tesis versión final isaac 06 febrero07
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INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
ESCUELA NACIONAL DE MEDICINA Y
HOMEOPATÍA
SECCIÓN DE ESTUDIOS DE POSGRADO E INVESTIGACIÓN
Programa Institucional en Biomedicina Molecular
Efecto de la L-DOPA sobre la activación y respuesta funcional de receptores dopaminérgicos del tipo
D2 en el globo pálido de ratas con Parkinson Experimental.
TESIS
Que para obtener el grado de Doctor en Ciencias en Biomedicina Molecular presenta el M. en C.
Carlos Isaac Silva Barrón
México, D. F. 2007
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Para la realización de esta tesis doctoral se contó con el apoyo del Consejo de Ciencia y Tecnología (CONACYT) a través del respaldo económico a los proyectos de investigación 38518-N y 50428-M.
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AGRADECIMIENTOS
• Agradezco al Dr. Benjamín Florán Garduño su apoyo incondicional y sobre todo por brindarme su generosa amistad en todo momento.
• Agradezco a los Drs. Jorge Aceves Ruiz y Benjamín Florán Garduño, el haberme abierto las puertas de sus laboratorios en el Departamento de Fisiología Biofísica y Neurociencias del Centro de Investigación y de Estudios avanzados del Instituto Politécnico Nacional, para la realización de esta tesis doctoral.
• Agradezco al Programa Institucional de Biomedicina Molecular del Instituto Politécnico Nacional el haberme aceptado para la realización de este proyecto.
• Agradezco su amistad y constante apoyo a todos los compañeros de posgrado (Brenda González, Claudia Rangel, Erick Escartín, Cesar Nava y al personal técnico de los laboratorios 4 y 13 (Leonor Florán, Alejandro Nuñez Arturo Sierra) del Departamento de Fisiología Biofísica y Neurociencias del Centro de Investigación y de Estudios avanzados del Instituto Politécnico Nacional.
• Agradezco al Dr. Guillermo Pérez Ishiwuara haber aceptado fungir como codirector de la presente tesis y a los Drs. Jorge Aceves Ruiz, Juan Santiago Salas Benito y Absalón Zamorano Carrillo el haberla revisado exhaustivamente, lo cual enriqueció notablemente el contenido de la misma.
• Agradezco a mi familia su paciencia, en especial el constate apoyo de Diana mi compañera de vida, de su hija Harumi y de mis hijos Karla, Ixchel, Mauricio y Ulises.
• Finalmente y como homenaje póstumo dedico el presente trabajo a mis padres Sara Barrón de Silva y Joaquín Silva Ledesma, quienes estoy seguro se sentirían orgullosos de estar presentes.
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ÍNDICE
TEMA PÁGINA 1. Introducción
a. La enfermedad de Parkinson b. Los efectos de la L-DOPA en la
terapia de la enfermedad de Parkinson.
c. Los Ganglios Basales y la dopamina d. Organización básica del circuito
ganglios basales-tálamo-corteza cerebral
e. Los ganglios basales y el control motor
f. Los ganglios basales y la dopamina
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2. Planteamiento del Problema
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3. Hipótesis
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4. Objetivos
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5. Estrategia Experimental
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6. Metodología a. Degeneración de las neuronas
dopaminérgicas de la pars compacta b. Protocolo de tratamiento crónico
con L-DOPA c. Experimentos de conducta de giro d. Experimentos para medir la
liberación de GABA radioactivo e. Experimentos para estudiar la
participación de la L-DOPA sobre receptores dopaminérgicos del tipo D2
f. Experimentos para estudiar la formación de dopamina a partir de L-DOPA
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6. Resultados Experimentales a. Síntesis de dopamina a partir de L-
DOPA en el globo pálido b. Efecto de la L-DOPA sobre la
liberación de GABA en el globo pálido de ratas hemiparkinsónicas
c. Efecto de la dopamina formada a partir de L-DOPA en el Globo Pálido sobre la liberación de GABA de ratas hemiparkinsónicas
d. Cambios en la actividad locomotora mediados por L-DOPA a través de activación de receptores D2
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e. Supersensibilidad conductual de los receptores a dopamina por el tratamiento con L-DOPA
f. Efecto del tratamiento con L-DOPA, sobre la sensibilidad de los receptores D2 del globo pálido.
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7. Discusión a. La activación de receptores
dopaminérgicos del tipo D2 por L-DOPA
b. El efecto del tratamiento crónico con L-DOPA en los receptores D2
c. La L-DOPA, los receptores a dopamina y las discinesias
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8. Conclusiones 59 9. Referencias Bibliográficas 60
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RESUMEN
A pesar de que han transcurrido casi dos siglos desde la descripción inicial de la Enfermedad de Parkinson, hasta el momento aun no es posible alcanzar su curación. Sabemos que es una enfermedad neurodegenerativa que paulatinamente va disminuyendo la cantidad de neuronas dopaminérgicas en una región cerebral conocida como parte compacta de la sustancia negra, lo cual se traduce en una reducción en la síntesis y liberación de dopamina en el circuito de los ganglios basales, ocasionando los síntomas clásicos de ese mal. Una de las alternativos clínicas que se plantearon a mediados del siglo pasado y que aun sigue siendo la más empleada hasta nuestros días, fue la de utilizar a la L-DOPA como medicamento en el mal de Parkinson, una vez que se le caracterizó como el precursor inmediato en la síntesis bioquímica de la dopamina. Sin embargo, la aplicación terapéutica de L-DOPA en tratamientos crónicos, manifestó alteraciones motoras secundarias conocidas como discinecias y/o distonías. Se sabe muy poco acerca de la etiología de estas últimas, motivo por el cual el objetivo central de este trabajo consistió en explorar los posibles mecanismos de acción que la L-DOPA ejerce sobre receptores dopaminérgicos del tipo D2 en la vía indirecta del circuito de los ganglios basales, explorando de manera más particular su influencia sobre el globo pálido, que es uno de los componentes distintivos de dicha vía y que muy probablemente esta involucrado en la generación de estos síntomas secundarios. Los resultados obtenidos en este proyecto, utilizando ratas de laboratorio a las cuales se les ha inducido el Parkinson experimentalmente, han aportado evidencias que indican que la L-DOPA activa los receptores dopaminérgicos del tipo D2 de manera directa, comportándose como un agonista farmacológico de estos receptores. De la misma manera, nos sugieren que durante el tratamiento crónico con L-DOPA se incrementa aún más la supersibilidad de los receptores dopaminérgicos del tipo D2 en el Parkinson experimental. Los resultados de este proyecto fueron publicados el año pasado en la revista internacional con arbitraje titulada Journal of Neural Transmission y presentados en varios congresos internacionales de neurociencias y de ciencias fisiológicas, así como en diferentes foros de divulgación científica. El financiamiento para este trabajo provino de losl proyectos 38518-N y 50428-M otorgado por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología.
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ABSTRACT
The Parkinson disease was described around two centuries ago. Despite the efforts made the problem has not been solved. We know that Parkinson disease is a neurodegenerative process produce by death of the dopaminergic neurons in the mesencephalon sustantia nigra pars compacta. This situation translates in a lower synthesis and release of dopamine within basal ganglia circuitry; and makes evident classical symptoms of this disease. The therapeutic treatment was development in the middle of last century and is the most used until our days: that is the use of L-DOP. Originally it was characterized as a metabolic precursor in the dopamine synthesis. However the chronic therapeutic use of L-DOPA gives other motor alterations called discinecia and/or dystonia. The ethiology of the last symptoms is not known. The main reason for propose L-dopa as the central objective of this research was to explore the process related whit the L-DOPA action on dopaminergic D2 receptors in the indirect pathway of basal ganglia circuit, insight more particularly the relationship on globus pallidus because it is a distinctive region of this via, and probability is related with the arise of secondary symptoms. The information obtained in this research was obtained in experimental parkinsonic rats and give evidences of the direct action of L-DOPA on dopaminergic receptors, in a similar way of the pharmacological agonists for this type of receptors. Data obtained with chronic therapeutic application suggests a supersensibility of the dopaminergic receptors type D2 in experimental Parkinson. The results of this research was published last year in the international Journal of Neural Transmission and exposed in several national and international meetings of neurosciences and the physiological sciences. The financial support for this work was made for CONACyT in the projects 38518-N and 50428-M
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INTRODUCCIÓN
La enfermedad de Parkinson La enfermedad de Parkinson (EP) representa uno de los principales
padecimientos neurodegenerativos de la clínica médica moderna, fué descrita por
primera vez en 1817 por James Parkinson, médico inglés de quien toma el
nombre. Afecta a las estructuras del cerebro relacionadas con el control y la
coordinación del movimiento, así como las del mantenimiento del tono muscular y
de la postura. No tiene distinciones de raza o sexo y se presenta en personas de
edad avanzada en todos los lugares del mundo. La frecuencia con la que se
proyecta el también llamado “mal de Parkinson” sobre la población en general es
de 1 en 400 habitantes, con una incidencia de 1 en 200 después de los 40 años de
edad, y se ha sugerido que la edad promedio para el comienzo de los síntomas se
halla entre los 55±11 años. En los Estados Unidos de Norteamérica
aproximadamente 1 millón de personas sufren de este padecimiento y cada año
son pronosticados alrededor de 60,000 nuevos casos, con un costo social
estimado en 22 mil millones de dólares por año (Obeso et al., 2000). Por lo que
respecta a México, aunque no tenemos estadísticas precisas, en base a las
estimaciones anteriores y tomando como referencia los resultados del último
censo poblacional (INEGI 2000) en donde el 22.7 % de la población total en
nuestro país se encuentra por arriba de los 40 años de edad y un 13.83 %
alcanzará dicha edad dentro de los próximos 10 años, parece muy probable que
la enfermedad de Parkinson se observe cada vez con mayor frecuencia en nuestro
país, ya que las tendencias de incidencia nos daría en este momento una
población potencial de 144,385.47 enfermos. Si consideramos el incremento en la
esperanza de vida de la población en general y le sumamos el aumento mundial
que han tenido la enfermedad de Alzheimer y la de Parkinson, podemos predecir
que las enfermedades neurodegenerativas ocuparán un lugar importante como
causa de morbilidad a mediano plazo.
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A pesar de que se han intentado usar diversas alternativas para tratar a los
enfermos de Parkinson, las cuales han ido desde el uso de fármacos precursores
de la dopamina, hasta la aplicación de trasplantes de tejidos capaces de sintetizar
dopamina o la utilización de células con potencialidad para diferenciarse en forma
de nuevas neuronas, se ha considerado que una terapia racional para tratar la
enfermedad de Parkinson debe estar basada en la comprensión de la acción de la
dopamina en la fisiología de los ganglios basales y sólo de esta manera puede ser
exitosa. La enfermedad ocurre cuando las neuronas de la parte compacta de la
sustancia negra (SNc) degeneran, lo que trae consigo una caída importante en la
concentración de dopamina en los ganglios basales. Sus síntomas principales son
la acinesia, la rigidez muscular y el temblor (Woooten y Trugman, 1989). Dado que
las conexiones de neuronas que se han sugerido se establecen dentro de los
circuitos neuronales que involucran a los ganglios basales, el tálamo y la corteza
cerebral para el control del movimiento, participan el globo pálido (GP) la sustancia
nigra reticulata (SNr) y el núcleo subtalámico (NST) (Alexander y Crutcher, 1990),
resulta importante entender las acciones de la dopamina en estos núcleos y sobre
todo en los núcleos de proyección del estriado (GP y SNr). Estudiar la
modificación funcional que existe en estas regiones cerebrales al generarse el
Parkinson en humanos o de manera experimental en animales de laboratorio,
permitirá entender las terapéuticas actuales, mejorarlas y/o proponer nuevas
estrategias racionales para los pacientes.
