1

I. INTRODUCCIÓN

Los efectos carcinogénicos y embriotóxicos causados por los colorantes

artificiales, se conocen, sin embargo su uso sigue siendo sin duda de gran

importancia en ciertos productos, ya que gracias al color se perciben

sensaciones agradables a la vista, además de ser un factor estético.

En los últimos tiempos, la industria cosmética, alimenticia y farmacéutica, se

han preocupado por brindar al consumidor productos de alta calidad que

sean seguros, es decir que posean los menores efectos secundarios y que a

la vez proporcionen vitaminas, minerales y todos aquellos elementos

capaces de mejorar la salud de la población.

Los colorantes naturales se han utilizado desde tiempos antiguos, pero hoy

en día vuelve a tener un papel importante en la industria, esto debido a la

gran exigencia de la población por consumir productos seguros, eficaces y

de calidad.

El mastuerzo es una planta muy conocida, autóctona del Perú. La población

desde nuestros antepasados lo empleaba para curar heridas. Su actividad

como antibiótico fue observado tempranamente. En medicina popular se

utiliza el cocimiento caliente de flores y ramas, en forma de compresas y

baños, para tratar afecciones de la piel y lavar heridas; esta misma

preparación se administra oralmente para combatir afecciones bronquiales y

de las vías urinarias; para estos mismos fines también se suele usar el jugo

2

fresco de la planta, que actualmente es de cultivo silvestre,

desaprovechando una fuente muy buena de colorante natural a partir de sus

pétalos de flores que pueden ser utilizados en la industria alimentaria como

en la industria farmacéutica y cosmética, sin mencionar su capacidad

antioxidante y contenido de compuestos bioactivos como los compuestos

fenólicos, antocianinas y betacaroteno.

En este trabajo de investigación se plantea la posibilidad de extracción de

colorante con disolventes orgánicos y el uso de los pétalos secos como

alternativa para su uso como colorante y evaluar su estabilidad, incentivando

así a la industrialización y contribución en la revalorización de la

biodiversidad de cultivos no tradicionales que tiene el departamento de Junín

permitiéndonos generar un soporte científico para validar una producción

sostenible.

En el presente trabajo se tienen los siguientes objetivos:

- Evaluar el efecto del solvente (agua, etanol y metanol) en el

rendimiento durante la extracción de antocianinas de los pétalos de

mastuerzo.

- Evaluar la estabilidad de las antocianinas frente a la temperatura, pH

y tiempo de almacenamiento.

3

II. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

2.1 El mastuerzo (Tropaeolum majus L.)

2.1.1 Historia

El Mastuerzo es junto con la papa, el tomate y el maíz, uno de los

grandes regalos que el continente americano hizo al europeo.

Aquellos conquistadores españoles, asombrados al ver ante sus

ojos tantas especies desconocidas para ellos (plantas, aves,

insectos), es muy posible que el Mastuerzo les llamara la atención

como simple planta ornamental. Y con esa intención se la llevaron

al viejo mundo. Pronto, sin embargo, se pusieron de manifiesto sus

notables propiedades medicinales.

Según Nanzi (1999), menciona que Francisco Hernández fue el

primero en escribir sobre las virtudes de esta planta, en su obra

Historia de las plantas de México, publicada en 1615, en “Flora

Española”, tomo IV, página 9, donde menciona que la planta es

originaria del Perú y por medio de nuestros descubridores llego a

España.

Esta planta crece en terrenos húmedos y aguanosos, todo el año

florece, la planta aplicada en heridas de la piel las cura y cicatriza,

el consumo de flores y hojas son buenas para las ulceras y

escorbutos de la boca. (Nanzi, 1999)

4

2.1.2 Clasificación taxonómica

División : Fanerógama

Sub división : Angiosperma

Clase : Dicotiledóneas

Sud clase : Rosidae

Orden : Brassicales

Familia : Tropaeolaceae

Género : Tropaeolum L.

Especie : Tropaeolum majus L.

2.1.3 Habitat

La flor de Mastuerzo es una especie originaria de América del Sur

de la región de los andes, más precisamente del Perú.

Actualmente se cultiva en macetas y jardines por toda Europa, ya

que solo requiere tierra mullida y frecuentes riegos. En

Sudamérica es posible, además, encontrarla en estado silvestre,

desde México hasta Argentina. (Nanzi, 1999)

2.1.4 Denominaciones

Capuchina común, flor de amor, espuela de galán, cachaco de

muladar, jacinto, marañuelas, pelón, pensamiento, taco de reina,

berro de México, mastuerzo de indias, cappuccina (Italiano),

capucine (Francés), Nasturtium (Inglés), kapuzinerkresse

(Alemán), chagas, mastru, papagaios (Portugués). (Nanzi, 1999)

2.1.5 Descripción botánica

Planta herbácea con hojas alternas, simples, con limbo orbicular

7-12 cm, peciolo entre 12 y 40 cm de largo, flor hermafrodita,

hipógina con el receptáculo alargado por detrás y formando con la

5

base de los 3 sépalos posteriores un espolón de 2-3 cm de largo,

cáliz con 5 sépalos y pétalos unguiculados 23-38 x 24-35 mm, 8

estambres de diferentes tamaños, fruto esquizocárpico con 3

aquenios de 1 a 1,5 cm de diámetro, de forma globosa, con tres

ángulos redondeados. Souto et al. (2012) menciona que las flores

de la capuchina son de colores, membranáceas, lisas poco

cerosas, florece desde la primavera hasta el otoño y se multiplica

por semillas y gajos.

Las flores de Mastuerzo son de sabor picante, similar a los berros,

que es debido a la presencia de compuestos de azufre, sus frutos

son preparados en encurtidos a un estilo similar a la alcaparra

(Loja, 2002).

Habitat: Ambientes ribereños de riachuelos, acequias, lagunas.

Figura 1. Estructura de la flor de Mastuerzo (Nanzi, 1999)

6

Figura 2. Los pétalos y los sépalos, donde se puede observar que

los sépalos inferiores son conados, formando un espolón. Fuente: Souto et al., 2012

Fuente: Souto et al., 2012

Figura 3. Las variaciones de los colores de las flores de la capuchina (Tropaeolum majus L.)

Figura 4. Aspecto general de las flores de la capuchina (Tropaeolum

majus L.). Fuente: Salvat, 1977

7

2.1.6 Principales Componentes Químicos

a) Glucosinolato: presente en la semilla como la Sinigrina.

b) Flavonoides: Quercetina, kaempferol, isoquercitina.

c) Antocianidinas: Delfinidina, cianidina, pelargonidina,

pelargonidina 3-soforosa.

d) Acidos Fenólicos: ac. P-hidroxibenzoico, ac.p-

hidroxifenilacético, ac. Vanilico, ac. Gentisico, ac.

Protocatequico, ac. Siríngico, p-cumarico, ac. Ferúlico, ac.

Cafeico, ac. Sinapico.

e) Polisacarido: Xiloglucano, restos de β-D galactosa.

f) Carotenoides: luteína, zeaxantina.

g) Fracción volátil: isocianato de bencilo.

h) Enzima: mirosinasa (hidroliza la glucotropaeoline en

tiocianato), β-glucosidasa.

i) Vitamina: vitamina C.

Detallado por (Ghedira y Goetz, 2013).

2.1.7 Composición química de la flor de mastuerzo

Tabla 1. Composición química de los pétalos de la flor de mastuerzo

Componentes Cantidad

Vitamina C (mg/100g) 59.17

pH 5.78

Acidez titulable (% de ác. Cítrico) 1.14

Azucares Reductores (mg glucosa/100g) 30.45

Antocianinas Totales (mg/100g) b.s 78.36

Fosforo (mg/100g) 0.48

Potasio (mg/100g) 3.80

Calcio (mg/100g) 0.34

Magnesio (mg/100g) 0.15

8

Sodio (mg/100g) 0.09

Hierro (mg/100g) 6.47x10−3

Magnesio (mg/100g) 5.85x10−3

Cobre (mg/100g) 1.17x10−3

Zinc (mg/100g) 9.07x10−3

Molibdeno (mg/100g) 0.29x10−3

Fuente: Souto et al. (2012)

2.1.8 Usos medicinales

El uso de la flor de mastuerzo se emplea contra las infecciones de

las vías respiratorias (Sinusitis, rinitis, faringitis, y especialmente

bronquitis), Infecciones de las vías urinarias, Favorece a la

cicatrización de la piel debido a su elevado contenido en azufre y

revitaliza el cabello (Nanzi, 1999).

El mastuerzo se puede clasificar como una hoja de verduras,

flores y varilla, ya que toda la planta puede ser consumido natural

o en salsas y/o conservas. Las flores, hojas y frutas tienen sabor

amargo y picante, ya que contienen los compuestos de azufre,

que también están presentes en el berro. Además, sus flores y

hojas tienen altas concentraciones de vitamina C y minerales y

fosfatos (Zurlo y Brandao, 1989, citado en Souto et al., 2012).

Las flores de mastuerzo son ricos en luteína, utilizados para

prevenir enfermedades como las cataratas y la degeneración

macular. Son también utilizados en el tratamiento contra el

escorbuto, porque es rica en vitamina C y minerales, tales como

nitrógeno, azufre, yodo, hierro, potasio y fosfatos en

enfermedades pulmonares y como expectorantes. Las hojas y las

flores de mastuerzo ayudan a los procesos digestivos y de lucha

contra la crisis nerviosa e insomnios. El maceramiento material

resultante de sus hojas fresco se utiliza para combatir la caída del

cabello y el fortalecimiento del cuero cabelludo. El mastuerzo por

lo tanto, puede ser considerado como vegetales nutritivos en sus

9

hojas y flores (Panizza, 1997 y Bremness, 1993, citado en Souto

et al., 2012)

2.2 Flores comestibles

Las flores comestibles aportan sustancias biológicamente activas como

vitaminas A, C, riboflavina, niacina, minerales como calcio, fosforo,

hierro y potasio beneficiando la salud de quien las consume. Sus

características organolépticas y valor nutricional pueden considerarse

un alimento funcional. No todas las flores pueden consumirse por ser

toxicas. (Lara-Cortes et al., 2013)

2.2.1 Características sensoriales de las flores comestibles

Las flores comestibles pueden ser usadas para adicionar color,

fragancia y sabor a los alimentos, el mayor componente de las

flores es agua (más del 80% de su composición) por tanto son

ingredientes calóricamente bajos.

Un ejemplo es la flor de jamaica, la flor de color purpura tiene un

sabor muy parecido al de la frambuesa. Los geranios (Pelargonium

zonale) brindan fragancia a los pasteles, los pensamientos (Viola x

wittrockiana) se usan en ensaladas dulces y saladas o para

acompañar quesos, las capuchinas regalan sabores picantes a

ensaladas. (Lara-Cortes et al., 2013)

2.2.2 Color

El color puede afectar e influir en las preferencias de consumo. Por

ejemplo en el caso de la flor de capuchina, pueden atraer y

estimular el apetito.

El color amarillo puede estar asociado con un sabor cítrico, agrio,

mientras que el azul, el cual es muy raro, puede relacionarse con

alimentos que tienden a ser azucarados.

10

Tabla 2. Usos de las flores comestibles en la gastronomía

Nombre común

Origen Nombre

Científico Uso

Alheli Ecuador

Matthiola incana Son usadas especialmente en postres dulces.

Amapola Europa, Africa y Asia.

Papaver rhoeas Con los pétalos se aromatiza el vino.

Azucena Corea, China, Japon y zonas templadas de Asia.

Hemerocallis

fulva

En Asia se venden frescas o secas, y se conocen como agujas doradas. Se usan rellenas, en postres, ensaladas,

sopas y

compotas.

Begonia Zonas tropicales de Asia, Africa y América

Begonia x tuberhybrida, B. semperflorens.

Uso como

guarnición de

platos.

Boca de dragon

Portugal y sur de Francia, hasta el este de Turquia y Siria.

Antirrhinum

majus

Para ensaladas.

Borraja Norte de Africa y America del Sur.

Borago

officinalis

Para aderezar platos frios y ensaladas.

Campanilla Noreste asiatico, China y Japon.

Platycodon grandiflorus

Para ensaladas.

Capuchina Peru, Ecuador y Colombia.

Tropaeolum

majus

Para ensaladas se usan los petalos. Va muy bien con legumbres, patatas, arroz, o sopa.

Chira Costa Rica

Indigofera suffruticosa

Cremas, asadas

Claveles Cuenca mediterranea

Dianthus caryophyllus,

Ensaladas de frutas.

11

D. barbatus, D. plumarius

Crisantemos Asia,principalmente en China.

Chrysanthemum spp

Para ensaladas, sopas, salsas y vinagretas.

Geranio Africa del sur

Pelargonium

spp

Para postres, pasteles y bebidas

Girasol Suroeste de E.U.A. y norte de Mexico

Helianthus

annuus

Los capullos sin abrir se pueden hacer al vapor como las alcachofas.

Gladiolo Africa del sur Gladiolus spp Para ensaladas

y guarnición de

platos.

Jamaica Mexico Hibiscus

sabdariffa

Infusiones,

extractos,

ensaladas,

tortas,

mermelada

Fuente: Lara-Cortes et al., 2013

2.2.3 Antocianinas

Las antocianinas encontradas con más frecuencia en las flores

están la pelargonidina, cianidina y delfinidina.

En flores de tulipan (Tulipa spp.) la pelargonidina es responsable

de los colores naranja a rojo, cianidina del color magenta y rojo, y

delfinidina el color purpura. En la flor de jamaica delfinidina-3

sambubiosido y cianidina-3-sambubiosido, en la azucena la

cianidina-3-rutinoside y delfinidina-3-rutinoside son las

responsables del color, los diferentes estudios han manifestado

las propiedades antioxidantes de estos pigmentos. (Lara-Cortes et

al., 2013)

12

2.2.4 Composición de flores comestibles

Tabla 3. Composición proximal de algunas Flores Comestibles (g /100 g de

muestra)

Flor Humedad Proteína Fibra Ceniza

Agave (Agave salmiana) 87.4 16.4* 12.7* 5.8*

Colorin (Erythrina

americana) 86.6 26.2* 17.3* 9.6*

Cuaresma (Euphorbia

radians) 90.1 25.1* 12.6* 9.4*

Cuchunuc (Gliricidia

sepium) 84.7 1.9** 2.4** 0.7**

Gasparito (Erythrina

caribaea) 88.5 27.4* 17.7* 10.1*

Loroco (Fernaldia

pandurata) 90.3 0.3** 1.3** 1.0**

Madroño (Arbutus

xalapensis) 89.7 11.3* 10.4* 6.9*

Moringa (Moringa oleifera) NR 18.9* 32.45* 9.7*

Taro (Colocasia esculenta) 88.8 10.1* 17.8* 5.1*

Yuca (Yucca filifera) 88.1 25.9* 8.5* 9.7*

NR: No Reportado, * Datos expresados en base seca, ** Datos expresados

en base húmeda.

Fuente: López – García, 2007

2.3 Compuestos fenólicos

Los compuestos fenólicos o polifenoles constituyen un amplio grupo de

sustancias químicas, considerados metabolitos secundarios de las

plantas, con diferentes estructuras químicas y actividad, englobando

más de 8000 compuestos distintos. Su forma más frecuente es la de

13

polímeros o lignina insoluble, mientras que su presencia en tejidos

animales está relacionada con el consumo e ingestión de alimentos

vegetales. La distribución de los compuestos fenólicos en los tejidos y

células vegetales varían considerablemente de acuerdo al tipo de

compuesto químico que se trate, situándose en el interior de las células

o en la pared celular.

