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UNIVERSIDAD NACIONAL DE ENTRE RÍOS Facultad de Ciencias de la Alimentación

Ingeniería en Alimentos

Trabajo Práctico Nº6

BIOMOLÉCULAS ORGÁNICAS II: Acidos Nucleicos y lípidos

1. Reconocimiento de ácidos nucleicos

Los ácidos nucleicos son grandes polímeros formados por la repetición de monómeros denominados nucleótidos. Los nucleótidos se unen entre si mediante enlaces fosfodiéster. Forman así largas cadenas; Los ácidos nucleicos almacenan la información genética de los organismos vivos y son los responsables de la transmisión hereditaria. Existen dos tipos , el ácido desoxirribonucleico (ADN) y el ácido ribonucleico (ARN). El ADN es el responsable de almacenar toda la información necesaria para “fabricar” un ser vivo. En su secuencia de nucleótidos contiene las instrucciones para construir los distintos componentes de la célula

Extracción de ADN

La extracción de ADN de una muestra se basa en el hecho de que los iones salinos son atraídos hacia las cargas negativas del ADN, permitiendo su disolución y posterior extracción de la célula. Para extraer el ADN de una muestra primero hace falta liberarlo del interior celular en el que se encuentra contenido. Se comienza entonces por romper las membranas y paredes celulares, esto se realiza a través de una lisis mecánica con la ayuda de un mortero, licuadora o minipimer. Luego se utiliza un detergente que disuelve los lípidos (moléculas grasas) y las proteínas de la membrana celular, rompiendo las uniones que mantienen la integridad de la misma. De esta forma como resultado de la acción mecánica aplicada y el uso del detergente se libera el contenido celular. Además, este detergente forma complejos con los lípidos y las proteínas, permitiendo que los mismos sean separados del ADN por filtración. Así se libera el ADN.

Cátedra de Biología 1

+ Detergente



Luego se adiciona cloruro de sodio. La molécula de NaCl en agua se separa en Na+ y Cl-. El ADN tiene altas cargas negativas dadas por los grupos fosfatos constituyentes de los nucleótidos. La carga negativa de la molécula de ADN es neutralizada por Na+ en la solución. El uso de NaCl ayuda entonces a mantener estable a la molécula de ADN para que no pierda su estructura. El agua interactua con ambos de manera que la sal y el ADN permaneces solubles. Por otro lado, esta neutralización permitirá que el ADN precipite con el agregado de alcohol. El alcohol frio hace que el ADN precipite ya que a diferencia del agua, permite que los iones positivos de la sal se acerquen más a las cargas negativas del ADN y lo neutralicen. Al perder sus cargas, las moléculas de ADN no pueden permanecer en solución y precipitan en la interfase entre el alcohol y el agua

Materiales• Multiprocesadora • Bananas• Agua• NaCl o Sal de mesa • Detergente o shampoo• Algodón• Alcohol 95% frio

Procedimiento

a) Procesar con una minipimer ¼ de banana cortada en rodajas con unos 5-10 ml de agua. Procesar hasta obtener un puré homogéneo. Tomar un alícuota de este puré y pasarlo a un vaso de precipitados.

b) Agregar una cucharadita de detergente líquido y una cucharadita de NaCl o sal de mesa.

c) Disolver el detergente y la sal revolviendo lentamente sin formar espuma. Dejar reposar por 5-10 minutos

d) Usando un embudo y algodón humedecido, filtrar la mezcla banana-agua-shampoo-sal




e) Recogemos el filtrado en un tubo con alcohol 95% frio. Durante todo el tiempo mantenemos el filtrado bien frío (colocar el tubo en un cubo con hielo)

f) El ADN neutralizado precipita en el alcohol frio. Se observa como un precipitado viscoso blanquecino.

g) Introducir una varilla y removerla hacia adelante y hacia atrás y poco a poco se irán enrollando los fragmentos de mayor tamaño de ADN. Pasado un minuto retirar la varilla atravesando la capa de alcohol con lo cual el ADN quedará adherido a su extremo con el aspecto de un copo de algodón mojado.