El presente trabajo de tesis profundiza en los mecanismos de acción
terapéutica de la L-DOPA, fármaco común y mayormente empleado en el
tratamiento de la enfermedad. El objetivo general consiste en contribuir al
esclarecimiento de sus efectos terapéuticos que permitan sugerir su mejoría, o
bien sirvan de base a nuevos intentos basados en una mejor comprensión de sus
mecanismos de acción.
Los efectos de la L-DOPA en la terapia de la enfermedad de Parkinson
Hallazgos Iniciales. Dos descubrimientos fundamentales para entender la
fisiopatología de la enfermedad de Parkinson fueron realizados a finales de la
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década de los cincuentas. El primero de ellos consistió en estudios post-mortem
en los que se demostró que dicha enfermedad se debía a una deficiencia en
dopamina (Ehringer and Hornykiewicz, 1960), mientras que el otro hallazgo
experimental demostró que el estado de acinesia inducido por una deficiencia en
dopamina inducida en roedores mediante el tratamiento con reserpina, podría ser
revertido mediante el uso de L-3,4-dihidroxifenilalanina (L-DOPA), el aminoácido
precursor de dopamina (Carlsson et al.,1957). Estos resultados fueron
rápidamente extrapolados hacia el humano y fue así como surgió la era de la
terapia del reemplazo de dopamina con L-DOPA. Estas evidencias, aunadas al
desarrollo de herramientas bioquímicas para determinar la participación de
enzimas en diferentes rutas metabólicas, conforman lo que actualmente
conocemos como la vía biosintética de las catecolaminas (entre las que se
encuentra la dopamina), lo cual se ha integrado en la figura 1.
Fig. 1. Representación esquemática de la síntesis de catecolaminas a partir de tirosina. Las neuronas dopaminérgicas no poseen dopamina beta hidroxilasa, por ello la actividad sintética termina solo a nivel de dopamina. El reemplazo de L-DOPA se basa en el concepto de que la L-DOPA es incorporada a las terminales sinápticas y ahí es convertida a dopamina por efecto de la AADC (descarboxilasa de los aminoácidos aromáticos). En el mismo esquema se muestra el catabolismo de la L-DOPA por acción de la COMT (transferasa del grupo catecol)
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La acción restauradora de la L-DOPA. La L-DOPA aún sigue siendo el
fármaco más empleado para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson.
Cuando se administra al organismo, es transportada activamente a través de la
barrera hematoencefálica y se asume que en el cerebro es descarboxilada en el
interior de las neuronas dopaminérgicas que aun sobreviven o cualquier neurona
que contenga la AADC, siendo liberada como dopamina para interactuar con los
receptores dopaminérgicos de la familia D1 y D2 que controlan el movimiento
(Hornykiewicz, 2002). Así la L-DOPA que es convertida a dopamina suple la
deficiencia de dopamina que ocurre en la enfermedad (Hefti et al., 1981). En
apoyo a esta explicación se tienen evidencias de que la L-DOPA eleva los niveles
cerebrales de dopamina (Hornykiewicz, 1974. Lloyd et al.,1975) y promueve la
actividad locomotora mediante una acción central (Butcher y Engel, 1969.
Trugman et al., 1991). Sin embargo, después de que se administra L-DOPA por
alrededor de 5 años a un enfermo de Parkinson, la mayoría de los pacientes
muestran una disminución de la actividad motora y lo que es más grave
movimientos involuntarios denominados discinesias. Esta disminución en la
eficacia clínica de la L-DOPA, es generalmente atribuida a la naturaleza
progresiva de la enfermedad por sí misma, considerándose que las neuronas
remanentes son insuficientes para mantener niveles sinápticos adecuados de
dopamina (Whone et al., 2003), sin embargo como veremos más adelante otros
efectos de la L-DOPA pudieran ser los responsables de tales síntomas.
La acción directa de la L-DOPA. El “reemplazo” de la dopamina no
parece ser suficiente para detener la muerte neuronal. Estudios de resonancia
magnética nuclear indican que la L-DOPA no detiene el proceso degenerativo,
pues a pesar de la terapia, el número de neuronas de la sustancia negra compacta
continúa disminuyendo (Whone et al., 2003). En consecuencia, si bien la L-DOPA
restaura la función, no es capaz de prevenir la muerte neuronal, una vez que se ha
iniciado el proceso degenerativo.
La aparición de efectos colaterales y secundarios en la terapia con L-DOPA
representa un problema para el entendimiento de los efectos benéficos de la L-
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DOPA por reemplazo en la enfermedad de Parkinson. ¿Como es posible que la
dopamina proveniente del reemplazo produzca los efectos secundarios
(particularmente la discinecia)? ¿Es la L-DOPA o la dopamina la responsable de
ellos?
Determinaciones de los efectos del tratamiento con L-DOPA sobre
diferentes parámetros funcionales en Parkinson Experimental, como lo es la
expresión de genes tempranos, la actividad motora, la actividad de las neuronas
estriatales etc. (Chartoff et al., 2001; Gerfen et al 1990); muestran que existe
supersensibilidad funcional producida por la denervación o la muerte de las
neuronas dopaminérgicas y que esta parece incrementarse con el tratamiento con
L-DOPA (supersensibilidad). La supersensibilidad se ha mostrado claramente
asociada a los receptores de la familia D1 (Chartoff et al., 2001; Gerfen et al
1990). Esto quiere decir que la terapia con L-DOPA incrementa aún más el
proceso de hipersensibilidad que la muerte neuronal inició, lo que es difícil
concebir que fuera provocado por la dopamina formada. En el modelo funcional
propuesto por Penney y Young (1983) para explicar la fisiopatología del Parkinson
y que describimos más adelante, los movimientos involuntarios exagerados
observados en extremidades, cara y cuello denominados discinéticos, podrían en
parte explicarse por sobreactividad del circuito neuronal conocido como la vía
directa y, al cual están directamente asociados los receptores de la familia D1
(Gerfen et al 1990, Aubert, 2005). Nuestro grupo de trabajo considera que en este
proceso no sólo deben estar involucrados los receptores dopaminérgicos del tipo
D1 sino también los del tipo D2, ya que sólo la coactivación de ambos receptores
puede producir el movimiento normal (Weick and Watters, 1987; Pollack 2004). El
estado que guarda la sensibilidad y respuesta funcional de los receptores tipo D2
en el tratamiento con L-DOPA ha sido poco estudiado. La sobreactivación que
produce la falta de dopamina en la vía indirecta, a la cual están asociados los
receptores dopaminérgicos del tipo D2, sugiere que también podrían estar
asociados al fenómeno discinético. En esencia un movimiento exagerado sin
control adecuado es considerado con un fenómeno discinético. Para tratar de
explicar la relación entre la discinesia y la L-DOPA, es necesario saber cual es la
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participación de la L-DOPA en procesos neuronales donde se le atribuye un efecto
directo, algunos de los cuales describiremos a continuación.
De la aparición de discinesias surge la idea de aclarar si la L-DOPA, tiene
efectos sobre los receptores a dopamina, es decir si es capaz de activarlos
directamente y tener una consecuencia funcional. Se ha reportado en estudios de
farmacocinética que existe una correlación directa entre elevadas concentraciones
plasmáticas de L-DOPA y la aparición de las discinesias, es de notar que los
efectos motores inducidos por la administración de L-DOPA no sólo se observan
en modelos de parkinson experimental, sino también en animales intactos (Pearce
et al., 2001). Esto sugiere que los efectos adversos de la L-DOPA pudieran no
solo depender de la hipersensibilidad de los receptores a dopamina producidos
por la muerte de las neuronas dopaminérgicas, sino también por efectos
farmacológicos directos.
Diferentes estudios han reportado efectos de la L-DOPA por si misma
(Aceves et al., 1991; Nakazato y Akiyama, 1989; Nakamura et al.,1994; Yue et al.,
1994; Fisher et al., 2000) y existen dos maneras de explicarlos, las dos coinciden
en que la L-DOPA tiene efectos per se, pero a través de mecanismos diferentes
(ver figura 2).
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Fig 2. Representación esquemática de los posibles efectos farmacológicos de la L-DOPA. El
primero se basa en los efectos mediados por su conversión a dopamina y activación de receptores
D1 y D2 de acuerdo a la hipótesis del reemplazo, mientras que el segundo involucra la activación
directa de receptores D1 o D2 ó receptores a la propia L-DOPA (receptor DOPAérgico)..
La primera hipótesis sugiere que L-DOPA es un neuromodulador y/o
neurotransmisor. Esta idea se inicia con trabajos como los de Goshima en 1991,
en los que mostró que la L-DOPA inhibe la liberación de dopamina y facilita la de
noradrenalina vía la activación de receptores D2 y β-adrenérgicos,
respectivamente. Estos efectos no son bloqueados por la inactivación de la
descarboxilasa de los aminoácidos aromáticos (AADC), la enzima que produce la
conversión de L-DOPA a dopamina, ni mimetizados por sus metabolitos.
Evidencias más recientes han llevado a proponer la existencia de un sistema
DOPAérgico, las cuales se basan en el cumplimiento de varios de los criterios
señalados para que un compuesto sea considerado como neurotransmisor, entre
ellos están: síntesis, metabolismo, transporte activo y liberación inducida
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farmacológica o fisiológicamente (Misu et al., 1996, 2002). El principal sitio donde
este sistema pudiera existir es el núcleo del tracto solitario (Yue et al., 1994-b),
región en la que se ha mostrado por inmunohistoquímica la presencia de neuronas
tirosina-hidroxilasa positivas (enzima que convierte el aminoácido L-tirosina en L-
DOPA), L-DOPA positivas y AADC negativas (Misu et al., 1996). También se ha
reportado que en el hipocampo, en el estriado y en la médula espinal, la
estimulación eléctrica produce liberación de L-DOPA. La primera función atribuible
a este sistema es el control del reflejo baroreceptor. En la revisión de Misu y
colaboradores del 2002, estos efectos están ampliamente discutidos. La hipótesis
tiene dos problemas, uno es que la evidencia clara del receptor DOPAérgico no
existe ni por estudios de receptor-ligando específicos, ni por estudios de clonación.
Por otro lado, habría que explicar como pueden surgir efectos colaterales a la
administración de L-DOPA como las discinesias, tratándose de un sistema
funcional. Mayores estudios deberán hacerse al respecto.
En una segunda hipótesis, los efectos de la administración de L-DOPA son
atribuidos a la activación directa de los receptores dopaminérgicos. Estudios
farmacológicos en presencia de inhibidores de la AADC, han mostrado efectos
directos de la L-DOPA mediados por la activación de los receptores D1 (Aceves et
al., 1991), así como D2 en ratas normales (Yue et al., 1994) y tratadas con
reserpina (Fisher et al., 2000). A este respecto, tampoco existe evidencia directa
de estudios de unión receptor-ligando específico.
La L-DOPA y las discinesias. En la enfermedad de Parkinson la discinesia
llega a ser tan intensa que obliga a la suspensión del tratamiento del enfermo con
L-DOPA y se piensa que de no ser por ello la L-DOPA sería el tratamiento ideal.
