado
-- -- -- ↑ vs 30% sacarosa
(20) ↑ vs 30%
sacarosa (20)
% En peso de tejido adiposo
↑ vs control (16, 20)
↑ vs control (16, 20)
↑ vs control (12, 16, 20)
↑ vs control (20) y vs 30% sacarosa
(20) ↑ vs control
FA
↑ vs control (12) (N.S.) ↑ vs control
(20)
↑ vs control (20)
↑ vs control (20)
↓ vs control (16) (N.S.)
-- ↑ vs control (20) (N.S.)
AST ↓ vs control
(12, 16)
↓ vs control (16)
↓ vs control (20) (N.S.) ↑ vs 30% sacarosa
(20) ↑ vs 30%
sacarosa (20) ↓ vs control (12) (N.S.)
↓ vs control (16) (N.S.)
ALT
↓ vs control (12) (N.S.) ↓ vs control
(20)
↓ vs control (16, 20)
↓ vs control (12, 16)
↓ vs control (20) (N.S.)
↑ vs 30% sacarosa y control (20)
(N.S.)
↑ vs 30% y 40% de
sacarosa y vs control (20)
(N.S.)
Histologías teñidas con
H&E
Grado 0 de HGNA
Grado 2, EHNA
Grado 3, EHNA
Grado 5, EHNAS Grado 6, EHNAS
Histologías teñidas con TM
F0 F0 F0 F0 F2 (n=3) y F0
(n=3)
Niveles séricos de citocinas
Sin cambio Sin cambio ↑ IL-6 vs
control (20)
↑ IL-6 y TNF- vs control (20) y
30% sacarosa (20)
↑ IL-6, TNF-y TGF- vs control (20),
30% y 40% de sacarosa (20)
147
En contraste, la fructosa es metabolizada principalmente por el hígado y el metabolismo
es excepcionalmente alto comparado con el de la glucosa; además su metabolismo hepático no
solo transforma la fructosa en glucosa sino que la almacena como glucógeno más rápido
comparado con el metabolismo de glucosa, y también estimula lipogénesis (Basaranoglu y col.,
2013; Basaranoglu y col., 2015; Schultz y col., 2015).
A propósito, la ingesta de sacarosa incrementa el consumo de hidratos de carbono llevando
a un incremento en los niveles de glucosa en sangre (hiperglucemia), y desarrollo de intolerancia
a la glucosa, reportado en nuestros grupos, y probablemente a RI. La RI produce una diminución
en el efecto de la insulina sobre su receptor y en la vía metabólica lleva a inhibición del sustrato
de receptor de insulina (IRS), que como consecuencia lleva a inhibición en síntesis de proteínas,
de glucógeno, incremento de gluconeogénesis, inhibición de la disminución de glucogenólisis,
así como inhibición de translocación de GLUT-4 de vesículas citoplásmicas a membrana;
además de un incremento en lipogénesis de novo. El incremento de gluconeogénesis lleva a un
aumento en la glucosa y ésta a su vez incrementa lipogénesis de novo; en conjunto con lo
mencionado anteriormente, se produce un aumento en los AG libres que son esterificados como
TG (Firneisz, 2014; Ahmed y col., 2015), mientras que la fructosa puede inducir lipogénesis en
hepatocitos incluso antes del desarrollo de RI (Schultz y col., 2015), llevando al desarrollo de
esteatosis en hígado, tal como fue observado en nuestras histologías. Esto también ocurre en
otros tejidos, llevando a un incremento de tejido adiposo visceral, efecto que también fue
observado en nuestros resultados.
El incremento en AG libres puede llevar a disfunción mitocondrial, lipoperoxidación y
producción de ROS. Estos factores, a su vez activan vías de inflamación, activación de NF-B
e IK llevando a la producción de citocinas proinflamatorias, quimiotaxis y activación de
148
células de Kupffer (Castro y col., 2014; López-Oliva y Muñoz-Martínez, 2014) (figura 33).
Este proceso inflamatorio puede estar presente en las ratas con ingesta de sacarosa al 40% y
50%, debido a la presencia de células inflamatorias infiltradas en parénquima y sinusoides
hepáticos, y al incremento en niveles séricos de IL-6 y TNF-. Además, este daño en hígado,
puede llevar a un incremento en los niveles séricos de FA, AST y ALT, pero probablemente se
vio enmascarado por la disminución producida por la deficiencia de nutrientes, y esto explica
porque los grupos con ingesta de sacarosa al 30% presentaron disminución en los niveles de
transaminasas comparadas con sus grupos control. Los grupos con ingesta de sacarosa al 40%
y 50% no presentaron cambios en las enzimas hepáticas al ser comparados con los niveles de su
respectivo grupo control.
Por otra parte, se sabe que las células de Kupffer activadas contribuyen al incremento en
inflamación, al liberar IL-6 y TNF-y como consecuencia se presenta necrosis de hepatocitos;
las células de Kupffer activadas también llevan a liberación de ROS y de TGF-tal como
observamos un incremento en niveles séricos de estas citocinas. Por lo tanto, tanto ROS como
células de Kupffer activadas favorecen la activación de células estrelladas hepáticas, que
presentan transdiferenciación de su fenotipo de células quiescentes a miofibroblastos, en
conjunto esto favorece la promoción de fibrosis (Chiang y col., 2011; Peverill y col., 2014; Diehl
y Day, 2017). Nosotros sugerimos que esto ocurre con la ingesta de sacarosa al 50%, ya que fue
el único grupo que mostró un incremento en los niveles séricos de IL-6, TNF- y TGF- y el
desarrollo de fibrosis. Además, esto puede estar relacionado con nuestras muestras histológicas,
donde los niveles séricos de IL-6 y TNF- fueron directamente proporcionales al grado de
esteatosis. Lo mencionado anteriormente corresponde al grupo con consumo de agua con
sacarosa al 50%, y es mostrado en la figura 33.
149
Figura 33. Mecanismo propuesto del efecto del consumo de sacarosa al 50% durante 20
semanas. La sacarosa actúa a nivel de sistema nervioso central llevando a disminución de
apetito e incremento de saciedad, y con esto a disminución en el consumo de alimento sólido,
esto a su vez lleva a un mayor consumo de hidratos de carbono y deficiencia en consumo de
otros nutrimentos. El alto consumo de hidratos de carbono lleva a incremento en tejido adiposo;
mientras que la deficiencia en nutrimentos puede llevar a disminución en los niveles séricos de
FA, AST y ALT. Además, nosotros sugerimos que el consumo crónico de sacarosa al 50%
produce intolerancia a la glucosa y probablemente RI, teniendo como consecuencia un
incremento de lipogénesis de novo y con esto incremento de AG libres que son esterificados
como TG y en hígado llevan al desarrollo de esteatosis. Esto puede inducir disfunción
mitocondrial, lipoperoxidación y disminución en capacidad oxidativa, llevando a un incremento
en ROS. Estos factores pueden activar vías de inflamación, observado como un incremento en
IL-6 y TNF-, células de Kupffer y células estrelladas hepáticas. Las células de Kupffer
150
activadas contribuyen al incremento en inflamación (IL-6, TNF- y TGF-) y necrosis; donde
este daño en hígado puede llevar a incrementar los niveles séricos de enzimas hepáticas, pero
que probablemente son enmascarados por la disminución producida por la deficiencia en
nutrimentos. Además, ROS y células de Kupffer activadas pueden activar células estrelladas
hepáticas, debido a TGF- y ROS, los cuales son liberados, y en conjunto con las células
activadas promueven fibrosis. PI3K, cinasa de inositol trifosfato.
151
10.3. Efecto del tratamiento con metformina y/o 4-HC sobre la enfermedad de HGNA
10.3.1. Efecto de los tratamientos sobre el consumo de alimento y peso corporal
El tratamiento con metformina en ratas sanas fue capaz de inducir incremento en el
consumo de alimento, estos resultados difieren por lo reportado por Hu y col. quienes no
observaron cambios en la ingesta de alimento en ratas sanas con administración de metformina
(500 mg∙kg-1 por día, 8 semanas) comparado con las que no recibieron tratamiento (Hu y col.,
2017). Estas diferencias pueden ser debidas a la dosis utilizada y al tiempo que se administró el
tratamiento. En contraste, los resultados del efecto de metformina sobre el consumo de alimento
en ratas con HGNA son similares a reportes previos, quienes han observado disminución
significativa en consumo de alimento inducido por: (1) metformina (500 mg∙kg-1 por día, 8
semanas), en ratas Wistar macho con diabetes mellitus (Hu y col., 2017); (2) metformina (300
mg∙kg-1 por día en agua), en ratas OLEFT macho con obesidad durante 10 (Jenkins y col., 2012)
y 12 (Linden y col., 2014) semanas; y (3) metformina (300 mg∙kg-1, vía p.o., dos veces al día,
durante 4 semanas), en ratas Sprague-Dawley macho con diabetes mellitus (Lv y col., 2012).
Las diferencias observadas en los resultados pueden deberse a la dosificación utlizada, siendo
probablemente la dosis utilizada, una dosis suboptima para inducir este efecto.
Lo anteriormente mencionado, puede ser explicado debido a que se ha observado que la
metformina puede cruzar barrera hematoencefálica (Lv y col., 2012) y en el hipotálamo puede
disminuir la actividad de la cinasa activada por monofosfato (AMPK), la cual disminuye la
expresión hipotalámica de neuropéptido Y (NPY), proteína r-agouti (AgRP) (orexigénico) e
incrementa proopiomelanocortina (POMC) (anorexigénica) (Lee y col., 2012; Lv y col., 2012).
Además, la metformina puede disminuir el consumo de alimento mediante la mejora o el
152
aumento de la sensibilidad de leptina (Malin y Kashyap, 2014) e incremento en niveles de
péptido 1 tipo glucagón (GLP-1) (Lv y col., 2012; Malin y Kashyap, 2014) (figura 34).
Sin embargo, pese a que se ha observado que la metformina bloquea la activación de
AMPK inducida por hiperglucemia en ratas, otros estudios no muestran reducción de actividad
de AMPK por metformina bajo concentraciones normales de glucosa (Lee y col., 2012); además
de eso, se ha demostrado que la metformina reduce la secreción de leptina per se antes de
disminuir peso corporal (Jenkins y col., 2012). Esto puede explicar nuestros resultados de que
el tratamiento con metformina incrementó significativamente el consumo de alimento en ratas
sanas comparado con el grupo sano con administración de vehículo. Estos efectos
contradictorios de la metformina pueden estar relacionados con diferentes medios metabólicos,
lo que sugiere que ciertos factores metabólicos son esenciales para los cambios conocidos por
la metformina en la ingesta de alimentos.
