UNIVERSIDAD DE COLIMA

MAESTRA EN CIENCIAS, REA: BIOTECNOLOGA

INDUCCIN DE EMBRIOGNESIS SOMTICA DE TEJIDO NUCELAR DE TRES VARIEDADES DE MANGO (Mangifera

indica L.).

TESIS

QUE PARA OBTENER EL GRADO DE

MAESTRO EN CIENCIAS, REA: BIOTECNOLOGA

PRESENTA

MIGUEL ANGEL MANZANILLA RAMREZ

ASESORES

M.C. SALVADOR GUZMN GONZLEZ

M.C. M. MANUEL ROBLES GONZLEZ

Tecomn, Col. Febrero de 2004

AGRADECIMIENTOS

A la Universidad de Colima, por el apoyo, as como por permitirme ingresar al

posgrado de la Facultad de Ciencias Biolgicas y Agropecuarias.

AL Dr. Richard Litz, por la capacitacin y apoyo durante la elaboracin de este

trabajo.

Al M.C. Vctor Manuel Medina Urrutia, por todo el apoyo recibido durante toda mi

formacin.

Al M.C. M. Manuel Robles Gonzlez, por sus sabios consejos y apoyo.

Al M.C. Salvador Guzmn Gonzlez, por su incondicional apoyo durante toda mi

formacin.

A mi amigo el Ing. Gerardo A. Snchez de la Torres, por su incondicional

amistad y apoyo.

A todos los profesores e Autoridades de la Facultad de Ciencias Biolgicas y

Agropecuarias de la Universidad de Colima.

A mis compaeros del Laboratorio de Biotecnologa Campus Tecomn.

A mis amigos investigadores del INIFAP Campo Experimental por su amistad y

apoyo.

A mis amigos del laboratorio de cultivo de Tejidos del Campo Experimental

Tecomn por su apoyo incondicional.

Al personal de campo del M.C. Vctor Medina Urrutia, (Carlos, Lalo, Gerardo,

Chava (q.e.p.d.) en especial a Armando Rivera Zamora) por su apoyo y

consejos.

A mis compaeros del COELIM-Col por su compresin.

A TODOS MUCHAS GRACIAS

DEDICATORIA

Con todo mi respeto y amor a mis padres Miguel A. Manzanilla Lpez y Martha

Esther Ramrez Beutelspacher. Por sus constantes apoyos y consejos que

nunca me han faltado.

A mi esposa Laura y mi hijo Miguel Emiliano, por su paciencia, amor, apoyo,

motivacin y dulce compaa que me dan a diario.

A mis hermanas Tita y Azu, por su amor, respaldo y apoyo incondicional.

A mis tos Manuel Cantu y Marielena Ramrez, por su apoyo y cario constante

durante toda mi vida.

A mis abuelitas Alicia Lpez (q.e.p.d.) y Esther Beutelspacher (q.e.p.d.), por su

gran ejemplo y su apoyo que me siguen brindando donde se encuentren.

A toda mi familias Ramrez y Manzanilla por su cario y respaldo.

A todos mis amigos en especial a Too y Bri, por su apoyo y cario.

NDICE Pginas.

LISTA DE CUADROS... 1

LISTA DE FIGURAS............ 3

RESUMEN.. 5

ABSTRACT. 6

I. INTRODUCCIN 7

II. REVISIN DE LITERATURA.. 10

2.1. Biotecnologa... 10

2.2. Cultivo de Tejidos 10

2.2.1. Cultivo de embriones... 11

2.2.2. Cultivo de meristemos. 12

2.2.3. Micropropagacin............ 12

2.2.4. Variacin somaclonal.. 13

2.2.5. Seleccin in vitro.. 13

2.2.6. Produccin de haploides........... 13

2.2.7. Cultivo de protoplastos 13

2.3. Embriognesis Somtica... 14

2.3.1. Conceptos de embriognesis somtica....... 15

2.3.2. Morfologa de la embriognesis somtica 15

2.3.3. Embriones somticos.. 16

2.3.4. Epigentica 17

2.3.5. Potencial embriognico.. 18

2.3.6. Embriognesis somtica directa 18

2.3.7. Embriognesis somtica secundaria.... 19

2.3.8. Desarrollo anormal de embriones somticos.. 19

2.3.9. Hiperhidricidad.. 19

2.4. Fases de la Embriognesis Somtica. 20

2.4.1. Induccin de embriognesis somtica. 20

2.4.1.1. Tipo de explantes 20

2.4.1.2. Nucela..................................................................................... 21

2.4.1.3. Factores que influyen en la adquisicin de capacidad embriognica ..

21

2.4.1.3.1. Hormonas..... 21

2.4.1.3.2. Genotipo y tipo de tejido........ 22

2.4.1.3.3. Enzimas y genes..... 23

2.4.1.3.4. Otros factores...... 24

2.4.2. Proliferacin y mantenimiento de cultivos embriognicos........... 26

2.4.2.1. Eventos tempranos en presencia de auxinas... 26

2.4.2.2. Clulas proembriognicas 27

2.4.3. Maduracin de embriones somticos... 27

2.4.3.1. Obtencin de embriones somticos... 27

2.4.3.2. Factores que inhiben en la produccin de embriones somticos

29

2.4.3.3. Polaridad de embriones somticos. 30

2.4.3.4. Factores que intervienen en la maduracin de embriones somticos...

31

2.4.3.4.1. Acumulacin de Protenas.... 31

2.4.3.4.2. Sacarosa......... 31

2.4.3.4.3. Densidad del explante.......... 32

2.4.3.4.4. Glutamina..... 32

2.4.3.4.5. cido absisico.. 33

2.4.4. Germinacin de embriones somticos. 34

2.4.5. Recuperacin y aclimatizacin de plntulas... 35

2.5. Aplicaciones de la Embriognesis Somtica..... 36

2.6. Organognesis en Mango. 37

2.7. Embriognesis Somtica en Mango.............. 38

2.8. Usos de la Embriognesis Somtica en Mango 44

III. MATERIALES Y MTODOS.. 48

3.1. Materiales.... 48

3.1.1. Material biolgico. 48

3.1.2. Lugar experimental.. 48

3.1.3. Medios de cultivo.. 49

3.2. Mtodos 50

3.2.1. Determinacin del estado de desarrollo... 50

3.2.2. Tamao de fruto y vulo..... 51

3.2.3. Induccin de embriognesis somtica.. 52

3.2.4. Proliferacin de tejido embriognico. 53

3.2.5. Recuperacin de embriones somticos 54

3.2.6. Maduracin de embriones somticos... 54

3.2.7. Germinacin de embriones somticos. 56

3.2.8. Anlisis estadsticos. 57

IV. RESULTADOS. 58

4.1. Estado de Desarrollo de la Semilla.. 58

4.2. Induccin de Cultivos Embriognicos..... 60

4.3. Proliferacin de Cultivos Embriognicos.... 64

4.3.1. Incremento en peso. 64

4.3.2. Nmero de embriones en estado temprano 68

4.4. Recuperacin de Embriones Somticos..... 70

4.4.1. Incremento en peso. 70

4.4.2. Embriones somticos desarrollados. 72

4.4.3. Embriones somticos hiperhidricos.. 73

4.5. Maduracin de Embriones Somticos.... 75

4.5.1. Sobrevivencia de embriones somticos... 77

4.5.2. Germinacin precoz de embriones somticos 78

4.5.3. Embriognesis secundaria..... 78

4.6. Germinacin de Embriones Somticos...... 82

4.6.1. Sobrevivencia de embriones somticos... 83

4.6.2. Emergencia de brotes. 83

4.6.3. Emergencia de races.. 83

V. DISCUSIN... 86

5.1. Estado de Desarrollo de la Semilla.. 86

5.2. Induccin de Cultivos Embriognicos..... 86

5.3. Proliferacin de Cultivos Embriognicos.... 88

5.4. Recuperacin de Embriones Somticos..... 89

5.5. Maduracin de Embriones Somticos.... 90

4.6. Germinacin de Embriones Somticos...... 91

VI. CONCLUSIONES 92

VII. REFERENCIAS... 93

1

LISTA DE CUADROS

Pgina

Cuadro 1. Sales menores y compuestos orgnicos del medio de cultivos de Murashige y Skoog (1962).

49

Cuadro 2. Sales mayores del medio de cultivo de Gamborg et al. (1968)..

50

Cuadro 3. Anlisis de varianza del efecto de tres variedades y la relacin del embrin/vulo sobre el tamao del vulo y del fruto.

58

Cuadro 4. Comportamiento de la longitud de fruto de tres variedades de mango con semillas de tres relaciones en tamao del embrin/vulo...

59

Cuadro 5. Comportamiento de la longitud del vulo de la semilla de tres variedades de mango con semillas de tres relaciones en tamao del embrin/vulo...

60

Cuadro 6. Anlisis de varianza del efecto de la variedad y la relacin embrin/vulo sobre la respuesta embriognica en medio de cultivo de induccin..

63

Cuadro 7. Potencial embriognico de tejido nucelar de tres estados de relacin en tamao del embrin/vulo de tres variedades de mango despus de nueve semanas en medio de cultivo de induccin...

64

Cuadro 8. Anlisis de varianza del efecto de la variedad y el estado fsico del medio de cultivo sobre el incremento en peso y el nmero de embriones desarrollados en medio de mantenimiento..

65

Cuadro 9. Efecto variedad-estado fsico del medio de cultivo sobre el incremento en peso de 100 mg de tejido embriognico de mango despus de cuatros semanas en medio de cultivo de mantenimiento..

68

Cuadro 10. Nmero de embriones somticos desarrollados a partir de 100 mg de tejido embriognico en dos estados fsicos del medio de cultivo de mantenimiento en tres variedades de mango despus de cuatros semanas en medio de cultivo de mantenimiento.

69

Cuadro 11. Anlisis de varianza del efecto de la variedad y el estado fsico del medio de cultivo sobre el incremento en peso y el nmero de embriones desarrollados en medio de recuperacin.

71

2

Cuadro 12. Incremento en peso de 100 mg de masas proembriognicas en dos estados fsicos del medio de cultivo en dos variedades de mango despus de 30 das en medio de cultivo de recuperacin..

72

Cuadro 13. Efecto variedad-estado de desarrollo sobre el nmero embriones en estado temprano (3-5 mm) desarrollados a partir de 100 mg de masas proembriognicas de mango despus de 30 das en medio de cultivo de recuperacin...

73

Cuadro 14. Nmero de embriones somticos hiperhdricos en estado temprano (3-5mm) desarrollados en 100 mg de masas proembriognicas en dos estados fsicos del medio de cultivo en dos variedad de mango despus de 30 das en medio de cultivo de recuperacin.