Una hipótesis sobre la generación de las discinesias, sugiere hiperactividad de la
vía directa de los ganglios basales a la cual están asociados los receptores D1
(Aubert, 2005). Los receptores D1 al ser activados de manera normal producen
hiperactividad y conducta estereotipada, ésta actividad sobre estimulada es
catalogada como una discinesia (O´sullivan et al., 2004). Consecuentemente,
podría suponerse que la L-DOPA generaría las discinesias activando los
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receptores D1 de manera directa y/o incrementando su hipersensibilidad
provocada por la denervación dopaminérgica. Apoyando esta hipótesis datos de
nuestro laboratorio no publicados aún, han mostrado que el tratamiento con L-
DOPA en ratas con denervación dopaminérgica incrementa aún mas la
hipersensibilidad del receptor D1 presináptico de las terminales estriado-nigrales.
También hallazgos como los de Aceves y colaboradores (1991), Nakazato y
Akiyama (2002) han mostrado que en ratas lesionadas del sistema dopaminérgico
con 6-hidroxidopamina, la L-DOPA y su metabolito la 3-metoxitiramina (3-MT),
activan a los receptores D1/D5 de manera directa, cumpliendo así con uno de los
requisitos para la generación de las discinesias; superestimulación de los
receptores a dopamina.
La participación de los receptores D2 en la discinesia inducida por L-DOPA
no ha sido adecuadamente estudiada. Movimientos estereotipados como la
masticación en vació (chewing) se han asociado a actividad de receptores de esta
familia, y tanto en humanos como en animales con parkinson experimental este
movimiento es uno de los signos que sirve de guía para el diagnostico de
discinesia inducida por fármacos (Tomiyama, 2004; Turrone et al., 2003).
Movimientos oro-faciales similares a la discinesia se han producido en ratas al
administrar antagonistas de receptores GABAérgicos en el globo pálido, la
activación de los receptores D2 en el GP provoca una disminución de la liberación
de GABA y podrían de esta manera contribuir a las discinesias (Floran et al.,
1997). Como veremos mas adelante los receptores D2 se asocian a la vía
indirecta del control motor de los ganglios basales. Sin embargo los efectos de la
L-DOPA activando directamente los receptores D2 de la vía no se han estudiado y
menos aún en Parkinson experimental. Por otra parte tampoco se conoce cual es
el efecto del tratamiento con L-DOPA sobre la sensibilidad y respuesta funcional
resultado de la actividad de receptores D2 de la vía indirecta, con la idea de ver si
existe supersensibilidad funcional o sobrecompensación que contribuyera al
proceso discinético. Continuar investigando al respecto es sumamente importante
para entender las acciones farmacológicas de la L-DOPA y la generación de las
discinesias como tal.
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Los Ganglios Basales y la dopamina
Los conceptos sobre organización morfo-funcional de los ganglios basales
han cambiado drásticamente en las dos últimas décadas, debido en gran medida a
los significativos avances en la comprensión de la anatomía, fisiología,
farmacología y biología molecular de esas estructuras (Obeso et al., 2006).
Evidencias independientes de cada una de esas disciplinas ha reforzado y
aumentado la percepción de que la arquitectura funcional de los ganglios basales
es esencialmente paralela. Esto representa una separación significativa de los
conceptos iniciales atribuidos a entender la organización de los ganglios basales,
los que generalmente enfatizaban una conectividad en serie (Alexander y
Crutcher, 1990). Evidencias actuales sugieren que los ganglios basales están
organizados en diversos circuitos que estructural y funcionalmente unen la corteza
cerebral, ganglios basales y tálamo con circuitos en diferentes regiones del lóbulo
frontal (Alexander y Crutcher, 1990).
Gracias a la organización anatómica característica de los ganglios basales,
prevaleció la opinión de que ellos servían esencialmente para integrar influencias
convergentes provenientes de las áreas corticales de asociación y sensoriales-
motoras hacia zonas talámicas comunes. También era ampliamente aceptado que
las zonas receptoras de los ganglios basales dentro del tálamo ventrolateral
recibían conexiones ascendentes provenientes del cerebelo y retornaban sus
propias proyecciones exclusivamente hacia la corteza motora primaria. (Alexander
and Crutcher, 1990). Sin embargo, hallazgos recientes han aportado variantes
para esos puntos de vista iniciales. No solo se ha demostrado que los ganglios
basales y las proyecciones cerebelosas se dirigen hacia zonas completamente
separadas dentro del tálamo ventrolateral, sino que hay también considerables
evidencias de que las conexiones provenientes de las regiones corticales de
asociación y sensorial motoras permanecen segregadas a través de vías
retroalimentadoras parcialmente cerradas que unen la corteza, los ganglios
basales y el tálamo. Más aún, la salida combinada de esos circuitos se ha
encontrado que proyecta no solamente a la corteza primaria motora, sino
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virtualmente a todo el lóbulo frontal. Además evidencias comprobables, sugieren
que existen al menos cinco circuitos ganglios basales-tálamo corticales
organizados en paralelo y grandemente segregados unos de otros con salidas a
diferentes partes del lóbulo frontal. De acuerdo a esta organización, los ganglios
basales parecen ser capaces de participar en diversas funciones, incluyendo las
esquelético motoras, oculomotoras, cognitivas y límbicas. (Alexander y Crutcher,
1990).
Organización básica del circuito ganglios basales-tálamo-corteza cerebral
Las siguientes son características generales que compartiría cualquiera de
los circuitos ganglios basales-tálamo-corteza cerebral: áreas corticales específicas
envían proyecciones glutamatérgicas excitatorias hacia porciones selectivas del
estriado (constituido por el núcleo caudado, putamen y estriado ventral) y se
acepta que representa la vía de entrada de información de los ganglios basales.
(Penny y Young, 1983). En virtud de sus altas frecuencias de descarga
espontánea, los núcleos de salida de los ganglios basales (segmento interno del
globo pálido, sustancia nigra reticulada y pálido ventral) ejercen un efecto tónico
inhibitorio mediado por el ácido gamma amino butírico (GABA) sobre su núcleo
blanco situado en el tálamo. Dentro de cada circuito, éste flujo inhibitorio de salida
parece ser diferencialmente modulado por dos vías opuestas, pero paralelas, que
pasan del estriado a los núcleos de salida de los ganglios basales.
Cada circuito incluye una “vía directa” hacia los núcleos de salida, la cual
surge de eferentes inhibitorios estriatales (a través de neuronas espinosas
medianas) que usan GABA y Sustancia P. La activación de esta vía tiende a
desinhibir la región talámica del circuito. Cada circuito incluye también una “vía
indirecta”, la cual surge del segmento externo del globo pálido y que recibe
neuronas de proyección estriatal que contienen GABA y encefalinas, del globo
pálido la información pasa al núcleo subtalámico por una vía exclusivamente
GABAérgica para finalmente continuar hacia los núcleos de salida por una vía
glutamatérgica (figura 3). La activación de la vía directa facilita la actividad cortical,
en tanto que la activación de la vía indirecta la inhibe.
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Los ganglios basales y el control motor
Los ganglios básales relacionados exclusivamente con el control motor son
núcleos de la base del cerebro, particularmente regulan la iniciación, focalización y
fineza (tunning) de los movimientos coordinados (Dray, 1980). Los núcleos
involucrados incluyen el núcleo estriado (NE) (caudado y putamen), el globo pálido
interno (Gpi o núcleo entopedúncular en roedores: EPn), la sustancia negra (SN)
(en sus dos porciones la parte compacta y la reticulada) y el núcleo subtalámico
(STN). Estos núcleos se organizan como el resto de los circuitos cortico-ganglios
basales-talamo corticales básicamente en dos circuitos conocidos como vía
directa e indirecta, respectivamente, y cuya activación produce efectos opuestos
sobre el control del movimiento, al facilitar o bloquear la activación de la corteza
motora (Penny y Young, 1983).
La información fluye por los circuitos neurales, proveniente de la corteza al
núcleo estriado que se conoce como la estación de entrada. Su principal grupo de
neuronas pertenecientes al tipo espinosas medianas, se sabe son de dos tipos.
Las de la vía directa o facilitatoria que proyectan sus axones al globo pálido
interno y/o sustancia nigra parte reticulada (también conocidos como núcleos de
salida) que constituyen la vía estriado nigral. Las de la vía indirecta o inhibitoria
que proyectan al globo pálido externo (que junto con el subtálamo forman los
núcleos de relevo) y que a su vez proyectan a los núcleos de salida, constituyen la
vía estriado palidal. Las neuronas estriatales no sólo se diferencian entre sí por
sus sitios de proyección sino también por su neurotransmisor asociado y
receptores. Las neuronas estriado nigrales, usan GABA como neurotransmisor
principal y como co-neurotransmisor a la sustancia P, además de poseer
receptores para dopamina del tipo D1; las neuronas de la vía estriado palidal usan
GABA también pero asociado a encefálinas como co-neurotransmisor y tienen
receptores dopaminérgicos del tipo D2 (Gerfen et al., 1990). Los receptores
dopaminérgicos se localizan tanto en el soma como en las terminales de las
neuronas, es decir, son de localización somática y presináptica.
21
La activación de la vía directa produce facilitación de las conductas
motoras por desinhibición cortical. En el estado de quietud la actividad tónica del
núcleo subtalámico estimula a las neuronas GABAérgicas de los núcleos de salida
(GPi y/o SNr) las cuales inhiben al tálamo y este no estimula la corteza motora.
Durante la planeación del movimiento, la corteza motora estimula a las neuronas
de los núcleos de entrada (estriado), el cual activa la vía directa e indirecta. La
activación de la vía directa inhibe a las neuronas de los núcleos de salida con lo
que se desinhibe el tálamo y se activa la corteza. Por el contrario la activación de
la vía indirecta inhibe a las neuronas palidales, lo cual produce desinhibición de las
neuronas subtálamicas que a su vez estimulan las neuronas de los núcleos de
salida volviendo finalmente a inhibir la corteza motora y terminando la actividad de
la misma (Ver figura 3)
Figura 3. Representación esquemática de la vía indirecta y directa de los ganglios basales en el control motor. El color de la flecha indica los flujos de información en los diferentes núcleos. Las flechas negras indican inhibición mediada por transmisión GABAérgica, las blancas, excitatoria por glutamatérgicas y las grises indican las áreas de proyección dopaminérgica. GPe: globo pálido externo; NST: núcleo subtalámico; GPi globo pálido interno; SNr: sustancia nigra pars reticulada; SNc: sustancia nigra pars compacta.
Corteza Motora
Caudo-Putamen
GPe
NST
GPi/SNr
SNc
Tálamo
Vía directa
Vía indirecta
22
Los ganglios basales y la dopamina.
La mejor manera de entender la acción de la dopamina en la fisiología de
los ganglios basales es entender la fisiopatología de la enfermedad de Parkinson.
En la enfermedad de Parkinson ocurre una dificultad para la iniciación del
movimiento y su ejecución que se conoce como bradicinesia o acinesia en un
grado extremo. Esto llevado al circuito de los ganglios basales implica que la vía
directa facilitatoria del movimiento tiene una actividad disminuida y la vía indirecta
inhibitoria tiene una actividad incrementada (Obeso et al., 2006). Como la
enfermedad de Parkinson se debe a una pérdida de las neuronas dopaminérgicas
de la sustancia nigra en su pars compacta, se puede inferir que la dopamina
mantiene el balance de activación de la vía directa e indirecta en el nivel adecuado
para la coordinación de las conductas motoras. Para ello en el contexto del
modelo, se asume que la dopamina al activar los receptores D1 localizados en la
vía directa estimula el disparo neuronal y la liberación de GABA de las neuronas
estriado-nigrales en las que se encuentran los receptores, de esta manera se
refuerza la facilitación del movimiento (Obeso et al., 2006). Al activar los
receptores D2 de las neuronas estriado-palidales se refuerza la acción facilitadora
sobre la actividad cortical, de esta manera, la dopamina ejerce un control fino
sobre la activación de ambas vías que fija el nivel del movimiento. La figura 4
representa la actividad del circuito de los ganglios basales en la enfermedad de
Parkinson, tanto de su vía directa como de la indirecta.