A pesar de haber observado que la metformina produjo cambios en el consumo de
alimento, esto no se vio reflejado en el peso corporal, pudiendo ser debido a que su efecto en
disminuir consumo de alimento fue limitado. Siendo un efecto no esperado, debido a que la
disminución de peso corporal es un efecto comúnmente inducido por la metformina (Malin y
col., 2013; Malin y Kashyap, 2014). Las diferencias observadas en estos resultados pueden ser
debidas a las dosis utilizadas, las cuales podrían ser consideradas como subóptimas para
disminuir el peso corporal.
Por otra parte, pese a que no fue estadísticamente significativo, este es el primer estudio
que muestra que 4-HC disminuye el consumo de alimento en ratas con HGNA, pero sin cambios
en el peso corporal comparado con ratas con HGNA y administración de vehículo. Existen pocos
reportes de este efecto para la trans-chalcona, la cual ha mostrado disminuir el consumo de
153
alimento en ratas (Najafian y col., 2010; Karkhaneh y col., 2016; Karimi-SalesJeddi y col.,
2018), aunque no se han encontrado los posibles mecanismos anorexigénicos. Algunos autores
sugieren que la trans-chalcona puede mejorar la sensibilidad de la leptina (Jalalvand y col.,
2015; Karkhaneh y col., 2016), y esta podría ser una vía de la 4-HC para reducir el consumo de
alimento (figura 34).
De manera interesante, cuando los animales recibieron el tratamiento en conjunto con la
metformina y 4-HC, el consumo de alimento se vio disminuido de manera significativa tanto en
el grupo sano como en el grupo con HGNA comparados con sus respectivos grupos con
administración de vehículo; y en las ratas con HGNA el efecto fue mucho mayor que el inducido
por las monoterapias de metformina y 4-HC. También el co-tratamiento disminuyó el peso
corporal en el grupo con HGNA, sugiriendo un posible efecto sinérgico en el incremento de la
sensibilidad de la leptina (Malin y Kashyap, 2014; Karkhaneh y col., 2016) (figura 34). Sin
embargo, se requieren futuros estudios que permitan entender estos mecanismos de acción.
10.3.2. Efecto de los tratamientos sobre la tolerancia a la glucosa
La metformina es el fármaco de primera elección en el tratamiento de pacientes con
DMT2; debido a su efecto antihiperglucémico, el cual ha sido reportado tanto en modelos
múridos (Lv y col., 2012; Linden y col., 2014; Saad y col., 2015; Li y col., 2016) como en
humanos (Tiikkainen y col., 2004; Jenkins y col., 2012; Jensterle y col., 2014), cuyos resultados
son similares a los reportados en el presente estudio, al observar que la metformina disminuyó
glucemia y la intolerancia a la glucosa, tanto en la monoterapia como cuando se dio en conjunto
con la 4-HC.
El efecto antihiperglucémico de la metformina se atribuye a su capacidad de suprimir la
producción de glucosa en hígado, a partir de glucógeno, reducir la absorción de glucosa en tracto
154
gastrointestinal, incrementar la captura de glucosa en órganos periféricos (Li y col., 2016),
incrementar la actividad de AMPK tanto en músculo esquelético, hígado y corazón (Li y col.,
2016; Lopez, 2018); así como de incrementar la concentración de GLP-1, el cual a su vez
estimula la secreción de insulina (Bouchoucha y col., 2011; McCreight y col., 2016) (Figura
34).
Por otra parte, solo existe un reporte del efecto de la 4-HC en niveles de glucosa en un
estudio in vitro en cultivo celular de adipocitos 3T3-L1. En dicho estudio, la 4-HC no mostró
tener potencial para inhibir la glucosa en el medio concentrado (Hsieh y col., 2012), sin
embargo, ese reporte no se puede tomar como referencia debido a la naturaleza del mismo y las
diferencias existentes al probarse fármacos en un estudio in vivo. Por otra parte, existen reportes
con otras chalconas similares a la 4-HC, como la 2,2’,5’-trihidroxichalcona (Rossi y col., 2013)
y trans-chalcona (Najafian y col., 2010; Jalalvand y col., 2015; Karkhaneh y col., 2016) que en
modelos múridos con diabetes o HGNA han disminuido glucemia en ayuno. Aun así, son
necesarios futuros estudios para determinar si la 4-HC puede disminuir los niveles de glucosa
en sangre en animales con diabetes mellitus o intolerancia a la glucosa.
En cuanto al efecto observado en disminuir los niveles de glucosa en sangre, inducido por
el tratamiento en conjunto con metformina y 4-HC, con los resultados obtenidos, sugerimos que
este fue debido al efecto antihiperglucémico de la metformina.
10.3.3. Efecto de los tratamientos sobre el desarrollo de tejido adiposo intraabdominal
Existen pocos reportes del efecto de la metformina sobre el desarrollo de tejido adiposo
en ratas, entre éstos, nuestros resultados coinciden con lo reportado por Jenkins y col., (2012),
y por Linden y col., (2014), quienes administraron tratamiento con metformina (150 mg∙kg-1 por
día durante la primer semana y 300 mg∙kg-1 por día, durante las 11 semanas restantes) en ratas
155
OLETF sedentarias; y tampoco encontraron diferencias en peso de tejido adiposo con el
tratamiento de metformina. En contraste, nuestros resultados difieren con Feng y col., (2019),
quienes reportaron que el tratamiento con metformina (250 mg∙kg-1 la primer semana, 500
mg∙kg-1 la segunda semana y 1000 mg∙kg-1 el resto del estudio), disminuyó significativamente
la masa grasa en pacientes con DMT2 y enfermedad de HGNA. Estas diferencias se pueden
deber a la diferencia en dosificación y a que este último estudio fue realizado en humanos.
Sugiriendo que probablemente la dosis utilizada de metformina en nuestro estudio fue una dosis
subóptima, incapaz de provocar una diminución en el porcentaje de peso del tejido adiposo.
En cuanto a la 4-HC, no observamos cambios en el porcentaje en peso de tejido adiposo,
y de esta hidroxichalcona no existen reportes previos que indiquen su efecto sobre el desarrollo
de tejido adiposo en otros modelos múridos o humanos.
10.3.4. Efecto de los tratamientos sobre la disminución de daño hepático e inflamación
En los grupos con consumo de agua pura y tratamiento con metformina, 4-HC, y
tratamiento en conjunto de metformina y 4-HC, se observó parénquima hepático con
arquitectura normal; presentando grado 0 de esteatosis, como se describió previamente y
coincide con lo reportado en la literatura (Kierszenbaum, 2008); mientras que el grupo con
tratamiento con solución salina presentó grado 1 de esteatosis. A pesar de que el grupo con
acceso a agua pura y tratamiento con solución salina tenían acceso a una dieta balanceada,
probablemente alcanzaron grado 1 de esteatosis, debido a que eran sedentarios; mientras que en
los tratados con monoterapia de metformina o 4-HC, o tratamiento en conjunto de metformina
y 4-HC tuvieron grado 0 de esteatosis por el efecto de los fármacos.
El grupo con ingesta de agua con sacarosa al 50% y tratamiento con vehículo, desarrolló
EHNAS, caracterizado por un incremento en porcentaje en peso de hígado, disminución de
156
actividad de enzimas hepáticas, esteatosis hepática y fibrosis, así como inflamación hepática y
sistémica.
Por otra parte en las ratas con HGNA, el tratamiento con metformina disminuyó aún más
los niveles séricos de ALT, además disminuyó el grado de esteatosis hepática y fibrosis, y
disminuyó niveles séricos de TGF-; estos resultados son consistentes con estudios previos
(Raso y col., 2009; Spruss y col., 2012; Fan y col., 2017; Feng y col., 2019). Debido a que Raso
y col. (2009) y Spruss y col. (2012), al dar tratamiento con metformina (250 mg∙kg-1 y 300
mg∙kg-1, respectivamente) en ratas Sprague-Dawley con dieta alta en grasa y en ratones
C57BL/J6 con ingesta de fructosa al 30% (respectivamente), observaron que la metformina
disminuyó ALT y esteatosis hepática. Mientras, Feng y col. (2019), realizaron un estudio
aleatorio en humanos con tratamiento con metformina, observando que esta disminuyó las
concentraciones séricas de ALT y AST. En tanto que Fan y col. Fan y col., 2017, dieron
tratamiento con metformina (200 mg∙kg-1), en ratones BALB/c con daño hepático inducido con
CCl4, y observaron que la metformina suprimió el incremento de la expresión de TGF-1 en
hígado y en consecuencia disminuyó la fibrosis hepática.
Sin embargo, nuestros resultados relacionados con el efecto de metformina sobre los
niveles séricos de IL-6 y TNF- son similares a reportes previos (Raso y col., 2009; Spruss y
col., 2012; Woo y col., 2014), ya que en esos estudios, la metformina disminuyó de manera
significativa estos parámetros, mientras que en nuestro estudio la metformina mostró una
tendencia a disminuir IL-6 y TNF- sin ser estadísticamente significativo, estas variaciones
pueden ser debido a las diferencias en dosificación y modelos de estudio utilizados. En contraste,
nosotros observamos que la metformina incrementó significativamente niveles séricos de IL-10
157
y disminuyó TGF-. En conjunto, estos resultados nos permiten sugerir que la metformina tiene
efecto terapéutico limitado en reducción de esteatosis hepática, fibrosis e inflamación.
El efecto terapéutico de metformina se puede explicar, debido a que estudios previos han
mostrado que ésta activa AMPK hepática, llevando a una disminución en lipogénesis e
incremento en -oxidación (Malin y Kashyap, 2014; Lopez, 2018; Iranshahy y col., 2019),
también incrementa PPAR y disminuye PPAR (Raso y col., 2009; Iranshahy y col., 2019);
con todo lo anterior, la metformina induce una disminución de esteatosis hepática. Además,
tiene actividad antiinflamatoria a causa de que incrementó IL-10 sérica y disminuyó el infiltrado
inflamatorio en hígado. Asimismo, varios estudios han mostrado que la metformina mejora la
actividad antioxidante en hígado, esto al disminuir MDA e incrementar SOD, catalasa (CAT) y
GPx en hígado (Srividhya y Anuradha, 2002; Xu y col., 2016) (figura 34). Siendo la actividad
oxidante un componente importante en el desarrollo de inflamación y en la activación de células
de Kupffer y de células estelares hepáticas (López-Panqueva, 2013; Peverill y col., 2014).
Mientras que las células de Kupffer activadas secretan TGF-, el cual activa a las células
estelares hepáticas, las cuales tienen un papel importante en la progresión a fibrosis hepática
(Fan y col., 2017). Esto último, es consistente con nuestros resultados, debido a que la
metformina disminuyó los niveles de TGF- y la fibrosis hepática.
