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UNIVERSIDAD AUSTRAL DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS
DIVERSIDAD GENÉTICA Y CARACTERIZACIÓN
MOLECULAR DE ISOFORMAS DE EXPANSINA TaEXPA6
RELACIONADA CON EL CRECIMIENTO DE LOS
GRANOS EN TRIGO (Triticum aestivum L.)
TESIS DE MAGÍSTER
SANTIAGO CRISTÓBAL VÁSQUEZ MATUTE
VALDIVIA – CHILE
2013
ii
DIVERSIDAD GENÉTICA Y CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE
ISOFORMAS DE EXPANSINA TaEXPA6 RELACIONADA CON EL
CRECIMIENTO DE LOS GRANOS EN TRIGO (Triticum aestivum L.)
Tesis presentada a la Facultad de Ciencias Agrarias de la Universidad Austral de Chile en
cumplimiento parcial de los requisitos para optar al grado de Magíster en Ciencias
Vegetales Mención Mejoramiento Vegetal
Por
SANTIAGO CRISTÓBAL VÁSQUEZ MATUTE
Valdivia – Chile
2013
iii
UNIVERSIDAD AUSTRAL DE CHILE FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS
INFORME DE APROBACIÓN TESIS DE MAGISTER
La Comisión Evaluadora de Tesis comunica al Director de la Escuela de Graduados
de la Facultad de Ciencias Agrarias que la tesis de Magister presentada por el
candidato
SANTIAGO CRISTÓBAL VÁSQUEZ MATUTE
ha sido aprobada en el examen de defensa de Tesis rendido el día 11 de Junio de
2013, como requisito para optar al grado de Magister en Ciencias Vegetales
mención Mejoramiento Vegetal, para que así conste para todos los efectos firman:
Profesor Patrocinante de Tesis:
Dr. Ricardo Riegel Schlegel. -----------------------------------
Comisión Evaluadora de Tesis:
Dr. Daniel Calderini Rosso.-----------------------------------
Dr. Manuel Muñoz David. -----------------------------------
iv
Dedicatoria
A mis padres y hermanos.
v
Agradecimientos: Primero agradezco a Dios por darme la vida y permitirme cumplir mis sueños. Mi más sincero agradecimiento a mi profesor patrocinante Dr. Ricardo Riegel, quien con su apoyo y dedicación supo compartir sus conocimientos para la exitosa realización de esta investigación, además me hizo fácil la Genética Vegetal. También quiero expresar mi gratitud mis profesores Dr. Daniel Calderini y Dr. Manuel Muñoz quienes con sus consejos y aportes contribuyeron a la realización mi tesis. Así mismo, mi agradecimiento a la Dra. Carolina Lizana, quien me ayudó en la revisión del manuscrito. A la M.Sc. Judith Carrasco y todo el equipo del Laboratorio de Biología Molecular, quienes me ayudaron y me facilitaron el trabajo de laboratorio. A todos los Amigos que conocí a lo largo de este tiempo, con quienes compartí gratos momentos. . A mi familia que siempre estuvo presente a pesar de la distancia, apoyándome en todas mis decisiones. A Marlene, por su apoyo constante. Gracias tenerme tanta paciencia... Así mismo, mi agradecimiento a la Sra. Viviana Riquelme, secretaria de La Escuela de Graduados, quien me ayudo en todos los tramites. Mi gratitud para la Universidad Politécnica Salesiana sede Cuenca por todo el apoyo brindado. Finalmente mis agradecimientos a la Secretaría Nacional de Ciencia Tecnología y Educación Superior de Ecuador SENESCYT, quienes financiaron mis estudios.
vi
ÍNDICE DE CONTENIDOS
Capítulo Página
ÍNDICE DE TABLAS IX
ÍNDICE DE FIGURAS X
RESUMEN XII
ABSTRACT XIV
1 INTRODUCCIÓN GENERAL 1
1.1 Componentes numéricos del rendimiento. 2
1.2 Peso de granos. 3
1.3 Principales factores que determinan el peso del grano. 4
1.4 Mecanismos moleculares involucrados en el crecimiento del grano. 5
1.4.1 Expansinas 5
1.4.2 Mecanismo de acción de las expansinas. 6
1.4.3 Estudios de expresión de las expansinas. 7
1.4.4 Regulación de la expresión génica 9
1.4.5 Control transcripcional 10
1.4.6 Elementos reguladores en cis 11
1.5 HIPÓTESIS 13
vii
1.6 OBJETIVOS 13
1.6.1 Objetivo general 13
1.6.2 Objetivos específicos 14
2 MATERIALES Y MÉTODOS 15
2.1 MATERIAL VEGETAL 15
2.2 MÉTODOS 15
2.2.1 Extracción de ADN 15
2.2.2 Diseño de partidores 16
2.2.3 Amplificación de fragmentos de ADN 17
2.2.4 Secuenciación directa y búsqueda de polimorfismos 18
2.2.5 Clonación y secuenciación 18
2.2.6 Análisis de secuencias 19
2.2.7 Comparación de las isoformas con secuencias EST 20
2.2.8 Predicción de la región promotora y elementos reguladores 21
3 RESULTADOS 22
3.1 Amplificación de regiones codificantes específicas del gen EXPA6 22
3.2 Secuenciación directa y validación de SNP 24
3.3 Clonación y secuenciación de fragmentos del gen codificantes de TaEXPA6 26
3.4 Análisis de secuencias de ADN. 27
3.5 Análisis de intrones. 33
3.6 Traducción y análisis de las proteínas. 34
3.7 Comparación de las isoformas de TaEXPA6 con secuencias EST 41
viii
3.8 Predicción de la región promotora y elementos reguladores en Cis del gen
TaEXPA6 44
4 DISCUSIÓN 48
5 CONCLUSIONES 57
6 BIBLIOGRAFÍA 58
7 ANEXOS 73
ix
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla Página
Tabla 1. Partidores utilizados para amplificar regiones del gen TaEXPA6 y
resultados de amplificación.............................................................................. 23
Tabla 2. Perfil térmico para la amplificación de regiones del gen TaEXPA6. ................... 23
Tabla 3. Longitud de secuencias de ADN generadas con el partidor SLIN-2 e
identidad con las secuencias TaEXPA6 (AY543532.1) y pTaEXA6
(FN556071.1). ................................................................................................. 27
Tabla 4.Longitud de los intrones de los clones de TaEXPA6. .......................................... 34
Tabla 5.Longitud de las ORF de los clones en los cultivares Bacanora y Weebil e
identidad con respecto a TaEXPA6.................................................................. 35
Tabla 6.Comparación de las isoformas de TaEXPA6 con secuencias EST de T.