23
Figura 4. Representación esquemática de las vías directa e indirecta de los ganglios basales, en la enfermedad de Parkinson. Las flechas adelgazadas y engrosadas respectivamente indican menor o mayor actividad de las vías, comparativamente.
Corteza Motora
Putamen
GPe
NST
GPi/SNr
SNc
Tálamo
Vía directa
Vía indirecta
24
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA.
La L-DOPA además de ser la mejor alternativa farmacológica para el
tratamiento de la enfermedad de Parkinson, representa en sí misma un paradigma
de la farmacología moderna, cuyo mecanismo de acción y efectos no están
adecuadamente dilucidados. La discinesia derivada de su uso crónico, representa
su principal problema. De entenderse los mecanismos que subyacen a ésta,
redundará, desde nuestro punto de vista, en un mejor abordaje farmacológico para
esta enfermedad.
Como vimos anteriormente, el fenómeno discinético parece estar asociado
a la sobrecompensación por L-DOPA de la actividad de la vía directa de los
ganglios basales sobre los receptores D1. La activación directa de estos
receptores por L-DOPA (Aceves et al., 1991), y el incremento de la
supersensibilidad de la vía por el fármaco, parecen ser los responsables de este
mecanismo (Aubert, 2005). Sin embargo poco se ha estudiado acerca de la
participación de los receptores D2 en los mecanismos de la discinesia y se
desconocen los efectos del tratamiento crónico con L-DOPA sobre la respuesta
funcional y la sensibilidad de estos receptores. Por ello en el presente trabajo
pretendemos contribuir a resolver básicamente dos preguntas: i) ¿es la L-DOPA
per se capaz de activar los receptores del tipo D2? y ii) ¿Cuál es el efecto del
tratamiento con L-DOPA sobre la sensibilidad y respuesta funcional resultado de la
activación de los receptores D2? Dado que los receptores D2 de los ganglios
basales se localizan en la vía indirecta, nuestro proyecto se encaminó al estudio
de los receptores del tipo D2 en el globo pálido por tres razones fundamentales.
Primera, porque el estriado representa una estructura que aunque contiene los
receptores D2 y el soma de las neuronas de la vía indirecta, también se
encuentran receptores D1 y las neuronas de la vía directa, lo que haría más
complejo el estudio y la interpretación de resultados, en cambio en el globo pálido,
los receptores D2 son presinápticos en donde refuerzan la activación de los
receptores somato-dendríticos, además de que nuestro grupo de trabajo ha
caracterizado el papel inhibitorio de estos receptores sobre la liberación de GABA
25
(Floran et al 1997), el principal neurotransmisor de la vía estriado-pálidal. En
segunda, nuestro grupo y otros más han considerado que de los principales
efectos que median la acción de la dopamina es el atribuido a receptores
presinápticos y en el globo pálido tienen esta localización y por último algunos de
los movimientos considerados como discinéticos como lo son la masticación en
vació, son generados por cambios de la actividad de las neuronas de este núcleo.
26
HIPÓTESIS
1. La L-DOPA es capaz de activar de manera directa los
receptores a dopamina del tipo D2 en el globo pálido e inhibir
la liberación de GABA.
2. El tratamiento con L-DOPA en Parkinson experimental
incrementa la supersensibilidad de los receptores a dopamina
del tipo D2 que ha producido la denervación dopaminérgica.
27
OBJETIVOS
1. Mostrar la activación de receptores dopaminérgicos del
tipo D2 por L-DOPA se realiza de manera directa (sin
necesidad de ser convertida a dopamina)
2. Estudiar si el tratamiento con L-DOPA supersensibiliza los
receptores dopaminérgicos del tipo D2 presentes en las
terminales estriado-nigrales.
28
ESTRATEGIA EXPERIMENTAL
Para cumplir con el primero de los objetivos planteados, nos propusimos
realizar estudios tendientes a probar el efecto directo que pudiera estar ejerciendo
la L-DOPA sobre la activación de receptores a dopamina del tipo D2 en el globo
pálido. Primeramente realizamos experimentos en donde se estudió la formación
de dopamina a partir de L-DOPA en rebanadas de dicho núcleo. Para ello, se
cuantificó la síntesis de dopamina a partir de L-DOPA en rebanadas normales y en
rebanadas denervadas de su aferencia dopaminérgica, siendo esta última
condición lo que constituye la base del Parkinson desarrollado en animal
experimental. En ratas macho de la cepa Wistar, el Parkinson se instaló mediante
la inyección estereotáxica de la toxina 6-hidroxidopamina (6-OHDA) en el haz
medial del cerebro. Este haz representa la zona del cerebro por donde discurren
los axones dopaminérgicos, la toxina al ser capturada en este sitio produce una
degeneración y muerte selectiva de las neuronas dopaminérgicas, produciendo un
hemiparkinsonismo en los dichos animales. Esto se pudo comprobar
conductualmente una semana después de la lesión, al analizar el nivel en la
conducta de giro que desarrollaron las ratas hemiparkinsonianas, lo cual nos
permitió la selección de animales para estudios neuroquímicos. Al mismo tiempo,
nos permitió mantener un hemisferio cerebral sin lesión que puede ser usado
como control. El estudio de la síntesis de dopamina se hizo exponiendo las
rebanadas a L-DOPA y luego determinando los contenidos de dopamina por
cromatografía líquida de alta presión.
Una vez determinado esto, nos propusimos estudiar el efecto de L-DOPA
sobre la liberación de GABA radioactivo en rebanadas de globo pálido,
comparando las rebanadas del lado control con las del lado denervado. Los
efectos de la L-DOPA se estudiaron en presencia de inhibidores de la
descarboxilasa de los aminoácidos aromáticos como el NSD 1015 (Dluzen et al
1992). Por ultimo, estudiamos si la L-DOPA produce cambios de actividad
locomotora mediados a través de activación directa de los receptores D2 por
29
medio del estudio de la conducta de giro en ratas denervadas en dos condiciones
experimentales: en presencia y ausencia de actividad de la descarboxilasa usando
inhibidores específicos como el NSD 1015 así como de bloqueadores de los
receptores D2.
La segunda pregunta acerca de que si el tratamiento con L-DOPA modifica
la sensibilidad y respuesta funcional de los receptores a dopamina del tipo D2 en
el globo pálido, fue abordada básicamente estudiando la inhibición de la liberación
de GABA radiactivo por receptores D2 en rebanadas provenientes de ratas
hemiparkinsónicas tratadas crónicamente con L-DOPA. En ellas realizamos
curvas de dosis respuesta para determinar los parámetros farmacológicos
resultado de la activación de estos receptores, como son la IC50 y la respuesta
inhibitoria máxima, ámbos indicadores de los cambios de sensibilidad del receptor.
30
METODOLOGÍA DEGENERACIÓN DE LAS NEURONAS DOPAMINERGICAS DE LA PARS COMPACTA Este procedimiento tiene por objeto inducir la degeneración del sistema
dopaminérgico nigro-estriatal por denervación química selectiva, lo que produce
un modelo de Parkinson Experimental. Los cerebros de las ratas así tratadas son
usados para experimentos de liberación de [3H]-GABA o síntesis de dopamina.
1. - Lesiones con 6-hidroxidopamina. Se seleccionaron ratas macho de la cepa
Wistar de 200 a 220 gramos de peso, las cuales fueron anestesiadas con hidrato
de cloral 400 mg/Kg de peso. Por estereotaxia se colocó 6-hidroxidopamina (8
µg/µl en solución salina isotónica y ácido ascórbico al 2%) a 1 mm lateral, 1 mm
posterior con respecto de la sutura de bregma y 7.1 mm de profundidad con
respecto de la duramadre (estas coordenadas han sido ya determinadas por
métodos de tinción histológica y corresponden al haz del cerebro medio por donde
corren los axones dopaminérgicos en dirección al estriado (ver Galván et al.,
2001). La velocidad de inyección fue de 1 µl por minuto y el volumen total fue de 1
µl.
2. - Evaluación de la lesión. Prueba de la apomorfina. Una semana después de la
lesión se inyectó apomorfina a la rata (0.5 mg /Kg, subcutáneamente) y se
determinó la cantidad de giros contralaterales que desarrolla el animal una hora
después de haber sido administrada dicho fármaco. El número de giros fue
proporcional al grado de degeneración inducida. Datos nuestros han mostrado que
más de 12 giros por minuto son indicativos de al menos una disminución en el
90% de la concentración de dopamina en el estriado ipsilateral, comparado con el
estriado intacto (Galvan et al., 2001).
31
PROTOCOLO DE TRATAMIENTO CRÓNICO CON L-DOPA. Este procedimiento tuvo por objeto simular la terapéutica de tratamiento con
L-DOPA en el Parkinson experimental logrado en el procedimiento anterior.
Administración de L-DOPA. Las ratas lesionadas con 6-hidroxidopamina
seleccionadas por la conducta de giro inducida con apomorfina, se dividieron en
dos grupos: experimental y testigo Al primero se le administró la droga, mientras
que al otro se le aplicó un vehículo. Los animales reciben benzerazida (15 mg/ Kg
de peso i.p.) para evitar la acción de la descarboxilasa periférica de la L-DOPA,
junto con 10 mg/ Kg de peso de L-DOPA metil ester por vía intraperitoneal. El
tratamiento se repitió cada día hasta observar un desarrollo de la hiperactividad
conductual y la aparición de discinesias, usualmente fue de 21 días (Cenci et al.,
1998).
EXPERIMENTOS DE CONDUCTA DE GIRO. Este protocolo tuvo por objeto estudiar la asimetría motora debida a los
cambios de sensibilidad que experimentan los receptores a dopamina por la
denervación o por el tratamiento con L-DOPA. De acuerdo al modelo una
disminución de la actividad de receptores a dopamina de uno de los hemisferios
cerebrales produce conducta de giro ipsilateral al ser estimulados por una droga
específica. El giro contralateral indica aumento de la actividad locomotora del lado
estimulado que puede ser debida a manipulación asimétrica de los receptores
dopaminérgicos o supersensibilidad de los receptores a dopamina con respecto
del lado no supersensible como en los casos de Parkinson experimental
asimétrico como los que se generan en los procedimientos anteriores.
1. Medición de la actividad conductual inducida por L-DOPA. La L-DOPA
indujo conducta de giro con el máximo efecto a los sesenta minutos después de la
administración Este efecto se debe a que al ser transformada la L-DOPA en
dopamina, estimula los receptores de ambos estriados, sin embargo la
hipersensibilidad del lado denervado produce que el animal gire al lado contrario
de la lesión. En el caso de los estudios de este proyecto se vio el efecto en ratas
32
con y sin tratamiento crónico. En el tratamiento crónico, esta actividad sé
monitorea diariamente durante la administración de la droga y se mide hasta que
alcanza un máximo, ya que se ha reportado que la droga produce un incremento
de la conducta de giro, lo cual ha sido explicado por un incremento en la
hipersensibilidad de los receptores dopaminérgicos
EXPERIMENTOS PARA MEDIR LA LIBERACION DE GABA RADIOACTIVO.