El tratamiento con la 4-HC presentó el efecto terapéutico más marcado entre los
tratamientos probados. Así, el tratamiento con la 4-HC fue el único que, en ratas con HGNA,
disminuyó significativamente el porcentaje del peso de hígado, también disminuyó esteatosis y
fibrosis hepática e indujo un marcado decremento en la inflamación hepática y sistémica, al
disminuir infiltrados inflamatorios hepáticos y los niveles de IL-6, TNF-, TGF- e incrementar
los niveles séricos de IL-10. Siendo este, el primer estudio en que se demuestra que la 4-HC
158
tiene efecto terapéutico en HGNA. Nuestros resultados son similares con Qu y col., (2014),
quienes reportaron un efecto antiinflamatorio de la 4-HC, debido a que disminuyó IL-1, TNF-
y NF-B en células de riñón. Además, se ha reportado que la 4-HC estimula PPAR (Mueller
y col., 2011) y posee actividad antioxidante (Armenta-Gutiérrez, 2016; Kucerova-Chlupacova
y col., 2018).
Por otra parte, otra chalcona llamada L2H17 reduce la producción de citocinas
inflamatorias (IL-1, IL-6, TNF-), suprime NF-B y reduce fibrosis en corazón y riñón, esto
último al disminuir los niveles de TGF- y colágeno IV (Fang y col., 2015). En tanto, que trans-
chalcona disminuye la producción PPAR y TNF-; otras chalconas han mostrado disminuir la
producción de IL-6, TNF- e incrementar los niveles de PPAR (Karimi-SalesMohaddes y col.,
2018).
Considerando nuestros resultados y los reportados previamente por otros investigadores,
podemos sugerir que el efecto terapéutico de la 4-HC que disminuye la esteatosis puede ser
debido a su acción sobre PPAR y PPAR, que son importantes componentes en la vía de
lipogénesis y como consecuencia induce disminución de la lipogénesis (Karimi-SalesMohaddes
y col., 2018). Por otro lado, la disminución en los niveles de citocinas proinflamatorias (IL-6,
TNF-) y el incremento de IL-10, son consistentes con la disminución de los infiltrados
inflamatorios en hígado; probablemente la 4-HC también induce actividad antioxidante en este
modelo. Todo esto, a su vez, puede explicar la disminución de TGF- y fibrosis (figura 34),
porque la actividad oxidante y la inflamación tienen una participación importante en la
activación de células de Kupffer y estelares hepáticas.
159
Finalmente, el tratamiento en conjunto con metformina y 4-HC mostró un efecto
terapéutico intermedio en disminuir la esteatosis hepática, fibrosis y en provocar un efecto
antiinflamatorio, comparado con las monoterapias de metformina y 4-HC; lo que nos hace
sugerir un probable antagonismo en sus acciones sobre PPAR, PPAR y NF-B. Sin embargo,
se requieren futuros estudios para entender el posible mecanismo de acción.
160
Figura 34. Posible mecanismo de acción del tratamiento con metformina y/o 4-
hidroxichalcona en HGNA. Metformina disminuye consumo de alimento probablemente
debido a que atenúa la actividad de la AMPK en cerebro, llevando a la disminución de NPY,
AgRP, e incrementa POMC. Además, metformina puede disminuir consumo de alimento debido
a que mejora la sensibilidad de leptina y GLP-1. Metformina también, tiene efecto
antiinflamatorio debido a que incrementó IL-10, y tuvo efecto terapéutico limitado al reducir
esteatosis y fibrosis hepática. El efecto de metformina en disminuir esteatosis puede ser por su
actividad antioxidante, que active AMPK induciendo disminución en lipogénesis, incremento
en -oxidación, incremento en PPAR y disminuye PPAR. Mientras, el efecto de metformina
en disminuir fibrosis hepática puede ser debido a que disminuyó TGF-, el cual es clave en el
desarrollo de fibrosis hepática. Por otra parte, la 4-HC probablemente disminuyó el consumo de
alimento por incrementar la sensibilidad de leptina; y mostró el efecto terapéutico más marcado
161
en disminuir inflamación, esteatosis y fibrosis hepática, esto debido a que 4-HC disminuyó IL-
6, TNF-, incrementó IL-10 y TGF-. Adicionalmente, la disminución de esteatosis hepática
puede ser debido a su actividad antioxidante y a que podría incrementar PPARy disminuir
PPAR y lipogénesis. Finalmente, contrario a lo esperado, el co-tratamiento presenta un efecto
intermedio en disminuir inflamación, esteatosis y fibrosis hepática, sugiriendo un posible
antagonismo, entre metformina y 4-HC. , efecto por metformina; , efecto por 4-HC; ,
efecto por co-tratamiento. Un símbolo significa efecto bajo, dos símbolos significan efecto
medio y tres símbolos significan efecto alto.
162
XI. CONCLUSIONES
11.1. Conclusión general
El tratamiento con 4-HC tiene efecto terapéutico en la enfermedad de HGNA en ratas
Wistar macho, siendo más eficaz que la monoterapia con metformina o el tratamiento en
conjunto con metformina y 4-HC, debido a una mayor actividad antiinflamatoria que redujo el
desarrollo de fibrosis hepática.
11.2. Conclusiones específicas
Conclusión 1:
En ratas Wistar macho el consumo de agua con sacarosa al 50% durante 20 semanas indujo
el mayor grado de evolución de la enfermedad de HGNA (EHNAS) comparado con sacarosa al
30% y 40%, generando esteatosis (grado 6) con infiltrado inflamatorio y fibrosis (F2).
Conclusión 2:
En ratas Wistar macho los tratamientos con metformina y 4-HC, y la monoterapia de
metformina, disminuyeron la progresión de enfermedad de HGNA a nivel sistémico de
metabolismo glucídico y lipídico a nivel hepático. Mientras que la 4-HC disminuyó la
progresión de la enfermedad de HGNA a nivel de metabolismo lipídico a nivel hepático, siendo
más eficaz en disminuir esteatosis hepática.
Conclusión 3:
En ratas Wistar macho los tratamientos con metformina y 4-HC, o la monoterapia con 4-
HC disminuyeron el progreso de inflamación inducida por la ingesta de sacarosa al 50%, siendo
la monoterapia con 4-HC la más eficaz.
163
Conclusión 4:
En ratas Wistar macho los tratamientos con metformina y/o 4-HC disminuyeron el
desarrollo de fibrosis inducida por la ingesta de sacarosa al 50%. Siendo la monoterapia con 4-
HC la más eficaz.
164
XII. LIMITACIONES DEL PROYECTO
1. La necesidad de estandarizar un modelo de HGNA en ratas Wistar macho, con consumo
de sacarosa y que permita alcanzar el grado de desarrollo de la enfermedad deseado.
2. Modelo de inducción largo (de cinco a seis meses), que impide tener resultados hasta
después de diez a doce meses, debido a que deben realizarse por duplicado.
3. Ausencia de estudios previos con 4-HC que nos permitan dilucidar su mecanismo de
acción.
4. Contar con las condiciones adecuadas en el momento preciso, para el adecuado
almacenamiento de las muestras, teniendo como consecuencia la pérdida de muchas de
éstas.
5. Carencia de recursos para poder realizar más pruebas que nos permitieran identificar los
mecanismos de acción de los tratamientos utilizados.
165
XIII. BIBLIOGRAFÍA
Abd El-Kader, S. M., y El-Den Ashmawy, E. M. (2015). Non-alcoholic fatty liver disease:
The diagnosis and management. World J Hepatol, 7(6), 846-858. doi: 10.4254/wjh.v7.i6.846
Adams, L. A., Anstee, Q. M., Tilg, H., y Targher, G. (2017). Non-alcoholic fatty liver
disease and its relationship with cardiovascular disease and other extrahepatic diseases. Gut,
66(6), 1138-1153. doi: 10.1136/gutjnl-2017-313884
Ahmed, M. H., Husain, N. E., y Almobarak, A. O. (2015). Nonalcoholic Fatty liver
disease and risk of diabetes and cardiovascular disease: what is important for primary care
physicians? J Family Med Prim Care, 4(1), 45-52. doi: 10.4103/2249-4863.152252
American Diabetes, A. (2015). (2) Classification and diagnosis of diabetes. Diabetes
Care, 38 Suppl, S8-S16. doi: 10.2337/dc15-S005
Antunes, L. C., Elkfury, J. L., Jornada, M. N., Foletto, K. C., y Bertoluci, M. C. (2016).
Validation of HOMA-IR in a model of insulin-resistance induced by a high-fat diet in Wistar
rats. Arch Endocrinol Metab, 60(2), 138-142. doi: 10.1590/2359-3997000000169
Arianingrum, R. (2014). Chalcones: The promising compounds to provide new ways for
cancer treatment. Implementation and Education of Mathematics and Sciences 2014. Paper
presented at the Yogyakarta State University: Proceeding of International Conference On
Research.
Armenta-Gutiérrez, E. J. (2016). Evaluación de la actividad antioxidante y
antiinflamatoria in vivo de la 4-hidroxichalcona. (Tesis de Maestria en Ciencias Biomédicas),
Universidad Autónoma de Sinaloa, Culiacán, Sinaloa, México.
166
Balderas-Villalobos, J., Molina-Munoz, T., Mailloux-Salinas, P., Bravo, G., Carvajal, K.,
y Gomez-Viquez, N. L. (2013). Oxidative stress in cardiomyocytes contributes to decreased
SERCA2a activity in rats with metabolic syndrome. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 305(9),
H1344-1353. doi: 10.1152/ajpheart.00211.2013
Basaranoglu, M., Basaranoglu, G., y Bugianesi, E. (2015). Carbohydrate intake and
nonalcoholic fatty liver disease: fructose as a weapon of mass destruction. Hepatobiliary Surg
Nutr, 4(2), 109-116. doi: 10.3978/j.issn.2304-3881.2014.11.05
Basaranoglu, M., Basaranoglu, G., Sabuncu, T., y Senturk, H. (2013). Fructose as a key
player in the development of fatty liver disease. World J Gastroenterol, 19(8), 1166-1172. doi:
10.3748/wjg.v19.i8.1166
Begum, S., Begum, A., y Koganti, B. (2018). Synthesis and Evaluation of Central
Antinociceptive activity of Ring Substituted Chalcones; Molecular Docking Studies with
Monoacylglycerol Lipase (MAGL) Enzyme. Oriental Journal of Chemistry, 34(4), 1890.
Beltrán-Aguilar, A. G. (2018). Actividad antiprotozoaria in vitro de 4-hidroxichalcona y
nanopartículas metálicas obtenidas a partir del extracto metanólico del fruto de Psidium
sartorianum contra Trypanosoma cruzi y Giardia duodenalis. (Tesis en Licenciatura en
Químico Farmacéutico Biólogo), Universidad Autónoma de Sinaloa, Culiacán, Sinaloa,
México.