aestivum de la Base de datos Cereals DB. ........................................................ 43
Tabla 7.Elementos regulatorios del promotor putativo del gen TaEXPA6
predichos con PlantCARE. .............................................................................. 47
x
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura Página
Figura 1. Mecanismo de acción de las expansinas. ............................................................. 7
Figura 2. Relación entre el largo de grano (círculos negros) o la expresión de
actividad de la pTaEXPA6(c) (círculos blancos) en función del tiempo
desde la antesis en la posición G2 del cultivar Bacanora. ................................... 9
Figura 3. Esquema del diseño de partidores. .................................................................... 17
Figura 4. Productos de la amplificación específica en los cultivares Bacanora y
Weebil utilizando partidores específicos. ......................................................... 22
Figura 5. Cromatograma de la detección de un SNP en la secuencias pTaEXPA6
(FN556071.1) entre los cultivares Bacanora y Weebil. .................................... 24
Figura 6. Digestión de fragmentos codificantes de pTaEXPA6 (FN556071.1) en
los cultivares Bacanora y Weebil con la enzima Sac1 para validar un
SNP. ................................................................................................................ 25
Figura 7. Fragmentos clonados usando los partidores SLIN-2 para amplificar
TaEXPA6 en los cultivares B: Bacanora y W: Weebil. .................................... 26
Figura 8. Esquema de la estructura de TaEXPA6. ............................................................ 28
Figura 9. Detección de una mutación en las secuencias del grupo mTaEXPA6. ............... 29
Figura 10. Árbol filogenético obtenido a partir de ADN genómico de los clones de
TaEXPA6 incluido los intrones. ...................................................................... 31
xi
Figura 11. Árbol filogenético obtenido a partir de ADN genómico parcial. ...................... 32
Figura 12. Alineamiento de las secuencias de intrones de los clones de TaEXPA6. ......... 33
Figura 13. Localización de intrones en la familia EXPA. ................................................. 34
Figura 14. Alineamiento de secuencias de proteínas predichas de TaEXPA6. .................. 36
Figura 15. Árbol filogenético obtenido a partir de las secuencias de aminoácidos. ........... 39
Figura 16. Árbol filogenético de regiones parciales de las secuencias de
aminoácidos. ................................................................................................... 40
Figura 17. Representación de la región promotora de TaEXPA6. ..................................... 44
Figura 18. Predicción de elementos regulatorios en cis. ................................................... 46
xii
RESUMEN
El trigo panadero es una de las principales fuentes alimenticias a nivel mundial, por lo que
el aumento de la producción es prioritario frente a la creciente demanda global de
alimentos. El peso de los granos es uno de los componentes numéricos más importantes del
rendimiento y el último en ser definido. Además de su importancia para el rendimiento, el
peso y tamaño de los granos son determinantes en la calidad industrial.
Estudios a nivel molecular sobre el crecimiento de los granos, surgieren que la capacidad
de elongación de estos está regulada por las expansinas, la cuales son proteínas que
participan en la extensión de la pared celular. Recientemente se ha reportado un papel
relevante de algunas expansinas comoTaEXPA6 (α-expansina 6) en la determinación del
peso final de los granos del trigo. En este contexto, la presente investigación se enfoca en el
estudio de la diversidad genética de este gen y la caracterización molecular de sus
isoformas. Además, considerando la escasa información acerca de regiones regulatorias de
genes de expansinas en trigo, se exploró posibles elementos reguladores. Por lo tanto, el
objetivo de la tesis fue determinar diferencias genéticas en el gen TaEXPA6 en dos
cultivares contrastantes en peso de grano y contribuir al conocimiento a nivel molecular
sobre la regulación de este gen.
Los resultados de la presente tesis proporcionan importante información sobre la diversidad
genética de TaEXPA6. En dos cultivares de trigo contrastantes en peso de grano se
encontraron diferencias genéticas en secuencias con alta identidad a TaEXPA6, las cuales
corresponden a por lo menos ocho isoformas distintas. Las diferencias entre isoformas
están apoyadas por arboles filogenéticos tanto a nivel de ADN como de proteína. Análisis
comparativos in silico de las isoformas con secuencias EST de trigo, apoyan la expresión
de TaEXPA6 en tejidos de grano como pericarpio, embrión y endospermo. Asimismo, se
identificó in silico un promotor putativo y posibles elementos regulatorios en cis del gen
xiii
TaEXPA6, datos que sirven para orientar futuras investigaciones encaminadas al
mejoramiento del rendimiento del grano de trigo.
xiv
ABSTRACT
The bread wheat is a major global food source, so the increase in production is priority
front the growing global demand for food. The weight of the grains is one of the numeric
components major of yield and the last to be defined. Besides its importance for yield,
weight and size of the grains are crucial to industrial quality.
