TRANSFERENCIA DE MATERIAL

GENÉTICO II: INDUCCIÓN DE PROTEÍNA

RECOMBINANTE

OBJETIVOS

Conocer el fundamento de la inducción de la síntesis de proteínas

recombinantes en E. coli

Realizar la inducción de una proteína recombinante (β-lactamasa)

Obtener la curva temporal de inducción de una proteína recombinante

Interpretar el patrón electroforético de producción de una proteína

recombinante

Conocer las aplicaciones biotecnológicas de las proteínas

recombinantes

Regulación de la expresión génica

De los 4,000 genes presentes en el genoma bacteriano, o de los

100,000 estimados para el genoma humano, únicamente se expresa

una fracción en un momento dado.

Existen al menos seis puntos potenciales en los que la cantidad de

proteína puede ser regulada:

1) Síntesis del transcrito primario de RNA

2) Procesamiento post-transcripcional del mRNA

3) Degradación del mRNA

4) Síntesis proteica (traducción)

5) Modificación postraduccional de proteínas

6) Degradación proteica.

Permeasa

LacY

lacZlacOlacP

Promotor Genes estructurales

lacY lacAlacI

-Galactosidasa

LacZ

Transacetilasa

LacAProteína reguladora

(represor)

LacI

Operón de la lactosa

(Operón lac)

Análogos de la lactosa

La mayoría de estos compuestos son galactósidos derivados de la

lactosa, donde la glucosa ha sido sustituida por algún radical o

grupo químico.

IPTG (isopropil-β-D-tio-galactósido)

Fenil-Gal (fenil-β-D-galactosa)

ONPG (orto-nitrofenil-β-D-galactopiranósido)

X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactósido)

Alolactosa

Un inductor del operón lac efectivo y no metabolizable que se usa a

menudo experimentalmente es el isopropiltiogalactósido (IPTG).

Estos inductores no metabolizables permiten la separación de la

función fisiológica de la lactosa como fuente de carbono para el

crecimiento de su función en la regulación de la expresión génica.

IPTG

El IPTG suele utilizarse como inductor artificial del operón lac, ya

que es capaz de unirse al represor LacI, pero no es un sustrato para

la β-galactosidasa y no puede ser metabolizado por la bacteria.

Proteínas recombinantes

Proteínas producidas artificialmente a partir degenes clonados

Aislamiento de la secuencia génica (ARNm) ytraducción de la proteína blanco

Introducción en un organismo (Procariota /Eucariota)

Expresión y purificación de la proteína blanco

Tecnología de DNA

recombinante: Aislamiento de

un gen de un organismo para

introducirlo en otro

Clonación del DNA

• DNA foráneo (secuencia que se desea clonar)

• Vector de clonación (vehículo)

• Organismo huésped (E. coli)

• Selección de vectores

Vector híbrido o recombinante

Vector de clonación pET-24a(+)

Mecanismo de acción del IPTG en la expresión de la

proteína mediada por el vector pET

Promotor T7

Promotor del bacteriófago T7

Controla la alta expresión de la

RNA polimerasa T7

Una copia del gen cromosomal

de la RNA polimerasa T7 bajo el

control del operador de la lactosa

Se utiliza una bacteria lisógena BL21 (DE3), en cuyo cromosoma se

ha insertado el gen que codifica la T7 ARN pol precedido del

promotor lacUV5.

La expresión del gen de T7 ARN pol se controla mediante el

promotor LacUV5.

Este es un promotor del operón lactosa inducible por el IPTG.

Sólo niveles muy débiles de expresión de T7 RNA pol se producen

cuando éste no es inducido.