Sus principales funciones en las células vegetales son las de actuar

como metabolitos esenciales para el crecimiento y reproducción de las

plantas y como agentes protectores frente a la acción de patógenos,

siendo secretados como mecanismos de defensa. (Martinez-Valverde et

al., 2000)

2.3.1 Composición

Químicamente, los compuestos fenólicos son sustancias que

poseen un anillo aromático, un anillo benceno, con uno o más

grupos hidróxidos incluyendo derivados funcionales (ésteres, metil

ésteres, glicósidos, etc). La naturaleza de los polifenoles varía

desde moléculas simples como los ácidos fenólicos hasta

compuestos altamente polimerizados, como los taninos. Se

presentan en plantas en forma conjugada con uno o más residuos

de azúcar unidos a los gupos hidroxilo, aunque en algunos casos

se puede producir uniones directas entre una molécula de azúcar y

un carbono aromático. Por ello la forma más común de

encontrarlos en la naturaleza es en forma de glicósidos, siendo

solubles en agua y solventes orgánicos. Los azúcares asociados

a los polifenoles pueden ser monosacáridos, disacáridos o incluso

oligosacáridos. Los compuestos a los que se encuentran unidos

con más frecuencia son: glucosa, galactosa, arabinosa, ramnosa,

xilosa y ácidos glucorónico y galacturónico. También pueden

encontrarse unidos a ácidos carboxílicos, ácidos orgánicos,

aminas, lípidos y otros compuestos fenólicos. (Martinez-Valverde et

al., 2000).

14

Estos compuestos pueden acumularse como productos finales de

dos rutas bioquímicas distintas la ruta del shikímico, que genera los

fenilpropanoides y cumarinas, o la ruta del acetato, que

proporciona las fenonas más simples y varias quinonas. Además

pueden generarse a través de una ruta metabólica intermedia que

genera flavonoides, siendo éste el grupo más importante y

numeroso de los compuestos polifenólicos.(Piñeiro, 2005).

2.3.2 Clasificación

Según Harborne (1989) citado por Piñeiro, (2005), los compuestos

fenólicos se pueden agrupar en diferentes clases dependiendo de

la estructura química básica. Puede comprobarse que los ácidos

hidroxibenzoicos e hidroxicinámicos, así como los flavonoides,

están universalmente distribuidos en alimentos de origen vegetal.

Por el contrario los isoflavonoides constituyen un grupo discreto

cuya presencia queda confinada a la familia de las plantas

leguminosas.

a. Fenoles y ácidos hidroxibenzoicos

Dentro de este grupo los fenoles tienen una estructura C6 y C6-

C2, es necesario enfatizar la importancia de los ácidos

vainillínico gálico y p-hidroxibenzoico, abundantes en plantas

superiores y helechos.

b. Ácidos hidroxicinámicos

Constituyen el grupo más ampliamente distribuido de los

compuestos también conocidos como fenilpropanoides. Entre

ellos hay cuatro estructuras básicas que existen en su estado

natural libre y se corresponden con los ácidos cumárico, cafeico,

ferúlico y sinápico.

Muchas funciones biológicas están íntimamente relacionadas

15

con la presencia de estos compuestos en las plantas y

comprenden propiedades antibióticas y relacionadas con la

inhibición del crecimiento y germinación.

c. Estilbenos

Familia de compuestos constituida por dos ciclos benceno,

generalmente en lazados por una cadena etano o etileno (C6-C2-

C6). Entre los isómeros trans de estos compuestos, destaca el

resveratrol, o 3,5,4’-trihidroxiestilbeno, por sus propiedades

beneficiosas para la salud, y que parece generarse en la uva

como respuesta a una infección fúngica.

d. Xantonas

Estos compuestos poseen 2 anillos fenólicos unidos por un

átomo de carbono (C6-C1-C6). Las xantonas y sus derivados han

demostrado tener efectos beneficiosos sobre las enfermedades

cardiovasculares.

e. Taninos

Se refiere a una fracción de compuestos polifenólicos

especialmente astringentes, cuya característica fundamental es

su alto peso molecular. Estas estructuras poseen una alta

capacidad de asociación con otros polímeros biológicos

esenciales como las proteínas y los hidratos de carbono.

f. Flavonoides

Las principales estructuras de este grupo que podemos

encontrar distribuidas en alimentos son antocianinas, flavanoles,

flavanonas, flavonoles, flavonas, isoflavonoides y chalconas.

El término “aglicona” representa un flavonoide no unido a

ninguna otra sustancia química, independientemente del tipo de

flavonoide que se considere. El término “glicósido”, o más

generalmente “estructura glicosilada” se emplea para indicar

estructuras resultantes de la unión a cualquier tipo de azúcar.

16

2.4 Las antocianinas

Las antocianinas representan un factor muy importante en la

industria alimenticia debido a las restricciones sanitarias hacia el uso

de colorantes sintéticos (Konga et al., citado por López, Quiñones y

Echeverri .2007). Adicionalmente estas sustancias poseen un valor

agregado que es su capacidad antioxidante (Konga et al. y Jiao et al.,

citado por López, Quiñones y Echeverri .2007); por esta razón se

está creando un excelente mercado de exportación de frutas frescas

con un alto contenido de antocianinas.

Las antocianinas representa un grupo muy amplio de compuestos

fenólicos vegetales, estos son los pigmentos hidrosolubles rojos,

azules y púrpuras de las flores, frutas y verduras. Estas poseen una

estructura básica en común, químicamente son glicósidos de las

antocianinas (Wong, citado por Poo, 2005), es decir, están

constituidas por una molécula de antocianidina, que es la aglicona, a

la que se une un azúcar por medio de un enlace β-glucosídico. La

estructura química básica de estas agliconas es el ión flavilio. (Baudi,

1993), también llamado 2-fenil-benzopirilio (Wong, citado por Poo,

2005) que consta de dos grupos aromáticos: un benzopirilio (A) y

un anillo fenólico (B); el flavilio normalmente funciona como un catión.

(Badui, 2006, citado por Poo, 2005).

La estructura química básica de estas agliconas es el ion flavilio,

también llamado 2-fenil-benzopirilio que consta de dos grupos

aromáticos: un benzopirilio y un anillo fenólico; el flavilio normalmente

funciona como un catión (Wong, 1995 y Badui, 2006)

Con respecto a las estructuras de antocianidinas más ampliamente

distribuidas en el reino vegetal, los seis compuestos que se citan a

continuación son los responsables de la mayoría de la pigmentación en

los frutos: cianidina, normalmente encontrada en su estado molecular

libre (no glicosilado), es quizás la más común, seguida por la

17

delfinidina, peonidina, pelargonidina, petunidina y malvidina. (Piñeiro,

2005).

Las antocianinas son derivados del catión 2-fenilbenzopirilio y debido a

la poca solubilidad de éstas en agua, no se encuentran de manera libre

en la naturaleza, sino en su forma glucosilada siendo una de las más

abundantes la cianidina-3-glucósido (Walford, 1980; citado en Leyva,

2009)

Figura 5. Estructura del flavilio y la antocianina

Fuente: Poo, 2005

18

Figura 6. Estructuras de las Antocianidinas más importantes

Fuente: Espino, 2014

2.4.1 Biosíntesis de las antocianinas

Según Springob (2003) citado por Garzón (2008), Los

precursores de las antocianinas son bien conocidos, se ha

establecido experimentalmente que al anillo A de las antocianinas

se sintetiza por la ruta del ácido malónico con la condensación de

tres moléculas de malonil-CoA, mientras que el anillo B se sintetiza

por la ruta de ácido shikímico. El ácido shikímico da paso a la

fenilalanina que por acción de una fenilalanina amonia liasa (FAL),

y después de una pérdida de NH3 se convierte en ácido p-

cumárico. El p-cumaril-CoA luego participa en una reacción de

condensación con las tres moléculas de malonil- CoA para formar

una chalcona de 15 C, reacción propiciada por una chalcona

sintetasa.

Este compuesto intermedio de 15 C es transformado en una

flavanona en una reacción catalizada por una chalcona isómerasa.

Finalmente, la flavanona es transformada en la correspondiente

antocianidina por una reacción de hidroxilación en el carbono 3

seguida por una deshidratación. La molécula de antocianidina

19

se estabiliza por glicosilación del heterociclo; reacción en la que

interviene una glicosil transferasa y posterior posibles reacciones

de metilación de los hidroxilos seguidas de acilaciones.

2.4.2 Contenido de Antocianinas en alimentos

En el Tabla 4 y 5 se presenta el contenido de antocianinas en

frutas seleccionadas, bebidas y vegetales, de la información

proporcionada en el cuadro se desprende la importancia de las

frutas como principal fuente de antocianinas.

Algunas antocianinas muy estables, como las de uvas, col morada y

rábano, están aciladas, lo que permite que las antocianinas de

cáscara de uva y de jugo de col morada sean comercializadas como

colorantes de alimentos. (Badui, 2006).

Tabla 4. Color y distribución de antocianinas en algunas frutas y

vegetales

Fuente: Wang H. (1997) citado por Márquez (2011)

Componente

Color

Frutas y vegetales

Delfinidina

Rojo, azulado

Uva, mora, arándano, grosella

Cianidina

Anaranjado, rojo

Fresa, zarzamora, grosella,

cereza, col morada,

arándano, saúco, maíz, uva,

frambuesa, cebolla roja.

Pelargonidina

Anaranjado

Fresa, maíz morado

Malvidina

Rojo, azulado

Uva, mora, arándano

Peonidina

Rojo

Cereza, arándano, camote

morado, ciruela

20

2.4.3 Propiedades funcionales de las Antocianinas

Gui-Fang et al. (2010) Citado en Aguilera et al. (2011) señalan

que las antocianinas son compuestos considerados

fisiológicamente activos y/o promotores de la salud. Ejercen

efectos terapéuticos conocidos que incluyen la reducción de la

enfermedad coronaria, efectos anticancerígenos, antitumorales,

antiinflamatorios y antidiabéticos; además del mejoramiento de la

agudeza visual y del comportamiento cognitivo. Los efectos

terapéuticos de las antocianinas están relacionados con su

actividad antioxidante.

Tabla 5. Contenido de antocianinas totales en frutas y vegetales comunes

Alimento

Contenido de

antocianinas

totales*

Manzana 83 - 326 Bilberry

300 - 320

Mora 83 - 326

Grosella negra 130 - 400

Mirtillo 25 - 495

Col roja 25

Cereza 450

Arándano 60 - 200

Saúco Uvas 450 - 600

Kiwi 100

Cebollas rojas 7- 21

Ciruela 2 – 25

Rábanos rojos 1 – 60

Frambuesa negra 300 - 400

Frambuesa roja 20 – 60

Fresas 15 – 35

21

Trandescantia paluda (hojas)

120

Papa pulpa morada 240

Camote pulpa morada (d) 100 - 430 (d)

Judías secas 10 - 100

Ruibarbo 200

Melocotón 1 – 12

Fuente: Burin, B. (2010), citado por Márquez (2011) *Todos los valores expresados en mg/100 g peso fresco

excepto (d) expresado en mg/100 g peso seco.

Kowalczyk et al. (2003), Citado en Quispe (2012), compararon las

propiedades antioxidantes de las antocianinas con antioxidantes

ampliamente conocidos y encontraron que éstas tuvieron más alta

actividad antioxidante que la vitamina E (α-tocoferol), ácido

ascórbico y β-caroteno.

Las antocianinas son conocidas por ser efectivos en la eliminación

de radicales libres, lo cual ha sido demostrado in vitro a través de

ensayos como el método ORAC (Oxygen radical absorbing

capacity). Un elevado número de investigadores han reportado

una alta correlación lineal entre el contenido total de antocianinas y

valores ORAC, Moyer et al. ( 2002) y Wang et al. (1997)

estudiaron el efecto de la glicosilación y la variación en la

estructura del anillo B de la antocianina en los valores de ORAC,

encontrando que la estructura del anillo B tiene un marcado efecto

en la actividad antioxidante, la ortho-hidroxilación y metoxilación

incrementa sustancialmente la actividad antioxidante. Además

señalan que las antocianidinas tienen más altos valores de ORAC

que sus correspondientes glícosidos, lo cual explicaría porque los

aglicones son muy inestables y altamente reactivos.

22

2.4.4 Principales Factores que influyen a la antocianina

Los pigmentos de antocianinas son relativamente inestables y la

mayor estabilidad se presenta en condiciones acidas. Tanto el

tono del pigmento como su estabilidad se ven influenciados por los

sustituyentes en el aglicon. La degradación de antocianinas se

produce no sólo durante la extracción del tejido vegetal, sino

también durante el procesamiento y almacenamiento de los

alimentos que las contienen, esto limita su efectiva aplicación

como colorantes. El conocimiento de la química de las

antocianinas se puede utilizar para minimizar su degradación

mediante la adecuada selección de los procesos y por selección

de los pigmentos de antocianina que sean más adecuados para la

aplicación que se desee (Fennema, 2000).

Los principales factores que gobiernan la degradación de las

antocianinas son: su conformación química, el pH, la temperatura,

la concentración de oxígeno, luz. Aquellos factores que tienen

menos importancia son: la presencia de enzimas degradativas,

ácido ascórbico, dióxido de azufre, iones metálicos y azúcares

como se detalla.

a) Efectos estructurales

Las unidades glicosídicas y los grupos acilos unidos a la

aglicona y el sitio de su enlace tienen efecto significativo en

la estabilidad y reactividad de la molécula de antocianina.

También el patrón de sustitución de la antocianidina, el

número y posición de los grupos hidróxilos y metóxilos en el

aglicon afecta el comportamiento químico de la molécula del

pigmento (Rein, 2005).

23

Existen estudios discrepantes respecto al efecto de la

hidroxilación y metilación de las moléculas de antocianinas,

algunos estudios demuestran que el incremento de la

hidroxilación del aglicon estabiliza las antocianidinas por

ejemplo en un estudio realizado por Dao et al. (1998), citado

por Rein, (2005) se encontró que la delfinidina (2 grupos

hidroxilos) es más estable que cianidina (un grupo hidroxilo)

en metanol acidificado. En otra investigación conducida por

Cabrita et al. (2000). Encontraron que en una solución buffer a

pH 3.1 cianidina 3-glucósido fue más estable que

pelargonidina 3- glucósido pero la delfinidina 3 glucósido fue

menos estable que cianidina 3 glucósido, además que

encontraron petunidina 3- glucósido, la cual tiene un grupo

hidroxilo en el anillo B del ion flavilium fue menos estable que

peonidina 3-glucósido la cual no tiene un grupo hidroxilo en el

mismo anillo. Respecto a la metilación existen investigaciones

que demuestran que el incremento de la metilación de los

grupos hidroxilos disminuye la estabilidad de las antocianinas

(Mazza y Brouillard, 1987, Cabrita et al. 2000).

Por otro lado el patrón de hidroxilación y metoxilación influye

no solo en la estabilidad sino además en las tonalidades del

color de las antocianinas, al respecto Fennema (2000).

b) PH

La naturaleza iónica de las antocianinas permite los cambios

de estructura de la molécula de acuerdo al pH que

prevalece, resultando en diferentes colores y tonalidades,

además diferentes susceptibilidades a los factores

degradativos. En soluciones acuosas incluso en los alimentos

las antocianinas pueden existir en cuatro formas estructurales,

dependiendo del pH la base quinoidal azul, el catión flavilio

24

rojo (AH+), la base pseudocarbinol incolora y la chalcona

incolora (Fennema, 2000).

En un medio muy ácido (pH 0.5) el catión rojo flavilio es la

única especie en equilibrio presente. El incremento del pH

influye en el decrecimiento de la intensidad del color y la

concentración de catión flavilio debido a que es hidratado por el

ataque nucleofílico del agua por lo que la forma carbinol

incolora predomina. La forma carbinol ha perdido su doble

enlace conjugado entre los anillo A y B y por lo tanto no

absorbe la luz visible (Brouillard, 1982). También una pérdida

rápida de protones del catión flavilium toma lugar cuando el pH

se eleva más alto y aumentando la concentración de la forma

coloreada quinonoidal. Cuando el pH se eleva más la forma

carbinol rinde a través de la apertura del anillo la chalcona

incolora (Mazza y Brouillard, 1987).

