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TRANSFERENCIA DE MATERIAL
GENÉTICO: INDUCCIÓN DE PROTEÍNA
RECOMBINANTE
OBJETIVOS
Conocer el fundamento de la inducción de la síntesis de proteínas
recombinantes en E. coli
Realizar la inducción de una proteína recombinante
Obtener la curva temporal de inducción de una proteína recombinante
Interpretar el patrón electroforético de producción de una proteína
recombinante
Conocer las aplicaciones biotecnológicas de las proteínas
recombinantes
Regulación de la expresión génica
De los 4,000 genes presentes en el genoma bacteriano, o de los
100,000 estimados para el genoma humano, únicamente se expresa
una fracción en un momento dado.
Existen al menos seis puntos potenciales en los que la cantidad de
proteína puede ser regulada:
1) Síntesis del transcrito primario de RNA
2) Procesamiento post-transcripcional del mRNA
3) Degradación del mRNA
4) Síntesis proteica (traducción)
5) Modificación postraduccional de proteínas
6) Degradación proteica.
Permeasa
LacY
lacZ lacO lacP
Promotor Genes estructurales
lacY lacA lacI
-Galactosidasa
LacZ
Transacetilasa
LacA Proteína reguladora
(represor)
LacI
Operón de la lactosa
(Operón lac)
Análogos de la lactosa
La mayoría de estos compuestos son galactósidos derivados de la
lactosa, donde la glucosa ha sido sustituida por algún radical o
grupo químico.
IPTG (isopropil-β-D-tio-galactósido)
Fenil-Gal (fenil-β-D-galactosa)
ONPG (orto-nitrofenil-β-D-galactopiranósido)
X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactósido)
Alolactosa
Un inductor del operón lac efectivo y no metabolizable que se usa a
menudo experimentalmente es el isopropiltiogalactósido (IPTG).
Estos inductores no metabolizables permiten la separación de la
función fisiológica de la lactosa como fuente de carbono para el
crecimiento de su función en la regulación de la expresión génica.
IPTG
El IPTG suele utilizarse como inductor artificial del operón lac, ya
que es capaz de unirse al represor LacI, pero no es un sustrato para
la β-galactosidasa y no puede ser metabolizado por la bacteria.
Proteínas recombinantes
Proteínas producidas artificialmente a partir de genes clonados
Aislamiento de la secuencia génica (ARNm) y traducción de la proteína blanco
Introducción en un organismo (Procariota / Eucariota)
Expresión y purificación de la proteína blanco
Tecnología de DNA
recombinante: Aislamiento de
un gen de un organismo para
introducirlo en otro
Clonación del DNA
• DNA foráneo (secuencia que se desea clonar)
• Vector de clonación (vehículo)
• Organismo huésped (E. coli)
• Selección de vectores
Vector híbrido o recombinante
Las bacterias DH5 alfa tienen una mutación de recA, no realizan una
recombinación heteróloga, lo cual garantiza una mayor estabilidad
del inserto.
Estas bacterias carecen de algunas endonucleasas, las cuales
podrían digerir los plásmidos durante el proceso para aislar el
plásmido.
Características de las bacterias DH5α
Mecanismo de acción del IPTG en la expresión de la proteína
mediada por el vector pEXP42 en la BL21 (DE3) Codon Plus RIL
Una copia del gen cromosomal
de la RNA polimerasa T7 bajo el
control del operador de la
lactosa
Esta bacteria está diseñada para propósitos de expresión de
proteínas. Es deficiente en algunas proteasas, por lo que no digerirá
las proteínas recombinantes
BL21 (DE3) es una bacteria lisógena, en cuyo cromosoma se ha
insertado el gen que codifica la T7 ARN pol precedido del promotor
lacUV5.
La expresión del gen de T7 ARN pol se controla mediante el
promotor LacUV5.
Este es un promotor del operón lactosa inducible por el IPTG.
Sólo niveles muy débiles de expresión de T7 RNA pol se producen
cuando éste no es inducido.
Características de las bacterias BL21(DE3)
Medio LB-ampicilina
Añadir IPTG a una concentración final de 0.75 mM
500 L
cultivo
saturado
5 mL
Aprox 56 kDa
Hexocinasa de maíz con dos tags V5 y His