Molecular studies on the grain growth, which arise elongation capacity of these is regulated
by expansins, proteins which are involved in cell wall extension. Recently it has been
reported to play an important role in some expansins as TaEXPA6 determining the final
weight of the grains. In this context, this research focuses on the study of the genetic
diversity of this gene and molecular characterization of its variants. Moreover, given the
limited information about gene regulatory regions expansins in wheat, explore potential
regulatory elements. Therefore, the objective of the thesis was to determine genetic
differences in gene TaEXPA6 in two contrasting cultivars for grain weight and contribute
to the molecular knowledge about the regulatory elements of this gene.
The results of this thesis provide important information on the genetic diversity of
TaEXPA6. In two wheat contrasting cultivars for grain weight, genetic differences were
found in sequences with high identity to TaEXPA6, corresponding to at least eight different
isoforms. These differences between isoforms are supported by phylogenetic trees both
DNA and protein. Comparative in silico analysis of isoforms with EST sequences,
supporting the expression of TaEXPA6 in tissue-grain as pericarp, embryo and endosperm.
Also identified in silico putative promoter and potential cis regulatory elements in gene
TaEXPA6, data used to guide future experiments aimed at improving grain y
1
1 INTRODUCCIÓN GENERAL
El trigo es uno de los tres cultivos más ampliamente sembrados y una de las principales
fuentes para la alimentación humana y animal (FAO, 2010). Estudios han demostrado que
en los últimos años la producción de este cereal no se ha incrementado al ritmo registrado
en el siglo pasado con la expansión de la frontera agrícola y la tecnología generada por la
revolución verde (Calderini y Slafer, 1998; Conway y Toenniessen, 1999; Araus y col.,
2008). La creciente demanda del trigo debido al aumento acelerado de la población mundial
y factores como el calentamiento global y la aparición de los biocombustibles que compiten
con la producción de alimentos, están agravando esta situación (Reynolds, 1996; Araus,
2008; Ernst, 2011). En este contexto, la solución más conveniente para aumentar la
producción mundial de trigo, parecería ser el incremento de la productividad de la
superficie ya utilizada, dado que la introducción sustentable de nuevas áreas de cultivo es
poco probable (Borlaug, 2007).
La generación del rendimiento es un proceso complejo que puede ser analizado de una
forma más sencilla a través de sus componentes numéricos: el número de granos por unidad
de área (NG) y sus subcomponentes, y el peso medio de estos granos (PG). El PG es uno de
los componentes numéricos del rendimiento más importantes y el último en ser definido,
finalizando el ciclo de cultivo cuando se completa su crecimiento (Egli, 1998). De este
modo, el rendimiento y la seguridad de cosecha están sólidamente ligados al crecimiento de
los granos (Calderini, 2011). Además de su importancia para el rendimiento,
fenotípicamente el PG es el componente más estable del rendimiento y tiene una
correlación positiva con el rendimiento en harina (Wiersma y col., 2001). El PG también es
importante en la determinación de la calidad del grano y de la semilla (Richards y Lukacs,
2002).
2
Estudios a nivel molecular realizados en trigo sugieren que la capacidad de elongación de
los granos posiblemente está regulada por las proteínas denominadas expansinas (Lizana y
col., 2010). Estas proteínas tendrían una importancia central en la determinación del peso
potencial de los granos mediante el crecimiento del pericarpio de los granos (Calderini y
col., 2010; Lizana y col., 2010; Hasan y col., 2011). Recientemente se ha mostrado que el
gen de la expansina de trigo TaEXPA6 podría ser un factor importante en la determinación
de tamaño de grano (Lizana y col., 2010).
Considerando la importancia que tiene el gen TaEXPA6 en la determinación del peso del
grano de trigo, y por otro lado la falta de antecedentes moleculares tanto a nivel de su
diversidad genética y de la actividad de su promotor, esta tesis tiene por objeto contribuir al
conocimiento molecular mediante un avance en la predicción de posibles elementos
reguladores que pueden estar implicados en el control de la expresión génica de TaEXPA6,
y por otro lado estudiar la diversidad genética de TaEXPA6 en cultivares que presentan
variación fenotípica en el tamaño de grano, para proveer información sobre posibles
variantes de isoformas de este gen que probablemente puedan estar implicadas en parte del
control genético de la elongación de los granos en trigo.
1.1 Componentes numéricos del rendimiento.
El rendimiento de un cultivo de grano queda definitivamente establecido y puede ser
medido recién al finalizar el ciclo del cultivo. El mismo se genera a lo largo de toda la
ontogenia debido al aporte que van realizando las distintas estructuras que lo componen.
Por lo tanto, el rendimiento se concibe como un conjunto de distintos componentes que se
desarrollan durante el ciclo del cultivo, quedando cada uno de ellos fijado en una fase
particular del ciclo del cultivo (Cárcova y col., 2003).
El rendimiento del trigo ha sido tradicionalmente analizado por un modelo a través del cual
se descompone al mismo en componentes más simples mediante sucesivas aproximaciones.
3
Según el planteamiento numérico, el rendimiento de grano de trigo está determinado por el
NG por unidad de área y el PG, de modo que el rendimiento final (por m2) es considerado
como el producto de:
[(Pl m-2
* Sp Pl-1
* sp Sp-1
* Gr sp-1
) * IGWt]
Donde, Pl m-2
, Sp Pl-1
, sp Sp-1
, Gr sp-1
e IGWt, son: plantas por m2, espigas por planta,
espiguillas por espiga, granos por espiguilla, y el peso promedio de granos individuales,
respectivamente. Los componentes entre paréntesis son subcomponentes del número de
granos m-2
, un componente importante junto con el peso medio de los granos individuales
(Slafer y col., 1996).