Bellentani, S. (2017). The epidemiology of non-alcoholic fatty liver disease. Liver Int, 37
Suppl 1, 81-84. doi: 10.1111/liv.13299
Bergmeyer, H. U., Horder, M., y Rej, R. (1986). International Federation of Clinical
Chemistry (IFCC) Scientific Committee, Analytical Section: approved recommendation (1985)
167
on IFCC methods for the measurement of catalytic concentration of enzymes. Part 2. IFCC
method for aspartate aminotransferase (L-aspartate: 2-oxoglutarate aminotransferase, EC
2.6.1.1). J Clin Chem Clin Biochem, 24(7), 497-510.
Bouchoucha, M., Uzzan, B., y Cohen, R. (2011). Metformin and digestive disorders.
Diabetes Metab, 37(2), 90-96. doi: 10.1016/j.diabet.2010.11.002
Brea, A., Pinto, X., Ascaso, J. F., Blasco, M., Diaz, A., Gonzalez-Santos, P., . . . Grupo
de trabajo sobre Dislipemia Aterogenica. Sociedad Espanola de, A. (2017). Nonalcoholic fatty
liver disease, association with cardiovascular disease and treatment. (I). Nonalcoholic fatty liver
disease and its association with cardiovascular disease. Clin Investig Arterioscler, 29(3), 141-
148. doi: 10.1016/j.arteri.2016.06.003
Busserolles, J., Rock, E., Gueux, E., Mazur, A., Grolier, P., y Rayssiguier, Y. (2002).
Short-term consumption of a high-sucrose diet has a pro-oxidant effect in rats. Br J Nutr, 87(4),
337-342. doi: 10.1079/BJNBJN2002524
Byrne, C. D., y Targher, G. (2015). NAFLD: a multisystem disease. J Hepatol, 62(1
Suppl), S47-64. doi: 10.1016/j.jhep.2014.12.012
Castellanos Jankiewicz, A. K., Rodriguez Peredo, S. M., Cardoso Saldana, G., Diaz Diaz,
E., Tejero Barrera, M. E., del Bosque Plata, L., y Carbo Zabala, R. (2015). Adipose tissue
redistribution caused by an early consumption of a high sucrose diet in a rat model. Nutr Hosp,
31(6), 2546-2553. doi: 10.3305/nh.2015.31.6.8935
Castillo-Romero, D. J. (2017). Evaluación farmacológica de la 4-hidroxichalcona como
tratamiento preventivo y curativo en el daño hepático tóxico agudo y crónico en ratas Wistar
168
macho. (Tesis de Maestría en Ciencias Biomédicas), Universidad Autónoma de Sinaloa,
Culiacán, Sinaloa, México.
Castro, A. V., Kolka, C. M., Kim, S. P., y Bergman, R. N. (2014). Obesity, insulin
resistance and comorbidities? Mechanisms of association. Arq Bras Endocrinol Metabol, 58(6),
600-609.
Cicero, A. F., Tartagni, E., y Ertek, S. (2012). Metformin and its clinical use: new insights
for an old drug in clinical practice. Arch Med Sci, 8(5), 907-917. doi: 10.5114/aoms.2012.31622
Clarke, J. D., Dzierlenga, A. L., Nelson, N. R., Li, H., Werts, S., Goedken, M. J., y
Cherrington, N. J. (2015). Mechanism of Altered Metformin Distribution in Nonalcoholic
Steatohepatitis. Diabetes, 64(9), 3305-3313. doi: 10.2337/db14-1947
Croci, I., Coombes, J. S., Sandbakk, S. B., Keating, S. E., Nauman, J., Macdonald, G. A.,
y Wisloff, U. (2019). Non-alcoholic fatty liver disease: prevalence and all-cause mortality
according to sedentary behaviour and cardiorespiratory fitness. The HUNT Study. Prog
Cardiovasc Dis. doi: 10.1016/j.pcad.2019.01.005
Chiang, D. J., Pritchard, M. T., y Nagy, L. E. (2011). Obesity, diabetes mellitus, and liver
fibrosis. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 300(5), G697-702. doi:
10.1152/ajpgi.00426.2010
Chimen, M., Yates, C. M., McGettrick, H. M., Ward, L. S., Harrison, M. J., Apta, B., . . .
Rainger, G. E. (2017). Monocyte Subsets Coregulate Inflammatory Responses by Integrated
Signaling through TNF and IL-6 at the Endothelial Cell Interface. J Immunol, 198(7), 2834-
2843. doi: 10.4049/jimmunol.1601281
169
Cho, Y. E., Lomeda, R. A., Ryu, S. H., Sohn, H. Y., Shin, H. I., Beattie, J. H., y Kwun,
I. S. (2007). Zinc deficiency negatively affects alkaline phosphatase and the concentration of
Ca, Mg and P in rats. Nutr Res Pract, 1(2), 113-119. doi: 10.4162/nrp.2007.1.2.113
Davidson, E. P., Coppey, L. J., Holmes, A., Lupachyk, S., Dake, B. L., Oltman, C. L., . .
. Yorek, M. A. (2014). Characterization of diabetic neuropathy in the Zucker diabetic Sprague-
Dawley rat: a new animal model for type 2 diabetes. J Diabetes Res, 2014, 714273. doi:
10.1155/2014/714273
Davis, S. N. (2007). Insulina, hipoglucemiantes orales y propiedades farmacológicas del
páncreas endócrino. In L. L. Brunton, J. S. Lazo & K. L. Parker (Eds.), Goodman & Gilman Las
bases Farmacológicas de la Terapéutica. (Decimo primera ed., pp. 1613-1646). México, D. F.:
McGraw Hill.
Díaz-Carrillo, J. T., Díaz-Camacho, S. P., Delgado-Vargas, F., Rivero, I. A., López-
Angulo, G., Sarmiento-Sánchez, J. I., y Montes-Avila, J. (2018). Synthesis of leading chalcones
with high antiparasitic, against Hymenolepis nana, and antioxidant activities. Brazilian Journal
of Pharmaceutical Sciences, 54(3).
Diehl, A. M., y Day, C. (2017). Cause, Pathogenesis, and Treatment of Nonalcoholic
Steatohepatitis. N Engl J Med, 377(21), 2063-2072. doi: 10.1056/NEJMra1503519
Dietrich, P., y Hellerbrand, C. (2014). Non-alcoholic fatty liver disease, obesity and the
metabolic syndrome. Best Pract Res Clin Gastroenterol, 28(4), 637-653. doi:
10.1016/j.bpg.2014.07.008
Dorn, C., Heilmann, J., y Hellerbrand, C. (2012). Protective effect of xanthohumol on
toxin-induced liver inflammation and fibrosis. Int J Clin Exp Pathol, 5(1), 29-36.
170
Doycheva, I., y Loomba, R. (2014). Effect of metformin on ballooning degeneration in
nonalcoholic steatohepatitis (NASH): when to use metformin in nonalcoholic fatty liver disease
(NAFLD). Adv Ther, 31(1), 30-43. doi: 10.1007/s12325-013-0084-6
Dufour, R. (2005). Guías del laboratorio para screening, diagnóstico y monitoreo de la
lesión hepática. Acta Bioquím Clín Latinoam, 39(3), 359-376.
Dyson, J., y Day, C. (2014). Treatment of non-alcoholic fatty liver disease. Dig Dis, 32(5),
597-604. doi: 10.1159/000360511
Ebadollahi-Natanzi, A. R., Mahmoudian, S., Minaeie, B., y Sabzevari, O. (2011).
Hepatoprotective activity of phloretin and hydroxychalcones against Acetaminophen Induced
hepatotoxicity in mice. Iranian Journal of Pharmaceutical Sciences, 7(2).
Edna, B., Mills, P. B., Arrington, J. B., Sobin, L. H., Heffess, C. S., y Mullick, F. G.
(1992). Métodos histotecnológicos. In I. d. P. d. l. F. A. d. l. E. U. d. America (Ed.).
ENSANUT-MC. (2016). Encuesta Nacional de Salud y Nutrición de Medio Camino.
ENSANUT. (2012). Encuesta Nacional de Salud y Nutrición 2012. Resultados
Nacionales.
ENSANUT. (2013). Encuesta Nacional en Salud y Nutrición 2012. Resultados por
entidad federativa. Sinaloa.
Escobar-Almazán, J. A. (2015). Síntesis y evaluación de la actividad antineoplásica de la
4-hidroxichalcona en la línea tumoral HeLa de cáncer cervicouterino humano. (Tesis de
Licenciatura de Químico Farmacéutico Biólogo), Universidad Autónoma de Sinaloa, Culiacán,
Sinaloa, México.
171
Fakhoury-Sayegh, N., Trak-Smayra, V., Khazzaka, A., Esseily, F., Obeid, O., Lahoud-
Zouein, M., y Younes, H. (2015). Characteristics of nonalcoholic fatty liver disease induced in
wistar rats following four different diets. Nutr Res Pract, 9(4), 350-357. doi:
10.4162/nrp.2015.9.4.350
Fan, K., Wu, K., Lin, L., Ge, P., Dai, J., He, X., . . . Zhang, L. (2017). Metformin mitigates
carbon tetrachloride-induced TGF-beta1/Smad3 signaling and liver fibrosis in mice. Biomed
Pharmacother, 90, 421-426. doi: 10.1016/j.biopha.2017.03.079
Fang, Q., Wang, J., Wang, L., Zhang, Y., Yin, H., Li, Y., . . . Zheng, C. (2015). Attenuation
of inflammatory response by a novel chalcone protects kidney and heart from hyperglycemia-
induced injuries in type 1 diabetic mice. Toxicol Appl Pharmacol, 288(2), 179-191. doi:
10.1016/j.taap.2015.07.009
Fazel, Y., Koenig, A. B., Sayiner, M., Goodman, Z. D., y Younossi, Z. M. (2016).
Epidemiology and natural history of non-alcoholic fatty liver disease. Metabolism, 65(8), 1017-
1025. doi: 10.1016/j.metabol.2016.01.012
Félix-Zavala, M. V. (2018). Evaluación de la actividad hemolítica de la 4-
hidroxichalcona en eritrocitos humanos y murino. (Tesis de licenciatura en Químico
Farmacéutico Biólogo), Universidad Autónoma de Sinaloa, Culiacán, Sinaloa, México.
Feng, W. H., Bi, Y., Li, P., Yin, T. T., Gao, C. X., Shen, S. M., . . . Zhu, D. L. (2019).