En soluciones muy acidas (pH= 0.5) la especie AH+ de color

rojo, es la única que se encuentra en solución. Al aumentar el

pH, la concentración y el color de la antocianina disminuye,

según la especie AH+ 1) pierda un protón para formar la

forma quinoidal azul o 2) se hidrata para pasar a la base

carbinol incolora que después 3) se tautomeriza a una

chalcona. Como el porcentaje de base quinoidal es muy

pequeño frente al total a cualquier pH, las antocianinas tienen

poco color cuando el pH es superior a 4 (Dominic y Wong,

1989).

Por lo señalado la estabilidad de la antocianina es dependiente

del pH por el equilibrio de las cuatro formas, de las cuales el

catión flavilium AH+ es el más estable y la forma más

coloreada, por lo que si el pH no favorece la presencia de la

molécula en la forma catión flavilium las antocianinas son

susceptibles a la degradación.

25

Esto es debido a una deficiencia del núcleo del flavilio, estos

pigmentos funcionan como verdaderos indicadores de pH; es

decir, su color depende de las condiciones de acidez o

alcalinidad del sistema en que se encuentran: a pH ácido

adquiere una estructura estable del catión flavilio de color rojo,

representado por la fórmula (AH+); cuando se incrementa el pH,

la distribución electrónica se modifica hasta llegar a la forma

quinoidea azul (A) o base anhidra; tanto la sal del flavilio

como la base anhidra pueden convertirse a la base del

carbinol incolora (B) , que predomina en el intervalo de pH de 4

a 5 (Badui , 2006).

Figura 7. Estructura de la antocianina a diferentes pH’s

Fuente: Coultate (1984), citado en Garzón (2008)

26

Figura 8. Espectro de absorción del cianidín-3 ramnoglucósido en

soluciones tampón a pH 0,71-4,02. La concentración de pigmento es

1,6 x 102 g/L. Fuente: Fennema, 2000

c) Temperatura

La estabilidad de las antocianinas en los alimentos se ve

notablemente afectada por la temperatura. La velocidad de

degradación de la antocianinas se incrementa durante el

procesamiento y almacenamiento en tanto la temperatura

aumenta (Maccarone et al. 1985). La velocidad de

degradación frente a este factor también está influenciada por

la presencia de oxígeno, el pH y la conformación estructural.

En general las características estructurales que conducen a

un aumento de la estabilidad frente a cambios de pH también

llevan a la estabilidad térmica (Fennema, 2000).

Existen diversas teorías que explican el efecto de este factor

en la estabilidad de la antocianina pero el mecanismo preciso

no se ha esclarecido totalmente. Adam (1973) sugiere que la

elevación de la temperatura en soluciones de antocianinas a

pH 2-4 induce la pérdida de la mitad glicosil de la antocianina,

27

por hidrólisis, lo cual lleva a la pérdida del color desde que

los aglicones son menos estables que sus formas

glicosidicas. Otros autores postulan que el calor desplaza el

equilibrio hacia la chalcona (Markakis et al., 1957 y Adam,

1973) como primer paso. Eventualmente la degradación

térmica conduce a productos marrones, especialmente en

presencia de oxígeno. Fennema (2000) menciona que el

camarín 3,5 diglucósido es el producto común de la

degradación térmica de las antocianidinas (cianidina,

peonidina, delfinidina, petunidina y malvidina) 3,5 diglicósido,

menciona además que se han postulado tres posibles rutas

que explicarían la degradación térmica. En la primera el

catión flavilium primero se transforma en la base quinonoidal,

después en diversos intermediarios y finalmente en el

derivado cumarinico y un compuesto correspondiente al anilloB.

En la segunda ruta el catión flavilio primero se transforma

en la base carbinol incolora, después en chalcona y

finalmente en productos de degradación pardos. La tercera

ruta es similar excepto que los productos de degradación de

la chalcona se intercalan primero.

Badui, (2006) señala que su alta hidrosolubilidad de los los

pigmentos se pueden perder fácilmente por lixiviación en el

agua que se utiliza en los diferentes tratamientos; a medida

que aumenta la temperatura se acelera la decoloración de la

fruta, ya que se favorece tanto la extracción que incluso se

puede llegar a obtener productos prácticamente incoloros.

Las antocianidinas altamente hidrolizadas son menos

estables que las metiladas, glucosiladas o acetiladas

(Fennema, 2000).

28

Figura 9. Curva espectrofotométrica de la degradación de las antocianinas del jugo de uva durante el almacenamiento: (a) control sin calentar; (b) calentando a 99°C por 1 hora; (c) calentando a 99°C por 2 horas; (d) jugo de uva comercial.

Fuente: Badui (2006)

d) Luz

Las antocianinas preservan el color mantenidas en la

oscuridad y su vez se ha observado que los diglicósidos

acilados, metilados, son más estables que los diglicósidos no

acilados, los cuales a su vez son más estables que los

monoglicósidos, también se reportaron que diglucósidos

acilados presentes en vino fueron los más estables

seguidos por diglucósidos no acilados y monoglucósidos en

orden decreciente cuando fueron expuestos a la luz. Por lo

que las antocianinas sustituidas en los grupos hidroxilo C-5 son

más susceptibles a la fotodegradación que aquéllas que no

tienen sustituyentes en esta posición. (Fennema, 2000).

29

e) Oxígeno y ácido ascórbico

Según Nebesky et al. (1969) mencionado por Rein (2005)

señalan que la presencia de oxígeno junto con temperaturas

elevadas fue una de las combinaciones con efecto más severo

en el color dentro de los factores estudiados en jugos de

berries y antocianinas puras aisladas.

Al estudiar los cambios que experimentan los zumos de frutas

en el almacenamiento han comprobado que existe una pérdida

paralela de ácido ascórbico y de antocianinas y sugieren que

posiblemente hay una interacción entre los dos compuestos.

Esta interacción se debe a que las antocianinas al interactuar

con los peróxidos provenientes de la degradación de la

vitamina C se destruyen por lo que la oxidación del ácido

ascórbico puede implicar una pérdida de pigmentos.

(Braverman, 1980).

Por ello se recomienda el envasado de los productos en

atmósfera de nitrógeno eliminando al máximo el oxígeno del

espacio de cabeza (Yúfera, 1998).

2.5 Capacidad Antioxidante

El concepto básico de actividad antioxidante de varios compuestos

naturales y sintéticos comprende una transición redox mediante la cual

la molécula antioxidante dona un electrón o átomo de hidrogeno,

equivalente a la donación de un electrón y un H+ al radical libre R*

(Pineda, 1999).

La capacidad antioxidante de un alimento depende de la naturaleza y su

concentración.

La actividad antioxidante ha sido expresada en varias formas. Un modo

fácil de expresarlo es con un referente estándar el acido 6-hidroxi-

2,5,7,8-tetrametilcroman-2-carboxilico, conocido como Trolox Prakash

30

(2001), citado por Villarroel (2008).

2.5.1 La oxidación y los agentes oxidantes

Químicamente la oxidación de un compuesto es la pérdida de

electrones, de hidrógenos o la ganancia de oxígeno en una

molécula. La reducción de un compuesto es exactamente lo

contrario; es decir, la ganancia de electrones, de hidrógenos o la

perdida de oxígeno. En tal sentido, un agente oxidante es una

molécula que se reduce al reaccionar con la molécula a la cual

oxida. Este par oxido-reductor es necesario químicamente y

esencial para entender la biología de las óxido-reducciones en el

organismo.

Las macromoléculas de importancia biológica (proteínas, ácidos

nucleicos, carbohidratos y lípidos) son moléculas nucleofílicas que

tienen electrones susceptibles de compartir, es decir, tienen

electrones en orbitales superficiales que pueden ser capturados

(oxidación) o compartidos en una reacción nucleofílica para formar

compuestos o aductos. Los oxidantes son compuestos

electrofílicos especies que tienen avidez por los electrones y que

tienen afinidad para reaccionar con macromoléculas nucleofílicas,

muchas de ellas de la mayor importancia biológica. Cervantes

(2005) citado por Quintanar y Calderón (2009).

Las especies reactivas de oxígeno (ERO) y nitrógeno (ERN), son

un subgrupo de moléculas oxidantes, que como su nombre lo

indica son altamente reactivas. Otro subgrupo son los radicales

libres que no solo tienen alta reactividad y capacidad oxidativa, sino

que adicionalmente pueden generar reacciones oxidativas en

cadena.

2.5.2 Los radicales libres

En forma general, un radical libre es un átomo o molécula que tiene

uno o más electrones desapareados en sus orbitales externos y es

31

capaz de tener una existencia independiente; sin embargo, es muy

reactivo ya que tiende a reducirse, es decir, sustrae un electrón de

átomos o moléculas estables, a las cuales oxida, con el fin de

alcanzar su propia estabilidad. Una vez que el radical libre ha

conseguido el electrón que necesita para aparear a su electrón

libre, la molécula estable que pierde el electrón se oxida y deja a

otro electrón desapareado, lo que la convierte a su vez en un

radical libre, iniciándose y después propagándose de la misma

manera, generando así una reacción en cadena. Hansberg (2002)

citado por Quintanar y Calderón (2009).

2.5.3 Tipos de radicales libres

Los radicales libres de importancia biológica pueden clasificarse

como:

1. Especies reactivas de oxígeno (ERO).

Las principales son el oxígeno molecular (O2), el ozono (O3) y el

oxígeno en singulete (O2), así como las especies de oxígeno que

están parcialmente reducidas; esto es, el anión superóxido (O2) el

peróxido de hidrógeno (H2O2), hidroperoxilo (HO2) y el radical

hidroxilo (OH). Estas especies son producto de la ruptura o de la

excitación del O2 y son más reactivos que el O2 en su estado basal.

El peróxido de hidrógeno, no es un radical libre pero está

estrechamente relacionado con la producción de radicales porque

es el principal precursor del radical hidroxilo. Estas ERO son

moléculas altamente reactivas que atacan constantemente al

organismo mediante reacciones bioquímicas de óxido-reducción,

que ocurren como parte normal del metabolismo celular o por

factores patológicos.

2. Metales de transición

Los elementos de la tabla periódica (Fe, Mn, Co, Ni y Cu)

pertenecen a los llamados metales de transición, tienen la

32

característica de llegar a ser estables por si mismos sin necesidad

de reaccionar con otro elemento, esto es, cuando a su último nivel

de energía le faltan electrones para estar completo los utiliza de los

niveles o subniveles internos, con lo cual logra su estabilidad, la

falta de electrones en el nivel de donde los transfirió se compensa

con otros electrones de otro nivel o subnivel, y así sucesivamente:

a este fenómeno se le llama transición electrónica. La mayoría de

los metales de transición tienen electrones desapareados y

precisamente gracias a esta transición pueden existir en forma de

radical libre.

3. Otros radicales libres.

Entre los que se encuentran los radicales libres de nitrógeno; tales

como, el óxido nítrico (NO) y el dióxido nítrico (NO2). El NO es un

radical muy reactivo y de importancia fisiológica puede oxidar y

dañar, pero es esencial en funciones biológicas complejas como

son la neurotransmisión y neurorregulación del sistema nervioso,

así como en procesos de agregación plaquetaria y coagulación

sanguínea, con el O2 genera NO2 y con el O2 forma peroxinitrito

(ONOO-). Este tipo de ERN son capaces de generar daño oxidativo

y muerte celular. Existen otros radicales libres que tienen diferente

naturaleza como el ión hipoclorito (ClO) y el radical triclorometilo

(CCl3) este último producido durante el metabolismo del CCl4 por el

citocromo.

La reactividad química de los diferentes tipos de radicales libres es

variable pero siempre elevada y de baja especificidad. La vida

media biológica del radical libre es de no más de microsegundos,

ya que puede reaccionar rápidamente con todo lo que esté a su

alrededor, pudiendo provocar un gran daño a macromoléculas y a

estructuras supramoleculares como las membranas. Rendón

(2005) citado en Quintanar y Calderón (2009).

33

2.5.4 Capacidad antioxidante de frutas y vegetales

En los últimos tiempos, ha existido un creciente interesen el estudio

de ciertas frutas y vegetales con alto poder antioxidante para

potenciar su consumo debido a su efecto positivo en la prevención

de ciertas enfermedades crónicas como el cáncer y enfermedades

cardiovasculares. (Rodrigo-García, 2006)

El efecto protector de los alimentos de origen vegetal se atribuye a

diversos nutrientes y fotoquímicos con actividad antioxidante.

(Pineda, 1999). Los extractos vegetales frescos muestran un efecto

antioxidante diferente y su actividad depende de la naturaleza y

concentración de los antioxidantes naturales presentes en el

alimento. (Pineda, 1999).

La actividad antioxidante de los compuestos fenólicos depende del

número y de la posición de los grupos hidroxilos, de la cantidad de

electrones donadores que contenga el anillo estructural, y de la

capacidad que tiene el grupo aromático de resistir el

desapareamiento de electrones (Kuskoski et al., 2005; Citado en

Almeida, 2012).

Tabla 6. Capacidad Antioxidante en Frutas

Frutas Total Capacidad antioxidante ORAC

(µmol eq-Trolox/g de muestra)

Base Humedad Bases Seca

Fresa 15.36 153.6

Ciruela 9.49 79.1

Naranja 7.50 51.7

Kiwi 6.02 36.5

Manzana 2.18 13.2

Tomate 1.89 7.8

34

Pera 1.34 9.6

Melón 0.97 12.9

Fuente: Cao (1996) citado en Villarroel (2008) eq-Trolox, equivalente trolox.

Tabla 7. Capacidad Antioxidante en Vegetales

Vegetales

Total

Capacidad

antioxidante

Base Seca

Ajos 23.2

Col 14.5

Brocoli 12.9

Remolacha 11.7

Maiz 7.2

Papa 4.6

Zanahoria 3.4

Apio 1.1

Expresado en (µmol eq-Trolox/g de muestra) Fuente: Cao (1996) citado en Villarroel (2008)

2.5.5 Métodos para evaluar la capacidad antioxidante

La actividad antioxidante de los frutos puede evaluarse in vitro e in

vivo por medio de experimentos sencillos. Con base a las

reacciones químicas involucradas, pueden dividirse en dos

categorías: ensayos basados en la transferencia de un átomo de

hidrógeno y ensayos basados en la transferencia de electrones

como se detalla en la Tabla N° 08.

Los métodos de transferencia de un átomo de hidrógeno están

basados en reacciones donde el antioxidante y el sustrato

compiten por el radical libre sintético, una molécula oxidable y un

35

antioxidante. Los métodos basados en la transferencia de un

electrón involucran una reacción de oxidación con el antioxidante

que es un indicador del punto final de la misma.

Las condiciones para el empleo de los métodos de transferencia de

electrón como el ABTS (ácido 2,2’azino-bis(6-sulfonato-3-

Etilbenzotiazolina)) y DPPH (α,α-difenil-β-picrilhidrazilo), pueden

variar de alguna u otra forma, (por ejemplo, el pH de los solventes

y la longitud de onda a la que se mide), dando diferentes

resultados. Sin embargo, son muy útiles para evaluar la actividad

antioxidante de sustancias y alimentos que los contienen. Estos

métodos pueden servir para evaluar si un proceso de

elaboración de un alimento influye sobre la actividad antioxidante,

además puede ser un indicativo del potencial antioxidante para su

consumo (Villarroel, 2008).

Tabla 8 . Clasificación de los métodos para evaluar la actividad

antioxidante de acuerdo a las reacciones involucradas

Mecanismo

Método

Transferencia de

hidrogeno

a. TRAP (del ingles total radical trapping antioxidant parameter)

b. ORAC (del inglés Oxygen Radical Absórbanse Capacity)

c. Inhibición de la oxidación de las LDL (Low- density lipoprotein)

Transferencia de

un electron

a. TEAC (del ingles Trolox

equivalent antioxidant capacity)

b. ABTS (ácido 2,2’azinobis (6-

sulfonato-3- etilbenzotiazolina))

c. FRAP (del ingles ferric-reducing

antioxidant power)

d. DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidracilo)

Fuente: Huang et al, (2005) Citado en Leyva (2009).