1. - Obtención de rebanadas. Se obtuvieron rebanadas de cerebro de 300 micras
de espesor provenientes de las ratas normales, parkinsónicas ó parkinsónicas
tratadas con L-DOPA, con la ayuda de un vibrátomo. Las rebanadas se colocaron
en un portaobjetos frío y se disecó el globo pálido bajo microscopía estereotáxica,
las muestras microdisecadas se colocaron en un tubo de ensayo con 2 ml de
solución de Krebs-Henseleit a 37 grados por 30 minutos (Floran et al., 1988).
2. - Incubación de la marca radioactiva. Pasado el período de equilibrio, la
solución se reemplazó por otra que contenía 2 x 10 -8 M de GABA radioactivo (90
100 µCi/mmol) y β-alanina 1 µM (para bloquear la captura glial de la marca)
durante 30 minutos. Al cabo de este tiempo las rebanadas fueron lavadas en
Krebs normal 3 veces para eliminar el exceso de la marca no capturada. Después
fueron transferidas a las cámaras de perfusión para el experimento.
3. -Procedimiento experimental. El sistema de perfusión consta de 20 cámaras
en paralelo; las rebanadas se distribuyeron al azar. La velocidad de perfusión fue
de 0.5 ml por minuto con Krebs normal, el cuál contenía ácido nipecótico para
bloquear la recaptura de [3H]-GABA; la perfusión se mantuvo por 30 minutos
antes de la colección de las muestras (fracciones) del GABA tritiado superfusado.
Primero se colectaron 4 fracciones durante 16 minutos para evaluar la liberación
basal. Luego las rebanadas se despolarizaron elevando (a 15 mM) la
concentración de K+, la cual se mantuvo por 16 minutos, permitiéndonos colectar
4 fracciones más. Luego fueron sometidas a la droga en estudio durante 6
fracciones, manteniéndose la despolarización con alto K+ (periodo de prueba). Al
final de este período, las rebanadas regresaron a la solución sin droga (16 minutos
33
mas , es decir 4 fracciones más). Por último las rebanadas se extrajeron de las
cámaras de perfusión y se transfirieron a viales en donde se solubilizaron con HCl
0.1 N para recuperar la radioactividad contenida en el tejido. Las muestras
colectadas fueron también transferidas a viales, y a todas se les agregó líquido de
centelleo para la cuantificación de la radioactividad por métodos convencionales
4. - Evaluación de resultados. La radioactividad de cada muestra o fracción se
expresó como la fracción de radioactividad liberada con respecto a la
radioactividad contenida en el tejido en el momento de colectar la fracción
correspondiente (F.R.), de acuerdo a la siguiente fórmula:
RADIOACTIVIDAD PRESENTE EN UNA FRACCIÓN
F.R.= ----------------------------------------------------------------------------
RADIOACTIVIDAD PRESENTE EN EL TEJIDO
Una vez procesado el FR, se procedió a calcular el cociente del grupo
experimental dividido entre el control. Un incremento del cociente por encima de 1
indica facilitación de la liberación y un cociente por debajo de uno indica inhibición.
Particularmente este cociente se estudió durante el periodo de aplicación de las
drogas al grupo experimental, en las gráficas se refirió como el eflujo fraccional de
[3H]-GABA (experimental /control).
5. Generación de curvas de concentración-efecto. Para este caso se procedió a
promediar los cocientes del FR en presencia de la droga estudiada a diferentes
dosis del fármaco. A cada grupo se le perfundió con una concentración diferente
de la droga que se seleccionó para su estudio. Este tipo de experimentos se
efectúo al menos en 3 ocasiones para explorar un amplio rango de
concentraciones. Los cocientes de las fracciones de liberación (F.R.), se
promediaron, obteniéndose el valor de la respuesta del grupo experimental total a
una concentración dada. Sé graficó la relación cociente de la fracción de
liberación promedio VS dosis de droga. El análisis de la curva se hizo por métodos
farmacológicos convencionales que permite obtener los valores de la dosis media
34
de aumento en la liberación de [3H]-GABA (EC50) o de la dosis media de
disminución en la liberación de [3H]-GABA (IC50), según sea el caso.
EXPERIMENTOS PARA ESTUDIAR LA PARTICIPACIÓN DE LA L-DOPA SOBRE RECEPTORES DOPAMINÉRGICOS DEL TIPO D2 Antes de estudiar los efectos de la L-DOPA sobre la liberación de [3H]-GABA
inducida por alto potasio, decidimos demostrar la dependencia o no que este
último proceso tiene con respecto al calcio. Todo ello, con la intención de analizar
si la liberación de [3H]-GABA se está realizando en las terminaciones nerviosas o
en las células gliales. La remoción de calcio del fluido con el que se perfunde a
las rebanadas disminuyó notablemente dicha liberación y nos indica la
procedencia neuronal de la misma (datos no mostrados).
Se probó el efecto de la L-DOPA sobre la liberación de [3H]-GABA inducida por
alto potasio, aplicando diversas dosis a rebanadas del globo pálido provenientes
del hemisferio cerebral lesionado. Para saber si el efecto era mediado por
receptores dopaminérgicos del tipo D2, se utilizó al sulpiride (antagonista de
receptores D2) adicionándolo a la L-DOPA en el fluido de perfusión de las
rebanadas. Se procedió de la misma manera, al tratar de analizar la inhibición de
la síntesis de dopamina a partir de L-DOPA, utilizando al NSD-1015 en diversas
dosis.
EXPERIMENTOS PARA ESTUDIAR LA FORMACIÓN DE DOPAMINA A PARTIR DE L-DOPA
1. - Obtención de rebanadas. Se obtuvieron rebanadas de cerebro de 300 µm de
espesor provenientes de las ratas normales, parkinsónicas ó parkinsónicas
tratadas con L-DOPA, con la ayuda de un vibrátomo. Las rebanadas se colocaron
en un portaobjetos frío y se disecó el núcleo bajo microscopio estereotáxico, las
muestras microdisecadas se colocaron en un tubo de ensayo con 2 ml de
solución de Krebs-Henseleit a 37 grados por 30 minutos (Silva et al., 2006).
35
2. - Incubación con L-DOPA. Las rebanadas de globo pálido fueron incubadas en
presencia de L-DOPA 100 µM durante tiempos variables, en presencia de meta
bisulfito de sodio para evitar su oxidación.
3.- Determinación de los contenidos de dopamina. Después de este tiempo fueron
lavadas y retiradas de las cámaras de incubación para se homogeneizadas
manualmente en 100 µl de ácido perclórico 0.1 N. Luego se centrífugó a 6000
rpm/min en una airfuge, el sobrenadante se transfirió a un filtro de 0.2 de nylon, La
pastilla se resuspendió en 120 µl de NaOH 0.1 N, para cuantificación de proteínas
por el método de Bradford. El sobrenadante se volvió a centrifugar a 1500 RMP
para retener partículas que pueden afectar la detección. Una alícuota de 25 µl, se
pasó por el sistema de cromatografía de líquidos de alta presión acoplada a un
sistema de detección de catecolaminas por electroquímica (Rosales et al., 1997).
36
RESULTADOS EXPERIMENTALES Síntesis de dopamina a partir de L-DOPA en el globo pálido. Los primeros experimentos se realizaron para saber si en el globo pálido se
forma dopamina a partir de L-DOPA aplicada de manera exógena. Los resultados
se muestran en las gráficas 1 y 2. La primera, representa el estudio en rebanadas
de globo pálido provenientes de ratas intactas donde se muestra el curso temporal
de la formación de dopamina en tres condiciones: el control (puntos negros), en la
que la síntesis (medida por la acumulación de dopamina a diferentes tiempos) se
incrementa casi linealmente con el tiempo, hasta alcanzar un máximo a los 45
minutos (149±9 ng/mg proteína). Dado que los experimentos de liberación
descritos anteriormente, se realizaron en rebanadas despolarizadas también con
15 mM de K+, quisimos analizar si ésta situación modificaba la síntesis de
dopamina. El grupo en el que se indica el efecto de la despolarización, se observa
(puntos rojos) que ésta no se ve modificada, alcanzando también la dopamina su
máxima concentración a los 45 minutos (154±5 ng/mg proteína), sin diferenciarse
estadística del control (p › 0.05, utilizando la prueba de t-student). Por último se
muestra el efecto de inhibir la AADC con 500 µM de NSD 1015 (puntos azules), lo
cual produce una pérdida total en la síntesis de dopamina a partir de la L-DOPA
(9.8±30 ng/mg proteína), dándonos una diferencia estadísticamente significativa
con respecto de los experimentos control y despolarizado (p ‹ 0.001, utilizando la
prueba t-student).
La segunda gráfica, nos muestra la síntesis de dopamina en rebanadas de
globo pálido provenientes de ratas hemiparkinsónicas, a los 40 minutos de
habérseles sometido a la exposición de L-DOPA. Se hace una comparación entre
rebanadas provenientes del hemisferio cerebral normal y del que fue denervado
mediante la aplicación de 6-OHDA en el haz del cerebro medio. Nótese como en
el lado no denervado se observa una acumulación similar a la de rebanadas
provenientes de ratas intactas, con un efecto del NSD 1015 igual (control
7.53±0.68 ng/mg de proteína, L-DOPA 128±8, p‹0.001 con respecto del control, L-
DOPA+NSD 7.11±0.33 no significativa estadísticamente con respecto del control;
37
prueba estadística: t-student). En contraste en el lado denervado, la acumulación y
el contenido inicial es mucho menor, pero también es altamente sensible del NSD
1015 (control 0.73±0.16 ng/mg de proteína, L-DOPA 3.8±0.30, p‹0.001 con
respecto del control, L-DOPA+NSD 0.86±0.13 no significativa estadísticamente
con respecto del control por t-student).
Gráfica 1. Síntesis de dopamina a partir de L-DOPA en rebanadas de globo pálido provenientes de ratas normales. La gráfica muestra la acumulación de dopamina en rebanadas expuestas a L-DOPA (100 µM) a diferentes tiempos bajo 3 condiciones. La primera (control, puntos negros) en solución Krebs normal. La segunda (despolarización, puntos rojos) se realizó en rebanadas en las que la concentración de K+ se elevó a 15 mM, de manera similar como se hizo en los experimentos de liberación. La tercera (inhibición, puntos azules) en presencia de NSD 1015 (500 µM) para inhibir la AADC. La acumulación fue diferente estadísticamente a partir del minuto 10 en las primeras dos condiciones (t-student P‹ 0.05). La tercera se realizó en presencia de NSD 1015 y la acumulación no varío con el tiempo. Los experimentos representan el promedio ± error estándar de 3 experimentos (3 replicas por experimento).
0 20 40 60
0
50
100
150
ControlDespolarizadoNSD 1015
L-DOPA
A
Minutos
Dop
amin
a(n
g/m
g pr
otei
na)
38
Gráfica 2. Síntesis de dopamina a partir de L-DOPA en rebanadas de globo pálido de ratas hemiparkinsónicas. La gráfica muestra comparativamente la acumulación de dopamina en rebanadas de globo pálido provenientes de ratas con parkinson experimental. Se muestra comparativamente el lado no denervado contra el lado lesionado con 6-hidroxidopamina (lado denervado). La acumulación fue diferente desde el punto de vista estadístico con respecto del tiempo cero (control, contenido inicial) a los 20 minutos. (t-student P‹ 0.001). No así en el caso de las rebanadas tratadas con NSD 1015. Los experimentos representan el promedio ± error estándar de (3 experimentos 3 replicas por experimento). Nótese la diferente escala usada con el propósito de mostrar las diferencias de contenidos iniciales de dopamina.