Effects of liraglutide, metformin and gliclazide on body composition in patients with both type
2 diabetes and non-alcoholic fatty liver disease: A randomized trial. J Diabetes Investig, 10(2),
399-407. doi: 10.1111/jdi.12888
172
Firneisz, G. (2014). Non-alcoholic fatty liver disease and type 2 diabetes mellitus: the
liver disease of our age? World J Gastroenterol, 20(27), 9072-9089. doi:
10.3748/wjg.v20.i27.9072
Ganesh, S., y Rustgi, V. K. (2016). Current Pharmacologic Therapy for Nonalcoholic
Fatty Liver Disease. Clin Liver Dis, 20(2), 351-364. doi: 10.1016/j.cld.2015.10.009
Garber, I. L., Aguilar-Salinas, C. A., Gómez-Pérez, F. J., Reza-Albarrán, A., Hernández-
Jiménez, S., Vázquez-Chavez, C., y Rull, J. A. (2004). El Síndrome Metabólilco. Posición de
la Sociedad Mexicana de Nutrición y Endocrinología, sobre la definición, fisiopatología y
diagnóstico. Característics del Síndrome Metabólico en México. Revista de Endocrinología y
Nutrición, 12, 109-122.
Gartner, L. P., y Hiatt, J. L. (2001). Texto Atlas de Histología (Segunda ed.). México,
D.F.: McGraw-Hill Interamericana.
GPC. (2012). Guía Práctica Clínica (GPC). Prevención, diagnóstico y tratamiento del
sobrepeso y obesidad exógena. . In C. N. d. E. T. e. Salud (Ed.). México.
Gruben, N., Shiri-Sverdlov, R., Koonen, D. P., y Hofker, M. H. (2014). Nonalcoholic
fatty liver disease: A main driver of insulin resistance or a dangerous liaison? Biochim Biophys
Acta, 1842(11), 2329-2343. doi: 10.1016/j.bbadis.2014.08.004
Guyton, A. C., y Hall, J. E. (2009). Tratado de Fisiología Médica (A. C. Guyton & J. E.
Hall Eds. Decimo primera ed.). España: Elsevier Saunders.
Hall, A., Covelli, C., Manuguerra, R., Luong, T. V., Buzzetti, E., Tsochatzis, E., . . .
Dhillon, A. P. (2017). Transaminase abnormalities and adaptations of the liver lobule manifest
at specific cut-offs of steatosis. Sci Rep, 7, 40977. doi: 10.1038/srep40977
173
Harris, R. B. S. (2018). Source of dietary sucrose influences development of leptin
resistance in male and female rats. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 314(4), R598-
R610. doi: 10.1152/ajpregu.00384.2017
Hassan, K., Bhalla, V., El Regal, M. E., y HH, A. K. (2014). Nonalcoholic fatty liver
disease: a comprehensive review of a growing epidemic. World J Gastroenterol, 20(34), 12082-
12101. doi: 10.3748/wjg.v20.i34.12082
Haukeland, J. W., Konopski, Z., Eggesbo, H. B., von Volkmann, H. L., Raschpichler, G.,
Bjoro, K., . . . Birkeland, K. (2009). Metformin in patients with non-alcoholic fatty liver disease:
a randomized, controlled trial. Scand J Gastroenterol, 44(7), 853-860. doi:
10.1080/00365520902845268
Hernández-Sampieri, R., Fernández-Collado, C., y Baptista-Lucio, P. (2006).
Metodología de la investigación (Cuarta ed.). México: McGraw Hill.
Hernandez Cruz, A., Garcia-Jimenez, S., Zucatelli Mendonca, R., y Petricevich, V. L.
(2008). Pro- and anti-inflammatory cytokines release in mice injected with Crotalus durissus
terrificus venom. Mediators Inflamm, 2008, 874962. doi: 10.1155/2008/874962
Hsieh, C. T., Hsieh, T. J., El-Shazly, M., Chuang, D. W., Tsai, Y. H., Yen, C. T., . . .
Chang, F. R. (2012). Synthesis of chalcone derivatives as potential anti-diabetic agents. Bioorg
Med Chem Lett, 22(12), 3912-3915. doi: 10.1016/j.bmcl.2012.04.108
Hu, X., Liu, Y., Wang, C., Hou, L., Zheng, X., Xu, Y., . . . Pang, S. (2017). Metformin
affects thyroid function in male rats. Oncotarget, 8(64), 107589-107595. doi:
10.18632/oncotarget.22536
174
Iranshahy, M., Rezaee, R., y Karimi, G. (2019). Hepatoprotective activity of metformin:
A new mission for an old drug? Eur J Pharmacol, 850, 1-7. doi: 10.1016/j.ejphar.2019.02.004
Jalalvand, F., Amoli, M. M., Yaghmaei, P., Kimiagar, M., y Ebrahim-Habibi, A. (2015).
Acarbose versus trans-chalcone: comparing the effect of two glycosidase inhibitors on obese
mice. Arch Endocrinol Metab, 59(3), 202-209. doi: 10.1590/2359-3997000000038
Jenkins, N. T., Padilla, J., Arce-Esquivel, A. A., Bayless, D. S., Martin, J. S., Leidy, H. J.,
. . . Laughlin, M. H. (2012). Effects of endurance exercise training, metformin, and their
combination on adipose tissue leptin and IL-10 secretion in OLETF rats. J Appl Physiol (1985),
113(12), 1873-1883. doi: 10.1152/japplphysiol.00936.2012
Jensterle, M., Kocjan, T., y Janez, A. (2014). Phosphodiesterase 4 inhibition as a potential
new therapeutic target in obese women with polycystic ovary syndrome. J Clin Endocrinol
Metab, 99(8), E1476-1481. doi: 10.1210/jc.2014-1430
Kabiri, N., Tabandeh, M. R., y Tabatabaie, S. R. (2014). Beneficial effects of pioglitazone
and metformin in murine model of polycystic ovaries via improvement of chemerin gene up-
regulation. Daru, 22, 39. doi: 10.1186/2008-2231-22-39
Kampov-Polevoy, A. B., Alterman, A., Khalitov, E., y Garbutt, J. C. (2006). Sweet
preference predicts mood altering effect of and impaired control over eating sweet foods. Eat
Behav, 7(3), 181-187. doi: 10.1016/j.eatbeh.2005.09.005
Karimi-Sales, E., Jeddi, S., Ebrahimi-Kalan, A., y Alipour, M. R. (2018). Trans-chalcone
enhances insulin sensitivity through the miR-34a/SIRT1 pathway. Iran J Basic Med Sci, 21(4),
359-363. doi: 10.22038/IJBMS.2018.24300.6063
175
Karimi-Sales, E., Mohaddes, G., y Alipour, M. R. (2018). Chalcones as putative
hepatoprotective agents: Preclinical evidence and molecular mechanisms. Pharmacol Res, 129,
177-187. doi: 10.1016/j.phrs.2017.11.022
Karkhaneh, L., Yaghmaei, P., Parivar, K., Sadeghizadeh, M., y Ebrahim-Habibi, A.
(2016). Effect of trans-chalcone on atheroma plaque formation, liver fibrosis and adiponectin
gene expression in cholesterol-fed NMRI mice. Pharmacol Rep, 68(4), 720-727. doi:
10.1016/j.pharep.2016.03.004
Kawasaki, T., Igarashi, K., Koeda, T., Sugimoto, K., Nakagawa, K., Hayashi, S., . . .
Yamanouchi, T. (2009). Rats fed fructose-enriched diets have characteristics of nonalcoholic
hepatic steatosis. J Nutr, 139(11), 2067-2071. doi: 10.3945/jn.109.105858
Kierszenbaum, A. L. (2008). Histología y Biología Celular: Introducción a la anatomía
patológica. (Tercera ed.). Barcelona, España: Elsevier Mosby.
Kilpatrick, L. A., Coveleskie, K., Connolly, L., Labus, J. S., Ebrat, B., Stains, J., . . .
Mayer, E. A. (2014). Influence of sucrose ingestion on brainstem and hypothalamic intrinsic
oscillations in lean and obese women. Gastroenterology, 146(5), 1212-1221. doi:
10.1053/j.gastro.2014.01.023
Kim, M. H., Kang, K. S., y Lee, Y. S. (2010). The inhibitory effect of genistein on hepatic
steatosis is linked to visceral adipocyte metabolism in mice with diet-induced non-alcoholic
fatty liver disease. Br J Nutr, 104(9), 1333-1342. doi: 10.1017/S0007114510002266
Kucerova-Chlupacova, M., Dosedel, M., Kunes, J., Soltesova-Prnova, M., Majekova, M.,
y Stefek, M. (2018). Chalcones and their pyrazine analogs: synthesis, inhibition of aldose
176
reductase, antioxidant activity, and molecular docking study. Monatshefte für Chemie-Chemical
Monthly, 1-9.
la Fleur, S. E., van Rozen, A. J., Luijendijk, M. C., Groeneweg, F., y Adan, R. A. (2010).
A free-choice high-fat high-sugar diet induces changes in arcuate neuropeptide expression that
support hyperphagia. Int J Obes (Lond), 34(3), 537-546. doi: 10.1038/ijo.2009.257
LaBrecque, D., Abbas, Z., Anania, F., Ferenci, P., Ghafor-Kjan, A., Goh, K. L., . . .
LeMair, A. (2012). Enfermedad del hígado graso no alcohólico y esteatohepatitis no alcohólica.
In O. M. d. Gastroenterología (Ed.).
Lahsasni, S. A., Al Korbi, F. H., y Aljaber, N. A. (2014). Synthesis, characterization and
evaluation of antioxidant activities of some novel chalcones analogues. Chem Cent J, 8, 32. doi:
10.1186/1752-153X-8-32
Lambert, J. B., y Mazzola, E. P. (2003). Nuclear magnetic resonance spectroscopy: an
introduction to principles, applications, and experimental methods: Prentice Hall.
Lau, J. K., Zhang, X., y Yu, J. (2017). Animal models of non-alcoholic fatty liver disease:
current perspectives and recent advances. J Pathol, 241(1), 36-44. doi: 10.1002/path.4829
Lee, C. K., Choi, Y. J., Park, S. Y., Kim, J. Y., Won, K. C., y Kim, Y. W. (2012).
Intracerebroventricular injection of metformin induces anorexia in rats. Diabetes Metab J,
36(4), 293-299. doi: 10.4093/dmj.2012.36.4.293
Leite, N. C., Villela-Nogueira, C. A., Cardoso, C. R., y Salles, G. F. (2014). Non-alcoholic
fatty liver disease and diabetes: from physiopathological interplay to diagnosis and treatment.
World J Gastroenterol, 20(26), 8377-8392. doi: 10.3748/wjg.v20.i26.8377
177
Li, X., Chen, Y., Zhao, Z., Lu, W., y Zhou, T. (2016).
Pharmacokinetic/Pharmacodynamic Analysis of Metformin using Different Models in Diabetic
Rats. Drug Res (Stuttg), 66(10), 547-554. doi: 10.1055/s-0042-111514
Lima-Mendoza, L. A., Colado-Velazquez, J., 3rd, Mailloux-Salinas, P., Espinosa-Juarez,
J. V., Gomez-Viquez, N. L., Molina-Munoz, T., . . . Bravo, G. (2014). Vascular damage in obese
female rats with hypoestrogenism. J Physiol Biochem, 70(1), 81-91. doi: 10.1007/s13105-013-
0283-2
Linden, M. A., Fletcher, J. A., Morris, E. M., Meers, G. M., Kearney, M. L., Crissey, J.