74

Cuadro 15. Anlisis de varianza del efecto de la variedad y la formulacin del medio de cultivo sobre la sobrevivencia, incremento en longitud, germinacin precoz y embriognesis secundaria de embriones somticos en medio de maduracin.

77

Cuadro 16. Porciento de sobrevivencia de embriones somticos en estado temprano (3-5 mm) de tres variedad de mango en cinco formulaciones del medio de cultivo despus de 30 das en medio de maduracin.

79

Cuadro 17. Efecto variedad-formulaciones del medio de cultivo sobre el porcentaje de embriones somticos en estado temprano (3-5 mm) con germinacin precoz despus de 30 das en medio de maduracin...

80

Cuadro 18. Efecto variedad-formulaciones del medio de cultivo sobre el porcentaje de embriones somticos en estado temprano (3-5 mm) con embriognesis secundaria despus de 30 das en medio de maduracin...

81

Cuadro 19. Anlisis de varianza del efecto de la variedad sobre la sobrevivencia y la emergencia de brotes y raz en embriones somticos en medio de germinacin....

82

Cuadro 20. Germinacin y sobrevivencia de embriones somticos de tres variedades de mango, despus de 30 das en medio de germinacin..

83

3

LISTA DE FIGURAS Pgina

Figura 1. Frutos inmaduros de tres variedades de mango 40 das despus de

la antesis......

48

Figura 2. Extraccin de nucela de vulo inmaduro de mango..

51

Figura 3. Etapas de desarrollo de la nucela en base a las relaciones embrin/vulo (1/3, y 2/3 ) evaluadas.

51

Figura 4. Nucela de mango al momento de ser explantada en medio de induccin...

52

Figura 5. Tejido embriognico (masas proembriognicas) de la variedad Ataulfo desarrollas a partir de nucelas despus de nueve semanas en medio de induccin....

53

Figura 6. Embriones somticos de la variedad Tommy Atkins en estado temprano (3-5 mm) subcultivados en medio de maduracin

55

Figura 7. Embriones somticos en estado dicotiledonal (10 a 20 mm. de longitud) en medio de germinacin.

57

Figura 8. Desarrollo de embriones somticos a partir de callo nucelar caracterstico de los variedad monoembrinicos Haden y Tommy Atkins.

61

Figura 9. Desarrollo de masas proembriognicas a partir de tejido nucelar despus de 9 semanas en medio de induccin..

61

Figura 10. Embriognesis directa a partir del tejido nucelar, caracterstico de la variedad poliembrinica Ataulfo..

62

Figura 11. Embriognesis secundaria en la variedad Haden.. 66 Figura 12. Masas proembriognicas en medio slido de mantenimiento.

66

Figura 13. Masas proembriognicas en medio lquido de mantenimiento

67

Figura 14. Embriones en estado de corazn creciendo a partir de masas proembriognicas despus de treinta das en medio de recuperacin.

67

4

Figura 15. Embriones somticos hiperhdricos desarrollados en medio de cultivo de recuperacin slido y lquido despus de 30 das.

70

Figura 16. Embrin somtico de la variedad Tommy Atkins con germinacin precoz despus de 3 semanas en medio de maduracin.

75

Figura 17. Embrin somtico de la variedad Ataulfo con Embriognesis secundaria despus de 2 semanas en medio de maduracin....

76

Figura 18. Embriones somticos aberrantes de las variedades Ataulfo y Tommy Atkins despus de 4 semanas en medio de maduracin...

76

Figura 19. Embriones somticos necrosados de la variedad Haden despus de cuatro semanas en medio de germinacin...

84

Figura 20. Embriones somticos de la variedad Ataulfo con desarrollo del meristemo de raz despus de 30 das en medio de germinacin..

84

Figura 21. Germinacin de embriones somticos de mango despus de 60 das en medio de cultivo de germinacin

85

5

RESUMEN

Las variedades comerciales de mango Ataulfo, Haden y Tommy Atkins son afectadas

por la antracnosis y la pudricin interna del fruto, que hasta hoy no han sido resueltas

a travs de mtodos de mejoramiento convencionales. La manipulacin gentica de

este grupo de plantas es una alternativa para tratar de resolver los problemas

mencionados. Sin embargo para ellos se requiere un sistema eficiente de

regeneracin de plantas va embriognesis somtica, el cual no a sido establecido

para dos de las variedades de objeto de estudio. Por ello se planteo el objetivo de

evaluar la respuesta al proceso de embriognesis somtica de las variedades

Ataulfo, Haden, y Tommy Atkins. Para esto, nucelas de semillas inmaduras fueron

cultivadas en medio nutritivo conteniendo sales mayores de B5, sales menores y

complementos orgnicos de MS complementado con 400 mg/L de glutamina, 4.5 mM

de 2,4 D (cido diclorofenoxiactico), 60 g/L de sacarosa y 8 g/L de agar. El

potencial embriognico de la variedad Ataulfo result ser intermedio (12.38 %),

mientras que el potencial de Haden (2.86 %) fue bajo. El estado de desarrollo ptimo

de las nucelas para la induccin de embriognesis somtica resulto la relacin

embrin/vulo de 1/3. Las variedad Ataulfo y Tommy Atkins formaron masas

proembriognicas mientras que la variedad Haden, solo desarrollo embriognesis

secundaria. El agua de coco y el carbn activado no tuvieron efecto en la maduracin

de embriones somticos de las variedades estudiadas. Se logro la germinacin

completa de embriones somticos de la variedad Ataulfo, los cuales posteriormente

se transfirieron a suelo.

Palabras clave: mango, embriognesis somtica, variedades.

6

ABSTRACT

The commercial varieties of mango, such as Ataulfo, Haden and Tommy Atkins are

affected by the anthracnose and internal breakdown of the fruit mango and have not

been solved yet by conventional breeding methods. The genetic manipulation of this

group of plants is an alternative to solve the mentioned problems. Nevertheless,

before an efficient system of regeneration of plants via somatic embryogenesis is

required, which has not established yet for Ataulfo and Haden. For that reason It the

objective was to evaluate the response to the process of somatic embryogenesis of

the mango varieties Ataulfo, Haden, and Tommy Atkins. Thus, nucellus of immature

seeds was cultivated in a culture medium containing major salts of B5, minor salts

and organic complements of MS supplemented with 400 mg/L of glutamine, 4.5 mM

of 2,4- D, 60 g/L of sucrose and 8 g/L of agar. The embryogenic potential of the

variety Ataulfo (12.38 %) was moderately embryogenic while the potential of Haden

(2.86 %) was loin and being difficult to regenerate. The optimum state of development

for explanting the nucellus for the induction of somatic embryogenesis was the

relationship embryo/ovule of 1/3. The varieties Ataulfo and Tommy Atkins

development proembriogenic masses while the variety Haden only development

secondary embryogenesis. The coconut water and the activated charcoal didn't have

effect on the maturation of somatic embryos of the studied varieties. Only was the

complete germination of somatic embryos of the variety Ataulfo achieved. Well-

developed plantlets regenerated from somatic embryos have been successfully

established on soil.

Key words: mango, somatic embryogenesis, varieties.

7

I. INTRODUCCIN. El mejoramiento y la propagacin convencional han contribuido significativamente

por varias dcadas en el mejoramiento gentico de plantas, sin embargo,

actualmente una de los principales retos que tienen, es la necesidad de incrementar

la productividad por un lado y por otro el disminuir los costos de produccin, por lo

tanto en este sentido el uso de herramientas biotecnolgicas es una alternativa viable

para resolver estos retos (Mondal et al., 2004).

En el proceso de modificar la composicin gentica de las plantas a travs del uso de

la biotecnologa, el cultivo de tejidos tiene un importante papel, por que acta como

un intermediario entre los avances hechos por la biologa molecular en el aislamiento

y modificacin de genes y la regeneracin de plantas transformadas para ser

evaluadas por los genetistas y fitomejoradores (Smith y Drew, 1990).

Dentro de las tcnicas de cultivo de tejidos la embriognesis somtica representa un

mtodo eficiente para la regeneracin de plantas y se le ha preferido entre otros

mtodos, para ser usada en el mejoramiento gentico de frutales, debido

principalmente a la dificultad que existe para regenerar tejidos por otras vas, como la

organognesis, por el alto contenido de compuestos fenolicos en los explantes. (Litz

y Jaiswal, 1991). La embriognesis somtica se define como el proceso por el cual

clulas somticas desarrollan los estados de embriogenia y dan como resultado

plantas completas sin fusin de gametos (Merckle et al., 1990). Los principales

factores que afectan la embriognesis somtica in vitro son la variedad, el origen del

explante y la composicin del medio de cultivo, particularmente con respecto a las

hormonas (Zimmerman, 1993).

Litz et al. (1982) reportaron por primera vez la embriognesis somtica recuperada

de vulos de mango (Mangifera indica L.) poliembrinico. Ms tarde, los cultivos

embriognicos pudieron ser inducidos de tejido nucelar de cultivares poliembrinicos

(Litz et al., 1984) y monoembrinicos (Litz, 1984).

8

En mango la competencia embriognica es una caracterstica intrnseca de ciertas

variedades. Los niveles de competencia embriognica, la morfologa potencial de

explantes nucelares y el establecimiento de cultivos embriognicos proliferantes

dependen del cultivar utilizado (Litz et al., 1993). Las variedades de mango difieren

tanto en su respuesta a las condiciones de maduracin como en el tiempo requerido

para la diferenciacin de embriones somticos. Por lo tanto, cada fase de la

embriognesis somtica debe ser determinada emprica y experimentalmente en

cada variedad de mango (Litz et al., 1993; Litz, 1997; Litz et al., 1998).

Para poder lograr la manipulacin gentica in vitro de mango es necesario contar con

la disponibilidad de un protocolo eficiente de regeneracin a partir de cultivos

celulares (Litz et al., 1982). Para as junto con otras herramientas biotecnolgicas,

poder resolver los principales problemas del mango, sin alterar la integridad de los

clones, adems el tiempo del mejoramiento gentico puede ser liberado del problema

del largo periodo juvenil y los aos adicionales para la evaluacin de rboles en

campo y por lo tanto superar los resultados obtenidos por las metodologas de

mejoramiento gentico convencional (Litz, 1997).

Actualmente la embriognesis somtica ha sido reportada en mas de 30 variedades

de mango (Litz, 1997), en las cuales no estn incluidas las variedades Ataulfo y

Haden, que junto con Tommy Atkins ya reportada por Litz (1984) son las variedades

mas importantes en la regin del pacfico de Mxico.