Efecto de la L-DOPA sobre la liberación de GABA en el globo pálido de ratas hemiparkinsónicas. De acuerdo a nuestras metas y con la metodología de liberación descrita,
procedimos a estudiar ahora los efectos de la L-DOPA sobre la liberación de
GABA en rebanadas de globo pálido provenientes de ratas hemiparkinsónicas.
Primeramente estudiamos el efecto de un pulso de L-DOPA en rebanadas del lado
denervado, en ausencia y presencia de NSD 1015, con la idea de prevenir la
formación de dopamina. A la vez probamos si en los efectos estaban involucrados
los receptores del tipo D2, a través de su bloqueo con l-sulpiride, el cual es un
0
25
50
75
100
125
L-Dopa L-Dopa +NSD 1015
Control
Dop
amin
e (n
g/m
g pr
otei
n)
Lado normal
0
1
2
3
4
5
ControlL-Dopa L-Dopa +NSD 1015
Lado denervado
Dop
amin
e (n
g/m
g pr
otei
n)
39
fármaco descrito como antagonista selectivo para dichos receptores. Los
resultados se muestran en la gráfica 3. En ella se observa como la L-DOPA (100
µM), en ausencia de dopamina, inhibe la liberación de GABA en las dos
condiciones: con NSD 1015 (41±2%) y sin NSD 1015 (39±3%), es decir
permitiendo y no la formación de dopamina, respectivamente También se puede
apreciar que su efecto es bloqueado por el L-sulpiride, en ambas condiciones.
Gráfica 3. Efecto de la L-DOPA sobre la liberación de GABA radioactivo en rebanadas de globo pálido provenientes de ratas denervadas. Arriba se muestra el curso temporal de un pulso de L-DOPA en el medio de perfusión, la cual inhibió significativamente la liberación de GABA radioactivo (p‹0.05, T-Wilcoxon). El efecto es completamente revertido por la coadministración de l-sulpiride (antagonista de los receptores dopaminérgicos del tipo D2). Abajo se muestra el mismo experimento sólo que en este caso se realizó en presencia de NSD 1015 (inhibidor de la enzima AADC). Los resultados representan el promedio de 3 experimentos por separado, con 5 replicas en cada experimento.
Globus Pallidus
0 2 4 6 8 10 12 14
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
1.50
L-dopa 100µMl-dopa+Sulpiride 10µM
Fracción de liberación
Eflu
jo fr
acci
onal
de
[3 H]-
GA
BA
(exp
erim
enta
l /co
ntro
l)
Globus Pallidus
0 2 4 6 8 10 12 14
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
1.50
L-dopa 100µMl-dopa+Sulpiride 10µM
En presencia de NSD 1015 500µM
Fracción de liberación
Eflu
jo fr
acci
onal
de
[3 H]-
GA
BA
(exp
erim
enta
l /co
ntro
l)
40
Gráfica 4. Curva dosis-respuesta del efecto de la L-DOPA sobre liberación de GABA. Se muestra el efecto inhibitorio de la L-DOPA sobre la liberación de GABA a diferentes dosis y en 3 condiciones: control (puntos negros), con NSD 1015 (puntos rojos) y con NSD 1015 y l-sulpiride (puntos azules).
Completando el estudio del efecto de la L-DOPA sobre la liberación de
GABA en rebanadas de ratas denervadas, procedimos a la caracterización
farmacológica del receptor involucrado en los efectos. Realizamos curvas de
concentración efecto de la L-DOPA, en tres condiciones, en presencia y ausencia
de NSD 1015, lo cual nos permitirá entender si se trata de diferentes receptores en
las diferentes condiciones y en presencia de sulpiride para ver si efectivamente se
comporta como un receptor de la familia D2. Los resultados se muestran en el
grafico 4. Nótese en la gráfica como la curva de en presencia y ausencia de NSD
1015 es la misma y el corrimiento de la derecha cuando se realiza en presencia de
L-sulpiride. Los parámetros de las curvas se muestran en la tabla 1. El único
parámetro que cambio significativamente entre las curvas fue el valor de Log IC50
al aplicar el NSD conjuntamente con el Sulpiride.
-10 -8 -6 -4 -2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2Control IC50=0.44 µM
NSD 1015 IC50=0.39 µM
NSD 1015 + Sulpiride IC50=64.80 µM
log [L-DOPA]
Eflu
jo fr
acci
onal
de
[3 H]-
GA
BA
(exp
erim
enta
l /co
ntro
l)
41
Parámetros de las curvas dosis respuesta a L-DOPA
Control NSD 1015 NSD+Sulpiride
Inhibición máxima (µM) 0.58±0.03 0.61±0.02 0.59±0.04
Log IC50 -6.4±0.2 -6.4±0.2 -5.2±0.2*
Pendiente -0.83±0.20 -0.84±0.31 -0.88±0.16
* p‹0.01 con respecto al control y NSD.
Tabla 1. Muestra los valores de las curvas de dosis respuesta resultado de la activación de receptores dopaminérgicos del tipo D2 por L-dopa en condiciones control, bloqueo de la AADC con NSD 1015 y de receptores D2 con l-sulpiride.
Efecto de la dopamina formada a partir de L-DOPA en el Globo Pálido sobre la liberación de GABA de ratas hemiparkinsónicas. Esta serie de experimentos tiene el objeto de conocer si la dopamina
formada a partir de L-DOPA, en el globo pálido alcanza a activar los receptores
D2. Las rebanadas provenieron de ratas denervadas y se comparó el lado
denervado y el control. Previamente a la incubación con la marca radiactiva, las
rebanadas fueron colocadas en soluciones que contenían L-DOPA (500µm) sin
inhibidor de la descarboxilasa. La idea fue permitir que se pudiera sintetizar
dopamina. Las pruebas para evaluar los efectos de dopamina formada, fueron
dos. Primero bloquear con l-sulpiride los receptores D2 y estimular la liberación de
DA con alto K+, esto provoca la salida de dopamina formada de las terminales
remanentes o cualquier otro sitio de síntesis. En condición normal esta maniobra
produce facilitación de la salida de GABA (Florán et al.,1997). La segunda es
provocar la salida de la dopamina endógena con metanfetamina, un bloqueador
del sistema de captura de alta afinidad. Esta maniobra en condiciones normales
activa los receptores D2 e inhibe la liberación de GABA. Los resultados de estas
maniobras se muestran en la gráfica 5.
42
Metanfetamina
0 2 4 6 8 10 12 14
0.0
0.5
1.0
1.5
Lado normalLado denervado
Fracción de liberación
Eflu
jo fr
acci
onal
de
[3 H]-G
AB
A (e
xper
imen
tal /
cont
rol)
Sulpiride
0 2 4 6 8 10 12 14
0.5
1.0
1.5
2.0
Lado normalLado denervado
Fracción de liberación
Eflu
jo fr
acci
onal
de
[3 H]-G
AB
A (e
xper
imen
tal /
cont
rol)
Gráfica 5. Efecto de la metanfetamina y el l-sulpiride sobre la liberación de GABA en rebanadas de globo pálido de rebanadas expuestas a L-DOPA 40 minutos antes del experimento de liberación. Arriba se muestra el efecto de la metanfetamina (500 µM). En el lado control la inhibición fue diferente estadísticamente con respecto del teórico esperado (p‹0.05 T-Wilcoxon) y con respecto del lado denervado. En el lado denervado no hubo diferencias. Abajo se muestra el efecto del l-sulpiride (100 µM). Al igual que para el caso anterior, en el lado control la facilitación por el bloqueo de los receptores D2 con l-sulpiride fue diferente estadísticamente contra el teórico esperado, y el lado denervado (uno, p‹0.05, T-Wilcoxon). Los resultados representan el promedio de 3 experimentos por separado, con 5 replicas en cada experimento.
43
Nótese como el lado normal se comporta de acuerdo a lo esperado, la
metanfetamina inhibe y el l-sulpiride estimula la liberación de GABA. Sin embargo
en el lado denervado no ocurrió ningún cambio.
Cambios en la actividad locomotora mediados por L-DOPA a través de activación de receptores D2.
Los estudios conductuales mostrados a continuación se realizaron en ratas
hemiparkinsónicas con el fin de ver efectos de la activación de receptores
dopaminérgicos por L-DOPA mediados y no mediados por su conversión a
dopamina y se encuentran en las gráficas 6 y 7. La administración de L-DOPA (25
mgrs/Kg. de peso i.p.) induce giro contralateral en ratas hemiparkinsónicas. La
respuesta típica se muestra en la gráfica 6, con un efecto máximo a la hora de
haber sido administrada de aproximadamente 10 giros por minuto y un total de
496±29 durante la sesión. Prevenir la conversión de la L-DOPA en dopamina por
la coadministración del inhibidor de la AADC el NSD 1015 (100 mg/Kg. de peso
i.p.), no eliminó totalmente el efecto del giro, permaneciendo en un total de
227±26.
La participación de los receptores D2 en el giro remanente resultado de la
prevención de la conversión a dopamina de la L-DOPA, fue estudiada mediante el
bloqueo de los receptores con l-sulpiride (17 mg/Kg. de peso s.c.), como se
muestra en la gráfica 7. En estos experimentos la administración de L-sulpiride o
el vehículo se realizó conjuntamente con NSD 1015. La cantidad de giros totales
sin sulpiride fue de 279±7 contra solo 26±2, en presencia de este.
44
Gráfica 6. Efecto del NSD 1015 sobre la conducta de giro inducida por L-DOPA en ratas hemiparkinsónicas. La sección de la izquierda muestra la velocidad de giro contralateral inducido por L-DOPA en dos condiciones, la primera permitiendo su conversión a dopamina (salina) y no permitiendo la conversión, por la administración previa de NSD 1015 por vía sistémica. A la derecha se muestra el acumulado de giros totales registrados en la sesión en ambos grupos. La cantidad de giros totales fue diferente estadísticamente p ,0.001 (t-student).
Gráfica 7. Efecto del sulpiride sobre la conducta de giro inducida por L-DOPA en ratas hemiparkinsonicas. La sección de la izquierda muestra la velocidad de giro contralateral inducido por L-DOPA en dos condiciones, la primera no permitiendo su conversión a dopamina (NSD 1015) y la segunda no permitiendo la conversión, pero bloqueando previamente los receptores D2 con sulpiride por la vía sistémica. A la derecha se muestra el acumulado de giros totales registrados en la sesión en ambos grupos. La cantidad de giros totales fue diferente estadísticamente p ,0.001 (t-student).
50 100 150 200
-16-14-12-10-8-6-4-2024
NSD 1015salina
NSD óVehículo
L-DOPA
minutos
Gir
o co
ntra
late
ral
0
200
400
600
Gir
o co
ntra
late
ral t
otal
50 100 150 200
-16-14-12-10-8-6-4-2024
Sulpiride + NSD 1015NSD 1015
Sulpiride+NSDó NSD 1015
L-DOPA
minutos
Gir
o co
ntra
late
ral
0
100
200
300
Gir
o co
ntra
late
ral t
otal
45
Supersensibilidad conductual de los receptores a dopamina por el tratamiento con L-DOPA. Antes de estudiar el efecto del tratamiento con L-DOPA sobre la respuesta
funcional resultado de la actividad de los receptores D2, estudiamos si
efectivamente el tratamiento conduce a una supersensibilidad de los receptores a
dopamina manifestada conductualmente. Dado que la L-DOPA, per se induce
conducta de giro mediada por activación de receptores a dopamina, monitoreamos
diariamente esta conducta a lo largo de 20 días de tratamiento. Los resultados se
muestran en la gráfica 8.