36

El método propuesto por Brand-Williams et al. (1995), citado en

Leyva (2009) método de DPPH• (2,2-difenil-1-picrilhidracilo), nos

permite evaluar la actividad de sustancias frente al radical libre

estable 2,2-difenil-1- picrilhidracilo (DPPH•), en una solución

metanólica que tiene un color violeta intenso que se pierde

progresivamente cuando se añade la muestra que contiene

antioxidantes. La decoloración del radical se determina a 517 nm

y la cuantificación se realiza por lo general empleando soluciones

patrón de Trolox. Este método es probablemente más eficiente

que el método ABTS en reacción con donadores de átomos de

hidrógeno. Sin embargo, el DPPH no reacciona con flavonoides

que no contenga grupos –OH en el anillo B al igual que con los

ácidos aromáticos que sólo contiene un grupo - OH (Roginsky y

Lissi, 2005; citado en Leyva, 2009). Pese a sus limitaciones, es

un método adecuado para medir la actividad antioxidante en

alimentos y extractos vegetales, mientras que no es adecuado

para la determinación de la capacidad antioxidante del plasma o

suero, ya que las proteínas precipitan con el metanol del medio de

reacción.

Los métodos para evaluar la capacidad antioxidante (CAOX)

pueden ser in vitro o in vivo. Una de las estrategias más

aplicadas en las medidas in vitro de la capacidad antioxidante

total de un compuesto, mezcla o alimento, consiste en

determinar la capacidad del antioxidante frente a sustancias

cromógenas de naturaleza radical; la pérdida de color ocurre de

forma proporcional con la concentración (Arena et al., 2001,

citados por Kuskoski et al., 2005). No obstante, las

determinaciones de la capacidad antioxidante realizadas in vitro

nos dan tan sólo una idea aproximada de lo que ocurre en

situaciones complejas in vivo.

37

Entre los métodos más aplicados para la determinación de la

CAOX están el ABTS y DPPH. Ambos presentan una excelente

estabilidad en ciertas condiciones, aunque también muestran

diferencias. El DPPH es un radical libre que puede obtenerse

directamente sin una preparación previa, mientras que el ABTS

tiene que ser generado tras una reacción que puede ser química

(dióxido de manganeso, persulfato potasio). (Arnao, 2000

citado en Kuskoski et al., 2005).

2.6 Determinación de las antocianinas

Existen distintas formas para determinar antocianinas ya sea en

forma total o en forma separada cada antocianina. Si se quiere

establecer las antocianinas en forma general muchos autores de

diversos estudios utilizan el método de pH diferencial. Pero si se

desea determinar las antocianinas en forma separada se recomienda

utilizar cromatografía. (Rebolledo, 2007. Citado en Cano, 2011).

2.6.1 Determinación de antocianinas de forma total.

La forma más utilizada para determinar antocianinas en forma total

es la basada en diferencial de pH. El contenido total de

antocianinas en extractos crudos que contiene otros materiales

fenólicos, que son determinadas por mediciones de absorción de

la solución a una determinada longitud de onda. Esto es posible

porque las antocianinas tienen una típica banda de absorción

entre 490 y 550 nm en la región del espectro visible. Esta banda

está lejos de la banda de absorción de otros fenoles, y tiene un

máximo espectro en el rango UV. En muchas instancias, sin

embargo, este simple método es inapropiado por la interferencia de

productos de degradación de antocianinas o melanoidinas de

38

reacciones de pardeamiento. En ambos casos, el acercamiento

debe ser usado para diferenciar y/o métodos sustractivos para

cuantificar antocianinas y su producto de degradación. (Rebolledo,

2007. Citado en Cano, 2011).

2.7 Solventes

Las disoluciones o soluciones son sistemas formados de dos

componenetes: el disolvente y el soluto. Suele denominarse disolvente

al componente más abundante y soluto al que se halla en menor

cantidad. (Oceano, 1995).

Un disolvente o solvente es una sustancia que permite la dispersión de

otra sustancia en esta a nivel molecular o iónico. Es el medio

dispersantes de la disolución. Normalmente, el disolvente establece el

estado físico de la disolución, por lo que se dice que el disolvente es el

componente de una disolución que está en el mismo estado físico que

la misma. Usualmente, también es el componente que se encuentra en

mayor proporción. (De.quimica, 2014).

Un buen solvente debe ser selectivo y con viscosidad suficientemente

baja para que pueda circular libremente, la concentración del soluto

aumentará y la relación de extracción disminuirá progresivamente

debido a que la gradiente de concentración se va reduciendo; y por lo

que la solución se hace más viscosa. (Chiboga y Francis, 1970 citado

en Medina, 2012)

Escoger el solvente adecuado es uno de los factores más importantes

en la obtención de extractos con alto contenido de compuestos

bioactivos. En general las formas agliconas altamente hidroxiladas de

los compuestos fenólicos son solubles en solventes tales como el

etanol, metanol y agua. Los solventes tales como acetato de etilo,

acetona y cloroformo se utilizan para los menos polares y altamente

metoxiladas (muy comunes en la piel de las frutas). (González-

Montelongo et al., 2010 citado en Paulino et al., 2013).

39

Las antocianinas son compuestos solubles en solventes polares y

comúnmente se extraen de sus fuentes naturales usando metanol o

etanol con pocas cantidades de algunos ácidos como ácido clorhídrico,

acético y fórmico, ya que el ácido mantiene el pH ácido lo que previene

el desplazamiento de los equilibrios químicos de hidratación y formación

de chalconas. Adicionalmente el uso de ácidos débiles previene la

degradación de las antocianinas no aciladas las cuales presentan

mayor labilidad. Sin embargo, durante el proceso de evaporación del

solvente acidificado puede ocurrir degradación de las antocianinas

aciladas, por la hidrólisis parcial o total de los ácidos enlazados a los

azúcares, especialmente en antocianinas aciladas con ácidos

dicarboxilicos como el ácido malónico. (Santacruz, 2011).

En relación a la extracción de estos pigmentos, (Rodríguez y Wrolstad,

1999 citado en Santacruz, 2011), señalan que el carácter polar de la

molécula de antocianina permite su solubilidad en variados solventes,

tales como alcoholes, acetona y agua. La elección del método de

extracción debe maximizar la recuperación de pigmentos con una

mínima cantidad de solventes y una degradación o alteración mínima

del estado natural. Dentro de los métodos más utilizados están la

extracción con metanol y la extracción con acetona y cloroformo.

El solvente escogido debe ser altamente selectivo, de baja viscosidad

que circule libremente, pero conforme la extracción trascurra, la

cantidad de soluto aumentara y el gradiente de concentración

disminuye, incrementando progresivamente la viscosidad.

Generalmente se utiliza etanol para la extracción de los principios

activos de las plantas, sin embargo el agua es considerada el solvente

universal por su capacidad de extracción en fase sólido-líquido. (Ullauri,

2010 citado en Almeida, 2012)

A. Polaridad de un disolvente

Las moléculas de líquidos que presentan dipolos permanentes,

presentan fuerzas intermoleculares más intensas. Estas dificultan o

40

incluso impiden la libre rotación de las moléculas, pues las elevadas

interacciones moleculares conducen a una asociación más o menos

estable de las moléculas vecinas. Una forma muy importante y

frecuente entre los alimentos son los enlaces mediante puentes de

hidrogeno de los dipolos.

Este efecto sobre la viscosidad es aún más intenso cuando la

asociación se extiende a un mayor número de moléculas. (Horst et

al., 2001)

La polaridad de un disolvente al parámetro que mide su polaridad y

le confiere propiedades de solubilización de diferentes solutos. En

general, las reacciones químicas tienen lugar en fase homogénea,

ya que, para que dos especies entren en contacto, deben estar en

la misma fase. En disolución, las especies reactivas gozan de

mayor libertad de movimiento y se difunden en el volumen total del

disolvente, aumentando así la probabilidad de colisión entre ellas.

El disolvente debe actuar sobre el soluto solvatándolo y venciendo

las fuerzas intermoleculares que lo mantienen unido, pero sin dar

lugar a la reacción. En función de la naturaleza del soluto y del

disolvente, las fuerzas de solvatación entre ambos pueden ser de

diferentes tipos: puentes de hidrógeno, interacciones polares y

fuerzas de London.

El disolvente idóneo suele tener unas características químicas y

estructurales similares a las del compuesto a disolver. La polaridad

y, consecuentemente, la solubilidad de los compuestos orgánicos

en disolventes polares, aumenta con la disminución de la longitud

de la cadena hidrocarbonada, la presencia de grupos funcionales

polares y la capacidad de formación de puentes de hidrógeno con el

disolvente. (Wikipedia, 2014)

B. Constante dieléctrica

La constante dieléctrica y el momento dipolar son propiedades

complementarias de una sustancia. Con frecuencia se utilizan

41

ambas constantes físicas para caracterizar su polaridad, aunque el

momento dipolar no representa la polaridad de un disolvente.

Cuando se quiere decir que una molécula es polar, se quiere decir

que tiene un elevado momento dipolar. Sin embargo, cuando se

dice que un disolvente es polar, significa que tiene una elevada

constante dieléctrica. En otras palabras, la polaridad de un

disolvente o constante dieléctrica, es una propiedad macroscópica

(a nivel macroscópico), mientras que la polaridad molecular o

momento dipolar es una propiedad de moléculas aisladas.

(Wikipedia, 2014)

C. Polaridad de enlace

Cuando dos átomos están unidos por un enlace covalente, el par de

electrones compartido puede ser atraído por igual por ambos

átomos, o puede ocurrir que uno de ellos lo atraiga más fuertemente

que el otro. Si ocurre lo primero, el centro de cargas positivas

coincide con el de negativas y el enlace no está polarizado. Pero si

el par de electrones no es atraído por igual por ambos núcleos, se

situará más próximo a uno de ellos y entonces los centros de las

cargas positiva y negativa no coincidirán y un extremo del enlace

tendrá un exceso de carga negativa y el otro extremo un defecto.

Habrá un centro o polo positivo y un centro o polo negativo y el

enlace estará polarizado.

La polaridad de los enlaces se debe a la electronegatividad

característica de cada átomo, que fue definida por Pauling como la

capacidad de cada átomo dentro de cada molécula para atraer los

pares de electrones hacia sí. Cuanto mayor sea la diferencia de

electronegatividad de dos átomos enlazados, mayor será la

polaridad del enlace entre ambos. Los átomos con distinta

electronegatividad presentan la densidad electrónica desplazada

hacia el átomo más electronegativo. (Wikipedia, 2014).

42

2.7.1 Propiedades de los solventes

2.7.1.1 Metanol

Alcohol metílico llamado también metanol o “espítiritu de la

madera” debido a la obtención de la destilación pirogenada

de la madera, líquido incolora muy móvil y volátil. Es un

líquido tóxico, ataca al nervio óptico causando ceguera. Es

considerada un solvente polar prótico (tiene la capacidad de

formar puentes de hidrógeno), es muy buen solvente de

sutancias hidrofílicas. Las propiedades físicas más

relevantes del metanol, en condiciones normales de presión

y temperatura se muestran en la siguiente

El metanol y el agua tienen propiedades semejantes debido

a que ambos tienen grupos hidroxilo que pueden formar

puente de hidrógeno. El metanol forma puente de hidrógeno

con el agua y por lo tanto es miscible (soluble en todas las

proporciones) en este solvente. Igualmente el metanol es

muy buen solvente de sustancias polares. (Wikipedia, 2014)

2.7.1.2 Etanol

El Etanol o alcohol etílico es un compuesto líquido,

incoloro, volátil, inflamable y soluble en agua cuyas

moléculas se componen de carbono, hidrógeno e hidróxilos

(CH3-CH2-OH).

El Etanol se produce a partir de 3

principales materias primas que son la sacarosa, almidón y

celulosa. El etanol, como ya hemos mencionado, es un

líquido incoloro, y altamente volátil, que está presente en la

mayoría de las bebidas fermentadas. Desde antaño se

producía etanol a través de la fermentación anaeróbica y

posterior destilación de las disoluciones que contenían en

su composición azúcar y levadura. (Wikipedia, 2014 y

Negrillo, 2014).

43

2.7.1.3 Agua

El agua es el disolvente universal, disuelve sales y

sustancias iónicas. También disuelve muchas otras

sustancias no iónicas pero con carácter polar, como

azúcares, alcoholes, aldehídos, cetonas y otros, cuyos

grupos carbonilos, aminos, hidroxilos y carboxilos

interaccionan con las moléculas de agua por medio de

puentes de hidrógeno (Badui, 2006).

Considerada el solvente universal, es de carácter polar

excelente solvente para solutos polares e iónicos, que se

denominan hidrofílicas.

La disolución de sólidos (sales) esta favorecida por

reacciones acido-.base, las reacciones de oxidación-

reducción, la hidratación y la hidrólisis. La velocidad de

disolución depende de factores, tales como la

concentración real en el agua, la superficie de contacto que

aumenta al triturar y al mezclar, la agitación, el tiempo y la

temperatura puesto que a mayor temperatura, mayor

velocidad de disolución. (Franco, 2014).

Tabla 9. Propiedades Químicas Generales

Propiedad Agua Etanol Metanol

Formula H2O CH3-CH2-OH (CH4O)

Peso molecular 18,16 g/mol 46.07 g/mol 32,04 g/mol

Temperatura crítica 374,1°C 241 °C -

Punto de ebullición 100°C 78 °C 65 °C

Punto de fusión 0°C -114 °C -97 °C

Densidad a 4°C 1 kg/m3 789 Kg /m3 791,8 kg/m3

Viscosidad 1,0020 cP a

20 °C

1.074 mPa·s

a 20 °C

0,59 mPa·s a

20 °C

Fuente: Wikipedia, (2011)

44

III. MATERIALES Y METODOS

3.1 Lugar de ejecución

El presente trabajo de investigación se llevó a cabo en los siguientes

laboratorios:

- Laboratorio de Análisis Instrumental –Universidad Nacional del Centro

del Perú

- Laboratorio de Control de calidad – Universidad Nacional del Centro del

Perú.

3.2 Materia Prima

- Pétalos de flores de mastuerzo (Tropaeolum majus L.) de color

anaranjado.

- Procedencia: Estación experimental El Mantaro – Universidad Nacional

del Centro del Perú.

3.3 Materiales y Equipos

3.3.1 Equipos

- Balanza analítica Marca Ohaus, capacidad max. 300 g

- Baño maría termo regulable Marca Thermostatic wáter bath

- Centrífuga

- Cocinilla eléctrica

45

- Espectrofotómetro Marca Shimatzu

- Estufa Marca WSU 200

- Mufla Marca 6000 Fumace Thermolyne

- Vortex Marca Heidoph reax Control

3.3.2 Materiales

Baguetas de vidrio, Campanas desecadora de vidrio, Cápsulas

de porcelana, Crisoles de porcelona, Celdas de cuarzo,

Embudos de vidrio, Fiolas de diferentes graduaciones, Frascos

ambar, Gradillas, Lunas de reloj, Micropipetas, Matraces de

diferentes graduaciones, Mortero, Papel filtro, Pinza metálica,

Picetas, Probetas de diferentes graduaciones, Termómetro,

Tubos de ensayo, Rejillas de asbestos, Tubos de centrífuga, y

Vasos de precipitación.

3.3.3 Reactivos

- Ácido clorhídrico al 37% q. p.

- Acetona

- Metanol 98%

- Agua destilada

- Carbonato de sodio al 99.8% q. p.

- Folin Ciocalteau 0.2 N

- Hidroxido de sodio al 99.8% q. p.

- Hexano 96.8 % q. p.

- α,α-difenil-β-picrilhidrazilo (DPPH)

46

3.4 Metodología

3.4.1 Análisis Fisicoquímico de las flor de mastuerzo

a) pH: método potenciométrico recomendado por la AOAC

(1990).