1.2 Peso de granos.
El PG se define en una etapa acotada del ciclo del cultivo, comprendida entre la floración y
la madurez fisiológica, es decir el periodo de llenado de grano hasta cuando cesa la
acumulación de materia seca (aprox. 37% de humedad). Sin embargo, en trabajos recientes
se han encontrado evidencias importantes que apoyan que la etapa previa a la antesis es de
suma importancia para la determinación del peso potencial de los granos (Calderini y col.,
1999a; Ugarte y col., 2007).
La relación entre el PG en madurez y las condiciones de crecimiento en el período previo a
la antesis estaría vinculada con el crecimiento de los carpelos florales, el futuro pericarpio
de los granos (Calderini y col., 2001; Hasan y col., 2011). En esta etapa la temperatura
media (Calderini y col., 1999a y Calderini y col., 2001) y la disponibilidad de asimilados
(Calderini y Reynolds, 2000) son los principales factores que definen el peso potencial del
grano.
4
A partir de antesis el PG es el resultado de la acumulación de materia seca principalmente
en tres tipos de tejidos: el embrión, el endospermo (80%) y el pericarpio. En este sentido, el
peso final de grano es producto de la capacidad individual del grano para acumular materia
seca y la disponibilidad de asimilados para llenar esos destinos (Borrás y col., 2003).
Los principales factores que controlan la capacidad del destino en el grano durante la etapa
post-antesis, son el número de células del endospermo y el número de gránulos de almidón
(Borrás y col., 2003). A su vez, el número de células endospermáticas varía con el cultivar,
las condiciones ambientales y la posición del grano en la espiga (Slafer y col., 2003).
Además, estudios realizados en trigo (Singh y Jenner, 1984) y maíz (Cirilo y Andrade,
1996) indican que el tamaño final del grano también depende de la expansión de las células
endospermáticas. Por lo tanto, el volumen final de grano estaría determinado por un lado,
por el tamaño de los carpelos florales al momento de la fecundación (Calderini y col.,
2001) y en la etapa post-antesis, por la capacidad de división y crecimiento de las células
endospermáticas (Borrás y col., 2004).
1.3 Principales factores que determinan el peso del grano.
En trigo diferentes variables del grano durante la etapa pre y post antesis como el tamaño y
peso de los carpelos (Calderini y col., 1999a,b; Ugarte y col., 2007), contenido hídrico
(Saini y Westgate, 2000), volumen (Millet y Pinthus, 1984) y longitud del grano (Lizana y
col., 2010; Hasan y col., 2011) han mostrado asociación positiva con el peso final del
grano, indicando que algunas de ellas podían estar involucradas en la determinación del
peso potencial (Calderini y col., 2010; Lizana y col., 2010).
Considerando que los carpelos de las flores se convertirán en el pericarpio de los granos, se
ha propuesto que el pericarpio impone una restricción física al crecimiento de los granos
en los cereales de clima templado, y por consiguiente sobre su volumen (Calderini y col.,
1999b; Ugarte y col., 2007). Relaciones positivas entre el peso de grano y peso/tamaño de
5
los carpelos en antesis ha sido reportada en cultivos de girasol (Cantagallo y col., 2004),
sorgo (Yang y col., 2009) y trigo (Hasan y col., 2011). Tomando en cuenta que la longitud
del grano es el primer rasgo en definirse en el período post-antesis se ha sugerido que un
mayor peso de carpelos en antesis permitiría un mayor volumen de grano especialmente
mediado por el largo de grano (Calderini y col., 1999a, b; Calderini y Reynolds, 2000;
Calderini y col., 2010; Hasan y col., 2011).
1.4 Mecanismos moleculares involucrados en el crecimiento del grano.
Estudios a nivel molecular sobre el crecimiento de los granos (Calderini y col., 2010;
Lizana y col.,2010) han generado información importante acerca de los mecanismos
moleculares que están involucrados en este proceso, sugiriendo que la capacidad de
elongación de los granos está regulada por las expansinas, las cuales son proteínas que
provocan el aflojamiento de la pared celular y son las únicas que muestran inducción
directa sobre la extensión de la pared celular y otros procesos que producen la modificación
de la pared celular y permiten el crecimiento vegetal (McQueen-Mason y col.,1992;
Cosgrove, 1999).
1.4.1 Expansinas
En general, las expansinas constan de 250 a 275 aminoácidos de longitud y se componen de
dos dominios (dominio 1 y 2) precedidos por un péptido señal. En base a análisis
filogenéticos, hasta el momento se reconocen cuatro familias de expansinas en plantas
(Kende y col., 2004). De la familia más grande a la más pequeña se designan: α-Expansinas
(EXPA), β-Expansinas (EXPB), expansinas tipo A (EXLA) y expansinas tipo B (EXLB).
Se ha demostrado experimentalmente que las proteínas α-Expansina y β-Expansina
provocan el aflojamiento de la pared celular (McQueen-Mason y col., 1992; Cosgrove y
col., 1997). Las EXPB se descubrieron originalmente en el polen (Cosgrove y col., 1997),
pero desde entonces se han identificado en otros tejidos (Reidy y col., 2001; Lee y Kende,
6
2001) con funciones putativamente similares a las EXPA. Las expansinas tipo A y tipo B
han sido menos estudiadas, se les ha identificado a partir de la identidad de sus secuencias
con las EXPA y EXPB.