El desarrollar un protocolo eficiente de regeneracin de cultivos celulares de las

variedades Ataulfo, Haden y Tommy Atkins va embriognesis somtica, abre la

posibilidad, para poder resolver ms rpido y eficazmente algunos de los problemas

del mango, como la antracnosis y la pudricin interna del fruto, que hasta hoy no han

sido resueltas a travs de mtodos convencionales.

9

El conocimiento antes descrito sobre la embriognesis somtica del mango permite

plantear la hiptesis de que es factible establecer el proceso de embriognesis

somtica en las variedades de mango Ataulfo, Haden y Tommy Atkins.

Para probar la hiptesis se tiene como objetivo general:

Desarrollar el proceso de embriognesis somtica en las variedades Ataulfo, Haden y Tommy Atkins.

Con los objetivos especficos siguientes:

Evaluar la induccin de embriones somticos de nucela en tres estados de desarrollo de las variedades Ataulfo, Haden y Tommy Atkins.

Determinar la proliferacin de masas proembriognicas de las variedades Ataulfo, Haden y Tommy Atkins en medio de cultivo lquido y slido.

Evaluar la maduracin de embriones somticos de las variedades Ataulfo, Haden y Tommy Atkins en medio de cultivo lquido y slido.

Establecer la germinacin de embriones somticos de las variedades Ataulfo, Haden y Tommy Atkins.

10

II. REVISIN DE LITERATURA

2.1. Biotecnologa.

El trmino Biotecnologa es utilizado ampliamente, sin embargo se ha enfocado en

mayor medida a las tcnicas moleculares usadas para modificar la composicin

gentica de una planta, por ejemplo la transformacin gentica. Tambin se ha

descrito como, el uso de organismos vivientes o procesos biolgicos para producir

sustancias o procesos tiles para el hombre (Brown y Thorpe, 1995).

La biotecnologa agrcola tiene potencial para desarrollar practicas agrcolas ms

sustentables, por ejemplo plantas que expresan protenas que tienen un efecto

insecticida, reduciendo sustancialmente el uso de insecticidas comerciales

(Morandini y Salamini, 2003). La ingeniara gentica de plantas puede ser una

herramienta muy importante, para producir variedades, que expresen uno o ms

genes de resistencia a diferentes factores como: plagas, enfermedades, tolerancia a

sales, etc., y de esta manera incrementar al abasto mundial de alimentos (Yoshida,

2002; McCullum et al., 2003). Recientemente las tcnicas moleculares y de

ingeniera gentica se han empleado en investigaciones para la conservacin de

reservas de rboles forestales y programas de manejo forestal (Vengadesan et al.,

2002).

Los cultivos desarrollados por biotecnologa han estado en el mercado por solo 8

aos, pero han causado un gran impacto tanto en nuestra produccin de alimentos

como en la agricultura moderna (Harlander, 2002).

2.2. Cultivo de Tejidos.

Dentro de la biotecnologa moderna el cultivo de tejidos puede ser definido como el

cultivo de todo tipo de clulas, rganos, tejidos, embriones y protoplastos bajo

condiciones aspticas (Smith y Drew 1990). El cultivo de tejidos comprende una

gama de tcnicas, mtodos y estrategias in vitro que son parte del grupo de

11

tecnologas llamadas biotecnologa de plantas. El cultivo de tejido ha sido utilizado

para crear variabilidad gentica, mejorar la sanidad y para incrementar el

germoplasma disponible. Actualmente los protocolos de cultivo de tejidos estn

disponibles para la mayora de las especies aunque continua optimizndose (Brown

y Thorpe, 1995). Las tcnicas de cultivos de tejidos en combinacin con tcnicas

moleculares han sido utilizadas para incorporar caractersticas a las plantas a travs

de la transformacin gentica. Las tcnicas in vitro para el cultivo de protoplastos,

anteras, microesporas, vulos y embriones han sido utilizadas para crear una mayor

variabilidad gentica y generalmente para la produccin de haploides (Brown y

Thorpe, 1995).

El cultivo de clulas individuales y meristemos puede ser utilizado para erradicar

patgenos en las plantaciones comerciales y en consecuencia mejorar

sustancialmente la produccin. Los laboratorios de micropropagacin producen

plantas en gran escala para el comercio de ornamentales y la agricultura (Brown y

Thorpe, 1995). La aplicacin de las tcnicas de cultivo de tejido para la propagacin

clonal, tiene actualmente un gran uso debido a la alta demanda de biomasa de

productos forestales (Vengadesan et al., 2002).

El cultivo de tejidos de plantas tiene un importante rol en estudios bsicos y

aplicados, incluyendo el mejoramiento gentico y son una herramienta, que junto con

otros mtodos biotecnolgicos permiten modificar y mejorar las plantas cultivadas

(Brown y Thorpe, 1995).

Dentro de las tcnicas de cultivo de tejidos se encuentran: 2.2.1. Cultivo de embriones. Es una de las primeras tcnicas de cultivo de tejidos aplicadas al mejoramiento de

plantas. Consiste en extraer el embrin de una semilla y posteriormente desarrollarlo

bajo condiciones aspticas e in vitro hasta que desarrolle una planta completa para

poder transplantarlo al suelo. El principal propsito del cultivo de embriones, es el de

12

recuperar plantas (embriones) durante pruebas de hibridacin sexual entre plantas

de variedades cultivadas y especies distantes (Williams, 1982)

2.2.2. Cultivo de meristemos.

El cultivo de meristemos consiste en remover el meristemo con dos o tres primordios

de la hoja y subsecuentemente cultivarlos en un medio de cultivo especifico y al igual

que en la micropropagacin se pueden generar nuevas plantas va organognesis

esta tcnica es rutinariamente usado para la erradicacin de enfermedades virales

en combinacin con otras tcnicas como la termoterapia y la criopreservacin

(Manganaris, 2003; Keller y Senula, 2003).

2.2.3. Micropropagacin.

La micropropagacin puede ser considerada como una extensin de la mayora de

los mtodos de propagacin convencional, cuando partes de plantas seleccionadas

son puestas en un adecuado medio de cultivo bajo condiciones especificas de cultivo

in vitro, para incrementar la produccin de brotes y su posterior subcultivo en forma

repetitiva, hasta producir una gran cantidad de plantas, con las caractersticas

genticas de la planta original (Hussey, 1983). Las principales cualidades de la

micropropagacin son la rapidez y la multiplicacin clonal de genotipos de plantas

superiores libres de enfermedades y plagas (Smith y Drew, 1990).

Para cada cultivo en particular se deben de seguir generalmente dos rutas empricas

bsicas para la produccin de plantas, por un lado, la embriognesis somtica que

se caracteriza por exponer a altos niveles de auxinas diferentes tejidos, para inducir

la formacin de estructuras embriognicas. La otra ruta llamada organognesis,

consiste en la exposicin de diferentes tejidos a balances definidos de auxinas y

citocininas para inducir la formacin de rganos diferenciados como brotes

(Christianson et al., 1988; Jeannin et al., 1998).

13

2.2.4. Variacin somaclonal.

La variacin somaclonal, se define como la variacin gentica que puede ocurrir en

una poblacin de clulas que son manipuladas bajo condiciones in vitro y es una

herramienta importante en el mejoramiento gentico de plantas. Actualmente en los

programas de mejoramiento el uso del cultivo de tejidos para producir variantes

somaclonales es poco usado (Smith y Drew, 1990).

2.2.5. Seleccin in vitro.

La seleccin in vitro es una herramienta importante para la identificacin de lneas

celulares que pueden ser tolerantes o resistentes al estrs producido por fitotoxinas

de patgenos, herbicidas, bajas temperaturas y sales txicas de aluminio y/o

manganeso. La seleccin in vitro implica el someter alguna poblacin de clulas a

una apropiada presin de seleccin, recuperando lneas variantes que han

desarrollado tolerancia o resistencia a un factor. Posteriormente, a partir de esas

clulas seleccionadas, recuperar plantas completas con tolerancia o resistencia al

factor de seleccin (Smith y Drew, 1990; Jaysankar y Litz, 1998).

2.2.6. Produccin de haploides.

La produccin de haploides se basa principalmente en la tcnica de cultivo de

anteras que consiste en extraer las anteras y/o polen inmaduro de una planta y

explantarlos en un medio de cultivo adecuado. Y as inducir la regeneracin de

tejidos haploides a partir de las microsporas o el polen (Williams y Maheswaran,

1986). El cultivo de vulos sin fertilizar es otro mtodo para obtener haploides (Smith

y Drew, 1990). Las clulas haploides son ampliamente usadas en la seleccin in vitro

y pueden ser utilizadas para la produccin de plantas resistentes a varios

metabolitos inhibitorios secundarios, estrs ambiental, herbicidas y fitotoxina (Chaleff,

1983; Mazur y Falco, 1989).

2.2.7. Cultivo de protoplastos.

Consiste en el manejo de protoplastos de clulas a las cuales se les ha removido su

pared celular por medio de mtodos mecnicos y/o enzimticos (Smith y Drew,

14

1990). Los protoplastos han sido usados en investigaciones de DNA recombinante

para la manipulacin de los genes en plantas (Caplan et al., 1983). La regeneracin

de plantas a partir de protoplastos es mas complicada en comparacin con el cultivo

de clulas y callos. Por lo tanto esta dificultad limita su aplicacin a la hibridacin

somtica y al estudio de transferencia de genes (Smith y Drew, 1990).

2.3. Embriognesis Somtica.

En varias especies de plantas, en complemento con la formacin de embriones

sexuales (embriognesis cigtica), existe otra alternativa posible. La formacin de

embriones a partir de clulas somticas (embriognesis somtica). Varios tipos de

embriognesis han sido definidos: a) Andrognesis: embriones originados de

microsporas; b) Partenognesis: embriones originados de oosporas u vulos; c)

Ginognesis: embriones originados de oosporas que no estn completamente

fertilizadas y d) Apometra: describe el origen de embriones tanto de clulas

sinrgidas como de antpodas (Sharp et al., 1980).

Se han reportado ejemplos especficos de embriognesis somtica que ocurren in

vivo. Este fenmeno es conocido como una forma de apomixis obligada llamada

embriona adventicia (Merkle, 1990) que se caracteriza por un crecimiento y

desarrollo embrionario de clulas somticas despus de la fertilizacin. Sin embargo,

el proceso de embriognesis somtica es mejor conocido, como un camino de

regeneracin in vitro (Merkle, 1990). Comparativamente el desarrollo de embriones

somticos y cigticos en estado temprano, ha sido muy similar en diferentes

especies, sin embargo el desarrollo es ms variable en embriones somticos

(Mordhorst et al., 1997).