Para la cuantificación del PH Se utilizó el método potenciométrico,

previamente calibrado el potenciómetro a Ph de 4.0 y de 7.0 con

soluciones Buffers.

b) Evaluación de Antocianinas Totales Monoméricas

Método del pH diferencial recomendado por Fuleki y Francis

(1968) modificado por Giusti y Wrolstad (2001) y citado en Gil

(2008).

El principio del método se basa en el cambio reversible del color

con el pH, de los pigmentos monomérícos antocianina. La forma

coloreada oxonium (catión flavilium) existe a pH 1,0 y la forma

hemicetal incolora (pseudo-base carbinol) predomina a pH 4,5. La

diferencia de absorbancia de estos pigmentos a 520 nm y 700 nm

es proporcional a la concentración del pigmento en la solución.

(Anexo 5)

c) Capacidad antioxidante

Se determinó utilizando el método basado en la reducción del

radical libre estable 2,2, difenil-1-picrilhidrazil (DPPH). Las

sustancias antioxidantes de las pulpas reaccionan con el DPPH y la

reducción del reactivo es seguida midiendo la disminución de la

absorbancia a 517 nm. Los resultados se expresan como μmol de

trolox Equivalente/g. en base húmeda metodología propuesta por

(Brand Williams et al. 1995, Citado en Quispe, 2012). (Anexo 6)

47

3.4.2 Método experimental

Para la extracción de antocianinas se realizaron los siguientes

procedimientos.

A. Acondicionamiento de la materia prima

A.1 Materia Prima

Se emplearon flores de Mastuerzo de la Estación

experimental El Mantaro – Universidad Nacional del

Centro del Perú

A.2 Lavado

En esta operación se eliminaron partículas extrañas y

pedúnculos de las flores y se sumergió en agua clorada

al 0.1%.

A.3 Secado

Se colocaron solo los pétalos de la flor de Mastuerzo en

bandejas de madera con el objetivo que se sequen, a

temperatura ambiente de la ciudad de Huancayo-

Departamento de Junín (18°C a 22°C) por 3 min y con

una humedad aproximada de 44% y bajo sombra.

B. Molienda

Se realizó el licuado de los pétalos de Mastuerzo seco con el

solvente (Metanol, Etanol y Agua) a una proporción del 10%,

obteniéndose un extracto.

C. Macerado

Se realizó el macerado por 24 horas a una temperatura de

5°C.

D. Centrifugado

Se llevó a centrifugar por un tiempo de 20 min hasta obtener

el líquido sobrenadante.

E. Envasado

48

Figura 10: Diagrama de flujo para la obtención de antocianinas de

flores de Mastuerzo.

LAVADO

SECADO

MOLIENDA

MACERADO

CENTRIFUGADO

ENVASADO

CUANTIFICACION DE

ANTOCIANINAS

SOBRENADANTE

- Eliminación de Partículas - Sumergido en agua clorada

al 0.1% x 3 min

- T° Ambiente (18°C-22°C) - HR= 44% Aprox.

EXTRACTO

- Pétalos: Metanol (1:10) - Pétalos: Etanol (1:10) - Pétalos: Agua (1:10)

Por 24 horas a 5°C

MATERIA PRIMA

49

3.4.3 Evaluación de la estabilidad del extracto acuoso del colorante de

pétalos de mastuerzo frente al tratamiento térmico

Método recomendado por Morales (2007). Se prepararon los extractos

acuosos de colorante de pétalos de mastuerzo, y se regulò a pH de 3, 4 y 5

con HCl 0,25 N y NaOH 2% . Los extractos fueron distribuidos en tubos de

ensayo herméticos de 25 mL. Los tubos de ensayo fueron cubiertos con

papel aluminio y los extractos asì acondicionados fueron sometidos a

tratamiento tèrmico a una temperatura de ebullición (89 °C) por un periodo

de 60 minutos. Se tomaron muestras a 0, 15, 30, 45 y 60 minutos

3.4.4 Evaluación de la estabilidad del extracto acuoso del colorante de

pétalos de mastuerzo frente al almacenamiento

Método recomendado por Morales (2007). Se prepararon los extractos

regulando el pH de los extractos a 3, 4 y 5 con HCl 0,25 N y NaOH 2%.Los

extractos se distribuyeron en tubos de vidrio con tapa y cerrados

herméticamente. Los extractos así acondicionados se almacenaron a 4 °C y

25 °C por un periodo de 30 días. Se tomaron muestras cada 5 días.

50

3.5 Diseño experimental

3.5.1 Para la evaluación del tipo de solvente en el rendimiento de

Antocianinas

SOLVENTE 1: METANOL: HCl (0.01%)

SOLVENTE 2: AGUA: HCl (0.01%)

SOLVENTE 3: ETANOL: HCl (0.01%)

SOLVENTE 4: ETANOL: AC CÍTRICO (0.01%)

SOLVENTE 5: ETANOL: AC ASCÓRBICO (0.01%)

El diseño estadístico aplicado fue el Diseño Completamente al azar para la

evaluación del tipo de solvente en el rendimiento de antocianinas

El análisis estadístico se realizó utilizando el software Minitab.

PETALOS DE FLORES DE MASTUERZO

SOLVENTE 2 SOLVENTE 3 SOLVENTE 4 SOLVENTE 1 SOLVENTE 5

REPET. 1

REPET. 2

REPET. 3

REPET. 1

REPET. 2

REPET. 3

REPET. 1

REPET. 2

REPET. 3

REPET. 1

REPET. 2

REPET. 3

REPET. 1

REPET. 2

REPET. 3

51

3.5.2 Evaluación de la estabilidad del extracto acuoso del colorante de

pétalos de mastuerzo frente al tratamiento térmico

Los extractos acuosos se someterán a temperatura de ebullición a 3 pH por

un tiempo de 60 minutos tomando muestras cada 15 minutos.

t1 t2 t3 t4 t5 t1 t2 t3 t4 t5 t1 t2 t3 t4 t5

Datos:

pH1 = 3

pH2 = 4

pH3 = 5

t1=0 min

t2=15 min

t3=30 min

t4=45 min

t5=60 min

Se evaluó la cantidad final de antocianinas después de los 60 minutos.

EXTRACTO DE PETALOS DE

MASTUERZO

pH1 pH2 pH3

52

3.5.3 Evaluación de la estabilidad del extracto acuoso del colorante

de pétalos de Mastuerzo frente al almacenamiento.

Datos:

El extracto de Mastuerzo se Almaceno a 2 diferentes temperaturas.

T1= 4°C

T2= 24°C (Baño maria)

pH1 = 3

pH2 = 4

pH3 = 5

(Con repetición de 3 pHs)

El diseño estadístico aplicado fue el diseño completamente al azar o

también llamado análisis de varianza de dos factores con repetición y con

arreglo factorial 2x3x3.

El análisis estadístico se realizó utilizando el software Minitab

EXTRACTO DE PETALOS DE

MASTUERZO

T1 T2

PH2 PH1 PH3 PH2 PH1 PH3

53

3.5.4 Evaluación de la capacidad antioxidante frente al

almacenamiento

Datos:

El extracto de Mastuerzo se Almaceno a 2 diferentes temperaturas.

T1= 4°C

T2= 24°C (Baño maría)

pH1 = 3

pH2 = 4

pH3 = 5

(Con repetición de 3 pHs)

El diseño estadístico aplicado fue el diseño completamente al azar o también

llamado análisis de varianza de dos factores con repetición y con arreglo

factorial 2x3x3.

El análisis estadístico se realizó utilizando el software Minitab.

EXTRACTO DE PETALOS DE

MASTUERZO

T1 T2

PH2 PH1 PH3 PH2 PH1 PH3

54

IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

4.1 Evaluación del solvente en el rendimiento de antocianinas

Se evaluaron cinco tipos de solventes extractores teniendo como base el

metanol acidificado con ácido clorhídrico, etanol acidificado con ácido

clorhídrico, ácido ascórbico y ácido cítrico y agua acidificada con ácido

clorhídrico al 0,01%.

Tabla 10. Rendimiento de antocianinas con tipos de solvente.

Solvente Rendimiento

(mg/100mL)

METANOL:HCl (0.01%) 63,07±0.10

AGUA:HCl (0.01%) 43,47 ±0.34

ETANOL:HCl (0.01%) 62,90 ±0.10

ETANOL:AC CITRICO (0.01%) 60,34 ±0.19

ETANOL: AC ASCORBICO (0.01%) 58,06 ±0.39

55

Figura 11. Extracción de Antocianinas según el Solvente

Los resultados que se muestran en la figura 11 muestran un mayor

rendimiento de contenido de antocianinas en la extracción con metanol:

ácido clorhídrico, seguido de etanol ácido: clorhídrico y etanol: ácido cítrico.

.

(Rodríguez y Wolstrad, 1999 citado en Santacruz, 2011), señalan que el

carácter polar de la molécula de antocianina permite su solubilidad en

variados solventes, tales como alcoholes y agua. Por ello se trabajó con

metanol. Etanol y agua, cuyas moléculas interaccionan con los grupos

hidroxilo de la cianidina, formando puentes de hidrógeno (Del Carpio et al.,

2009, citado en Almeida, 2012).

El disolvente actúa sobre el soluto solvatándolo y venciendo las fuerzas

intermoleculares que lo mantienen unido, pero sin dar lugar a la reacción.

(Wikipedia, 2014)

Para mantener pH ácidos se trabajó con HCl, Ac Cítrico, y Ac. Ascórbico el

uso de estos ácidos previene el desplazamiento de los equilibrios químicos

de hidratación y formación de chalconas, formándose una mayor

63.07

43.47

62.90

60.34

58.06

0.00 10.00 20.00 30.00 40.00 50.00 60.00 70.00

METANOL: HCl (0.01%)

AGUA: HCl (0.01%)

ETANOL: HCl (0.01%)

ETANOL: AC CÍTRICO (0.01%)

ETANOL: AC. ASCÓRBICO(0.01%)

Antocianinas (mg/100 mL)

So

lve

nte

Ac

idif

icad

o

Evaluacion del Solvente en el Rendimiento de Antocianinas

56

estabilidad, antocianina-solvente.

El ácido utilizado en los solventes puede causar hidrólisis parcial de las

fracciones acil en antocianinas aciladas, especialmente en aquellas con

ácidos dicarboxílicos tales como ácido malónico, por lo que el uso de

ácidos débiles es deseable, tal como ácido tartárico o cítrico para mantener

los sustituyentes dicarboxílicos intactos. (Almeida, 2012)

El tamaño de las partículas influye en la extracción porque los sólidos de

tamaño pequeño tienen una mayor superficie de contacto con el líquido y la

distancia de difusión entre el soluto y el solvente por lo tanto la cantidad de

soluto transferido es más alto (Ullauri, 2010, citado en Almeida, 2012). Por

otra parte partículas muy finas forman una mayor viscosidad lo cual es muy

difícil de separarlo.

De los disolventes evaluados, el metanol fue el que logro extraer mayor

cantidad de componentes antioxidantes, esto se debe a que este disolvente

tiene la capacidad de causar daño al tejido a nivel de pared celular,

permitiendo así la salida de componentes intracelulares esto ha sido

probado en diversos estudios.

Almeida (2012) también menciona que solventes de baja viscosidad

ayudan a una mejor circulación y extracción de antocianinas, por lo que si a

ello se le suma el agitado en el extracto aumenta la difusión y aumentando

la transferencia de masa desde las partículas solidad al líquido.

El metanol es reconocido como un eficiente agente de extracción, pero no

es considerado seguro. En cambio, el etanol representa una alternativa de

disolvente seguro en procesos de extracción para productos con fines

alimenticios.

Por ello el disolvente extractor a utilizado en la presente investigación fue el

etanol: ácido cítrico ya que este presenta varias ventajas al ser utilizado

como disolvente de extracción, por ejemplo: no es tóxico, es económico y

su capacidad de extracción es tan buena como la del metanol.

Al realizar el análisis estadístico se observó:

57

Tabla 11. Análisis estadístico de la Evaluación del Solvente en el

Rendimiento de Antocianinas

Fuente G.L. Suma de

Cuadrados

Cuadrado

de la Media F-Valor Pr>F

Solventes 4 797,479 199,369 3227,01 0.000

Error 10 0,617 0,0618

Total 14 798,097

(Anexo 1)

De la Tabla N°11, se evalúa el estadístico de los solventes presentando

además la significación de p=0.00, siendo significativo por ser ˂ 0.05 por lo

que se rechaza la hipótesis nula. Por lo tanto podemos decir que existen

diferencias significativas en la evaluación del solvente en el rendimiento de

antocianinas.

Utilizando el método de Tukey se muestra que no existe diferencia

significativa entre los solventes Metanol:HCl y Etanol:HCl, expresados con

la misma letra (A) de agrupación que se muestra a continuación:

Solventes N Media Agrupación

1 3 63,065 A

3 3 62,954 A

4 3 60,338 B

5 3 58,056 C

2 3 43,472 D

Dónde: (1) Metanol: HCl (0.01%), (2) Agua: HCl (0.01%), (3) Etanol: HCl

(0.01%), (4) Etanol: Ac. Cítrico (0.01%), (5) Etanol: Ac. Ascórbico (0.01%).

Las medias que no comparten una letra son significativamente diferentes.

Se observa en el modelo de Tukey que el que tiene menor contenido de

antocianinas en el extracto es del solvente acuoso, presentando

58

43,472mg/100 ml esto se debe a que las antocianidinas son menos

solubles en el agua.

El solvente Etanol: Ac. Cítrico (0.01%), está representado por la letra B, lo

cual indica que es significativamente diferente al Metanol: HCl (0.01%) y

Etanol: HCl (0.01%).

El solvente Etanol: Ac. Cítrico (0.01%) su uso es de grado Alimentario para

la Industria a comparación de los anteriores, y presenta mayor extracción

que Agua: HCl (0.01%) y Etanol: Ac. Ascórbico (0.01%).

Por ello se recomienda trabajar con el solvente Etanol: Ac. Cítrico (0.01%).

4.2 Evaluación de la estabilidad del extracto de los pétalos de Mastuerzo

frente al Tratamiento Térmico y pHs.

Se evaluó la estabilidad del extracto obtenido a temperatura de ebullición por

un tiempo de 60 minutos a diferentes pHs.

El extracto fue llevado a tubos de ensayo y sometido a temperatura de

ebullición por un tiempo de 60 minutos y se evaluó la estabilidad del

colorante a temperatura de ebullición y a pHs igual 3,4 y 5.

En las tablas siguientes se muestra los resultados obtenidos de los

extractos sometidos a pHs diferentes y a temperatura de ebullición por 60

minutos.

Tabla 12. Contenido de antocianinas a temperatura de ebullición por 60

minutos, a pH 3

PH=3 Contenido de Antocianinas (mg/100 g)

TIEMPO (MIN)

R1 R2 R3 Promedio

0 60,42 60,4 60,39 60,40 ±0.01

15 60,38 60,38 60,35 60,37 ±0.01

30 58,61 58,62 58,63 58,62 ±0.01

45 57,68 57,72 57,71 57,70 ±0.02

60 56,98 56,97 56,96 56,97 ±0.01

59

Tabla 13. Contenido de antocianinas a temperatura de ebullición por 60 minutos, a pH 4

(R1) Repetición N° 1, (R2) Repetición N° 2, (R3) Repetición N° 3

Tabla 14. Contenido de antocianinas a temperatura de ebullición por 60

minutos, a pH 5

(R1) Repetición N° 1, (R2) Repetición N° 2, (R3) Repetición N° 3

PH=4 Contenido de antocianinas (mg/100 g)

TIEMPO R1 R2 R3 Promedio

0 60,42 60,4 60,39 60,40 ±0.01

15 60,41 60,39 60,39 60,39 ±0.01

30 59,01 59,21 59,24 59,15 ±0.12

45 58,6 58,9 58,87 58,79 ±0.16

60 58,2 57,96 58,1 58,08 ±0.12

PH=5 Contenido de antocianinas (mg/100 g)

TIEMPO R1 R2 R3 Promedio

0 60,42 60,4 60,39 60,4 ±0.01

15 59,23 59,14 59,25 59,2 ±0.05

30 58,68 58,67 58,72 58,69 ±0.02

45 58,02 58,06 58,1 58,06 ±0.04

60 57,45 57,48 57,56 57,49 ±0.05

60

Figura 12. Variación del contenido de antocianinas a temperatura de

ebullición a diferentes pHs por 60 minutos

Figura 13. Contenido de antocianinas a diferentes pHs despues de 60 min.