1.4.2 Mecanismo de acción de las expansinas.
El modelo actual de la acción de las expansinas se basa en la interpretación de resultados de
los primeros estudios bioquímicos realizados in vitro con estas proteínas (McQueen-Mason
y col., 1992; McQueen-Mason y Cosgrove, 1994; McQueen-Mason y Cosgrove, 1995).
Luego del descubrimiento de dos expansinas (McQueen-Mason y col., 1992), se pudo
establecer que las mismas no eran capaces de hidrolizar polisacáridos de la matriz. En
diferentes ensayos no se logró detectar actividad endo o exoglucanasa (McQueen-Mason y
Cosgrove, 1994; McQueen-Mason y Cosgrove, 1995), pectinasa (McQueen-Mason y
Cosgrove, 1995) o transglicosilasa (McQueen-Mason y col., 1993), pero se demostró que
tenían la capacidad de relajar la tensión de las paredes celulares. Además, se determinó que
estas proteínas se unían a la interfase entre las micro fibrillas de la matriz de hemicelulosa
(McQueen-Mason y Cosgrove, 1995) y que eran capaces de debilitar la celulosa, donde las
fibras de celulosa están interconectadas por puentes de hidrogeno.
De este modo se propuso un modelo, en el cual las expansinas actúan facilitando el
deslizamiento de los polímeros de la pared celular cuando estos están sometidos a alguna
tensión, debilitando la fuerza de la unión de los enlaces de hidrogeno que mantienen unidos
a los componentes de la red de celulosa-hemicelulosa (Figura 1) (McQueen-Mason y
Cosgrove, 1995).
7
Figura 1. Mecanismo de acción de las expansinas. Fuente: Carpita y McCann, (2000).
Cuando la pared está sometida a tensión (flechas azules), las expansinas (en amarillo) relajarían esa
tensión actuando en la interfase entre las micro fibrillas de celulosa y las moléculas de
hemicelulosas (entrecruzamientos de glucanos) que las recubren, debilitando la fuerza de la unión
de los enlaces de hidrogeno que participan en dicha unión. Posteriormente actuarían otras enzimas
como Xiloglucano endotransglicosilasas XETs, (en verde) que remodelarían la pared adecuándola
al nuevo estado de menor tensión.
1.4.3 Estudios de expresión de las expansinas.
Las expansinas se expresan en todas las partes en expansión de las plantas o en los órganos
que se someten a modificaciones de la pared celular, por ejemplo: ápices de raíz (Wu y col.,
2001), entrenudos (Lee y Kende, 2001), meristemos apicales (Vogler y col., 2003), flores
8
(Gookin y col., 2003), polen (Cosgrove y col., 1997), pelos radicales (Cho y Cosgrove,
2002) y frutos (Brummel y col., 1999). Se ha reportado que la sobreexpresión o
silenciamiento de genes de expansinas afectan la expansión de las hojas de Arabidopsis
(Cho y Cosgrove, 2000), raíces de soya (Lee y col., 2003) o entrenudos en arroz (Choi y
col., 2003), pero estos efectos pueden ser inesperados (Rochange y col., 2001),
posiblemente debido a que las expansinas pertenecen a una gran familia de genes con
funciones parcialmente redundantes (Li y col., 2003).
Expansinas especificas se expresan preferentemente en determinados órganos (Wu y col.,
2001; Cosgrove, 2002; Lee y Kende, 2001, 2002; Shin y col., 2005). Varios estudios
sugieren que cada expansina puede tener un patrón temporal específico de expresión
relacionado con estímulos ambientales (Brummel y col., 1999). Por ejemplo, la expresión
de cinco genes de α-expansina de arroz fueron inducidos en los entrenudos mediante
tratamiento con giberelina y heridas (Lee y Kende, 2001).
En contraste, otros estudios indican que la regulación de las expansinas está dada por varios
estímulos hormonales o ambientales. En pera, durante la maduración, seis genes de
expansina mostraron superposición de expresión y regulación similar por etileno (Hiwasa y
col., 2003). En garbanzo, cuatro α-expansinas tienen sobre-expresión coordinada por IAA o
brasinólidos (Sánchez y col., 2004).
Los estudios realizados hasta ahora en trigo, apoyan la hipótesis que las expansinas
tendrían un rol importante en el crecimiento del pericarpio de los granos; las cuales estarían
regulando la elongación, y posiblemente el contenido hídrico máximo de los mismos.
Lizana y col. (2010) reportaron altos niveles de expresión de pTaExpA6 (FN556070.1);
pTaEXPA6-a (FN556071.1); pTaEXPA6-b (FN556069.1), expansinas homólogas a
TaEXPA6 (Lin y col., 2005), en los primeros días después de antesis, disminuyendo los
niveles de transcriptos en coincidencia con la estabilización de la elongación del grano
(Figura 2).
9
Figura 2. Relación entre el largo de grano (círculos negros) o la expresión de actividad de la
pTaEXPA6(c) (círculos blancos) en función del tiempo desde la antesis en la posición G2 del
cultivar Bacanora. Fuente: Calderini y col. (2010).ID = pTaEXPA6 (AY543532).
1.4.4 Regulación de la expresión génica
Los organismos multicelulares complejos como son las plantas están compuestos de
diferentes tejidos cuyas características individuales dependen de las proteínas específicas
expresadas por sus tipos celulares. La diferenciación, el desarrollo y la funcionalidad de los
tejidos específicos dependen del conjunto de proteínas selectivamente expresadas por cada
célula. Estas proteínas expresadas en forma diferencial pueden funcionar como
componentes estructurales de las células, enzimas reguladoras del metabolismo, factores de
transcripción, receptores celulares y componentes intracelulares de señalización (Brandan
y col., 2002).