M., . . . Rector, R. S. (2014). Combining metformin and aerobic exercise training in the treatment
of type 2 diabetes and NAFLD in OLETF rats. Am J Physiol Endocrinol Metab, 306(3), E300-
310. doi: 10.1152/ajpendo.00427.2013
Lisboa, Q. C., Costa, S. M., y Couto, C. A. (2016). Current management of non-alcoholic
fatty liver disease. Rev Assoc Med Bras (1992), 62(9), 872-878. doi: 10.1590/1806-
9282.62.09.872
Liu, F., Wang, C., Zhang, L., Xu, Y., Jang, L., Gu, Y., . . . Li, Q. (2014). Metformin
prevents hepatic steatosis by regulating the expression of adipose differentiation-related protein.
Int J Mol Med, 33(1), 51-58. doi: 10.3892/ijmm.2013.1560
Loa, J., Chow, P., y Zhang, K. (2009). Studies of structure-activity relationship on plant
polyphenol-induced suppression of human liver cancer cells. Cancer Chemother Pharmacol,
63(6), 1007-1016. doi: 10.1007/s00280-008-0802-y
López-Oliva, E., y Muñoz-Martínez, E. (2014). SREBP-1c, ChREBP y LXR: Su
influencia en el desarrollo de hígado graso no alcohólico. An Real Acad Farm, 80, 14-48.
178
López-Panqueva, R. L. (2013). Hepatología para gastroenterólogos y hepatólogos. Rev
Col Gastroenterol, 28(2), 161-168.
López-Velázquez, J. A., Silva-Vidal, K. V., Ponciano-Rodriguez, G., Chavez-Tapia, N.
C., Arrese, M., Uribe, M., y Mendez-Sanchez, N. (2014). The prevalence of nonalcoholic fatty
liver disease in the Americas. Ann Hepatol, 13(2), 166-178.
Lopez, M. (2018). Hypothalamic AMPK and energy balance. Eur J Clin Invest, 48(9),
e12996. doi: 10.1111/eci.12996
Lv, W. S., Wen, J. P., Li, L., Sun, R. X., Wang, J., Xian, Y. X., . . . Gao, Y. Y. (2012).
The effect of metformin on food intake and its potential role in hypothalamic regulation in obese
diabetic rats. Brain Res, 1444, 11-19. doi: 10.1016/j.brainres.2012.01.028
Macomber, R. S. (1998). A complete introduction of modern NMR spectroscopy: John
Wiley & Sons, INC.
Madan, B., Batra, S., y Ghosh, B. (2000). 2'-hydroxychalcone inhibits nuclear factor-
kappaB and blocks tumor necrosis factor-alpha- and lipopolysaccharide-induced adhesion of
neutrophils to human umbilical vein endothelial cells. Mol Pharmacol, 58(3), 526-534.
Malin, S. K., y Kashyap, S. R. (2014). Effects of metformin on weight loss: potential
mechanisms. Curr Opin Endocrinol Diabetes Obes, 21(5), 323-329. doi:
10.1097/MED.0000000000000095
Malin, S. K., Nightingale, J., Choi, S. E., Chipkin, S. R., y Braun, B. (2013). Metformin
modifies the exercise training effects on risk factors for cardiovascular disease in impaired
glucose tolerant adults. Obesity (Silver Spring), 21(1), 93-100. doi: 10.1002/oby.20235
179
Marcolin, E., Forgiarini, L. F., Rodrigues, G., Tieppo, J., Borghetti, G. S., Bassani, V. L.,
. . . Marroni, N. P. (2013). Quercetin decreases liver damage in mice with non-alcoholic
steatohepatitis. Basic Clin Pharmacol Toxicol, 112(6), 385-391. doi: 10.1111/bcpt.12049
Marcolin, E., San-Miguel, B., Vallejo, D., Tieppo, J., Marroni, N., Gonzalez-Gallego, J.,
y Tunon, M. J. (2012). Quercetin treatment ameliorates inflammation and fibrosis in mice with
nonalcoholic steatohepatitis. J Nutr, 142(10), 1821-1828. doi: 10.3945/jn.112.165274
Marin, V., Rosso, N., Dal Ben, M., Raseni, A., Boschelle, M., Degrassi, C., . . . Gazzin,
S. (2016). An Animal Model for the Juvenile Non-Alcoholic Fatty Liver Disease and Non-
Alcoholic Steatohepatitis. PLoS One, 11(7), e0158817. doi: 10.1371/journal.pone.0158817
McClain, C. J., Mokshagundam, S. P., Barve, S. S., Song, Z., Hill, D. B., Chen, T., y
Deaciuc, I. (2004). Mechanisms of non-alcoholic steatohepatitis. Alcohol, 34(1), 67-79. doi:
10.1016/j.alcohol.2004.07.007
McCreight, L. J., Bailey, C. J., y Pearson, E. R. (2016). Metformin and the gastrointestinal
tract. Diabetologia, 59(3), 426-435. doi: 10.1007/s00125-015-3844-9
Méndez-Sanchez, N., Gutiérres-Grobe, Y., Chávez-Tapia, N. C., Kobashi-Margain, R. A.,
y Uribe, M. (2010). Hígado graso no alcohólico y esteatoepatitis no alcohólica: conceptos
actuales. Rev Gastroenterol Méx, 2, 143-148.
Moreno, G. M. (2012). Definición y clasificación de la obesidad. Revista Médica Clínica
Las Condes, 23(2), 124-128.
Morrison, R. T., y Boyd, R. N. (1998). Química orgánica: Pearson educación.
Motamed, N., Rabiee, B., Poustchi, H., Dehestani, B., Hemasi, G. R., Khonsari, M. R., . .
. Zamani, F. (2017). Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) and 10-year risk of
180
cardiovascular diseases. Clin Res Hepatol Gastroenterol, 41(1), 31-38. doi:
10.1016/j.clinre.2016.07.005
Mueller, M., Beck, V., y Jungbauer, A. (2011). PPARalpha activation by culinary herbs
and spices. Planta Med, 77(5), 497-504. doi: 10.1055/s-0030-1250435
Murguia-Romero, M., Jimenez-Flores, J. R., Sigrist-Flores, S. C., Tapia-Pancardo, D. C.,
Jimenez-Ramos, A., Mendez-Cruz, A. R., y Villalobos-Molina, R. (2015). Prevalence of
Metabolic Syndrome in Young Mexicans: A Sensitivity Analysis on Its Components. Nutr
Hosp, 32(1), 189-195. doi: 10.3305/nh.2015.32.1.9031
Murray, R. L. (1984). "Alanine aminotransferase" in Clinical Chemestry. Teory, analysis
and correlation: CV Mosby St Lououis.
Najafian, M., Ebrahim-Habibi, A., Yaghmaei, P., Parivar, K., y Larijani, B. (2010). Core
structure of flavonoids precursor as an antihyperglycemic and antihyperlipidemic agent: an in
vivo study in rats. Acta Biochim Pol, 57(4), 553-560.
Narender, T., y Papi Reddy, K. (2007). A simple and highly efficient method for the
synthesis of chalcones by using borontrifluoride-etherate. Tetrahedron Letters(48), 3177 - 3180.
Nowakowska, Z. (2007). A review of anti-infective and anti-inflammatory chalcones. Eur
J Med Chem, 42(2), 125-137. doi: 10.1016/j.ejmech.2006.09.019
Odegaard, A. O., Choh, A. C., Czerwinski, S. A., Towne, B., y Demerath, E. W. (2012).
Sugar-sweetened and diet beverages in relation to visceral adipose tissue. Obesity (Silver
Spring), 20(3), 689-691. doi: 10.1038/oby.2011.277
Olsen, N. J., Andersen, L. B., Wedderkopp, N., Kristensen, P. L., y Heitmann, B. L.
(2012). Intake of liquid and solid sucrose in relation to changes in body fatness over 6 years
181
among 8- to 10-year-old children: the European Youth Heart Study. Obes Facts, 5(4), 506-512.
doi: 10.1159/000341631
OMS. (2016a). 10 datos sobre la diabetes. Retrieved 9/02/17, 2017, from
www.who.int/features/factfiles/diabetes/es
OMS. (2016b). Aumento de la obesidad en el mundo., 2017, from
www.who.int/mediacentre/new/releases/2016/curtail-sugary-drinks/es/
OMS. (2016c). Diabetes: perfiles de los países 2016. México. Retrieved 9/02/17, 2017,
from www.who.int/diabetes/country-profiles/es/
OMS. (2018). Obesidad y sobrepeso. Retrieved 26/05/2019, 2019, from
https://www.who.int/es/news-room/fact-sheets/detail/obesity-and-overweight
Orlikova, B., Tasdemir, D., Golais, F., Dicato, M., y Diederich, M. (2011). Dietary
chalcones with chemopreventive and chemotherapeutic potential. Genes Nutr, 6(2), 125-147.
doi: 10.1007/s12263-011-0210-5
Packard, A. E., Ghosal, S., Herman, J. P., Woods, S. C., y Ulrich-Lai, Y. M. (2014).
Chronic variable stress improves glucose tolerance in rats with sucrose-induced prediabetes.
Psychoneuroendocrinology, 47, 178-188. doi: 10.1016/j.psyneuen.2014.05.016
Pan, Y., Chen, Y., Li, Q., Yu, X., Wang, J., y Zheng, J. (2013). The synthesis and
evaluation of novel hydroxyl substituted chalcone analogs with in vitro anti-free radicals
pharmacological activity and in vivo anti-oxidation activity in a free radical-injury Alzheimer's
model. Molecules, 18(2), 1693-1703. doi: 10.3390/molecules18021693
182
Pandit, R., Mercer, J. G., Overduin, J., la Fleur, S. E., y Adan, R. A. (2012). Dietary
factors affect food reward and motivation to eat. Obes Facts, 5(2), 221-242. doi:
10.1159/000338073
Peverill, W., Powell, L. W., y Skoien, R. (2014). Evolving concepts in the pathogenesis
of NASH: beyond steatosis and inflammation. Int J Mol Sci, 15(5), 8591-8638. doi:
10.3390/ijms15058591
Pilatova, M., Varinska, L., Perjesi, P., Sarissky, M., Mirossay, L., Solar, P., . . . Mojzis, J.
(2010). In vitro antiproliferative and antiangiogenic effects of synthetic chalcone analogues.
Toxicol In Vitro, 24(5), 1347-1355. doi: 10.1016/j.tiv.2010.04.013
Planells, E., Lerma, A., Sanchez-Morito, N., Aranda, P., y J, L. L. (1997). Effect of
magnesium deficiency on vitamin B2 and B6 status in the rat. J Am Coll Nutr, 16(4), 352-356.