A temperatura de ebullición

56 56.5 57 57.5 58 58.5

pH3

pH4

pH5

56.97

58.08

57.49

Contenido de antocianinas (mg/100 g.)

Dif

ere

nte

s p

Hs

Evaluación del contenido de Antocianinas

61

Se observa en la Figura 13, que a pH 4 se conserva mayor contenido de

antocianinas seguido del pH 5 y pH 3, observando contenidos muy cercanos

entre ellos.

La degradación de antocianinas se produce no sólo durante la extracción del

tejido vegetal, sino también durante el procesado y almacenamiento de los

tejidos alimentarios. (Fennema, 2000).

Los principales factores que gobiernan la degradación de las antocianinas

son el pH, la temperatura, oxigeno, y estructura.

La estabilidad de las antocianinas tiene una fuerte influencia de los

sustituyentes hidroxilo y metóxilo. La degradación no solo ocurre durante la

extracción del tejido de la planta sino también durante el proceso.

Los grupos hidroxilo, metóxilo, azucares y azucares asiladas tienen un

efecto marcado en el color y la reactividad de las antocianinas. El color es

influido por los rangos fisicoquímicos. Generalmente conforme se incrementa

el grupo hidroxilo, el color se transforma de rosa a azul, observándose el

efecto inverso con los grupos metóxilo. Mazza y Broullard (1987) citado en

Castillo (2006).

En el extracto de flor de mastuerzo se obtuvo un color naranja brillante por lo

que las antocianinas son conocidas para formar complejos débiles con

numerosos compuestos tales como proteínas, taninos, otros flavonoides y

polisacáridos por lo cual es referido como copigmentación intermolecular. La

mayoría de estos compuestos no son coloreados por ellos mismos, pero

cuando se asocian con las antocianinas ellos aumentan el color y la

estabilidad del cromóforo. (Aguilera, 2009). Frente a temperatura y pHs.

Las antocianinas tienen cambios importantes de color con las variaciones de

pH, cuando el pH es ácido su color es rojo intenso mientras que a pH neutro

se encuentra de manera incolora y a pH alcalino su coloración es amarilla y

pasa posteriormente a ser azul. Cuevas et al., 2008, citado en Almeida,

2012.

62

En la figura 8 se observa un gráfico en relación pH y absorbancia donde a

menor pH mayor absorbancia, que también lo podríamos relacionar con la

intensidad de color presentado en los extractos, entonces a mayor

intensidad de color entonces mayor cantidad de antocianinas esto debido a

su comportamiento estructural. Si la antocianina es estable en pHs bajos,

entonces la estabilidad térmica es mejor a altas temperaturas (Fennema,

2000).

Altas temperaturas y pHs neutros o alcalinos afectan a la pigmentación de

los extractos de antocianinas que es la degradación del color, la cual se

puede presentar como consecuencia de la exposición a la luz (foto

degradación), por acción de la temperatura efecto conocido como oxidación

térmica o descomposición térmica. Cuando los alimentos se someten a

elevadas temperaturas, el color de los mismos cambia entre tonalidades que

van desde un ligero amarillo hasta un intenso café, debido las reacciones de

caramelización que se producen en su interior (Badui, 2006).

Existen diversas teorías que explican el efecto de la temperatura en la

estabilidad de la antocianina pero el mecanismo preciso no se ha

esclarecido totalmente. Se sugiere que la elevación de la temperatura en

soluciones de antocianinas a pH 2-4 induce la pérdida de la mitad glicosil de

la antocianina, por hidrólisis, lo cual lleva a la pérdida del color desde que los

aglicones son menos estables que sus formas glicosidicas. Otros autores

postulan que el calor desplaza el equilibrio hacia la chalcona (Markakis et al.,

1957).

La pérdida de color de las antocianinas también se da por causa de las

reacciones enzimáticas que se producen en forma natural, en la enzima β-

glucosidasa hidrolizan al enlace glucosídico en el átomo de carbono 3,

separando al aglicón del azúcar. Existen enzimas del tipo de las

polifenolasas que también pueden causar una decoloración. (Almeida, 2012)

En la figura 13, se observa que a pH3 después de ser sometido a

temperatura de ebullición, el contenido de antocianinas es menor que a pH4

y pH5. Cuando interactúan pHs y Temperaturas, en el extracto de flor de

63

mastuerzo se activan las enzimas propias de la flor y a ello se suma la

acidificación del solvente que hacen que las antocianinas se hidrolicen y

sean menos estable, por ello se reporta un contenido bajo de antocianinas.

Rein (2005) señala que en general los mismos factores estructurales los

cuales mejoran la estabilidad de las antocianinas frente al pH también

incrementan su estabilidad térmica. En un estudio de la estabilidad de las

antocianinas de Sambucus canadensis y Sambicus nigra encontraron que la

acilación mejora la estabilidad frente al calor y la luz, mientras que la

glicosilación únicamente estabiliza las antocianinas en presencia de luz.

Rubinskiene et al. (2005). En un estudio del impacto de varios factores en la

composición y estabilidad de antocianinas de grosella negra concluyeron

que la cianidina 3-rutinosido fue la antocianina más estable frente al

tratamiento térmico a 95 °C frente a cianidina 3-glucósido, delfinidina 3-

glucósido y delfinidina 3- rutinósido, mientras cianidina y delfinidina

rutinosida fueron las más estables durante el almacenamiento.

Pero Centeno (2003) citado en Almeida (2012) discrepa con Rein (2005)

mencionando que a medida que se incrementa la temperatura la extracción

es mejor pero si el rango de temperatura está entre 70 y 100 °C el

rendimiento no aumenta de forma significativa para extracción de

antocianinas.

En la figura 13, se observa que a pH4 hay mayor cantidad de contenido de

antocianinas, Debido a que el núcleo del flavilio, es estable a pH ácidos o

bajos. Y en el pH5 se observa una pequeña disminución de contenido de

antocianinas es porque el catión flavilio de color rojo, representado por la

fórmula (AH+); cuando se incrementa el pH, la distribución electrónica se

modifica hasta llegar a la forma quinoidea azul o base anhidra que

pueden convertirse a la base del carbinol incolora, que predomina en el

intervalo de pH de 4 a 5 (Badui, 2006).

64

Linden y Lorient (1994), Citado en Almeida (2012) recomiendan utilizar

colorantes con antocianinas en la zona del pH entre 3,5 a 6,0 para lograr

colores que van desde el rojo violáceo hasta el rojo cereza.

En las siguientes figuras se muestra el porcentaje de retención de las

antocianinas a diferentes pHs.

Tabla 15. Porcentaje de Retención de antocianinas a temperatura de

ebullición por 60 minutos, a pH 3

TIEMPO (Min.)

Concentración de

antocianinas (mg/100g.)

Porcentaje de

retención (%)

0 60,40 100

15 60,37 99.45

30 58,62 97.05

45 57,70 95.52

60 56,97 94.32

Tabla 16. Porcentaje de Retención de antocianinas a temperatura de

ebullición por 60 minutos, a pH 4

TIEMPO (Min.)

Concentración de

antocianinas (mg/100g.)

Porcentaje de

retención (%)

0 60,40 100

15 60,39 99.98

30 59,15 97.93

45 58,79 97.33

60 58,08 96.15

65

Tabla 17. Retención de antocianinas a temperatura de ebullición por 60

minutos, a pH 5

TIEMPO (Min.)

Concentración de

antocianinas (mg/100g.)

Porcentaje de

retención (%)

0 60,40 100

15 59,20 98.01

30 58,69 97.16

45 58,06 96.12

60 57,49 95.18

Figura 14. Contenido de antocianinas expresado porcentualmente a

diferentes pHs despues de 60 min y a temperatura de ebullición

Se realizó los cálculos de porcentaje de retención de antocianinas

encontrándose que a pH 4 existe un mayor porcentaje de retención del

pigmento, mostrando una pérdida de pigmento hasta de un 6% a

temperatura de ebullición por 60 minutos.

Los extractos de antocianinas de la flor de Mastuerzo, se aplicaría fácilmente

en productos alimenticios como néctares, mermeladas, etc. Porque el uso de

altas concentraciones de azúcar (>20%) o jarabes para preservar frutas y

94.32%

96.15%

95.18%

93 93.5 94 94.5 95 95.5 96 96.5

pH3

pH4

pH5

PORCENTAJE DE CONTENIDO DE ANTOCIANINAS (%)

DIF

EREN

TES

pH

s

CANTIDAD DE CONTENIDO DE ANTOCIANINAS EXPRESADO PORCENTUALMENTE

66

derivados tiene un efecto protectivo global sobre los cromóforos de las

antocianinas, presumiblemente por la baja actividad de agua (aw). La aw

reducida está asociada con una reducida velocidad de degradación de

antocianinas: la hidratación de cromóforos de antocianinas a especies

descoloridas llega a ser menos favorable como el agua llegue a ser limitante.

Efectivamente, polvos de antocianinas deshidratadas (aw ≤ 0.3) son

relativamente estables a temperatura ambiente por varios años cuando son

mantenidos en contenedores sellados herméticamente (Jackman y Smith,

1992) Citado en Aguilera (2009).

4.3 Evaluación de la estabilidad del extracto acuoso de pétalos de

Mastuerzo frente al almacenamiento a temperaturas de 4°C y 24°C por

30 días a diferentes pHs.

Se muestra a continuación la pérdida de antocianinas en almacenamiento a

4 y 24°C por 30 días, y a diferentes pHs.

4.3.1 Temperatura de almacenamiento a 4°C

En las tablas siguientes se muestra el comportamiento de la

pérdida de antocianinas a la temperatura de almacenamiento de

4 ° C y diferentes pHs.

Tabla 18. Evaluación de la pérdida de antocianinas por efecto de la

temperatura de almacenamiento (4°C) a pH 3

PH=3 Contenido de antocianinas (mg/100g.)

Tiempo (Días)

R1 R2 R3 Promedio

0 60,42 60,40 60,39 60,40 ±0.01 5 60,40 60,41 60,42 60,41 ±0.01

10 60,40 60,39 60,40 60,39 ±0.005 15 59,84 59,86 59,89 59,86 ±0.02 20 59,25 59,26 59,32 59,27 ±0.03 25 58,96 58,89 58,86 58,90 ±0.05 30 58,64 58,68 58,72 58,68 ±0.04

(R1) Repetición N° 1, (R2) Repetición N° 2, (R3) Repetición N° 3

67

Tabla 19. Evaluación de la pérdida de antocianinas por efecto de la

temperatura de almacenamiento (4°C) a pH 4

Tabla 20. Evaluación de la pérdida de antocianinas por efecto de la

temperatura de almacenamiento (4°C) a pH 5

PH=5 Contenido de antocianinas (mg/100g.)

Tiempo (Días)

R1 R2 R3 Promedio

0 60,42 60,4 60,39 60,40 ±0.01

5 59,98 59,97 59,96 59,97 ±0.01

10 59,21 59,2 59,17 59,19 ±0.02

15 58,26 58,24 58,28 58,26 ±0.02

20 57,98 57,98 57,96 57,97 ±0.01

25 57,25 57,29 57,21 57,25 ±0.04

30 56,87 56,87 56,89 56,87 ±0.01

PH=4 Contenido de antocianinas (mg/100g.)

Tiempo (Dias)

R1 R2 R3 Promedio

0 60,42 60,4 60,39 60,40 ±0.01

5 60,01 59,96 60,24 60,07 ±0.14

10 59,78 59,76 59,76 59,76 ±0.01

15 59,12 59,16 59,07 59,11 ±0.04

20 58,56 58,58 58,62 58,58 ±0.03

25 58,01 57,98 58,00 57,99 ±0.01

30 57,81 57,75 57,75 57,77 ±0.03

68

4.3.2 Temperatura de almacenamiento a 24°C

En las siguientes tablas se muestra el contenido de antocianinas en

almacenamiento a diferentes pHs, a 24°C.

Tabla 21. Evaluación de la pérdida de antocianinas por efecto de la

temperatura de almacenamiento (24°C) a pH 3

(R1) Repetición N° 1, (R2) Repetición N° 2, (R3) Repetición N° 3

Tabla 22. Evaluación de la pérdida de antocianinas por efecto de la

temperatura de almacenamiento (24°C) a pH4

PH=3 Contenido de antocianinas (mg/100g.)

Tiempo (Días)

R1 R2 R3 Promedio

0 60,42 60,4 60,39 60,4 ±0.01

5 60,12 60,14 60,14 60,13 ±0.01

10 59,8 59,78 59,76 59,78 ±0.02

15 59,24 59,26 58,9 49,25 ±0.2

20 58,75 58,76 58,72 58,74 ±0.02

25 57,86 57,89 57,92 57,89 ±0.03

30 57,05 56,98 56,99 57,00±0.03

PH=4 Contenido de antocianinas (mg/100g.)

Tiempo (Días)

R1 R2 R3 Promedio

0 60,42 60,4 60,39 60,39 ±0.01

5 59,72 59,69 59,72 59,72 ±0.01

10 58,98 58,99 59,00 59,00 ±0.01

15 58,13 58,14 58,12 58,12 ±0.01

20 57,75 57,72 57,78 57,78 ±0.03

25 57,06 57,08 57,08 57,08 ±0.01

30 56,75 56,74 56,75 56,75 ±0.005

69

Tabla 23. Evaluación de la pérdida de antocianinas por efecto de la

temperatura de almacenamiento (24°C) a pH 5

Al realizar el análisis estadístico de los valores finales nos muestra que

existe diferencia significativa en el contenido de antocianinas a las dos

temperaturas de almacenamiento y diferentes pHs.

Tabla 24. Análisis estadístico de la Evaluación de la estabilidad de

contenido de antocianinas frente al almacenamiento a las temperaturas de

4°C y 24°C

(Anexo 2)

De la Tabla N°24, se evalúa el estadístico de la estabilidad contenido

antocianinas frente a temperatura de almacenamiento y pHs además la

significación de p=0.00, siendo significativo por ser ˂ 0.05 por lo que se

rechaza la hipótesis nula. Por lo tanto podemos decir que existen diferencias

PH=5 Contenido de antocianinas (mg/100g.)

Tiempo (Días)

R1 R2 R3 Promedio

0 60,42 60,4 60,39 60,40 ±0.01

5 59,09 59,12 59,11 59,11 ±0.01

10 58,47 58,39 58,39 58,41 ±0.04

15 57,32 57,35 57,32 57,33 ±0.01

20 56,42 56,44 56,42 56,42 ±0.01

25 55,89 55,84 55,86 55,86 ±0.02

30 55,09 55,04 55,06 55,06 ±0.02

Fuente G.L. Suma de

Cuadrados

Cuadrado

de la

Media

F-Valor Pr>F

Temperatura 1 10,17 10,17 12123,24 0,000

pHs 2 11,0228 5,5114 6569,89 0,000

Temperatura*pHs 2 0,5331 0,2665 317,74 0,000

Error 12 0,0101 0,0008

Total 17 21,736

70

significativas en la evaluación de la estabilidad de antocianinas frente a

temperatura de almacenamiento y pHs.

Utilizando la prueba de Tukey se muestra que existe diferencia significativa

en el contenido de antocianinas a las dos temperaturas y pHs que se

muestra a continuación:

.

Temperatura pHs N Media Agrupación

1 1 3 58,7 A

1 2 3 57,8 B

2 1 3 57,0 C

1 3 3 56,9 D

2 2 3 56,7 E

2 3 3 55,1 F

Las medias que no comparten una letra son significativamente diferentes. A

temperatura de 4°C y pH3 hay un contenido mayor de antocianinas.