h) Graficar y describir lo observado

Electroforesis en gel de agarosa

La electroforesis es una técnica muy utilizada para separar moléculas de acuerdo a su diferente movilidad en un campo eléctrico. Básicamente la velocidad con la que se mueve un electrolito es proporcional a la relación carga/masa. El ADN tiene como ya se ha señalado, una fuerte carga negativa, por lo que si se lo somete a un campo eléctrico, migra hacia el ánodo. Sin embargo, la relación carga/masa se mantiene constante, pues cada unidad monomérica que se agrega aporta la misma carga y masa, sin modificar así la relación. Con el objetivo de separar moléculas de ADN de distinto tamaño, es necesario introducir en el medio una malla (gel) que impida la difusión libre de las moléculas. De este modo, los fragmentos de ADN de mayor tamaño, serán efectivamente retenidos en relación a aquéllos más pequeños, consiguiendo así resolver una mezcla heterogénea de fragmentos de acuerdo sólo al tamaño de los mismos. Los geles se comportan entonces como un tamiz molecular y permiten separar moléculas cargadas en función de su tamaño y forma. Así, moléculas de ADN de diferente tamaño van a emigrar de forma distinta en una electroforesis en gel de agarosa. La agarosa es un polímero lineal extraído de un alga marina. Mediante concentraciones variables de agarosa, se pueden separar fragmentos de ADN desde 200 hasta aproximadamente 500kb de longitud. Este tipo de geles usualmente se corren en configuración horizontal, en un campo eléctrico de fuerza y dirección constante. La agarosa forma una matriz, cuya densidad está determinada por la concentración misma de la agarosa. Cuando se aplica un campo eléctrico a través del gel, el ADN, cargado negativamente a pH neutro, migra hacia el ánodo. Para visualizar el ADN utilizamos un compuesto aromático, el bromuro de etidio, que intercalándose entre las bases nitrogenadas de los pares de nucleótidos, produce una concentración alta localizada en forma proporcional a la masa de ADN presente en cada banda. De esta manera, cuando iluminamos el gel con luz UV, ésta excita las moléculas de colorante emitiendo luz visible. Dado que el colorante se ha concentrado en las bandas que contienen ADN, el fondo de luz en el resto del gel es despreciable, y el método es de gran sensibilidad.




Objetivo

En esta práctica, se pretende que el alumno comprenda el fundamento teórico de esta técnica y sus aplicaciones. Los docentes llevaran a cabo la separación electroforética en gel de agarosa de ADN que el alumno va a aislar y purificar a partir de banana. Preparación del gel de agarosa (Esta actividad la realizan los docentes por razones de Seguridad)

- 30 ml del buffer de electroforesis TBE y 0,21 g de agarosa (0,7 %).- Se funde la solución de agarosa en un microondas o placa calefactora.- Se deja enfriar la suspensión hasta que alcance unos

50ºCaproximadamente.- Se coloca el peine que servirá para formar los pocillos del gel en el

soporte- Una vez que la solución de agarosa ha alcanzado los 50ºC, se le añaden

2 µL de bromuro de etidio (10 mg/ml) y se mezcla bien. ¡MANIPULAR CON GUANTES!

- Se vierte la solución de agarosa con bromuro de etidio en el soporte, previamente sellado. Se deja polimerizar durante unos 30 minutos.

Electroforesis

- Colocar el soporte del gel en la cubeta de electroforesis. ¡¡OJO!!: Los pocillos deben de estar cerca del cátodo (polo negativo, color negro).

- Se añade buffer de electroforesis TBE, de forma que cubra bien el gel de agarosa.

- Se aplican o “siembran” 10 µl de la muestra preparada (con buffer de siembra) en los pocillos (en paralelo se siembra un Marcador de peso molecular)

- Se tapa la cubeta de electroforesis y se conectan los electrodos a la fuente de alimentación. Se comprueba que está bien conectada.

- Se programa la fuente a unos 100 voltios y se comienza a correr la electroforesis que durará unos 30-45 minutos.

- Una vez acabada la electroforesis se visualizan los fragmentos de DNA mediante luz UV y se realiza una fotografía de la imagen.

Buffer Tris-borato (TBE)Solución de trabajo: 0.5X: 0.045M Trisborato 0.001M EDTASolución stock: 5X: 54g Tris base 27.5g ac. Bórico 20ml 0.5M EDTA (Ph 8.0)

Esquema


Soporte o molde



2. Reconocimiento de lípidos

A diferencia de los carbohidratos y proteínas, los lípidos tienen diversas estructuras y funciones, pero sus características de solubilidad son semejantes entre ellos. Se definen operacionalmente como compuestos orgánicos insolubles en agua o ligeramente solubles, que se encuentran en los sistemas biológicos. Los lípidos son hidrofóbicos (no polares) y/o anfipáticos (que tienen componentes polares y no polares).

Test para la detección de lípidos

Sudán III es un colorante soluble en grasa (liposoluble) que permite identificar la presencia de lípidos; el cual pertenece al grupo de colorantes indiferentes, que son aquellos que no tienen afinidad por estructuras ácidas o básicas. El colorante (rojo) es insoluble en el agua En el siguiente cuadro se describen las actividades a desarrollar para la determinación en muestras biológicas que contienen lípidos del tipo ácidos grasos.

Determinación de lípidos

Materiales y procedimientos

1 2 3 4

Agua de canilla (ml) 5 4 4Aceite de girasol ( ml) 5Homogeneizado de músculo de pescado (ml)

1

Homogeneizado de hamburguesa de carne (ml)

1

Sudán III (gotas) 4 4 4 4Agitar vigorosamente los tubos y dejar en reposo 5 minutos

x x x x

Registrar lo observado (+/-)

Los homogeneizados de músculo de pescado y hamburguesa de carne se realizan cortando pequeños trozos de cada material con bisturí y se pisan en mortero con pisón en 2 ml de agua de canilla cada muestra

Cuestionario1. ¿Qué tipos de riesgo acarrea la manipulación del bromuro de etidio?


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