Porth, C., y Garpard, K. J. (2003). Essentials of Pathophysiology: Lippincott Williams &
Wilkins.
Qu, Q., Dai, B., Yang, B., Li, X., Liu, Y., y Zhang, F. (2014). 4-Hydroxychalcone
attenuates hyperaldosteronism, inflammation, and renal injury in cryptochrome-null mice.
Biomed Res Int, 2014, 603415. doi: 10.1155/2014/603415
Quian, Y., Shang, Y., Teng, Q., Chang, J., Fan, G., Wei, X., . . . Zhou, B. (2011).
Hydroxychalcones as potent antioxidants: Structure-activity relationship analysis and
mechanism considerations. Food Chemestry, 126, 241-248.
Ramachandran, R., y Saraswathy, M. (2014). Up-regulation of nuclear related factor 2
(NRF2) and antioxidant responsive elements by metformin protects hepatocytes against the
acetaminophen toxicity. Toxicology Research, 3(5), 350-358. doi: 10.1039/C4TX00032C
183
Raso, G. M., Esposito, E., Iacono, A., Pacilio, M., Cuzzocrea, S., Canani, R. B., . . . Meli,
R. (2009). Comparative therapeutic effects of metformin and vitamin E in a model of non-
alcoholic steatohepatitis in the young rat. Eur J Pharmacol, 604(1-3), 125-131. doi:
10.1016/j.ejphar.2008.12.013
Rodriguez-Ramiro, I., Vauzour, D., y Minihane, A. M. (2016). Polyphenols and non-
alcoholic fatty liver disease: impact and mechanisms. Proc Nutr Soc, 75(1), 47-60. doi:
10.1017/S0029665115004218
Rosini, T. C., Silva, A. S., y Moraes, C. (2012). Diet-induced obesity: rodent model for
the study of obesity-related disorders. Rev Assoc Med Bras, 58(3), 383-387.
Rossi, M., Caruso, F., Crespi, E. J., Pedersen, J. Z., Nakano, G., Duong, M., . . . Incerpi,
S. (2013). Probing antioxidant activity of 2'-hydroxychalcones: crystal and molecular structures,
in vitro antiproliferative studies and in vivo effects on glucose regulation. Biochimie, 95(10),
1954-1963. doi: 10.1016/j.biochi.2013.07.002
Saad, M. I., Kamel, M. A., y Hanafi, M. Y. (2015). Modulation of Adipocytokines
Production and Serum NEFA Level by Metformin, Glimepiride, and Sitagliptin in HFD/STZ
Diabetic Rats. Biochem Res Int, 2015, 138134. doi: 10.1155/2015/138134
Sanches, S. C., Ramalho, L. N., Augusto, M. J., da Silva, D. M., y Ramalho, F. S. (2015).
Nonalcoholic Steatohepatitis: A Search for Factual Animal Models. Biomed Res Int, 2015,
574832. doi: 10.1155/2015/574832
Santos-Ballardo, C. L. (2016). Evaluación de la toxicidad subcrónica de la 4-
hidroxichalcona en ratas Wistar macho. (Tesis de licenciatura en Químico Farmacéutico
Biólogo), Universidad Autónoma de Sinaloa, Culiacan, Sinaloa, México.
184
Scully, T. (2012). Diabetes in numbers. Nature, 485(7398), S2-3.
Schultz, A., Barbosa-da-Silva, S., Aguila, M. B., y Mandarim-de-Lacerda, C. A. (2015).
Differences and similarities in hepatic lipogenesis, gluconeogenesis and oxidative imbalance in
mice fed diets rich in fructose or sucrose. Food Funct, 6(5), 1684-1691. doi:
10.1039/c5fo00251f
Shaw, L. M., Stromme, J. H., London, J. L., y Theodorsen, L. (1983). International
Federation of Clinical Chemistry, (IFCC), Scientific Committee, Analytical Section. IFCC
methods for the measurement of catalytic concentration of enzymes. Part 4. IFCC method for
gamma-glutamyltransferase [(gamma-glutamyl)-peptide: amino acid gamma-
glutamyltransferase, EC 2.3.2.2]. J Clin Chem Clin Biochem, 21(10), 633-646.
Silverstein, R. M., Webster, F. X., y Kiemle, D. J. (2005). Spectrometric identification of
organic compounds: John Wiley & Sons, Inc.
Singh, P., Anand, A., y Kumar, V. (2014). Recent developments in biological activities
of chalcones: a mini review. Eur J Med Chem, 85, 758-777. doi: 10.1016/j.ejmech.2014.08.033
Spruss, A., Kanuri, G., Stahl, C., Bischoff, S. C., y Bergheim, I. (2012). Metformin
protects against the development of fructose-induced steatosis in mice: role of the intestinal
barrier function. Lab Invest, 92(7), 1020-1032. doi: 10.1038/labinvest.2012.75
Srividhya, S., y Anuradha, C. V. (2002). Metformin improves liver antioxidant potential
in rats fed a high-fructose diet. Asia Pac J Clin Nutr, 11(4), 319-322.
Tiikkainen, M., Hakkinen, A. M., Korsheninnikova, E., Nyman, T., Makimattila, S., y
Yki-Jarvinen, H. (2004). Effects of rosiglitazone and metformin on liver fat content, hepatic
185
insulin resistance, insulin clearance, and gene expression in adipose tissue in patients with type
2 diabetes. Diabetes, 53(8), 2169-2176.
Tilg, H., y Moschen, A. R. (2008). Insulin resistance, inflammation, and non-alcoholic
fatty liver disease. Trends Endocrinol Metab, 19(10), 371-379. doi: 10.1016/j.tem.2008.08.005
Trujillo-Arriaga, H. M. (2007). La curva de tolerancia a la glucosa oral. Un enfoque
alternativo. ContactoS, 64, 21-24.
Van De Wier, B., Koek, G. H., Bast, A., y Haenen, G. R. (2017). The potential of
flavonoids in the treatment of non-alcoholic fatty liver disease. Crit Rev Food Sci Nutr, 57(4),
834-855. doi: 10.1080/10408398.2014.952399
Varinska, L., van Wijhe, M., Belleri, M., Mitola, S., Perjesi, P., Presta, M., . . . Mojzis, J.
(2012). Anti-angiogenic activity of the flavonoid precursor 4-hydroxychalcone. Eur J
Pharmacol, 691(1-3), 125-133. doi: 10.1016/j.ejphar.2012.06.017
Weiss, J., Rau, M., y Geier, A. (2014). Non-alcoholic fatty liver disease: epidemiology,
clinical course, investigation, and treatment. Dtsch Arztebl Int, 111(26), 447-452. doi:
10.3238/arztebl.2014.0447
Woo, S. L., Xu, H., Li, H., Zhao, Y., Hu, X., Zhao, J., . . . Wu, C. (2014). Metformin
ameliorates hepatic steatosis and inflammation without altering adipose phenotype in diet-
induced obesity. PLoS One, 9(3), e91111. doi: 10.1371/journal.pone.0091111
Wu, J. Z., Cheng, C. C., Shen, L. L., Wang, Z. K., Wu, S. B., Li, W. L., . . . Qiu, P. H.
(2014). Synthetic chalcones with potent antioxidant ability on H(2)O(2)-induced apoptosis in
PC12 cells. Int J Mol Sci, 15(10), 18525-18539. doi: 10.3390/ijms151018525
186
Xu, H., Zhou, Y., Liu, Y., Ping, J., Shou, Q., Chen, F., y Ruo, R. (2016). Metformin
improves hepatic IRS2/PI3K/Akt signaling in insulin-resistant rats of NASH and cirrhosis. J
Endocrinol, 229(2), 133-144. doi: 10.1530/JOE-15-0409
Yadav, V. R., Prasad, S., Sung, B., y Aggarwal, B. B. (2011). The role of chalcones in
suppression of NF-kappaB-mediated inflammation and cancer. Int Immunopharmacol, 11(3),
295-309. doi: 10.1016/j.intimp.2010.12.006
Zhang, Y., Liu, J., Yao, J., Ji, G., Qian, L., Wang, J., . . . Liu, Y. (2014). Obesity:
pathophysiology and intervention. Nutrients, 6(11), 5153-5183. doi: 10.3390/nu6115153
Zhou, M., Liu, L., Wang, W., Han, J., Ren, H., Zheng, Q., y Wang, D. (2015). Role of
licochalcone C in cardioprotection against ischemia/reperfusion injury of isolated rat heart via
antioxidant, anti-inflammatory, and anti-apoptotic activities. Life Sci, 132, 27-33. doi:
10.1016/j.lfs.2015.04.008
187
XIV. ANEXOS
11.1. Perspectivas
11.1.1. Determinar el efecto del tratamiento con metformina y 4-HC en proceso
inflamatorio a nivel hepático, mediante la determinación de expresión de citocinas
proinflamatorias (IL-1, IL-6, TNF-), antiinflamatorias (IL-10, TGF-) en ratas Wistar macho
sanas y con HGNA.
11.1.2. Determinar el efecto del tratamiento con metformina y 4-HC en la expresión de
PPARy PPAR a nivel hepático, así como los niveles de leptina y adiponectina a nivel
sanguíneo, en ratas Wistar macho sanas y con HGNA. Con la intención de identificar dianas en
el mecanismo de acción de los fármacos evaluados.
11.1.3. Determinar el efecto farmacológico de 4-HC en intolerancia a la glucosa o diabetes
mellitus tipo 2 en un modelo múrido.
11.1.4. Determinar el efecto farmacológico de 4-HC en el tono simpático vasopresor en
el modelo de rata descerebrada y desmedulada.
11.1.5. Determinar el efecto farmacológico de 4-HC en vasodilatación en el modelo de
rata descerebrada y desmedulada.
11.2. Productos
De la tesis de doctorado se presentó un cartel en congreso nacional:
Acosta-Cota S.J., Ruiz-Quiñonez A.K., Aguilar-Medina E.M., Ramos-Payán R.,
Romero-Quintana J.G., Montes-Ávila J., Rendón-Maldonado J.G., Osuna-Martínez U.
Caracterización de un modelo in vivo del desarrollo de la enfermedad de hígado graso no
188
alcohólico, asociado con presencia de obesidad e intolerancia a la glucosa. I Jornada Nacional
de Investigación en Salud Durango 2017.
Se presentaron tres ponencias en congresos nacionales:
Acosta-Cota S.J., Ruiz-Quiñonez A.K., Aguilar-Medina E.M., Ramos-Payán R.,
Romero-Quintana J.G., Montes-Ávila J., Rendón-Maldonado J.G., Osuna-Martínez U.
Caracterización de un modelo in vivo del desarrollo de la enfermedad de hígado graso no
alcohólico, asociado con presencia de obesidad e intolerancia a la glucosa. I Jornada Nacional
de Investigación en Salud Durango 2017.