Figura 15. Contenido de antocianinas durante el almacenamiento en

teperaturas de 4°C y 24°C despues de 30 dias.

53 54 55 56 57 58 59

pH3

pH4

pH5

58.68

57.77

56.87

57

56.75

55.06

Contenido de Antocianina (mg/100g.)

Va

ria

cio

n d

e p

Hs

Evaluación de la estabilidad de contenido de antocianinas frente al almacenamiento a las

temperaturas de 4°C y 24°C

T = 24°C

T = 4°C

71

En general se observa que al variar la temperatura de 4 a 24°C existe mayor

retención de contenido de antocianinas a 4°C y a medida que aumenta el pH

la concentración de antocianinas disminuye para las dos temperaturas.

Por lo que decimos que hay mayor contenido de antocianinas en extracto de

la flor de Mastuerzo a 4°C y a pH 3.

En general los pigmentos de los extractos de antocianinas de la flor de

mastuerzo son notoriamente destruidos por el calor durante el

procesamiento y almacenamiento de los alimentos. El aumento de la

temperatura produce la perdida de una molécula de azúcar en la posición 3 y

como consecuencia la ruptura del anillo y como efecto la formación de

chalconas incoloras (Garzón, 2008) citado en (Fennema, 2000). Esto se

aprecia en los resultados obtenidos después de los 30 días de

almacenamiento.

Las antocianinas son relativamente inestables, siendo únicamente su

comportamiento aceptable cuando se encuentran en medio acido, se

degradan cambiando el color durante el almacenamiento sobre todo cuando

es más elevada la temperatura.

Las diferentes coloraciones de las antocianinas también se deben a la

conversión del catión flavilo a formas secundarias de las antocianinas en

medios acuosos así como a interacciones moleculares. Debido a una

deficiencia del núcleo de flavilo, estos pigmentos funcionan como verdaderos

indicadores de pH. A pH ácidos adquieren una estructura estable de catión

flavilo colorido. Al aumentar el pH se promueve la desprotonación del catión

flavilo; a pH 7.0 y superiores debido a la desprotonación continuada

predominan las formas quinoidales, en estos casos el efecto batocrómico.

El cambio de color de los vinos de rojo púrpura a café-rojizo se debe a la

formación de polímeros estables de antocianina-taninos, resultado de la

copigmentación. A medida que el vino se añeja, cambia de un rojo brillante a

un rojo-café o más oscuro; esto va acompañado de una reducción de la

concentración de las antocianinas monoméricas y de un incremento en la

producción de compuestos poliméricos. (Badui, 2006).

72

4.4 Evaluación de la capacidad Antioxidante frente a la Temperatura

de Ebullición.

Se evaluó la capacidad antioxidante en los procesos de evaluación de

estabilidad del colorante extraídos cuyos resultados se muestran en las

siguientes tablas:

Tabla 25. Variación de la capacidad antioxidante al variar el tiempo de

exposición a Temperatura de Ebullición a pH 3

PH=3 CAPACIDAD ANTIOXIDANTE

(umol TE/g. de muestra)

Tiempo (Min.)

R1 R2 R2 Promedio

0 298,65 298,69 298,72 298,69 ±0.03 15 292,75 292,74 292,69 292,73 ±0.03 30 285,32 286,56 285,56 285,81 ±0.6 45 284,86 284,25 284,57 284,56 ±0.3 60 280,63 280,65 280,69 280,66 ±0.03

Tabla 26. Variación de la capacidad antioxidante al variar el tiempo de

exposición a Temperatura de Ebullición a pH 4

PH=4 CAPACIDAD ANTIOXIDANTE

(umol TE/g. de muestra)

Tiempo (Min.)

R1 R2 R2 Promedio

0 298,65 298,69 298,72 298,69 ±0.03

15 293,56 293,84 293,45 293,62 ±0.2

30 289,25 289,35 289,28 289,29 ±0.05

45 286,25 286,35 286,29 286,3 ±0.05

60 282,56 282,54 282,46 282,52 ±0.05

umol TE=micromol trolox equivalente

(R1) Repetición N° 1, (R2) Repetición N° 2, (R3) Repetición N° 3

73

Tabla 27: Variación de la capacidad antioxidante al variar el tiempo de

exposición a Temperatura de Ebullición a pH 5

Figura 16. Evaluación de la capacidad antioxidante en diferentes pHs despues de 60 min. Expuestos a temperatura de ebullición.

umol TE=micromol trolox equivalente

En la evaluación de la actividad antioxidante en extractos de flores de

Mastuerzo se obtuvieron resultados mediante el método de captura de

radicales libres que utiliza el radical 1,1-difenil-2-picril-hidrazilo (DPPH). Este

método es probablemente más eficiente que el método ABTS (ácido

2,2’azinobis (6-sulfonato-3-etilbenzotiazolina)) por capturar mayores

280.66

282.52

279.28

277.00 278.00 279.00 280.00 281.00 282.00 283.00

pH3

pH4

pH5

Capacidad Antioxidante (µmol TE/g. de muestra)

Dif

ere

nte

s p

Hs

Evaluación de la Capacidad Antioxidante

PH=5 CAPACIDAD ANTIOXIDANTE

(umol TE/g. de muestra)

Tiempo (Min.)

R1 R2 R2 Promedio

0 298,65 298,69 298,72 298,69 ±0.03

15 294,23 294,56 294,58 294,46 ±0.19

30 289,35 289,65 289,64 289,55 ±0.17

45 281,21 281,35 281,26 281,27 ±0.07

60 279,25 279,35 279,24 279,28 ±0.06

74

electrones (Sánchez-Moreno, 2002) citado en (Leyva, 2009).

Existen factores que afectan la actividad antioxidante de los compuestos

fenólicos. Así, el número y posición de grupos hidroxilo, la presencia de

azúcares unidos y el grado de polimerización determinarán propiedades de

los compuestos fenólicos tales como la solubilidad y la tendencia a ceder

electrones o átomos de hidrógeno. (Leyva, 2009).

En la figura 16, se puede identificar que la diferencia de pérdida de la

capacidad antioxidante es mínima para los 3 pHs.

Los resultados indican que el contenido de la capacidad antioxidante es

mayor a pH4, por lo que el ion flavilio se encuentra más estable a pHs

ácidos. A pHs muy ácidos y temperaturas elevadas se hidrolizan las

antocianinas siendo más inestables como en el pH3 a las cuales no solo

reacciona la acidez sino también las reacciones enzimáticas naturales de la

flor disminuyen la capacidad antioxidante.

4.5 Evaluación de la capacidad antioxidante del extracto de pétalos de

Mastuerzo frente al almacenamiento a temperaturas de 4°C y 24°C por

30 días a diferentes pHs.

Se realizó la evaluación también en almacenamiento a 4 y 24°C.

4.5.1 Almacenamiento a temperatura de 4°C

Tabla 28. Evaluación de la pérdida de capacidad antioxidante por efecto de

la temperatura de almacenamiento (4°C) a pH 3

PH=3 CAPACIDAD ANTIOXIDANTE

(umol TE/g. de muestra)

Tiempo (Dias)

R1 R2 R2 Promedio

0 298,65 298,69 298,72 298,65 ±0.03

5 298,64 298,61 298,61 298,04 ±0.01

10 296,84 296,87 296,87 296,61 ±0.01

15 295,95 296,25 296,12 295,91 ±0.15

20 295,45 295,65 295,52 295,36 ±0.1

25 294,93 294,96 294,97 294,75 ±0.02

30 294,23 294,32 294,36 294,30 ±0.06

75

Tabla 29. Evaluación de la pérdida de capacidad antioxidante por efecto de

la temperatura de almacenamiento (4°C) a pH 4

Tabla 30. Evaluación de la pérdida de capacidad antioxidante por efecto de

la temperatura de almacenamiento (4°C) a pH 5

umol TE=micromol trolox equivalente

(R1) Repetición N° 1, (R2) Repetición N° 2, (R3) Repetición N° 3

PH=4 CAPACIDAD ANTIOXIDANTE

(umol TE/g. de muestra)

Tiempo (Dias)

R1 R2 R2 Promedio

0 298,65 298,69 298,72 298,62 ±0.03

5 298,56 298,54 298,53 298,31 ±0.01

10 297,89 297,86 297,84 297,34 ±0.02

15 296,21 296,31 296,28 295,97 ±0.05

20 295,32 295,36 295,38 294,97 ±0.03

25 294,25 294,23 294,24 294,15 ±0.01

30 293,98 293,95 293,98 293,97 ±0.01

PH=5 CAPACIDAD ANTIOXIDANTE

(umol TE/g. de muestra)

Tiempo (Dias)

R1 R2 R2 Promedio

0 298,65 298,69 298,72 298,40 ±0.03

5 297,95 297,89 297,85 297,66 ±0.05

10 297,12 297,15 297,14 296,91 ±0.01

15 296,45 296,42 296,46 296,28 ±0.02

20 295,85 295,89 295,96 295,29 ±0.05

25 294,12 294,15 294,14 293,81 ±0.01

30 293,12 293,16 293,18 293,15 ±0.03

76

4.5.2 Almacenamiento a temperatura de 24°C

Tabla 31. Evaluación de la pérdida de capacidad antioxidante por efecto de

la temperatura de almacenamiento (24°C) a pH 3

PH=3 CAPACIDAD ANTIOXIDANTE

(umol TE/g. de muestra)

Tiempo (Dias)

R1 R2 R2 Promedio

0 298,65 298,69 298,72 298,69 ±0.03

5 297,89 297,84 297,84 297,86 ±0.02

10 296,45 296,48 296,51 296,48 ±0.03

15 295,89 295,87 295,89 295,88 ±0.01

20 295,01 295,09 295,06 295,05 ±0.04

25 294,21 294,23 294,28 294,24 ±0.03

30 293,2 293,25 293,14 293,2 ±0.05

Tabla 32. Evaluación de la pérdida de capacidad antioxidante por efecto de

la temperatura de almacenamiento (24°C) a pH 4

PH=4 CAPACIDAD ANTIOXIDANTE

(umol TE/g. de muestra)

Tiempo (Dias)

R1 R2 R2 Promedio

0 298,65 298,69 298,72 298,69 ±0.03

5 297,45 297,48 297,46 297,46 ±0.01

10 296,48 296,48 296,35 296,44 ±0.07

15 295,78 295,72 295,74 295,75 ±0.03

20 294,87 294,87 294,98 294,91 ±0.06

25 294,01 294,08 298,07 295,39 ±2.32

30 292,45 292,52 292,58 292,52 ±0.06

77

Tabla 33. Evaluación de la pérdida de capacidad antioxidante por efecto de

la temperatura de almacenamiento (24°C) a pH 5

PH=5 CAPACIDAD ANTIOXIDANTE

(umol TE/g. de muestra)

Tiempo (Dias)

R1 R2 R2 Promedio

0 298,65 298,69 298,72 298,69 ±0.03

5 297,21 297,2 297,18 297,2 ±0.01

10 296,45 296,45 296,48 296,46 ±0.01

15 295,05 295,08 295,02 295,05 ±0.03

20 294,12 294,15 294,13 294,13 ±0.01

25 293,45 293,48 293,49 293,47 ±0.02

30 292,01 291,86 291,86 291,91 ±0.08

Tabla 34. Análisis estadístico de la Evaluación de la capacidad antioxidante

de antocianinas frente al almacenamiento a las temperaturas de 4°C y 24°C

(Anexo 3)

De la Tabla N° 34, se evaluó el estadístico de la capacidad antioxidante

frente a la temperatura de almacenamiento y a pHs diferentes, la

significación obtenida de p=0.00 y p=0.001, siendo significativo por ser ˂

0.05 por lo que se rechaza la hipótesis nula. Por lo tanto podemos decir que

existen diferencias significativas en la evaluación de la capacidad

antioxidante.

Utilizando el método de Tukey se muestra que existe diferencia significativa

Fuente G.L. Suma de

Cuadrados

Cuadrado

de la

Media

F-Valor Pr>F

Temperatura 1 7,2327 7,2327 2123,79 0,000

pHs 2 4,4950 2,2475 659,96 0,000

Temperatura*pHs 2 0,0915 0,0457 13,43 0,001

Error 12 0,0409 0,0034

Total 17 11,8601

78

en el contenido de capacidad antioxidante en almacenamiento a diferentes

temperaturas y diferentes pHs.

T pHs(Varios) N Media Agrupación

1 1 3 294,3 A

1 2 3 294,0 B

2 1 3 293,2 C

1 3 3 293,2 C

2 2 3 292,5 D

2 3 3 291,9 E

Al realizar el análisis se obtuvo que existe diferencia significativa, habiendo

mayor capacidad antioxidante en la agrupación A, que se encuentra a

temperatura de 4°C y a Ph3.

Figura 17. Contenido de antocianinas a diferentes temperaturas de

almacenamiento despues de 30 dias.

La actividad antioxidante es un parámetro de gran interés para valorar la

capacidad antioxidante de un sistema biológico. La actividad antioxidante

290.00 291.00 292.00 293.00 294.00 295.00

pH 3

pH 4

pH 5

294.36

293.98

293.20

293.2

292.52

291.91

Contenido de Antocianina (mg/100g.)

Var

iaci

on

de

pH

s

Evaluación de la Capacidad Antioxidante frente al almacenamiento a las temperaturas de 4°C y 24°C

T = 24°C

T = 4°C

79

comprende una transición redóx mediante la cual la molécula

antioxidante dona un electrón o átomo de hidrógeno, equivalente a la

donación de un electrón y un H+ al radical libre R* (Cadenas, 2000).

La capacidad antioxidante varía en función de compuestos estudiados y sus

solubilidad en fase acuosa o lipídica y está fuertemente condicionada por

el sistema usado como sustrato, las condiciones de catálisis de la

oxidación, las propiedades redóx de sus grupos hidrofenólicos y la relación

estructural entre las diferentes partes de la estructura química (Pokorny,

2001)

La capacidad antioxidante tiene directa relación con el número de grupos

hidroxilos unidos a los carbonos de los anillos, entre mayor número de

grupos OH mayor capacidad antioxidante (Gross, 1987) Citado en (Castillo,

2006).

Nicoli et al. (1999), indican que en la mayoría de los casos, el procesamiento

es el responsable de pérdidas significativas de los antioxidantes naturales.

Esto es debido a que la mayoría de antocianinas son relativamente

inestables al tratamiento térmico. Por lo que los extractos de flor de

mastuerzo aplicado a diferentes temperaturas muestran disminución en la

capacidad antioxidante por ser oxidados a altas temperaturas (Yoshioka et

al., 1990) citado por (Larrauri et al., 1998). Esto se aprecia en los extractos

almacenados a 24°C.

En la figura 17 se observa que hay una mayor capacidad antioxidante en

condiciones de pH3 y temperatura de almacenamiento a 4°C, esto debido

que en los extractos de flor de mastuerzo pueden deberse a la acilación que

presentan las moléculas de antocianina con ácidos cinámicos y otros

compuestos que poseen capacidad antioxidante. (Lock, 1997)

En un estudio realizado en vinos con moras negras se encontró que la

actividad antioxidante se ve influenciada por el porcentaje de antocianinas

poliméricas que se forman durante el añejamiento, por el contrario el

contenido de antocianinas monoméricas se ve disminuida con el tiempo de

almacenamiento (Tsai et al., 2004) citado en (Leyva, 2009). Con lo cual

confirmaríamos que a mayor tiempo de almacenamiento hay una

80

disminución de las antocianinas monoméricas.

.

4.6 Relación entre el contenido y capacidad antioxidante de las

Antocianinas

Se realizó una relación del efecto de la pérdida de capacidad

antioxidante respecto al contenido de antocianinas que se muestra

en las siguientes tablas tanto a 4°C como a 24°C y a pH3.

Tabla 35. Variación de la capacidad antioxidante al variar el contenido de

antocianinas por efecto de la temperatura de almacenamiento (4°C) a pH 3

umol TE=micromol trolox equivalente

T = 4°C

TIEMPO (dias)

CONTENIDO DE ANTOCIANINAS

(mg/100g.)