La embriognesis in vitro tiene gran potencial en estudios experimentales y es

ampliamente usada en la investigacin cuando se necesita resolver problemas

genticos de plantas, ingeniera gentica, prcticas de mejoramiento, para estudiar la

modulacin de la expresin de los genes requeridos en el desarrollo de embriones en

estado temprano para investigar los procesos de diferenciacin que se dan en la

formacin de plantas completas a partir de una clula (Kato y Takeuchi, 1963; Sharp,

15

et al., 1980; Wetherell, 1984; Zimmerman, 1993; Feher et al., 2002; Feher et al.,

2003). La embriognesis somtica in vitro tambin se ha considerado como un

avance en las tcnicas de micropropagacin, aunque todava presenta problemas en

la reconversin ha planta comparada con la organognesis (Smith y Drew, 1990).

La embriognesis somtica fue descrita por primera vez en plantas de zanahoria

(Steward et al., 1958) cuando se observ el desarrollo de estructuras embriognicas

in vitro. Comenzando con el desarrollo globular de embriones somticos, que

despus se transformaron en embriones en estado de corazn, posteriormente

estado de torpedo y finalmente germinaron produciendo plantas frtiles. Los factores

que afectan esta frecuencia de eventos fueron estudiados en detalles y optimizados,

resultando protocolos con alta produccin de embriones bien desarrollados. Debido a

la perfeccin del protocolo, el cultivo en suspensin de clulas somticas de

zanahoria se us como el modelo favorito en el estudio de mecanismos

embriognicos (Kato y Takeuchi, 1963; Wetherell, 1984).

2.3.1. Conceptos de embriognesis somtica.

Proceso por el cual las clulas somticas, desarrollan los estados de embriogenia y dan como resultado plantas enteras sin fusin de gametos

(Merckle et al., 1990).

Se refiere al desarrollo de estructuras embriognicas a partir de clulas de origen somtico (no sexual) (Smith y Drew, 1990).

La formacin de un embrin a partir de una clula, sin la necesidad de la fusin de gametos (Tisserat et al., 1979)

2.3.2. Morfologa de la embriognesis somtica.

En el caso de las dicotiledneas, un embrin somtico es morfolgicamente similar a

un embrin cigtico, sobre todo en su desarrollo evolutivo desde proembrin, fase

globular, corazn, torpedo y fase cotiledonal o embrin maduro (Yasuda et al., 2000).

16

En los estados iniciales, el suspensor esta en menor desarrollo en embriones

somticos (puede ser quizs un reflejo de inutilidad bajo condiciones in vitro). Otra

diferencia importante es que el embrin cigtico forma un eje embrional con el

meristemo apical, preparndose para la dormancia. Mientras que el embrin

somtico no sufre disecacin ni dormancia, as la embriognesis somtica se dirige

a formar de una clula, una planta sin interrupcin (Merckle, 1990).

Xu y Bewley (1992), con la ayuda de un microscopio electrnico describieron los

contrastantes patrones de desarrollo entre los embriones somticos y cigticos,

destacando un desarrollo lento en los estados tempranos y un desarrollo ms rpido

en los estados tardos del embrin somtico en comparacin con el cigtico; otra

diferencia fue la falta de un suspensor bien definido y la formacin de mltiples

cotiledones mal desarrollados en embriones somticos.

La embriognesis somtica es similar al desarrollo in vivo a partir del estado de

torpedo. A partir de ese estado el desarrollo de embriones somticos,

particularmente el desarrollo programado de los meristemos, sigue un camino que en

un sentido muestra ms analoga con la organognesis (Ammirato, 1983: Sung y

Okimoto, 1981; Nomura y Komamine, 1985).

2.3.3. Embriones Somticos.

Los embriones somticos son estructuras bipolares que cuentan con: un eje radical y

otro apical, cotiledones, no poseen conexin vascular con el tejido materno y

presentan bandas procambiales entre los pices (Zimmerman, 1993). Su desarrollo

es nutrido por clulas vecinas a travs de conexiones protoplasmticas, estas

estructuras bipolares son capaces de crecer y formar plantas normales, debido a la

naturaleza bipolar del embrin, es posible la alta velocidad de multiplicacin

(Escalant y Teissont, 1989; Sharp et al., 1980; Zimmerman, 1993).

17

Yasuda et al. (2000) describieron en zanahoria una inusual secuencia de estados

morfolgicos en la formacin de embriones en estado de corazn a partir de masas

proembriognicas.

2.3.4. Epigentica: direccin de la embriognesis.

La direccin de la embriognesis es medida como epigentica: que es la distancia de

las clulas del explante hasta el estado embriognico. Se han clasificado a las

clulas no embriognicas como (CNEs) y a las clulas pre-embriognicas clulas

determinadas a inducir embriogenia como (CEs) (Sharp et al; 1980; Sharp et al.,

1982; Evans et al., 1981). Las CEs son epigenticamente embriognicas al

explantarlas y son determinadas durante el ciclo mittico celular, ejemplo: clulas de

embriones cigticos, en cambio las CNEs son el producto de un arranque

epigentico del estado embriognico en el medio de cultivo, se originan de clulas

que reingresan al ciclo mittico celular y se rediferencian a CEs (Sharp et al., 1980).

Los reguladores de crecimiento (auxinas y/o citocininas) son los agentes primarios

que determinan a las CNEs, mientras que en las CEs actan como activadores del

desarrollo (Sharp et al., 1980). Una vez inducido las CNES, funcionan equivalente a

CEs y ambos pueden mantenerse y multiplicarse en el estado embrionario bajo

condiciones apropiadas de cultivo, tales cultivos consisten de proembriones

globulares masas proembriognicas proliferantes (MPEs).

La embriognesis puede ser directa con clulas embriognicas desarrolladas

directamente del explante, o puede ser indirecta, con desorganizados ciclos mitticos

no embriognicos interpuestos entre el explante de tejido diferenciado y estructuras

embriognicas reconocidas (Merkle, 1990). Por lo tanto la diferencia crtica entre

embriognesis directa e indirecta es la diferencia entre CEs y CNEs.

La embriognesis directa e indirecta tienen distintas ventajas y limitaciones con

respecto a su particular aplicacin. As clulas somticas CEs, son generalmente

18

ms fcilmente inducidas a producir embriognesis somtica que clulas vegetativas

diferenciadas CNEs (Merkle et al., 1990).

2.3.5. Potencial embriognico: adquisicin de totipotencia.

Los estudios definen el fenmeno de totipotencia como: cualquier clula de la planta,

puede actuar como un sustituto del cigoto para iniciar una nueva planta. Para poder

generar una planta, la embriognesis somtica debe desarrollar un estado de

embrin somtico desarrollar estructuras morfognicas, de las cuales, los rganos

individuales de la planta puedan surgir (Kato y Takeuchi, 1963; Wetherell, 1984).

Una vez adquirida la totipotencia es una capacidad larga y duradera, en este sentido,

una poblacin de clulas puede conservar esta propiedad, si es subcultivada en

presencia de auxinas por meses aos y todava tienen la capacidad de generar

embriones tan solo removiendo las hormonas (Zimmerman, 1993).

2.3.6. Embriognesis somtica directa

La embriognesis somtica directa, especialmente en ausencia de auxinas

exgenas, esta asociada con un perodo relativamente corto entre el tiempo de la

iniciacin cotiledonal y el comienzo de la maduracin de los embriones (Maheswaran

y Williams, 1986b). Durante este tiempo, en el explante aparece una clonacin

directa, desarrollndose as clulas embriognicas en un estado temprano. Del

amplio espectro de aplicaciones y condiciones asociadas con la embriognesis, se

busca enfatizar ms, en sistemas basados en embriones cigticos o explantes con

embriognesis somtica directa. Este proceso es conocido como clonacin

embrionaria. Se supone que estos explantes estn compuestos principalmente de

CEs o clulas que requieren una menor epigentica para programar la expresin al

estado embriognico. (Merkle et al., 1990).

Dentro de los factores que limitan la embriognesis directa se encuentra la

plasmolisis de las clulas explantadas descrita por Wetherell (1984). Este factor se

cree que afecta el estado epignico de las clulas y puede ser explicado por su

19

capacidad de interrumpir las interacciones clula-clula requeridas para mantener

coordinados los patrones de desarrollo (Merkle et al., 1990).

2.3.7. Embriognesis somtica secundaria.

El poder de las tcnicas de clonacin de embriones y su explotacin para:

propagacin, produccin de metabolitos, transformacin gentica tienen como base

la embriognesis recurrente tambin llamada repetitiva, accesoria, proliferante

secundaria. La cual ocurre cuando embriones somticos primarios fallan, para

madurar normalmente hasta plntulas y en lugar de eso dan origen a ciclos

sucesivos de embriones somticos, que provienen comnmente de clulas

superficiales de los cotiledones hipocotilo (Merkle et al., 1990).

2.3.8. Desarrollo anormal de embriones somticos.

In vivo el desarrollo normal embrionario es dado por el tejido circundante al vulo y

para imitar esta condicin in vitro, se debe ser hbil para facilitar el desarrollo normal

de embriones somticos (Merkle, 1990). Debido a la gran sensibilidad a los factores

externos. La embriognesis somtica presenta numerosos casos de desarrollo

anormal in vitro como son : La aparicin de estructuras de raz o brotes unipolares,

la formacin de mltiples cotiledones, embriones secundarios, complejos de clulas

proembriognicas callo de la cual surgen brotes adventicios, races, hojas y

algunos rganos florales y finalmente la hiperhidricidad (Kevers et al., 1984; Merkle,

1990).

2.3.9. Hiperhidricidad

La hiperhidricidad o vitrificacin (Debergh et al., 1992) es un serio problema que

afecta a varias plantas que son cultivadas in vitro (Kevers et al., 1984). Los tejidos

hiperhdricos se caracterizan por una apariencia vidriosa, tallos y hojas traslcidas y

una distorsin de sus rganos (Brand, 1990). El desarrollo y supervivencia de

cultivos hiperhdricos es muy bajo (Debergh y Maene, 1984). Se ha descrito que la

hiperhidricidad esta asociada con varios factores del medio del cultivo incluyendo un

bajo potencial matrix (Debergh, 1983), baja concentracin de agente gelificante, altas

20

concentraciones de citocininas y la presencia de alguno de los nutrientes del medio

de cultivo.