Acosta-Cota S.J., E.M. Aguilar-Medina, R. Ramos-Payán, J.G. Romero-Quintana, J.G.
Rendón-Maldonado, J. Montes-Ávila, Osuna-Martínez U. Caracterización de un modelo in vivo
del desarrollo de la enfermedad de hígado graso no alcohólico, asociado con presencia de
obesidad e intolerancia a la glucosa. Cuarto Encuentro de Jóvenes Investigadores en el Estado
de Sinaloa. Mazatlán, Sinaloa, México. 13 y 14 de septiembre de 2017.
Selene de Jesús Acosta Cota, Elsa Maribel Aguilar Medina, Rosalio Ramos Payán, José
Geovanni Romero Quintana, Julio Montes Ávila, José Guadalupe Rendón Maldonado, Lorenzo
Ulises Osuna Martínez. Efecto del tratamiento con metformina y 4-hidroxichalcona en ratas
Wistar macho con hígado graso no alcohólico. Sexto Encuentro de Jóvenes Investigadores en el
Estado de Sinaloa. Mazatlán, Sinaloa, México. 12 y 13 de septiembre de 2017.
Se presentó una conferencia magistral en un congreso regional:
Selene de Jesús Acosta Cota. Efecto del tratamiento con metformina y 4-hidroxichalcona
en ratas Wistar macho con hígado graso no alcohólico. Programa de conferencias del “XXIV
189
Aniversario de la Asociación Farmacéutica Mexicana- Representación Estudiantil Sinaloa”.
Culiacán, Sinaloa, México. 8 al 11 de octubre de 2018.
Se participó en un concurso nacional:
Acosta-Cota S.J., Ruiz-Quiñonez A.K., Aguilar-Medina E.M., Ramos-Payán R.,
Romero-Quintana J.G., Montes-Ávila J., Rendón-Maldonado J.G., Osuna-Martínez U.
Caracterización de un modelo in vivo del desarrollo de la enfermedad de hígado graso no
alcohólico, asociado con presencia de obesidad e intolerancia a la glucosa. Obteniendo el
Segundo Lugar en la categoría: Investigación Básica en el XV Concurso de Trabajos de
Investigación en Salud, realizado en el marco de I Jornada Nacional de Investigación en Salud
Durango 2017.
Así mismo, durante el periodo de doctorado, participé como asesora de dos tesis de
licenciatura:
Del alumno Jesús Hernán Beltrán Ornelas. Para obtener el título de Licenciado en
Químico Farmacéutico Biólogo. “Estudio del efecto farmacológico del NaHS en el tono
simpático vasopresor en el modelo de rata descerebrada y desmedulada”. Directores: Dr. David
Centurión Pacheco y Dr. Lorenzo Ulises Osuna Martínez. 23 de Septiembre 2016.
De la alumna Ana Karen Ruiz Quiñónez. Para obtener el título de Licenciada en Químico
Farmacéutico Biólogo. “Estandarización del desarrollo de hígado graso en un modelo de
obesidad y resistencia a insulina en ratas Wistar macho como herramienta de evaluación de
tratamientos farmacológicos experimentales”. Directores: Dr. Lorenzo Ulises Osuna Martínez
y Dr. José Guadalupe Rendón Maldonado. 2 de Junio de 2017.
190
Participé en el comité evaluador en cuatro presentaciones de tesis de licenciatura:
Como vocal en presentación de tesis de la alumna Ana Karen Ruiz Quiñónez. Para obtener
el título de Licenciada en Químico Farmacéutico Biólogo. “Estandarización del desarrollo de
hígado graso en un modelo de obesidad y resistencia a insulina en ratas Wistar macho como
herramienta de evaluación de tratamientos farmacológicos experimentales”. Directores: Dr.
Lorenzo Ulises Osuna Martínez y Dr. José Guadalupe Rendón Maldonado. 2 de Junio de 2017.
Como secretaria en presentación de tesis de la alumna María Virginia Félix Zavala. Para
obtener el título de Licenciada en Químico Farmacéutico Biólogo. “Evaluación de la actividad
hemolítica de la 4-hidroxichalcona en eritrocitos humanos y murinos”. Directores: Dr. Lorenzo
Ulises Osuna Martínez y Dr. Julio Montes Ávila. 16 de mayo de 2018.
Como secretaria en la presentación de tesis de la alumna Grecia Josefa Medina Terol. Para
obtener el título de Licenciada en Químico Farmacéutico Biólogo. “Evaluación del efecto
farmacológico de metformina sobre el sistema nervioso simpático en el modelo de rata
descerebrada y desmedulada”. Directores: Dr. David Centurión Pacheco y Dr. Lorenzo Ulises
Osuna Martínez. 17 de agosto de 2018.
Como secretaria en la presentación de tesis de la alumna Dalia Carolina Meléndrez
Ramírez. Para obtener el título de Licenciada en Químico Farmacéutico Biólogo. “Evaluación
antialodínica del extracto de Tripterigyum Wilfordii en ratas Wistar”. Directores: Dra. Geovanna
Nallely Quiñonez Bastidas y Dra. Gloria Marisol Castañeda Ruelas. 25 de marzo de 2019.
Participé en la dirección de una tesis de licenciatura:
Del alumno Juan Antonio González López. Para obtener el título de Licenciado en
Químico Farmacéutico Biólogo. “Inducción de hígado graso no alcohólico en ratas Wistar
191
macho mediante el consumo de sacarosa”. Directores: Dr. Lorenzo Ulises Osuna Martínez y M.
en C. Selene de Jesús Acosta Cota.
Se generaron dos artículos originales:
Acosta-Cota SJ, Aguilar-Medina EM, Ramos-Payán R, Ruiz-Quiñónez AK, Romero-
Quintana JG, Montes-Ávila J, Rendón-Maldonado JG, Sánchez-López A, Centurión D, Osuna-
Martínez U. Histopathological and biochemical changes in the development of nonalcoholic
fatty liver disease induced by high-sucrose diet at different times. Can J Physiol Pharmacol.
2019; 97 (1): 23-36. (PUBLICADO).
Acosta-Cota SJ, Aguilar-Medina EM, Ramos-Payán R, Romero-Quintana JG, Montes-
Ávila J, Rendón-Maldonado JG, Sarmiento-Sánchez I, Sánchez-López A, Centurión D, Osuna-
Martínez U. Therapeutic effect of treatment with metformin and/or 4-hydroxychalcone in male
Wistar rats with nonalcoholic fatty liver disease. Eur J Pharmacol. (EN REVISIÓN).
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XV. SIGLAS Y ABREVIACIONES
%: Porcentaje.
4-HC: 4-Hidroxichalcona.
AG: Ácidos grasos.
AgRP: Proteína r-agouti.
ALT: Alanina aminotransferasa.
AMPK: Cinasa activada por monofosfato.
ANOVA: Análisis de varianza.
AST: Aspartato aminotransferasa.
ATP: Adenina trifosfato
BCA: Brusochalcona A.
BF3∙OEt2: Trifloruro dieterato de boro.
CAT: Catalasa.
CCl4: Tetracloruro de carbono.
CHC: Carcinoma hepatocelular.
ChREBP: Proteína de unión a elemento de respuesta de hidratos de carbono.
COX-2: Ciclooxigenasa 2.
CTGF: Factor de crecimiento de tejido conectivo.
: Desplazamiento químico.
DAG: Diacilglicerol.
DMSO: Dimetilsulfóxido.
DMT2: Diabetes mellitus tipo 2.
208
DPPH: 2,2-difenilpicrilidrailo.
e.e.m.: Error estándar de la muestra.
EHNA: Esteatosis hepática no alcohólica.
EHNAS: Esteatohepatitis no alcohólica severa.
ERS: Estrés del retículo endoplásmico.
FA: Fosfatasa alcalina.
FGF21: Factor de crecimiento de fibroblastos 21.
g: Gramo.
GGT: Gama glutamil transferasa.
GLP-1: Péptido 1 tipo glucagón.
GLUT: Transportador de glucosa.
GO∙: Radical galvinilo.
GPx: Glutatión peroxidasa.
GSH: Glutatión.
GR: Glutatión reductasa.
h: hora.
H2O2: Peróxido de hidrógeno.
HDL: Lipoproteína de alta densidad.
HeLa: Células de cáncer cervicouterino humano.
HepG2: Células de carcinoma hepatocelular humano.
HGNA: Hígado graso no alcohólico.
H&E: Hematoxilina y eosina.
HX/XO: Hipoxantina/xantina oxidasa.
Hz: Hertzios.
209
ICAM-1: Molécula de adhesión intracelular 1.
IL-1: Interleucina 1 beta.
IL-6: Interleucina 6.
IL-10: Interleucina 10.
IMC: Índice de masa corporal.
iNOS: Sintasa de óxido nítrico inducible.
IRS: Sustrato de receptor de insulina.
J: Constante de acoplamiento.
JNK: Cinasas Jun.
kg: Kilogramo.
L: Litro.
LDL: Lipoproteína de baja densidad.
m: Metro.
MAPK: Proteína cinasa activada por mitógeno.
MCP-1: Proteína quimioatrayente de monocitos-1.
MDA: Malondialdehído.
mg: Miligramo.
mL: Mililitro.
MTT: 3-(4,5-dimetiltiazo-2-il)-2,5-difeniltetrazolio.
N.S.: No significativo.
NaH2PO4: Bifosfato de sodio.
Na2HPO4: Fosfato de disodio.
Na2SO4: Sulfato de sodio.
210
NF-B: Factor nuclear kappa B.
nm: Nanómetro.
NP-Y: Neuropéptido Y.
NO: Óxido nítrico.
PI3-K: Fosfatidil inositol 3-cinasa.
pg: Picogramos.
PGE2: Prostaglandina E2.
p.o.: Per oral.
POMC: Proopiomelanocortina.
PPAR: Receptor activado por proliferación de peroxisomas.
PTGO: Prueba de tolerancia a la glucosa oral.
RANTES: Quimiocina de regulación por activación expresada y secretada por linfocitos T.
REL: Retículo endoplásmico liso.
RER: Retículo endoplásmico rugoso.
RI: Resistencia a insulina.
RMN: Resonancia magnética nuclear.
ROS: Especies reactivas de oxígeno.
SM: Síndrome metabólico.
SOD: Superóxido dismutasa.
Solc. Sal.: Solución salina.
T3: Triyodotironina.
T4: Tiroxina.
TG: Triglicéridos.
211
TGF-: Factor de crecimiento transformante beta.
TLC: Cromatografía en capa fina.
TM: Tricrómica de Masson.
TNF-: Factor de necrosis tumoral alfa.
UI: Unidades internacionales.
VCAM-1: Molécula de adhesión vascular 1.
VEGF: Factor de crecimiento endotelial vascular.