Como puede observarse la administración de L-DOPA produce un efecto de
incremento del número de giros inducidos a medida que ocurre el tratamiento. La
velocidad máxima se alcanza a los 60 minutos de administrada (21±3) y tras 10
días de tratamiento (19±4).
46
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180
0
30
20
10
5
101520
7
Día de tratamiento
minutos
Gir
o co
ntrl
ater
ales
por
min
uto
0 5 10 15 20
30
20
10
0
dias de tratamiento
Giro
s co
ntra
late
ral p
orm
inut
o m
áxim
o
Gráfica 8. Efecto del tratamiento crónico con L-DOPA sobre la conducta de giro inducida por ella misma en ratas hemiparkinsónicas. A la izquierda se muestra la respuesta característica una dosis de L-DOPA ( 10 mgrs/Kg. i.p.) en ratas hemiparkinsónicas a los diferentes días de tratamiento dos semanas después de la lesión. El efecto máximo aparece a la hora y luego decae con el tiempo. A la derecha se muestra la velocidad máxima de giro inducido a los diferentes días de tratamiento. Nótese que el giro máximo se alcanza a los 10 días y la velocidad máxima alcanzada en promedio es de 20±4 giros.
47
Efecto del tratamiento con L-DOPA sobre la sensibilidad de los receptores dopaminérgicos del tipo D2, en el globo pálido. Una vez concluidos el estudio de los efectos de la activación de receptores
para dopamina del tipo D2 por L-DOPA, se estudiaron los cambios que el
tratamiento crónico produce sobre la sensibilidad de los mismos. La interrogante
que nos planteamos fue la de valorar si la supersensibilidad conductual se
manifiesta por una supersensibilidad funcional resultado de la activación de los
receptores en el globo pálido. Los resultados están en las gráficas 9, 10 y 11 y
cuantificados en las tablas 2 y 3. La evaluación se realizó activando los receptores
con su agonista selectivo el quinpirole, y específicamente se midió la inhibición de
la liberación de GABA en rebanadas de ratas parkinsónicas lado normal y lado
denervado.
0 2 4 6 8 10 12 14
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
Quinpirole 5 µM control Quinpirole 5 µM Denervated
Fracción de liberación
Eflu
jo fr
acci
onal
de
[3 H]-G
AB
A (e
xper
imen
tal /
cont
rol)
0 2 4 6 8 10 12 14
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
Quinpirole 50 µM controlΟ Quinpirole 50 µM Denervated
Fracción de liberación
Eflu
jo fr
acci
onal
de
[3 H]-G
AB
A (e
xper
imen
tal /
cont
rol)
Gráfica 9. Activación de receptores D2 en globo pálido proveniente de ratas denervadas. La gráfica muestra el efecto de dos concentraciones del agonista selectivo de los receptores D2 el quinpirole sobre la liberación de GABA radioactivo tanto en el lado normal como el denervado. Nótese como comparativamente la respuesta en ambas dosis es mayor la respuesta en el lado denervado que el control, juzgado por la respuesta inhibitoria observada.
48
La activación de receptores D2 en ratas denervadas con y sin tratamiento
con L-DOPA tiene diferencias en dos sentidos, primero describiremos las que
produce la denervación por sí misma y luego las que producen el tratamiento
crónico sobre la denervación.
En rebanadas provenientes de ratas denervadas y tratadas solo con
solución salina la respuesta funcional resultado de la activación de receptores D2
en el lado denervado esta súper sensibilizada como se muestra en la gráfica 9 y
10. La inhibición de la liberación de GABA siempre es mayor en las rebanadas del
lado denervado que en el control para la misma dosis de agonista empleado, de
hecho los cambios se reflejan en el cambio en el valor de la IC50 sin afectar la
inhibición máxima.
Gráfica 10. Curva de dosis-efecto del quinpirole sobre la liberación de GABA en rebanadas de globo pálido provenientes de ratas denervadas. Se muestra la inhibición de la liberación por la activación de receptores D2 con el agonista selectivo el quinpirole comparativamente en el lado control contra el denervado. La cuantificación de los parámetros de la curva se muestra en la tabla 2. Se muestra el resultado de 3 experimentos por triplicado de cada dosis, promedio ± error estándar.
-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
lado denervadoIC50=0.050 µM
lado control IC50=2.41 µM
Log [Quinpirole]
Eflu
jo fr
acci
onal
de
[3H
]-G
AB
A.
Expe
rimen
tal/C
ontr
ol
49
Tabla 2. Se resumen los parámetros de las curvas de dosis respuesta de activación de receptores D2 con quinpirole en globo pálido de ratas hemiparkinsónicas, en el lado control y en el lado denervado.
En rebanadas provenientes de ratas denervadas y tratadas crónicamente
con L-DOPA la respuesta funcional resultado de la activación de receptores D2 en
el lado denervado esta súper sensibilizada aún mas como se muestra en la gráfica
10. La inhibición de la liberación de GABA siempre fue mayor en las rebanadas del
lado denervado que en el control, de hecho los cambios se reflejan en el valor de
la IC50, sin afectar la inhibición máxima. Los parámetros de la curva-dosis
respuesta observados en el lado control son muy similares a los del lado control
de ratas tratadas solo con solución salina (compare tablas 2 y 3).
Lado control Lado denervado
Inhibición máxima
(µM)
0.32±0.06 0.39±0.03
Log EC50 -5.62±0.18 -7.28±0.19*
Pendiente -0.47±0.11 -0.56±0.10
* p‹0.01 con respecto al control
50
Gráfica 11. Curva de dosis-efecto del quinpirole sobre la liberación de GABA en rebanadas de globo pálido provenientes de ratas denervadas y tratadas con L-DOPA. Se muestra la inhibición de la liberación por la activación de receptores D2 con el agonista selectivo el quinpirole comparativamente en el lado control contra el denervado. La cuantificación de los parámetros de la curva se muestra en la tabla 3. Se muestra el resultado de 3 experimentos por triplicado de cada dosis, promedio ± error estándar.
Tabla 3 Se resumen los parámetros de las curvas de dosis respuesta de activación de receptores D2 con quinpirole en globo pálido de ratas hemiparkinsónicas y tratadas con L-dopa, en el lado control y en el lado denervado.
Lado control Lado denervado
Inhibición máxima
(µM)
0.32±0.03 0.39±0.09
Log EC50 -5.59±0.07 -8.21±0.33*
Pendiente -0.60±0.17 -0.50±0.10
* p‹0.001 con respecto al control
-10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
lado denervadoIC50=0.006 µM
lado control IC50=2.56 µM
Log [Quinpirole]
Eflu
jo fr
acci
onal
de
[3H
]-G
AB
A.
Expe
rimen
tal/C
ontr
ol
51
DISCUSIÓN
Como previamente mencionamos la L-DOPA, es el principal y es el fármaco
más comunmente usado en el tratamiento para la enfermedad de Parkinson, pero
además de todo esto representa todo un reto de la farmacología moderna, pues
dentro de su uso subyacen mecanismos de acción que no han sido
adecuadamente dilucidados y un modelo farmacológico de discinesia inducida
cuya fisiopatología está por esclarecerse.
En el presente trabajo se han abordado experimentalmente los efectos de la
L-DOPA a través de puntos: primero, mediante la activación directa de receptores
dopaminérgicos del tipo D2 por L-DOPA y segundo, los efectos del tratamiento
crónico con este fármaco en el Parkinson experimental, en relación a los
receptores D2 precisamente.
La activación de receptores dopaminérgicos del tipo D2 por L-DOPA.
A la fecha no existe ninguna controversia en cuanto a la hipótesis del
reemplazo simple. Una gran cantidad de referencias apoyan esta teoría (Lopez et
al., 2001), sin embargo, un nuevo cúmulo de información refuerza la idea de que
existen efectos de la L-DOPA no mediados por su conversión a dopamina (Misu et
al., 1986, 2002; Nakazato and Akiyama,1989; Aceves et al., 1991; Nakamura et
al., 1994; Yue et al., 1994; Fisher et al., 2000), efectos que involucran receptores
dopaminérgicos del tipo D1 y a un propuesto receptor DOPAérgico y en los que se
ha determinado desde la liberación de neurotransmisores, hasta su relación con
la actividad locomotora. Poco se sabe acerca de los efectos que la L-DOPA
pudiera tener sobre receptores dopaminérgicos del tipo D2, lo que se conoce es
que median también la actividad locomotora (De Long 1990) y la liberación de
GABA en los ganglios basales, particularmente en el estriado y el globo pálido
(Floran et al.,1997, Querejeta et al., 2001, Cooper y Stanford , 2001), y sobre todo
no se conoce si esto puede ocurrir en el caso particular del Parkinson
experimental.
52
Nuestros hallazgos indican que la L-DOPA inhibe la liberación de GABA en
el globo pálido del animal denervado que representa el modelo más representativo
de la Enfermedad de Parkinson, de acuerdo a nuestros resultados de la grafica 3,
y 4. Este efecto claramente no depende de su transformación a dopamina dado
que el bloqueo de la AADC con NSD 1015 no previene el efecto inhibitorio de la L-
DOPA. También es claro que esto es mediado por receptores D2, ya que es un
efecto inhibitorio (la dopamina endógena, los agonistas D2 inhiben la liberación de
GABA en este núcleo, ver Florán et al., 1997) y se bloquea con l-sulpiride
(antagonista selectivo de los receptores D2/D3). Este efecto tiene además otra
característica: que la activación del receptor dopaminérgico del tipo D2
aparentemente podría ser en el mismo sitio que actúa la dopamina o sus
agonistas farmacológicos, ya que en presencia de dosis crecientes del l-sulpiride,
la curva dosis respuesta a L-DOPA se desplaza de manera paralela a la derecha
(gráfica 4, tabla 1), es decir la L-DOPA se comporta como un agonista clásico para
el receptor dopaminérgico del tipo D2, por lo menos en lo que al globo pálido
corresponde.
El globo pálido denervado, a pesar de la caída importante de dopamina
(gráfica 2), que se correlaciona con la muerte de las neuronas dopaminérgicas tras
la denervación, tiene la capacidad de sintetizar dopamina, sin embargo ésta no
alcanza los niveles que se pueden observar en el lado no denervado (misma
gráfica), ni en ratas intactas (gráfica 1). A pesar de ello cabe preguntarse entonces
si esta dopamina es capaz de activar los receptores dopaminérgico del tipo D2,
dado que se ha sugerido en la enfermedad de Parkinson con manifestaciones
clínicas importantes que esto seria suficiente para que la L-DOPA pudiera tener
efectos (Hornikiewickz, 2002). Nuestros hallazgos muestran que al menos en el
globo pálido esto no ocurre, ya que la exposición previa a L-DOPA en rebanadas
de ratas denervadas en las que se permitió la formación de dopamina, esta última
no fue capaz de inhibir la salida de GABA, cuando es movilizada con
metanfetamina, ni con alto K+ (gráfica 5). La transformación de L-DOPA en
dopamina puede ocurrir en otros elementos neuronales que contienen la AADC
como son las terminales serotoninérgicas (Arai et al., 1994, Tanaka et al., 1999,
53
Lopéz et al., 2001) y que existen en el globo pálido (Bengel et al., 1997) las cuales
pudieran contribuir a la formación de dopamina, sin embargo dos hechos hacen
poco viable esta posibilidad: primero la AADC de terminales es sensible de NSD
1015 (Dluzen et al., 1992) y segundo, la lesión con 6-hidroxydopamina también
provoca muerte de neuronas seretoninérgicas (Takeuchi et al., 1991).