En cultivos de membrillo el aumento del calcio elimin la hiperhidricidad (Singha et

al., 1990) y se registr que los bajos niveles de potasio estn asociados con la

hiperhidricidad. Tambin al remover iones de cloro se encontr que tambin se

reduce la hiperhidricidad en Prunus, en tanto que en Salix los iones de amonio

estuvieron asociados con la hiperhidricidad, aunque tambin se describi, que est

basada en la adiccin o reduccin de nitrato de amonio (Brand, 1990).

2.4. Fases de la embriognesis somtica

Induccin de embriognesis somtica Proliferacin y mantenimiento de embriones somticos Maduracin de embriones somticos Recuperacin de embriones somticos

Maduracin de embriones somticos

Germinacin de embriones somticos

2.4.1 Induccin de embriognesis somtica.

2.4.1.1. Tipo de explante.

La Embriognesis somtica han sido inducida a partir de una gran variedad de

explantes de plantas, generalmente de embriones cigticos, semillas germinadas,

embriones inmaduros, cotiledones, brotes meristemticos, inflorescencias inmaduras,

vulos, microesporas, hojas, estigma, estilo, clulas de raz, embriones somticos

inmaduros y en algunas especies a partir de nucelas (Kochba et al., 1972; Srinivasan

y Mullins, 1980; Litz, 1984; Lai y McKersie, 1994; Twyford y Mantell, 1996;

21

Rodrguez-Garay et al., 1996; Lee et al., 1997; Carimi et al., 1998; y Hofer et al.,

2000; Nhut et al., 2003).

2.4.1.2. Nucela.

La nucela es un tejido no-vascular muy utilizado para estudios experimentales en

ginognesis, desarrollo de plntulas nucelares, induccin de poliembriona,

endospermo y desarrollo de embriones (Hossain et al., 1993; Linnestad et al., 1998;

Dominguez y Cejudo, 1998). Se ha reportado que un inusual crecimiento nucelar

formacin de embriones adventicios ocurre de forma natural en por lo menos 16

familias de plantas. Actualmente se explota este tejido para la induccin de cultivos

embriognicos en varias plantas leosas. Gracias a la recuperacin de plantas de

tejido nucelar va embriognesis somtica se pueden eliminar enfermedades

sistmicas (Rangaswamy, 1981; Litz, Chavez y Moon, 1998),

2.4.1.3. Factores que influyen en la adquisicin de capacidad embriognica.

La adquisicin de capacidad embriognica en plantas mayores se debe a varios

factores intra- y extracelular (De Jong et al., 1993). Se conocen diferentes factores

qumicos y ambientales que influyen en la embriognesis somtica.

2.4.1.3.1. Hormonas.

La adquisicin de totipotencia es el paso ms critico en la embriognesis somtica y

el factor mas importante que la afecta, es la aplicacin de hormonas endgenas,

debido a que el uso de auxinas a altas concentraciones es necesario para causar la

desdiferenciacin y la estimulacin de la totipotencia, varias auxinas han sido

usadas para este propsito: la auxina natural IAA y otras sintticas como el cido

naphtalenacetico (NAA), el cido diclorofenoxiactico (2,4-D), plicoram, cido

picolnico y cinetina (Finstad et al., 1993; Desamero et al., 1994; Litz et al., 1998;

Xing et al., 2000; Cooke et al., 2002 .

El 2,4 - D es la auxina ms eficiente y la ms comnmente usada para la promocin

de embriognesis somtica ya que: 1) estimulan una rpida divisin celular; 2)

estimulan una divisin celular sincronizada que da como resultado clulas

22

proembriognicas y 3) estimulan la proliferacin de clulas proembriognicas (Litz et

al., 1998).

Cuando sol se uso benzilaminopurina (BAP) (citocinina) para inducir embriognesis

somtica resulto ser limitado a explantes (CEs) del hipocotilo de embriones muy

inmaduros. En contraste, las auxinas son efectivas en inducir embriognesis

somtica de un amplio rango de tejidos y estados de desarrollo, solo las auxinas

tienen el potencial para regenerar CNEs de tejido no embriognico (Merkle et al.,

1990).

Tulecke y McGranahan (1985) usaron la combinacin de ambos auxinas y citocininas

para inducir embriognesis somtica y en este caso no estuvo claro cada papel, si

estn presentes o no las citocininas en la induccin de embriones somticos.

Iantcheva et al. (1999) reportaron en Medicago la induccin de embriognesis

somtica en alta frecuencia con el uso de Thidiazuron (TDZ) y 6-Benzylaminopurina

(BAP). Mithila et al. (2003) inducieron con TDZ, embriognesis somtica a partir de

explantes de violeta africana.

2.4.1.3.2. Genotipo y tipo de tejido.

El genotipo, tipo de tejido y estado de desarrollo pueden ser factores determinantes

en la habilidad de respuesta comparativa a las auxinas o citocininas (Merkle et al.,

1990).

En alfalfa la respuesta embriognica es especfica del genotipo y altamente

hereditable, al parecer, controlada por dos genes codominantes (Hernndez y

Christie, 1989; Kielly y Bowley, 1992).

Nogan et al. (1989) describieron la embriognesis somtica de Medicago truncatula

como altamente dependiente del genotipo. Esta restriccin genotpica inhibe el uso

de ms fuentes de germoplasma para la introduccin de nuevas caractersticas

genticas (Das Neves et al., 1999).

23

Bailey et al. (1993a), reportaron que la formacin de cultivos embriognicos

proliferantes de soya es dependiente del genotipo. Lo cual fue corroborado por

Simmonds y Donaldson (2000), al evaluar 20 genotipos de soya de ciclo corto. Tanto

que con cebada, Castillo et al. (1998) evaluaron 18 genotipos y obtuvieron los

mismos resultados.

Merkle y Battle (2000) reportaron en Liquidambar styraciflua especie maderable, que

la induccin embriognica es fuertemente afectada por el genotipo y el tipo de

explante. En otra especie como Quercus robur L. Endemann y Wilhelm (1999)

describieron que el estado de desarrollo del explante, as como la influencia de la

estacionalidad, deben de ser considerados como factores importantes en la

induccin de embriognesis somtica.

En cacahuate (Arachis hypogaea L.) Baker y Wetzstein (1998), reportaron que la

respuesta embriognica en hojas, era influenciada por el estado de desarrollo del

explante, el tiempo de induccin y el medio de cultivo. En papa dulce se describi

que la respuesta embriognica es influenciada por el genotipo y las concentraciones

de auxinas (Desamero et al., 1994)

2.4.1.3.3. Enzimas y Genes.

Yu y Pauls (1993) identificaron un marcador que co-segrega con uno de los genes

que determinan la embriognesis somtica en alfalfa tetraploide.

Boyer et al. (1993) demostraron que ocurran cambios cualitativos y cuantitativos en

la sntesis de polipptidos (15 fueron especialmente acumulados) durante la

adquisicin de competencia embriognica en tejido de hojas de Chichorium.

En especies como zanahoria (Sung y Okimoto, 1981); arroz (Chen y Luthe, 1987);

maz (Franz et al., 1989); Pastos (Hahne et al., 1988) y chncharo (Stirn y Jacobsen,

1987); se han descrito diferencias en la sntesis de protenas entre tejido

embriognico y no-embriognico. En estos cultivos el desarrollo de callo

24

embriognico estuvo acompaado de la sntesis de polipptidos embriognicos

especficos en un rango entre 45 y 55 kDa.

Corre et al. (1996) describieron que el gen Em puede ser usado como un marcador

universal de la embriognesis somtica, ya que en estudios realizados con Triticum

aestivum L. estaba asociado con cultivos que expresaban potencial embriognico y

mas precisamente a cultivos que presentaban embriones somticos.

Dupire et al. (1999) reportaron 116 protenas dentro de 20 grupos potencialmente

relacionados con la embriognesis somtica de Asparagus officinalis L., de los

cuales, dos grupos fueron particularmente importante: 1) con 6 polipptidos que

estn relacionados con la competencia embriognica y 2) once protenas

relacionadas con la inhibicin de la repuesta embriognica.

En Lycium barbarum, la diferenciacin y desarrollo de clulas embriognicas es

regulada por tres distintas enzimas (disminutasa superoxidasa, peroxidasa y

catalasa); Al igual que el peroxido de hidrgeno utilizado como un agente de estrs

oxidativo, es capaz de inducir genes de expresin y sntesis de protenas para

promover la embriognesis somtica en esta especie (Kairong et al., 1999).

Cvikrova et al. (1999) describieron en explantes de alfalfa, que la alta actividad

meristemal y la formacin de proembriones correlacionaba con altas cantidades de

putrecina, espermidina, espermina y tiramida libre; al igual que tena una correlacin

negativa con contenidos de feniletilamina libre.

2.4.1.3.4. Otros factores.

Por otra parte, la densidad celular es tambin otro factor importante, que afecta le

embriognesis somtica (Higashi et al., 1998), al igual que las concentraciones de

Oxgeno (Kvaalen y Ernstsen, 1993).

25

Kikuchi et al. (1995) describieron que las cerradas uniones intracelulares son

esenciales para los procesos morfogenticos como la embriognesis y

organognesis.

Nakano y Mii (1993) en estudios hechos con Dianthus reportaron, que la cefatoxina

(antibitico), fue capaz de inducir embriognesis somtica en un medio sin auxinas.

Schmidt et al. (1994) asentaron que el factor Nod (Rhizobium lipoligosacarido), una

molcula bacterial, promueve la formacin de embriones globulares de zanahoria y

parte de su actividad puede estar relacionada con el balance de los reguladores de

crecimiento endgenos.

Pedroso y Pais (1995) en hojas de Camellia japonica estudiaron cambios en la

distribucin elemental, molecular, estructural e histolgica, durante la induccin de

embriognesis somtica. Encontraron severas fluctuaciones en el nmero de

cristales de oxalato de calcio y la acumulacin de almidn, que ocurri solo en tejidos

con respuesta embriognica.

En complemento Iwai et al. (1999), utilizando un microscopio electrnico para el

anlisis morfolgico y histoqumico de callo de zanahoria, reportaron la presencia de

estructuras amorfas en la superficie de callo embriognico de zanahoria mientras que

en la superficie de callo no embriognico no se presentaron dichas estructuras. As

como que en clulas cultivadas de zanahoria no existe correlacin entre los puentes

de calcio de las pectinas y las uniones intercelulares.

Por otra parte, en hojas de Chichorium, Bellettre et al. (1999) describieron que el

glicerol en comparacin con la sacarosa como fuente de carbn durante la fase de

induccin, tuvo un efecto inhibitorio en la respuesta embriognica.