CAPACIDAD ANTIOXIDANTE (µmol TE/g de

muestra)

0 60,40 298,65

5 60.,41 298,04

10 60,40 296,61

15 59,86 295,91

20 59,28 295,36

25 58,90 294,75

30 58,68 294,36

81

Figura 18. Capacidad antioxidante vs el contenido de antocianas a 4°C

Tabla 36. Variación de la capacidad antioxidante al variar el contenido de

antocianinas por efecto de la temperatura de almacenamiento (24°C) a pH 3.

T = 24°C

TIEMPO (dias)

CONTENIDO DE ANTOCIANINAS

(mg/100g.)

CAPACIDAD ANTIOXIDANTE (µmol TE/g de

muestra)

0 60,40 298,69

5 60,13 297,86

10 59,78 296,48

15 59,25 295,88

20 58,74 295,05

25 57,89 294,24

30 57,01 293,20

y = -0.0665x + 60.702 R² = 0.9186

y = -0.227x + 299.12 R² = 0.8715

0.00

50.00

100.00

150.00

200.00

250.00

300.00

350.00

0 5 10 15 20 25 30 35

Co

nte

nid

o d

e a

nto

cian

inas

C

apac

idad

an

tio

xid

ante

Tíempo (días)

Variación de la capacidad antioxidante al variar contenido de antocianinas a 4°C

82

Figura 19. Variación de capacidad antioxidante al variar el contenido de

antocianas a 24°C

En la relación de antocianinas y capacidad antioxidante, se muestra que a

medida disminuye el contenido de antocianinas también disminuye la

capacidad antioxidante.

El comportamiento antioxidante de los compuestos fenólicos parece estar

también relacionado con su capacidad para quelar metales, inhibir la

lipoxigenasa y captar radicales libres, aunque en ocasiones también pueden

promover reacciones de oxidación in vitro.

Leyva (2009) menciona que la actividad antioxidante no siempre está

relacionado con el mayor contenido de fenoles en un producto, lo cual

sugiere que existen otros metabolitos que están aportando actividad

antioxidante, como la vitamina C. y Kalt (2005), citado en Quispe (2012)

afirma que las frutas fuertemente coloreadas con un alto nivel de

antocianinas, tales como la grosella negra, baya de sauco y arándano

poseen típicamente una capacidad antioxidante mayor.

y = -0.1122x + 60.713 R² = 0.9595

y = -0.1795x + 298.61 R² = 0.9931

0.00

50.00

100.00

150.00

200.00

250.00

300.00

350.00

0 5 10 15 20 25 30 35

Co

nte

nid

o d

e a

nto

cian

inas

C

apac

idad

an

tio

xid

ante

Tiempor (días)

Variación de la capacidad antioxidante al variar el contenido de antocianinas a 24°C

83

Entonces podemos afirmar lo que nos dice Kalt (2005), citado en Quispe

(2012) que a mayor contenido de antocianinas, habrá una mayor capacidad

antioxidante en los extractos elaborados con flor de mastuerzo.

84

V. CONCLUSIONES

1. El mayor rendimiento de extracción del contenido de antocianinas

de la flor de mastuerzo se obtuvo con el solvente metanol: HCl

(0.01%) con 63,07±0.10 mg/100ml, seguido del etanol: HCl (0.01%)

con 62,9 ±0.1 mg/100ml y etanol: ácido cítrico (0.01%) con 60,34

±0.19 mg/100ml, las cantidades de antocianinas obtenidos en los

extractos son muy cercanos por lo que se optó en trabajar con el

solvente etanol: ácido cítrico por ser de grado alimentario, evitando

trabajar con metanol y HCl por producir malestares a la salud

humana y en mayores cantidades su toxicidad.

2. La mayor estabilidad térmica del extracto de antocianinas

sometidas por 60 minutos y a una temperatura de ebullición se

obtuvo del extracto a pH4 con un contenido de 58,08 ±0.12 mg/100

g comparado al extracto de pH3 con un contenido de 56,97 ±0.01.

3. La mayor estabilidad de contenido de antocianinas después de 30

días de almacenamiento se obtuvo en las condiciones de

temperatura de almacenamiento de 4°C y a pH 3 con un contenido

de 58,68 ±0.04 mg/100 g. a comparación del extracto de

antocianina almacenado a temperatura de 24°C (baño maría) con

un pH 5 obteniéndose un contenido de 55,06 ±0.02 mg/100 g.

85

4. Se obtuvo la mayor capacidad antioxidante de los extractos de la

flor de mastuerzo después de ser sometidos a tratamiento térmico

a 89ºC durante 60 minutos, en las condiciones de pH 4 con un

contenido de 282,52 ±0.05 umol TE/g. de muestra (umol TE, micro

mol trolox equivalente) a comparación del extracto sometido a pH 5

con un contenido de 279,28 ±0.06 umol TE/g.

5. La mayor estabilidad de la capacidad antioxidante de los extractos

obtenidos después de 30 días de almacenamiento se obtuvo en las

condiciones de temperatura de almacenamiento de 4°C y a pH 3

con un rendimiento de capacidad antioxidante de 294,30 ±0.06

umol TE/g. de muestra a comparación del extracto de antocianina

almacenado a temperatura de 24°C (baño maría) con un pH 5

obteniéndose un rendimiento de capacidad antioxidante de 291,91

±0.08 umol TE/g

6. En la relación de contenido de antocianinas y capacidad antioxidante

en condiciones de almacenamiento de 4°C y a pH 3 el

comportamiento muestra que a mayor contenido de antocianinas,

habrá una mayor capacidad antioxidante y a un menor contenido de

antocianinas habrá una menor capacidad antioxidante.

86

VI. RECOMENDACIONES

1. Promover la producción de flor de mastuerzo, con cuidados desde la

plantación hasta la cosecha, para mejorar la producción.

2. Promover el consumo directo de la flor de mastuerzo, en ensalada o

cocido, para beneficiarse de sus bondades.

3. Los resultados obtenidos permiten recomendar la flor de mastuerzo para

una producción dirigida a ser comercializada en la industria, debido a su

elevado contenido de antocianinas benéficos para la salud y por ser una

fuente de pigmento para la industria alimentaria y farmacéutica.

87

VII. BIBLIOGRAFÍA

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of Anthocianins. J. Agric. Chem

63. Wikipedia, (2014). Polaridad de un Disolvente. Página:

http://es.wikipedia.org/wiki/Polaridad_de_un_disolvente

64. Wong, D. (1995). Química de los Alimentos: Mecanismos y Teoría. Ed.

Acribia, S. A. España. 476.

65. Yúfera E. (1998) “Química de los alimentos”. Edit. Síntesis S.A Madrid –

España. Zaragoza – España. 111-115 pp.

94

ANEXOS

95

ANEXO 1. ANALISIS ESTADISTICOS DE LOS DATOS

1. DE LA EVALUACION DEL SOLVENTE

ANOVA unidireccional: Antocianinas Monomericas vs. Solventes Fuente GL SC CM F P

Solventes 4 797.4798 199.3699 3227.01 0.000

Error 10 0.6178 0.0618

Total 14 798.0976

S = 0.2486 R-cuad. = 99.92% R-cuad.(ajustado) = 99.89%

ICs de 95% individuales para la media

basados en Desv.Est. agrupada

Nivel N Media Desv.Est. --------+---------+---------+---------+-

1 3 63.065 0.096 *)

2 3 43.472 0.337 *)

3 3 62.954 0.000 (*

4 3 60.338 0.193 (*

5 3 58.056 0.386 (*

--------+---------+---------+---------+-

48.0 54.0 60.0 66.0

Desv.Est. agrupada = 0.249

Agrupar información utilizando el método de Tukey

Solventes N Media Agrupación

1 3 63,065 A

3 3 62,954 A

4 3 60,338 B

5 3 58,056 C

2 3 43,472 D

Las medias que no comparten una letra son significativamente diferentes.

Intervalos de confianza simultáneos de Tukey del 95%

Todas las comparaciones de dos a dos entre los niveles de Solventes

Nivel de confianza individual = 99.18%

Solventes = 1 restado de:

Solventes Inferior Centro Superior

2 -20.260 -19.593 -18.926

3 -0.779 -0.111 0.556

4 -3.395 -2.728 -2.060

5 -5.676 -5.009 -4.342

Solventes -------+---------+---------+---------+--

2 (*

3 (*

4 (*

96

5 (*

-------+---------+---------+---------+--

-12 0 12 24

Solventes = 2 restado de:

Solventes Inferior Centro Superior -------+---------+---------+---------

+--

3 18.814 19.482 20.149 *)

4 16.198 16.865 17.533 (*)

5 13.917 14.584 15.251 *)

-------+---------+---------+---------

+--

-12 0 12

24

Solventes = 3 restado de:

Solventes Inferior Centro Superior -------+---------+---------+---------

+-

4 -3.284 -2.616 -1.949 (*

5 -5.565 -4.898 -4.230 (*

-------+---------+---------+---------

+-

-12 0 12

24

Solventes = 4 restado de:

Solventes Inferior Centro Superior -------+---------+---------+---------

+--

5 -2.949 -2.281 -1.614 *)

-------+---------+---------+---------

+--

-12 0 12

24

Gráfica de caja de Antocianinas Monomericas

54321

65

60

55

50

45

Solventes

An

tocia

nin

as M

on

om

eri

ca

s

Gráfica de caja de Antocianinas Monomericas

97

ANEXO 2: Evaluación de la estabilidad

2.1 Modelo lineal general: Tacys vs. Temperatura, pHs Factor Tipo Niveles Valores

Temperatura fijo 2 1, 2

pHs fijo 3 1, 2, 3

Análisis de varianza para Tacys, utilizando SC ajustada para pruebas

Fuente GL SC Sec. SC Ajust. CM Ajust. F P

Temperatura 1 10.1700 10.1700 10.1700 12123.24 0.000

pHs 2 11.0228 11.0228 5.5114 6569.89 0.000

Temperatura*pHs 2 0.5331 0.5331 0.2665 317.74 0.000

Error 12 0.0101 0.0101 0.0008

Total 17 21.7360

S = 0.0289636 R-cuad. = 99.95% R-cuad.(ajustado) = 99.93%

Agrupar información utilizando el método de Tukey y una confianza de 95.0%

Temperatura N Media Agrupación

1 9 57.8 A

2 9 56.3 B

Las medias que no comparten una letra son significativamente diferentes.

Agrupar información utilizando el método de Tukey y una confianza de 95.0%

pHs N Media Agrupación

1 6 57,8 A

2 6 57,3 B

3 6 56,0 C

Las medias que no comparten una letra son significativamente diferentes.

Agrupar información utilizando el método de Tukey y una confianza de 95.0%

Temperatura pHs N Media Agrupación

1 1 3 58,7 A

1 2 3 57,8 B

2 1 3 57,0 C

1 3 3 56,9 D

2 2 3 56,7 E

2 3 3 55,1 F

Las medias que no comparten una letra son significativamente diferentes.

98

ANEXO 3: Modelo lineal general: C.A vs. T, pHs (Varios) Factor Tipo Niveles Valores

T fijo 2 1, 2

pHs(Varios) fijo 3 1, 2, 3

Análisis de varianza para C.A, utilizando SC ajustada para pruebas

Fuente GL SC Sec. SC Ajust. CM Ajust. F P

T 1 7.2327 7.2327 7.2327 2123.79 0.000

pHs(Varios) 2 4.4950 4.4950 2.2475 659.96 0.000

T*pHs(Varios) 2 0.0915 0.0915 0.0457 13.43 0.001

Error 12 0.0409 0.0409 0.0034

Total 17 11.8601

S = 0.0583571 R-cuad. = 99.66% R-cuad.(ajustado) = 99.51%

Observaciones inusuales de C.A

EE de Residuo

Obs C.A Ajuste ajuste Residuo estándar

16 292.010 291.910 0.034 0.100 2.10 R

R denota una observación con un residuo estandarizado grande.

Agrupar información utilizando el método de Tukey y una confianza de 95.0%

T N Media Agrupación

1 9 293,8 A

2 9 292,5 B

Las medias que no comparten una letra son significativamente diferentes.

Agrupar información utilizando el método de Tukey y una confianza de 95.0%

pHs(Varios) N Media Agrupación

1 6 293,8 A

2 6 293,2 B

3 6 292,5 C

Las medias que no comparten una letra son significativamente diferentes.

Agrupar información utilizando el método de Tukey y una confianza de 95.0%

T pHs(Varios) N Media Agrupación

1 1 3 294,3 A

1 2 3 294,0 B

2 1 3 293,2 C

1 3 3 293,2 C

2 2 3 292,5 D

2 3 3 291,9 E

Las medias que no comparten una letra son significativamente diferentes.

99

ANEXO 4. IMÁGENES DE LAS ANTOCIANINAS EXTRAIDAS Y

PREPARADAS ANTES DE SU LECTURA.

100

Anexo 5: Método de pH diferencial

A. Procesos para la preparación de los reactivos:

A.1 Buffer pH 1,0 (cloruro de potasio 0,025 M).- Pesar 1,86 g de KCL en un

vaso de precipitacion, agregar agua hasta los 980 ml. Medir el pH y ajustar a

1,0 con HCl concentrado. Transferir a una probeta de 1 L y enrasar con agua

destilada.

A.2 Buffer pH 4,5 (acetato de sodio 0,4 M).- Pesar 54,43 g de CH3CO2Na-

3H2O en un vaso de precipitacion, agregar 960 ml. de agua destilada. Medir

el pH y ajustar a 4,5 con HCI concentrado.Transferir a una probeta de 1 L y

enrasar con agua destilada.

B. Preparación de la muestra:

Determinar la absorbancia de la muestra diluída con los buffers de pH 1,0 y

4,5 a 520 nm y 700 nm. Las muestras diluidas son leídas contra un blanco

de agua destilada. Medir las absorbancias entre los 20 y 50 minutos de la

preparación de la muestra

C. Cálculos:

Se calcula la concentración de pigmento antocianina, expresado como

cianidina-3 glucósido equivalente, mediante la siguiente fórmula:

Antocianinas (mg

L) =

A ∗ MW ∗ DF ∗ 103

ε ∗ 1

Dónde:

A = (A52Onm - A700nm)pH 1,0 - (A520nm - A700nm)pH 4,5.

MW = 449,2 g/mol (peso molecular) para la cianidina-3-glucósido.

DF = factor de dilución establecido previamente.

101

1 = espesor de la celda del espectro fotómetro (1 cm).

Ɛ = 26900 coeficiente de extinción molar en L mol-1cm-1, para cianidina-3-

glucósido.

103 = conversión de g a mg.

Anexo 6: Método del 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazil (DPPH)

En este análisis se utilizó una solución madre de DPPH, a partir de la cual

se obtuvo otra solución diluida, mezclando 10 ml de la solución madre con

45ml de metanol aproximadamente hasta obtener una solución con una

absorbancia de 1.1 ± 0.02 a una longitud de onda de 515 nm.

Para la cuantificación de la capacidad antioxidante se mezcló en un tubo de

ensayo 150 μL de muestra con 2850 μL de la solución diluída de DPPH,

luego se dejó en agitación, a temperatura ambiente y en un ambiente oscuro

por el tiempo de reacción que le correspondía a la muestra y luego se

procedió a la lectura de la muestra a 515 nm.

Reemplazando la absorbancia en la siguiente ecuación:

Y = (0.8676(ΔAbs)+0.013)(Vextracto/mmuestra)(Dil.)

Dónde:

Y = Capacidad antioxidante expresada en μmol TE/g de muestra

ΔAbs = Diferencia de absorbancia que existen entre el blanco y la muestra

Vextracto= Volumen final obtenido de la extracción en ml.

mmuestra= Cantidad de muestra utilizada en la extracción en gramos

Dil. = Dilucion del extracto (ml de alícuota/ml de extracto)

La capacidad antioxidante total se expresó como μmol equivalentes de

Trolox (TE) por g en base seca