Ha sido sugerido que los efectos conductuales de la L-DOPA pueden ser
ocasionados por sus metabolitos. El principal de ellos es la 3-metoxitiramina (3-
MT) y se ha propuesto que puede ejercer su efecto a través de receptores D1/D5
(Nakazato y Akiyama, 2002). La posibilidad de que este efecto de la L-DOPA,
ocurriera por 3-MT a través de receptores D2, también existe. Sin embargo el
hecho de que el desplazamiento paralelo de curva de dosis respuesta a la derecha
de la L-DOPA por el l-sulpiride y el bloqueo de los receptores D1 con SCH 23390
(ver metodología), descartan esta posibilidad.
Otra pregunta interesante consiste en saber si los efectos conductuales de
la L-DOPA sobre la actividad locomotora se efectúa de manera directa sobre
receptores a dopamina, en este caso particular sobre receptores D2, lo cual ha
sido sugerido por algunos autores (Fisher et al., 2000). Nuestros hallazgos sobre
conducta de giro apoyan esta idea (ver gráfica 7). Si bien es cierto que la conducta
de giro contralateral observada sin NSD 1015 (permitiendo la formación de
dopamina), es mucho mayor que en presencia de la droga, también es claro que la
actividad de giro remanente depende de efectos directos mediados por la
activación de receptores dopaminérgico del tipo D2 como lo muestra la misma
gráfica.
La conducta de giro contralateral observada, puede ser explicada en
términos de la activación de receptores dopaminérgico del tipo D2 en el globo
pálido. De acuerdo al modelo de los ganglios basales (figura 4) la conducta de giro
contralateral resulta de sobreactividad de la corteza motora de uno de los
hemisferios cerebrales, la cual a su vez está controlada por la entrada talámica
excitatoria. En la denervación dopaminérgica unilateral existe una
supersensibilidad de los receptores a dopamina del lado denervado, los cuales al
ser estimulados presentan una mayor respuesta funcional. La inhibición de la
54
liberación de GABA por la L-DOPA, desinhibe el disparo de las neuronas palido-
subtalámicas inhibitorias, dando como consecuencia desinhibición de los núcleos
premotores del tálamo e hiperactividad cortical del lado de la lesión. Así, se
refuerza la acción de la activación de receptores dopaminérgico del tipo D1
localizados en la vía directa y que pueden ser coactivados por la misma L-DOPA
(Aceves et al., 1991) y de esta manera producir giro, lo cual implica promover la
locomoción.
En resumen, nuestros resultados muestran la activación directa de los
receptores dopaminérgicos del tipo D2 por L-DOPA en las terminales estriado-
palidales, lo cual contribuye a entender los efectos de la L-DOPA, en su acción
terapéutica en el Parkinson experimental.
El efecto del tratamiento crónico con L-DOPA sobre los receptores dopaminérgico del tipo D2.
Efectos directos sobre los receptores a dopamina tanto D1 y D2 de la L-
DOPA sin duda contribuyen al efecto terapéutico. Sin embargo, la contraparte son
los efectos indeseables del tratamiento crónico. De que depende y cuales son los
mecanismos involucrados, es lo que habrá de resolverse. Un buen principio es
comprender los cambios que explican la supersensibilidad de los receptores a
dopamina provocados primeramente por la denervación y en segundo por el
tratamiento crónico.
La supersensibilidad a la denervación es un hecho. Conductualmente en
todos los modelos experimentales de enfermedad de Parkinson la estimulación de
los receptores a dopamina produce patrones de conducta aumentados en
magnitud (citas), para el caso de los receptores D2 esto correlaciona con el
aumento en el número de receptores observado (upregulation) (Garcia, 2003) incremento del RNAm para el receptor (Gerfen 1990), aumento de la expresión de
genes tempranos normalmente estimulados por estos receptores (Gerfen et al.,
2002) la utilización de 2-deoxi-glucosa (Trugman et al., 1991) y podríamos
agregar uno mas: el aumento de la respuesta funcional medido por la liberación de
55
GABA en el globo pálido como se ve en las gráficas 9 y 10 y la tabla 2. En ellas se
demuestran tres aspectos importantes: uno, que en la denervación la inhibición de
la liberación de GABA está incrementada, dos que la curva dosis-respuesta del
quinpirole muestra un aumento de la sensibilidad manifestado por un corrimiento a
la izquierda y tres que este corrimiento es paralelo y sólo afecta el valor de la IC50
sin afectar la respuesta máxima ya que la IC50 que la lleva de 2.41 µM a 50 nM.
Esto es consistente con el modelo fisiopatológico de la enfermedad de Parkinson
que indica que la acinesia y/o bradicinesia son producto del aumento de actividad
de la vía indirecta y que intenta verse compensada por un aumento de la
sensibilidad de los receptores dopaminérgicos del tipo D2. De hecho, un buen
blanco terapéutico propuesto según el modelo es la activación directa de los
receptores D2, lo cual es cumplido en buena medida por la L-DOPA actuando
directamente sobre estos receptores.
De acuerdo a la hipótesis del reemplazo cabe esperar con suficiente razón,
que el tratamiento con L-DOPA restaure, además de la función motora, el estado
de los receptores, genes y respuesta funcional al estadio previo a la pérdida de
dopamina. Sin embargo esto no ocurre. El tratamiento con L-DOPA aumenta aún
más la supersensibilidad conductual como se muestra en la gráfica 8. L-DOPA
activa los receptores a dopamina lo que produce giro contralateral el cual aumenta
con los días de tratamiento (efecto denominado “priming”), esto sugiere que la
sensibilidad de los receptores también se va incrementando con el tratamiento
crónico. Esto se puede corroborar con el cambio que ocurre a nivel de la
respuesta funcional que medimos en este proyecto, que es la inhibición de la
liberación de GABA. Como se muestra en la gráfica 11 y la tabla 3, lejos de
regresar a lo normal la supersensibilidad de los receptores D2 se incrementa aún
más, ya que como vemos la curva de inhibición del quinpirole se desplaza aún
más a la izquierda de manera paralela (a juzgar porque no hay cambio en el valor
de la pendiente), pero se incrementa de manera importante la IC50, llegando al
orden de 6 nM. Este cambio en la sensibilidad también está asociado a un
incremento en el número de receptores. Datos de nuestro grupo de trabajo en los
que se estudió, por autoradiografía, la expresión de receptores dopaminérgicos del
56
tipo D2 en el globo pálido de animales denervados y con tratamiento con L-DOPA
igual al seguido en este proyecto, muestran también un incremento importante en
la unión (“binding”) (Ver figura 5)
Figura 5. Autoradiograma que muestra el incremento densidad de receptores D2 en el globo pálido de ratas denervadas con y sin tratamiento con L-DOPA. La lesión se efectuó en el hemisferio derecho y solo produjo un ligero incremento de receptores D2, sin embargo el tratamiento crónico produjo un importante incremento en el “binding” particularmente localizados a la porción medial del globo pálido como lo indican la flecha. Datos no publicados.
Estos cambios indican que el tratamiento con L-DOPA no sólo no evita la
progresión de la enfermedad, sino que además activa o desencadena un elemento
más que incrementa la supersensibilidad de los receptores dopaminérgicos del
tipo D2 y que habrá de esclarecerse.
Por otro lado es importante resaltar que el tratamiento crónico con L-DOPA,
no modifica el estadío de los receptores dopaminérgicos del tipo D2 asociados al
lado no denervado, ya que los valores de las curvas dosis respuesta mostrados en
las tablas 2 y 3 no varían significativamente. Esto sugiere que los cambios que
produce el tratamiento crónico sobre los receptores dopaminérgicos del tipo D2,
ocurren sólo en caso de pérdida de inervación dopaminérgica. Es probable que
en la denervación ocurran cambios significativos en la fisiología de las neuronas
estriatales que evita que, a pesar del reemplazo o la activación de receptores
57
dopaminérgicos, se vuelva a una situación control y por otro lado que el
tratamiento crónico acentúe o provoque nuevas alteraciones. En resumen
nuestros resultados muestran que la supersensibilidad de los receptores D2 se ve
incrementada importantemente por el tratamiento con L-DOPA.
La L-DOPA, los receptores a dopamina y las discinesias.
Es un hecho que la muerte neuronal en la enfermedad de Parkinson es
progresiva e irreversible, aún a pesar del tratamiento con L-DOPA (Whone et al.,
2003). También se ha sugerido muerte de otros elementos neuronales, como lo
son las neuronas serotoninérgicas y noradrenérgicas (Hornikyewicks, 2002).
Inclusive se ha sugerido que la L-DOPA o sus metabolitos representan un factor
de estrés oxidativo que contribuiría a la muerta neuronal, sin embargo los efectos
tóxicos de la L-DOPA no se han podido mostrar in vivo (Mytilineou et al., 2003).
Esto indica que los sitios potenciales para el reemplazo también van
disminuyendo, en consecuencia es factible que los efectos de L-DOPA, mediados
por activación directa de receptores D1 y D2, tengan un papel cada vez más
importante en el efecto terapéutico a la vez que se produce un aumento de los
efectos colaterales como las discinesias. De ocurrir así, es factible entonces que
dichos efectos colaterales se deban a L-DOPA por sí misma en un sistema
previamente supersensible.
Los incrementos de supersensibilidad de los receptores dopaminérgicos
provocados por la L-DOPA se han sugerido tanto para receptores D1 como para
receptores D2, y uno de los más importantes son los que miden la respuesta
funcional. Nuestro grupo de trabajo ha mostrado claramente el caso de los D1
(Aceves et al., 1991) y ahora el de los D2 (este trabajo experimental), esto es
relevante porque es la respuesta funcional, resultado de la activación de
receptores dopaminérgicos, es la que finalmente determina la actividad de los
núcleos de salida y el control motor. En el modelo funcional de los ganglios
basales propuesto por Penney y Young en 1983, la discinesia puede entenderse
como un hiperactividad de la vía directa asociada a receptores D1, lo opuesto a lo
58
que ocurre en el Parkinson (Gerfen et al., 1990). Sin embargo algunos patrones de
conducta discinéticos se han asociado a receptores D2, no sólo en Parkinson
experimental sino también en animales normales (Pearce et al., 2001, Taylor et al.,
2005.). Así, una inhibición intensa sobre la liberación de GABA en el globo pálido
por acción de la L-DOPA en un receptor contribuiría a acentuar el desbalance
entre la vía indirecta y directa, así como a la génesis de la discinesia.
Naturalmente esto es una especulación pero representa una alternativa para
continuar con este trabajo de investigación. Sería interesante entender cual es el
efecto de la L-DOPA y el estado de los receptores D1 y D2 en animales con
parkinson y discinéticos.
Interesantemente se ha mostrado que el cambio de uso de agonistas
selectivos de receptores D2 en Parkinson experimental tratado con L-DOPA,
elimina la discinesias inducidas por el fármaco (Hadj Tahar et al., 2005). Por lo
tanto no se puede descartar la participación de la vía indirecta y los receptores D2
en la generación de estos efectos. Esto indica que un cambio en el régimen
terapéutico usando agonistas D2 mejora clínicamente al paciente e indica que la
responsable de la discinesia es la L-DOPA por sí misma. Por ahora nuestro
trabajo agrega dos elementos más al entendimiento de los efectos farmacológicos
de la L-DOPA a la terapia de la enfermedad de Parkinson: la activación de
receptores D2 por L-DOPA y su supersensibilización durante el tratamiento
crónico.
59
CONCLUSIONES
1. La L-DOPA activa los receptores D2 de manera directa comportándose como un agonista farmacológico de estos receptores.
2. El tratamiento crónico con L-DOPA incrementa la supersibilidad de los
receptores D2 en el Parkinson experimental.
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