Actualmente se conoce que la embriognesis somtica en zanahoria es promovida y

estimulada por una variedad de factores condicionantes, como son las protenas

26

arabinogalactan (Kreuger y Van Horst, 1993; Toonen et al., 1997), protenas

extracelulares (De Jong et al., 1992) y la fitosulfoquina-a (Kobayahi et al., 1999b).

Fisichella y Moroni (2003) describieron que la composicin de la atmsfera en el

frasco con cultivos de hojas de membrillo, puede influenciar la embriognesis

somtica de esta especie.

2.4.2. Proliferacin y mantenimiento de embriones somticos.

2.4.2.1 Eventos tempranos en presencia de auxinas.

Si las auxinas son retenidas en el medio, el proceso de la embriognesis se detiene

en alguna parte antes del estado globular de los embriones. El punto donde se

detiene es ms o menos tpico para cada una de las lneas de clulas. En las lneas

de clulas proliferantes de zanahoria se observaron varios estados de desarrollo

desde clulas indiferenciadas hasta embriones globulares, otras lneas solo

mostraron clulas indiferenciadas y MPE (Masas proembriognicas) (Zimmerman,

1993).

Los efectos en el desarrollo celular por la accin de las auxinas en un explante para

la induccin de desdiferenciacin por un lado y para la formacin de embriones

primarios (EMP) por el otro. Deben ser anotados para cada lnea de clulas. Esta

aparente contradiccin puede ser entendida si uno considera que una vez formados

los (EMP) pueden hacerse insensible a las auxinas. La sensibilidad a las auxinas es

recobrada en un estado posterior (post-globular), cuando los embriones en presencia

de auxina detienen su avance definitivo y regresan a tejido indiferenciado. Debido a

que los embriones (EMP) en estado globular no producen auxinas por lo que la

embriognesis procede normalmente. Despus del estado globular los embriones

comienzan a formar callo. Esto puede ser explicado, suponiendo la produccin y

transportacin en bloque de auxinas (IAA) almacenadas a partir del estado globular.

En consecuencia despus del estado globular los embriones comienzan a producir

auxinas y se hacen sensitivos a esta comportndose semejante al tejido somtico

(Zimmerman, 1993).

27

En Arabidopsis thaliana los altos contenidos intracelulares de 2,4-D pueden interferir

con el desarrollo de embriones somticos despus del estado globular (Meijer et al.,

1999). Dyachok et al. (2000) describieron que en Picea abies el factor Nod secretado

por la especie Rhizobium, estimula el desarrollo de masas proembriognicas en

medio suplementado con 2,4-D.

2.4.2.2. Clulas proembriognicas

Un tejido explantado in vitro consiste de varios tipos de clulas. Los explantes al ser

tratados con reguladores de crecimiento sus clulas comienzan a desdiferenciarse y

proliferar. Para la induccin del estado embriognico los explantes requieren de

extensos ciclos de clulas proliferando desorganizadamente, la muerte o perdida de

explantes celulares circundantes, y/o altos niveles de auxina sinttica. En presencia

de auxinas endgenas, despus de varios das (a veces semanas) una poblacin de

pequeas clulas compactas emergen (Nomura y Komamine, 1985). Esas pequeas

y compactas clulas divididas en forma asimtrica y sus clulas hermanas junto con

ellas, se amontonan como un tpico grupo de clulas acumuladas. Las cuales se

conocen como: masas proembriognicas agrupamiento embriognico. Sobre estas

masas proembriognicas se desarrollan los embriones somticos (Zimmerman,

1993).

Nimura y Komamine, (1985) en cultivos en suspensin de zanahoria determinaron 3

diferentes tipos de desarrollo celular. Los cuales clasificaron en: Tipo 1. Clulas de

forma esfrica que tenan un dimetro de 12 mM que podran diferenciar embriones a

una frecuencia cercana al 90 %. Tipo 2. Clulas de forma ovalada que solo

diferenciaron 10% embriones somticos. Tipo3. Clulas elongadas que no

diferenciaron embriones. Yasuda et al. (2000) describieron en zanahoria a partir de

clulas somticas individuales, la formacin de masas proembriognicas de diversas

formas y con varios patrones de divisin.

2.4.3. Maduracin de embriones somticos.

28

2.4.3.1 Obtencin de embriones somticos.

En embriones somticos en estado temprano, un alejamiento o disminucin de la

concentracin de auxinas en el medio de cultivo puede romper el ciclo de continua

proliferacin de masas proembriognicas y permitir a los embriones el desarrollo y

maduracin. Debido a que este alejamiento de auxinas ejerce un efecto de disminuir

la friabilidad aumentando los contactos clula-clula y permitiendo un incremento en

la polaridad dentro del grupo de clulas embriognicas (Merkle et al., 1990).

En el caso de zanahoria para que un embrin pueda emerger la masa

proembriognica debe tener por lo menos tres clulas. Aunque todas las clulas son

totipotentes, el nmero de embriones formado es pequeo comparado con el nmero

de clulas en las masas proembriognicas (Wetherell, 1984). En ese mismo trabajo

se determin que la plasmolisis de clulas proembriognicas, atrofia la interconexin

intracelular, permitiendo que ms clulas expresen independientemente su

totipotencia a travs de la formacin de embriones somticos.

Masuda et al. (1995) registraron la formacin de embriones somticos, a partir de

masas proembriognicas desarrolladas en la epidermis de zanahoria sin fase de

callo ni cultivo en suspensin. Kreuger y Van Holst (1995) describieron que las

protenas arabinogalactanas (AGPs) pueden incrementar (fraccin Zum18 AGP) o

inhibir (fraccin ZUM 15 AGP) el desarrollo de embriones somticos de zanahoria.

En complemento Toonen et al. (1997) evidenciaron que los diferentes cultivos en

suspensin de zanahoria tienen diferentes respuestas a una particular (AGPs) y que

era muy claro que los diferentes tipos de AGPs presentes en cultivos en suspensin

pueden ser tanto promotores como tambin inhibidores de la elongacin celular.

Overvoorde y Grimes (1994) indicaron que son necesarios 200 M de Ca2+ exgeno,

para lograr la formacin de embriones somticos de zanahoria. Litz (1986) sealo en

Carica papaya, que el estrs osmtico es un importante factor que condiciona la

embriognesis somtica de cultivos en suspensin. En palma de dtil se logro una

mejor recuperacin y desarrollo de embriones somticos en suspensin sin sacarosa

29

durante dos semanas (Veramendi y Navarro, 1996). Hohe et al. (1999) registraron

que la acumulacin de CO2 en cultivos en suspensin, incrementa la recuperacin

de embriones somticos de Cyclamen persicum Mill.

Fernando y Gamage (2000) en Cocos nucifera L. mencionaron que la incorporacin

de ABA en concentraciones de 2.5-5 M durante cinco semanas incrementaba la

formacin y desarrollo de embriones somticos en comparacin con los producidos

con bajos niveles de 2,4-D.

Biahoua y Bonneau (1999) describieron que: La ms alta frecuencia de

embriognesis somtica de Euonymus europaeus L. fue obtenida en el medio de

cultivo con concentraciones de 350 mM de sacarosa 89 mM de glucosa. Un mnimo

potencial osmtico es requerido para estimular la emergencia de embriones

somticos; Elevadas concentraciones de glucosa tienen un efecto inhibitorio

independientemente de su efecto osmtico, mientras que elevadas concentraciones

de sacarosa mantienen su presin osmtica al igual que estimulan la emergencia de

numerosos embriones somticos. Se ha reportado la produccin embriones

somticos de calidad y con un alta taza de conversin, en varias especies de

confieras (Stasolla et al., 2002).

2.4.3.2. Factores que inhiben la obtencin de embriones somticos.

Es conocido que el estado globular de embriones somticos, es el mas sensitivo de

todos los estados de desarrollo (Zimmerman et al., 1989) y que tratamientos con

diversos inhibidores como el cido benzil-isohexaloacetico (un anlogo de las

auxinas; Baldan et al., 1995), la pirimidina 2-amino-5-ethoxicarboril (una pirimidina

causante de la hipometilacin; Lo Schiavo et al., 1989) y la Brefeldina A (un inhibidor

de la secrecin de protenas, Capitano et al., 1997) causan un bloqueo en el estado

globular y en la produccin de poliembriones. Tambin se demostr la gran

sensibilidad de embriones somticos en estado globular a la temperatura (Lo Schiavo

et al., 1990).

30

Osuga et al. (1993) determinaron que cuando clulas embriognicas son cultivadas

en medio libre de auxinas a una alta densidad celular, la formacin de embriones

somticos de zanahoria se ve fuertemente reducida. Kobayashi et al. (1999a)

demostraron que la inhibicin es causada por un factor(es) que tiene un peso

molecular cercano a 3500 el cual es adicionado(s) al medio por clulas

embriognicas que han sido cultivadas a alta densidad. Kobayashi et al. (2000)

reportaron la purificacin y identificacin del alcohol 4-hidroxibenzil, el cual es el

mayor factor inhibitorio formado en el medio de cultivo por clulas de zanahoria a

altas densidades.

En un estudio realizado con membrillo, se determino que tanto la ventilacin del

frasco como el reemplazar la atmsfera del frasco con diferentes mezclas de gases

reducen la formacin de embriones somticos por lo que se cree que componentes

gaseosos diferentes a O2 y CO2 presentes en la atmsfera del frasco, pueden

promover la formacin de embriones somticos (Fisichella y Moroni, 2003).

2.4.3.3. Polaridad de embriones somticos

Una de las cuestiones mas importantes a considerar durante los mecanismos de la

embriognesis somtica, es lo relacionado a la diferenciacin celular y la polaridad

embrionaria durante la primera divisin celular (Feher et al., 2002).

La formacin de embriones somticos prosigue del establecimiento de la polaridad

en clulas indiferenciadas. A su vez la polaridad acciona para inducir la formacin de

embriones somticos (Merkle et al., 1990). En ciertos instantes, se pueden aumentar

la polaridad y as aumentar la diferenciacin de MPEs (Dijak et al., 1986).

La polaridad en el desarrollo de embriones en estado globular a embriones en estado

de corazn es regulada por el transporte polar de auxinas. Este transporte esta

ntimamente relacionado con la iniciacin y el mantenimiento del crecimiento

polarizado de embriones somticos. Al interferir con este transporte se promueve la

formacin de embriones con cotiledones fusionados (Liu et al., 1993). Binarova y

31

Dolezel (1993) describieron que el rompimiento del esqueleto celular microtubular (el

cual juega un importante rol en la generacin y mantenimiento de la polaridad

celular), interrumpe la embriognesis somtica de cultivos en suspensin de alfalfa y

zanahoria.