La regulación de la expresión de los genes en los eucariontes es compleja, existiendo
diferentes niveles de regulación, entre los cuales están: la estructura de la cromatina,
regulación transcripcional, postranscripcional, traduccional y postraduccional. El control
transcripcional de la expresión genética constituye uno de los modos más importantes de
10
regulación de la expresión génica. En esta categoría están incluidos los promotores,
secuencias regulatorias, elementos de respuesta y la interacción entre múltiples proteínas
activadoras o inhibidoras que actúan mediante su unión a secuencias específicas de
reconocimiento al ADN.
Los organismos eucariontes como las plantas, han desarrollado complejos patrones de
expresión génica que varían a lo largo de su ciclo de vida y en respuesta a las señales de su
entorno. La transcripción de un gen en estado activo está controlada en la iniciación por la
interacción de la RNA polimerasa con su promotor. En la mayoría de los genes, éste es el
punto de control más importante (Peretó y col., 2007).
1.4.5 Control transcripcional
La transcripción de un gen, comienza con la formación de un complejo de iniciación por la
RNA polimerasa II y los factores de transcripción en el promotor del gen que se va a
transcribir. En primer lugar, se forma el complejo de pre iniciación (PIC: Pre-Iniciation
Complex) que consiste en la unión de la RNA polimerasa II a los factores transcripcionales
basales o generales del complejo TFIID. El complejo TFIID es el responsable del
posicionamiento correcto del complejo de iniciación respecto al inicio de la transcripción.
Está compuesto por la proteína de unión a la caja TATA (TBP: TATA-box Binding
Protein) así como un número de factores asociados. A este PIC se unen además factores
transcripcionales que interaccionan específicamente con elementos reguladores en cis(CRE:
Cis-Regulatory Elements)presentes en los promotores de sus genes diana. Estos factores se
clasifican en activadores si incrementan la expresión de un gen, y en represores si la
disminuyen.
Otra clase de factores transcripcionales son los coactivadores o correpresores, que regulan
la transcripción interaccionando con el PIC o con los reguladores específicos que se unen al
ADN. Dentro de éstos, se han identificado acetilasas transcripcionales arquitectónicos
11
(cofactores remodeladores de la cromatina) que están involucrados en el empaquetamiento/
desempaquetamiento del ADN en nucleosomas o estructuras cromatínicas de orden
superior (Martínez, 2002).
La regulación de los genes eucarióticos reside principalmente en la modulación de la
actividad del complejo de la RNA polimerasa II por interacciones específicas con los
distintos factores transcripcionales. La composición de este complejo unido a un promotor
dado, puede cambiar en respuesta a factores del medio y ante determinadas señales
exógenas o endógenas. Así, se pueden formar un gran número de combinaciones diferentes
(control combinado de la regulación transcripcional) que regularían la expresión de los
distintos momentos.
Un factor de transcripción dado, puede de esta forma, desempeñar diversos papeles
regulando la expresión de distintos genes en respuesta a los estímulos que la planta percibe,
o a los propios procesos fisiológicos de esta. Los factores transcripcionales están a su vez
regulados por distintos mecanismos, entre los que se encuentran la autorregulación,
modificaciones post-traduccionales, degradación por el proteosoma, transporte al núcleo y
por el mecanismo de control por micro ARNs (Schwechheimer y col., 1998; Jones-Rhoades
y col., 2006).
1.4.6 Elementos reguladores en cis
Además de la región que dará lugar al producto de transcripción, dentro del ADN se
encuentran de manera intrínseca ciertos componentes estructurales que no son traducidos
en proteínas, cuyo objetivo principal es regular la expresión de los genes, es decir cuando y
como se van a expresar (Cobian y Eguiarte, 2002). Estos componentes son secuencias
cortas que se conocen genéricamente como elementos reguladores en cis, en contraposición
con las proteínas que se unen a ellas controlando la expresión espacio-temporal del gen
denominadas elementos o factores reguladores en trans.
12
Los elementos reguladores son determinados mediante análisis experimental, pero esta
actividad es laboriosa y tardada. Sin embargo, en los últimos años, se han desarrollado
aproximaciones basadas en la identificación de elementos reguladores dentro del genoma,
así como de los factores que se unen a dichos elementos para controlar la expresión génica
(Fredmany col., 2009). Esto ha sido posible, en parte, gracias a la secuenciación de los
genomas de especies pertenecientes a distintos linajes evolutivos, a la ingente cantidad de
información acerca de los perfiles de expresión génica y al avance en las metodologías
computacionales que permiten el estudio de los mecanismos de regulación transcripcional.
La predicción mediante el uso de métodos computacionales supone una gran ayuda en el
estudio de los elementos reguladores, no obstante esta identificación no es sencilla, debido
a que los elementos reguladores y promotores no están bien definidos, existiendo una gran
diversidad de los mismos, lo que conlleva a una falta de entendimiento de todos los
elementos reguladores necesarios para la transcripción. Además, existen muchos falsos
positivos debido al reducido tamaño de las secuencias (6 a 8 nucleótidos).
Son muy limitados hasta el momento los estudios acerca de las regiones promotoras de
genes de expansinas en la mayoría de las especies. Se conocen las regiones promotoras de
los genes de expansina de Arabidopsis y de arroz, debido a la secuenciación completa de
sus genomas (Lee y col., 2001; Choi y col., 2006). En trigo, se ha estudiado el promotor de
TaEXPB23 mediante transformación en Nicotiana tabacum, para estudios de crecimiento
celular (Xing y col., 2009) y tolerancia a estrés hídrico (Li y col., 2012). También, se ha
estudiado el promotor de OsEXPA4 un gen involucrado en cambios en tamaño celular de
las hojas en arroz (Choi y col., 2003). Considerando otras especies se tiene conocimiento de
los promotores de los genes MaEXP1 y MaEXP2 en banano (Asha y col., 2007), y en
algodón se ha estudiado algunos promotores de genes de α-expansinas (Harmer y col.,
2002).