2.4.3.4. Factores que intervienen en la maduracin de embriones somticos.

2.4.3.4.1. Acumulacin de protenas.

Los embriones somticos no acumulan la misma cantidad de protenas que se

observan en semillas in vivo. Se han detectado en embriones somticos de alfalfa

10% de las protenas almacenadas que se encuentra en embriones cigticos (Stuart

et al., 1988). Embriones somticos son menos vigorosos que las semillas in vivo. En

consecuencia, si se incrementa la acumulacin de protenas, podra ser posible

incrementar el vigor de embriones somticos (Stuart et al., 1988).

Flinn et al. (1993) en un estudio realizado con abeto, reportaron que exista similitud

en la regulacin de la expresin del gen de reserva de protena, durante los estados

tempranos e intermedios de la embriognesis somtica y cigtica. Pero existieron

diferencias en la expresin de genes en los estados posteriores durante la

maduracin, lo cual puede ser atribuido a la influencia de la disecacin de los

embriones cigticos, la cual no ocurre en embriones somticos.

Reid et al. (1999a) describieron que las reservas almacenadas de nutrientes

minerales (P,K,Mg,Ca,Fe y Zn) fueron similares tanto en embriones somticos como

en embriones cigticos individuales de Picea glauca (Moench)Voss. En complemento

trabajando con la misma especie Ried et al. (1999b) encontraron que embriones

somticos y embriones cigticos tambin tienen una composicin muy similar en los

globoides y los Fe-rich. Por lo cual es factible pensar, en los embriones somticos

como una herramienta para desarrollar estudios nutrimentales que no son posible

estudiar con embriones cigticos.

32

2.4.3.4.2. Sacarosa

La sacarosa es un metabolito ampliamente utilizado en la regulacin del desarrollo

tanto de embriones somticos como cigticos (Anandarajah y McKersie, 1990). Para

producir plantas vigorosas, se requiere un perodo de crecimiento y maduracin

embriognica antes de la germinacin. Esto se logra normalmente utilizando medios

de cultivo con niveles del 3 al 6 % de sacarosa, aunque se han usado niveles que

pasan el 40 % en algunas especies (Lee y Thomas, 1985; Janick, 1986; Buchheim et

al., 1989). Incrementos progresivos en los niveles de sacarosa son usados para

lograr la maduracin, debido ha que altos niveles de sacarosa implican la disecacin

osmtica del medio (Merkle et al., 1990).

Concentraciones mayores a 30 g por litro detienen la germinacin precoz de

embriones somticos de M. Sativa y les permite continuar con los procesos de

maduracin sin la necesidad de ABA (Anandarajah y McKersie, 1990). Tremblay y

Tremblay (1995) reportaron que las concentraciones optimas de sacarosa para la

maduracin de embriones somticos de abeto negro variaron entre 4% y 6%, e

indicaron que la sacarosa acta principalmente como un regulador osmtico en la

maduracin de embriones somticos.

2.4.3.4.3. Densidad del explante.

El nmero de embriones somticos por unidad de medio influye en el desarrollo,

maduracin y adquisicin de tolerancia a la disecacin de embriones somticos, al

igual que en la germinacin de plntulas vigorosas (Lai et al., 1992).

2.4.3.4.4. Glutamina.

La inclusin de glutamina, alanina, prolina y arginina en concentraciones de 30 mM

en medio de regeneracin de M. sativa incrementa la produccin de embriones

somticos, su peso seco, la sntesis de protenas almacenadas, al igual que el

promedio de conversin a planta (Lai et al., 1992).

33

Khlifi y Tremblay (1995) con embriones somticos de abeto negro, reportaron que la

L-glutamina a concentraciones de 2 a 3 g l-1, puede ser usada como nica fuente de

nitrgeno para la maduracin, ya que incremento el nmero de embriones somticos

maduros en seis distintos genotipos. Morcillo et al. (1999) describieron que la adicin

de argenina y glutamina incremento la acumulacin de protenas en embriones

somticos de palma de aceite; pero que la acumulacin de protenas depende del

genotipo y aminocido utilizado.

Nuutila et al. (2000) describieron que en los estados embriognicos tempranos de

embriones somticos de cebada, se requiere la presencia de glutamina o otro

aminocido, para que pueda ser transformado hasta protenas. Tambin

determinaron que en los estados posteriores de maduracin y regeneracin la

necesidad de nitrgeno orgnico disminuye.

2.4.3.4.5. cido absisico (ABA).

El ABA tiene al menos dos funciones principales en los procesos de maduracin de

embriones somticos de alfalfa. El primero es prevenir la germinacin precoz de

embriones somticos a concentraciones de aproximadas a 1M (Anandarajah y

McKersie, 1990). El segundo es incrementar la tolerancia a la disecacin en el

estado de desarrollo cotiledonal, a concentraciones de 10 - 50 M. (Senaratna et al.,

1990).

Ammirato (1974) report que impidi la germinacin precoz de embriones somticos

en suspensin de alcaravea con ABA a 10-7 M. En complemento el ABA promovi el

desarrollo de cotiledones bien formados y suprimi la produccin de embriones

secundarios. Ammirato (1983) reporto que los mismos niveles tuvieron efecto similar

en cultivos de embriones somticos en suspensin de zanahoria. Basado en estos

resultados el propuso que la regulacin de la maduracin de embriones somticos

por ABA puede ser usado para facilitar cultivos en gran escala, plantaciones

mecanizadas, induccin artificial de dormncia y su incorporacin en semillas

artificiales. In vivo, existen altos niveles de ABA durante la maduracin temprana de

34

embriones dicotiledonales los cuales inducen la acumulacin de un grupo de

protenas hidroflicas, tambin el ABA le concede proteccin a la disecacin (Merkle

et al., 1990).

La funcin del ABA en la iniciacin de la acumulacin de reservas no es

desconocida. Debido a que cuando se inicia la acumulacin de reservas, esta

coincide con altos niveles de ABA endgena (Merkle et al., 1990). La aplicacin de

ABA exgena a embriones somticos en un estado adecuado, puede ayudar a

recuperar un mayor nmero de embriones somticos normales (Merkle et al., 1990).

Shiota et al. (1999) reportaron que diferentes tratamientos de ABA en embriones

somticos de zanahoria, pueden permitir su almacenaje a temperaturas de -25 C

por ms de 169 semanas. Visser et al. (1999) desarrollaron la hiptesis de que las

protenas G estn involucradas en el efecto inhibitorio del ABA durante la

germinacin de embriones somticos de cebada.

2.4.4. Germinacin de embriones somticos.

El proceso que llamamos germinacin, comienza con la prdida de humedad de la

semilla (inhibicin) y se completa cuando una parte del embrin generalmente la

radcula, se extiende penetrando las estructuras que lo rodean (Bewey, 1997).

Para que la germinacin ocurra en orden, los embriones somticos deben de tener

brotes funcionales y races capaces de tener crecimiento meristemtico (Merkle et

al., 1990). Altos niveles de auxinas pueden inhibir el desarrollo y crecimiento de

brotes meristemales. Por lo que si embriones jvenes no son transferidos a un medio

con baja concentracin o sin presencia de auxinas, despus de la induccin a

embriognesis estos no madurarn adecuadamente y generarn embriognesis

secundaria. (Muralidharan y Mascarenhas, 1987; Gorst et al., 1987; Parrott et al.,

1988).

En esta etapa puede ser necesaria la adicin de carbn activado al medio de cultivo

para remover la mayor cantidad de auxinas como sea posible de los embriones

35

somticos (Buchheim et al., 1989). A bajos niveles de auxinas despus de la

iniciacin de los cotiledones, se logra una temprana formacin de brotes. En

condiciones no apropiadas de cultivo, la germinacin puede ocurrir prematuramente,

teniendo como consecuencia plntulas dbiles o sin viabilidad (Merkle, 1990).

Para algunas especies, la eficiente conversin a plntula requiere la imposicin de

una disecacin temporal antes de la germinacin. Este procedimiento imita la

maduracin de semillas in vivo y puede ser necesario para iniciar los procesos

metablicos necesarios para la germinacin y crecimiento de plntulas in vitro.

(Rosenberg y Rinne, 1988).

Gjuleva y Arnold (1999) reportaron que solo embriones perfectamente desarrollados

de Picea abies fueron capaces de desarrollar hasta plantas normales, tambin

determinaron que el extracto de semillas afecta positivamente tanto a embriones bien

desarrollados como a embriones con pobre desarrollo, pero solo en el periodo inicial.

En palma de aceite se logro la germinacin de embriones somticos derivados de

cultivos de suspensin con diferentes niveles de BA (6-benziladenina) (Aberlenc-

Bertossi et al., 1999).

2.4.5. Recuperacin y aclimatacin de plntulas.

En la mayora de las especies de plantas, la regeneracin de plantas es un factor

bsico en el cultivo de tejidos, la micropropagacin a gran escala y en la

transformacin gentica (Nhut et al., 2003)

En soya, entre los factores que tienen mayor influencia para la recuperacin de

plantas son; el tiempo de exposicin a las auxinas (Parrott et al., 1988), el genotipo

de la planta (Bailey et al., 1993b), morfologa de los embriones somticos (Lazzeri et

al., 1985), la falta de elongacin del hipocotilo (Komatsuda et al., 1992), el desarrollo

de los cotiledones y tratamientos de deshidratacin durante la germinacin

(Buchheim et al., 1989).

36

Plntulas que crecieron in vitro en una atmsfera saturada de humedad mostraron un

reducido desarrollo de ceras cuticulares y funcin anormal de los estomas (Wetztein

y Siommer, 1983). En la fase de aclimatacin mientras que hojas y races normales

se desarrollan, las perdidas de plntulas pueden ser altas si no son protegidas de la

perdida de agua al transpirar. Debido a que las plntulas deben estar sujetas a ir

reduciendo progresivamente la humedad. La aclimatacin de plntulas presenta un

problema en la micropropagacin comercial, (Merkle et al., 1990). La mayora de las

especies cultivadas requieren un proceso de aclimatizacin, para contar con una alta

sobrevivencia de plantas vigorosas, que nos permitan tener xito en el transplante

(Hazarika, 2003).

Para la aclimatizacin de plantas, la embriognesis somtica es una alternativa

debido a que se pueden evitar minimizar los problemas de aclimatacin, si los

embriones pueden ser removidos de su cultivo en madurez fisiolgica y germinar

bajo condiciones normales de crecimiento (Pretova y Williams, 1986).

2.5 Aplicaciones de la Embriognesis Somtica.

La embriognesis somtica es un modelo que nos permite estudiar y entender las

bases moleculares y celulares de plantas, as como estudiar la capacidad

embriognica de clulas somticas (Feher et al., 2003). En los ltimos aos se ha

utilizado para estudiar la capacidad embriognicas de clulas somticas utilizando

como modelo embriognesis de mutantes de Arabidopsis (Feher et al., 2003).

Ahora la manipulacin gentica de clulas tiene un alcance tal que el alto nivel de

refinamiento de las tcnicas regeneracin de plantas a partir de cultivos celulares es

extremadamente importante (Sharp et al., 1980). En este respecto, la embriognesis

somtica tiene muchas ventajas sobre la organognesis debido a:

Embriones a diferencia de brotes se originan de una clula individual. Los cultivos embriognicos pueden ser sincronizados y purificados. Se pueden tener cultivos de material homogneo.

37

Algunas especies son recalcitrantes a la embriognesis somtica, as como algunos

cultivares de la misma especie. Los recientes hallazgos de mutantes y variantes

epignicas desvirtan a la embriognesis somtica, pero puede ser resuelta con

adicin al medio de factores condicionantes (glicoprotenas) secretados por cultivos

embriognicos, particularmente si estos factores condicionantes comprueban no ser

especficos (Sharp et al., 1980).

En frutales tropicales el uso de la gentica de clulas somticas para mejoramiento

gentico, depende de la disponibilidad de protocolos eficientes para la regeneracin

de plantas a partir de explantes de rboles maduros. La recuperacin de cultivos

embriognicos a partir de tejido maduro de rboles tropicales y subtropicales

depende de la especie, cultivar, tipo de explante (estado de desarrollo) y el medio de

induccin (Litz et al., 1998a).

Los cultivos embriognicos de especies tropicales y subtropicales han sido utilizadas

para propagacin, seleccin in vitro a factores biticos y abiticos, aislamiento y

cultivo de protoplastos, transformacin gentica y para estudios de conservacin de

germoplasma (Litz et al., 1998a). Actualmente se est implementando el uso de

bioreactores de inmersin temporal, en especies leosas, los cuales representan una

alternativa para la produccin de semillas artificiales ( Etienne-Barry et al., 1999).

Ibaraki y Murata (2001) reportaron que la automatizacin de los procesos

biotecnolgicos puede incrementar el uso de la embriognesis somtica para la

micropropagacin, en dos sentidos: 1. Como una importante herramienta para la

investigacin en Embriognesis somtica y 2. Mejorando la eficiencia de produccin

de embriones con un reducido costo de produccin.

2.6. Organognesis en Mango.

Rao et al. (1981) describieron la induccin de races adventicias a partir de callo

iniciado de cotiledones de mango, en medio de crecimiento de Murashige y Skoog

38

(1962) MS, suplementado con cinetina y cido naftalenacetico (ANA). Sin embargo,

no observaron la diferenciacin de brotes.

Posteriormente el potencial morfogentico de hojas de rboles maduros de mango

fue demostrado por Raghuvanshi y Srivastava (1995), quienes iniciaron callo

caulognico a partir de hojas jvenes del variedad Amrapalli. Se controlo la

exudacin fenlica con un antioxidante (0.05% polivinilpirolidona). La formulacin

reguladora optima para la formacin de brotes mltiples a partir de callo de hoja fue

el medio MS que contena 13.0 M de cinetina junto con 1.1 M de cido indolactico

(AIA). El enraizamiento de los brotes se obtuvo al subcultivarlos en medio con 9.8

M de AIA. Los cultivos se mantuvieron a 25 C con fotoperido de 16/8 h

proporcionado por luz blanca fluorescente (50 70 micromoles ms).

2.7. Embriognesis somtica en Mango.

La embriognesis se a logrado en ms de 30 variedades de mango (Litz, 1997). Litz

et al. (1982) fueron los primero en inducir el crecimiento lento de callo in vitro de

explantes nucelares de mango, extrados de vulos fertilizados de frutos inmaduros

(4.0 4.8 cm.) de mangos poliembrinicos y posteriormente (Litz, 1984) de mango

monoembrinicos. En medio MS modificado: con la mitad de sales y complementado

con 60 gr./l de sacarosa, 400 mg/L de glutamina, 100 mg/L de cido ascrbico, 1.0

mg/L de 2, 4-D y 8.0 gr./L de Difco Agar. Se obtuvo embriognesis somtica a partir

de callo en este medio y posteriormente se subcultiv en medio sin reguladores.

De Wald et al. (1989a), estudiaron los componentes del medio y las caractersticas

que afecta el crecimiento de cultivos embriognicos nucelares de mango y la

produccin de embriones somticos in vitro. Se incluyo el papel de los

complementos orgnicos, formulaciones bsales, agentes solidificantes y estado

fsico del medio (slido liquido). Obteniendo los siguientes resultados: El

crecimiento de cultivo embriognico en suspensin fue ms eficiente que en medio

slido. Sin embargo, el cultivo en medio slido fue esencial para una alta frecuencia y

produccin de embriones morfolgicamente normales, el agente gelificante gelrite

39

fue ms efectivo con respecto al Bacto Agar Difco. El medio basal B-5 modificado fue

mejor para el mantenimiento de los cultivos embriognicos y la produccin de

embriones somticos morfolgicamente normales, en comparacin con los medio MS

WPN. La concentracin de sacarosa al 5 y 6% resultaron optimas para la

produccin de embriones somticos y tambin incrementaron la frecuencia de

embriones recuperados, quienes se diferenciaron normalmente a estado temprano

de corazn. El agua de coco al 20% mejor la produccin de embriones somticos

en 18%. Otros complejos orgnicos agregados solos en combinacin con agua de

coco fueron inefectivos (Casena Hidrolizada) altamente inhibitorios (Extracto de

malta) en comparacin con el testigo.

De Wald et al. (1989b) reportaron la maduracin y germinacin de embriones

somticos de mango que lograron por transferencias secuenciales de embriones

somticos en estado de corazn, a una serie de medios a base de la formulacin

B5. La germinacin precoz y otras anormalidades en el desarrollo, se controlaron con

la incorporacin de 3 M de cido absisico (ABA) y 6% (P/V) de sacarosa al medio.

Otros factores incluyendo: la sustitucin de Gelrite (0.175%) por Agar, el uso de

medio slido en vez de medio lquido y el cultivo de los embriones somticos en

oscuridad hasta la madurez fisiolgica, tambin afectaron el crecimiento y desarrollo

normal de los embriones. El agua de coco (20% V/V) fue esencial en la

embriognesis somtica. Los embriones somticos germinados se establecieron con

xito en medio de transplante y continuaron su crecimiento en el invernadero.

Jana et al. (1993) registraron un mtodo para la rpida produccin de embriones

somticos de tres cultivares monoembrinicos, a partir de tejido nucelar. El medio de

induccin consisti de medio MS suplementado con 5.0 mg/L de 2,4-D, 60 g/l de

sacarosa y 2.5 g/l de carbn activado. La maduracin de los embriones se observo al

reducir las concentraciones del medio basal suplementado con 1.0 mg/L de ABA,

20% de agua de coco, 100 mg/L de casena hidrolizada, 40 g/l de sacarosa y 2.5 g/L

de carbn activado. La normal germinacin de embriones somticos se vio

40

favorecida con 5 mg/L de BA. El desarrollo a planta se completo en un perodo de 75

a 80 das.

Monsalud et al. (1995) asentaron que la hiperhidricidad en embriones somticos

inmaduros de mango, es un factor limitante para el desarrollo de cultivos

embriognicos en suspensin de varios cultivares de Mango. La solucin ha este

problema se llevo a cabo por dos caminos.

1.-Embriones somticos en estado de corazn (2-3 mm) fueron parcialmente

deshidratados bajo condiciones controladas a una alta humedad relativa (RH) por un

lapso de 24 28 h.

2.-La concentracin del agente solidificante en medio con reguladores de crecimiento

fue incrementada de 2.0 hasta 6.0 g/l.

Los resultados obtenidos fueron los siguientes: la parcial deshidratacin de los

embriones somticos fue normal en apariencia, pero los embriones somticos

parcialmente deshidratados germinaron precozmente cuando se cultivaron en medio

de maduracin y el cido absisico (ABA) no revierte la hiperhidricidad en embriones

somticos primarios. El ABA (500 mM) estimul la reversin de este patrn anormal

en el desarrollo de embriones secundarios ya que inhibe la germinacin precoz y

permite la maduracin de embriones somticos. Los embriones somticos

parcialmente deshidratados (4-7 mm) permanecieron viables por encima de 32 das

en ausencia de medio de maduracin bajo una alta humedad relativa. El incremento

en las concentraciones del agente gelificante en el medio de cultivo, resulto en una

alta frecuencia de reversin de la hiperhidricidad (Monsalud et al., 1995).

Pliego-Alfaro et al. (1996) con la finalidad de lograr una maduracin completa de

embriones nucelares de mango mencionaron que el desarrollo en el estado

cotiledonal de embriones nucelares de mango disminuyo in vitro por la exposicin a

750 1750 mM de ABA, ya que la elongacin y germinacin de embriones

nucelares fue inhibida a lo largo de 4 semanas despus de ser subcultivado en

41

medio conteniendo ABA. Mientras que el Mannitol en concentraciones entre 7.5 y

12.5 % inhibi el desarrollo de embriones nucelares, al tener posiblemente un efecto

osmtico. No se observo efecto residual despus de subcultivar los embriones

somticos en medio sin mannitol. Temperaturas entre 22.5 y 37.5 C estimularon el

desarrollo embriognico, mientras que las temperaturas bajas (7.5 y 15 C) retardan

la germinacin. En el primer mes no hubo germinacin. En complemento embriones

somticos se establecieron 8 semanas a 7.5 C y posteriormente a 22.5 C y

despus de 2 meses, 86 % de estos embriones germinaron. Este resultado indico

que es posible frenar el desarrollo de embriones recalcitrantes con altas

concentraciones de ABA, mannitol o bajas temperaturas (Pliego-Alfaro et al., 1996).

Pliego et al. (1996b) sealaron que la inhibicin del crecimiento en embriones

somticos de mango fue inducida in vitro por ms de cuatro semanas con ABA (0

100 mM) con o sin alta osmolaridad provista por mannitol (0 10 %). La alta

osmolaridad y ABA afectaron significativamente la longitud de embriones somticos,

la germinacin precoz y la produccin de embriones somticos se