13
Los estudios realizados sobre expansinas en Triticum aestivum sugieren que estas proteínas
están codificadas por una familia multigénica, siendo descritos hasta la actualidad varios de
estos genes. En el caso particular del genTaEXPA6 se conoce la región codificante (CDS) y
parcialmente la región 3‟UTR. Partiendo de la información existente y considerando la
importancia que tendría el gen TAEXPA6 en la determinación del tamaño del grano en
trigo, sería interesante obtener antecedentes acerca de la diversidad genética, posibles
variantes alélicas o eventuales isoformas de este gen. Además, tomado en cuenta que no
existen estudios sobre la actividad del promotor de este gen, sería importante obtener
información sobre secuencias reguladoras que puedan estar influyendo en su expresión. Por
lo cual, esta tesis se enfoca tanto en el estudio de la diversidad genética como al de las
secuencias reguladoras del gen TaEXPA6, con el objeto de contribuir al conocimiento de
las bases moleculares del crecimiento de los granos en trigo.
1.5 HIPÓTESIS
Existe diversidad de secuencias con alta identidad al genTaEXPA6 en dos cultivares de
trigo contrastantes en peso de grano, las cuales corresponden a isoformas del mismo gen.
1.6 OBJETIVOS
1.6.1 Objetivo general
Determinar diferencias genéticas asociadas con genes codificantes de TaEXPA6 en dos
cultivares contrastantes en peso de grano y contribuir al conocimiento molecular sobre
elementos reguladores del gen TaEXPA6 en trigo.
14
1.6.2 Objetivos específicos
i. Estudiar la diversidad genética del gen TaEXPA6 en dos cultivares de trigo
contrastantes en peso de grano.
ii. Caracterizar molecularmente las isoformas del gen TaEXPA6.
iii. Identificar in silico la región promotora, elementos reguladores del genTaEXPA6 y
comparar las isoformas con secuencias EST de trigo.
15
2 MATERIALES Y MÉTODOS
2.1 MATERIAL VEGETAL
Se utilizaron dos cultivares de trigo (Triticum aestivum L.) contrastantes para peso de
grano. Bacanora que presenta un elevado rendimiento a través de un alto número de granos
y mediano peso de granos(Hasan, 2011). El otro cultivar fue Weebil que también muestra
un elevado rendimiento, pero contrariamente caracterizado por un menor número de granos
y un alto peso de granos (Hasan, 2011). Los cultivares fueron obtenidos en el Centro
Internacional de Mejoramiento de Maíz y Trigo (CIMMYT). Las semillas fueron
germinadas sobre papel filtro húmedo en placas de Petri y trasplantadas a macetas que
contenían turba-arena 1:1. Las plantas crecieron en invernáculo.
2.2 MÉTODOS
2.2.1 Extracción de ADN
La extracción de ADN genómico se realizó a partir de 0.1 g de hojas jóvenessegún
adaptaciones del método descrito por Almeyda y col.(1999). El tejido se maceró en 400 μL
de buffer de extracción CTAB 2% (Tris 100 mM pH 8, EDTA 20 mM, NaCl 1,4 M, CTAB
2%) y 0,2% de mercaptoetanol y polyvinylpyrrolidone (PVP). Se incubó durante 30
minutos a 65°C, y luego se adicionó 200μL de cloroformo: alcohol isoamílico (24:1),
seguido de centrifugado (15 min a 8.000 rpm). Posteriormente, se recuperó la fase superior
(180 μl), a la cual se le agregó 80 μl de NaCl 5M frio (-20°C) + 400 μl de etanol 96% frío (-
20°C), incubándose por 30 minutos a 4°C. Después de la incubación, se centrifugó a 3000
rpm por 3 minutos, seguido de 6000 rpm por 3 minutos, para posteriormente eliminar el
sobrenadante y lavar el precipitado con 200 μl de etanol frío 70%, centrifugando a 8000
rpm por 3 minutos. El ADN se resuspendió en 50 μL de agua desionizada estéril con 1 %
16
de RNAsa a 37°C por 15 minutos para finalmente mantener el ADN a -20ºC. La
concentración del ADN fue determinada por espectrofotometría (NanoDrop ND1000,
Cellygent), para todos los ensayos se normalizó a 140 ng/μL.
2.2.2 Diseño de partidores
Se buscaron secuencias nucleotídicas disponibles en la base de datos GenBank
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) para α-Expansina 6 en T. aestivum (TaEXPA6) y
mediante el software Primer3 v.0.4 (http://frodo.wi.mit.edu/) se diseñaron partidores
específicos siguiendo tres procedimientos:
i. Utilizando la secuencia TaEXPA6 (AY543532.1) (Lin y col., 2005),en los
extremos de la región codificante se diseñaron dos pares de partidores: SLIN-1 y
SLIN-2 forward y reverse (F y R) (Tabla 1) (Fig. 3. A).
ii. La secuencia del gen TaEXPA6 y tres secuencias parciales de EXPA6 en T.
aestivum nombradas como pTaEXPA6 (FN556071.1), pTaEXPA6(a) (FN556069.1)
y pTaEXPA6(b) (FN556070.1) (Lizana y col., 2010), que presentan identidad de
92%, 84% y 84% respectivamente, con el gen TaEXPA6, se tomaron como
referencia para diseñar los partidores. Se alinearon las cuatro secuencias utilizando
el software CLUSTALW (http://clustalw.genome.ad.jp/) y se diseñaron partidores
específicos en los extremos de la región codificante, en sitios menos conservados
entre las secuencias, con el propósito de que la amplificación sea específica para
pTaEXPA6 (Fig. 3. B). Para esta región se diseñaron cuatro pares de partidores:
ExpOp-1, ExpOp-2, ExpOp-3 y ExpOp-4, F y R (Tabla 1).
iii. Mediante el software CLUSTALW se alinearon las secuencias TaEXPA6 y
pTaEXPA6, se encontró alta identidad entre las secuencias a partir de 435pb 3‟ -
17
5‟, en este sitio se cortaron y unieron las secuencias, se diseñaron partidores en los
extremos de esta nueva secuencia (Exp-Extd. F y R) (Fig. 3. C).
Figura 3. Esquema del diseño de partidores.
A: Tomando como referencia la secuencia TaEXPA6 (AY543532.1)se diseñaron los partidores
SLIN-2 F y R en sus extremos (las flechas amarillas indican los partidores). B: Como referencia se
utilizó pTaEXPA6 (FN556070) y se diseñaron partidores específicos en los extremos de la
secuencia (ExpOp-3 F y R). C: TaEXPA6 y pTaEXPA6 se alinearon y unieron en una región que
comparten alta identidad y se diseñaron partidores en los extremos de la región codifícate de la
secuencia unida (Exp-Extd. F y R).
2.2.3 Amplificación de fragmentos de ADN
Para obtener los fragmentos de interés se realizó la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR). En un volumen de reacción total de 50 uL, que contiene 2 uL de ADN, 36,6 μL de
agua desionizada estéril, 5μL de Taq buffer 10X (Fermentas), 1 μL de dNTPs (10 mM;
Fermentas), 3 μL de MgCl2 (25 Mm; Fermentas), 1 μL de cada partidor (10 pmol/μL) y 0,4
μL de Taq polimerasa (5u/μL) (Fermentas). Las amplificaciones se realizaron utilizando el
18
siguiente perfil térmico: desnaturalización inicial a 94 ºC por 3 min., 35 ciclos de 94 ºC por
30 seg, reasociación a 56 ºC por 38 seg., y extensión a 72 ºC por 1 min., y la extensión final
a 72 ºC por 6 min. Los productos fueron separados en geles de agarosa al 1,5% (p/v) con
tinción de bromuro de etidio (0,5 μg/mL) en Buffer TEB, y visualizados en transiluminador
bajo luz ultravioleta. Las condiciones para las reacciones PCR fueron similares para todos
los fragmentos de interés, variando la pareja de partidores dependiendo de cada fragmento.
2.2.4 Secuenciación directa y búsqueda de polimorfismos
Para determinar posibles diferencias genéticas de las secuencias codificantes de pTaEXPA6
entre los cultivares Bacanora y Weebil, los fragmentos amplificados con los partidores
ExpOp-3 y ExpOp-4 (R y F)se secuenciaron directamente por los dos extremos mediante el
servidor externo Macrogen Inc., Seúl, Corea. Las secuencias obtenidas fueron corregidas
mediante el software Chromas Lite 2.01 y utilizando el programa CLUSTALW se
alinearon las secuencias para buscar diferencias nucleotídicas a nivel de ADN entre los
cultivares Bacanora y Weebil.
Para validar los posibles polimorfismos se realizó la búsqueda de enzimas de restricción
mediante el software NEBcutter V 2.0 (http://tools.neb.com/NEBcutter2/), los fragmentos
fueron digeridos utilizando una enzima de restricción procediendo de acuerdo a las
instrucciones del fabricante.
2.2.5 Clonación y secuenciación
Considerando que T. aestivum es una planta poliploide, y para garantizar que la
amplificación de los fragmentos de interés provengan de copias individuales del genoma,
los productos PCR fueron sometidos a purificación y clonación. La purificación se realizó
mediante el Kit Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega). Los productos PCR
fueron clonados utilizando el Kit pGEM-T Easy Vector System II (Promega). El
19
procedimiento se realizó según instrucciones del fabricante e incluyó las etapas de reacción
de ligación del producto PCR en plásmidos y transformación de células de Escherichia coli
con plásmidos recombinantes.
Las colonias bacterianas transformadas fueron seleccionadas al azar para realizar la
reacción PCR con los partidores SP6 y T7 en un volumen de reacción total de 50 µL
utilizando el siguiente perfil térmico: desnaturalización inicial a 94 ºC por 3 min., 32 ciclos
de 94 ºC por 50 seg., reasociación a 50 ºC por 40 seg., extensión a 72 ºC por 1 min, y la
extensión final a 72 ºC por 7 min. Los productos se visualizaron mediante electroforesis en
geles de agarosa al 1,5% (p/v) mediante tinción con bromuro de etidio (0,5 μg/mL). Los
productos PCR fueron secuenciados por Macrogen Inc., Seúl, Corea.
2.2.6 Análisis de secuencias
Los datos de secuenciación fueron revisados y corregidos mediante el software Chromas
Lite 2.01. Con el fin revisar y confirmar que los clones codifican TaEXPA6, las secuencias
nucleotídicas fueron comparadas con las secuencias existentes en la base de datos
utilizando el programa de búsqueda Basic Local Alignment SearchBLAST NCBI
(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
Las secuencias clonadas se alinearon con la secuencia de referencia existente en la base de
datos TaEXPA6 y se determinó la localización de los intrones. Las proteínas fueron
predichas utilizando los programas ExPASy Translate Tool
(http://web.expasy.org/translate/) y Orf-Finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects
/gorf/).
El análisis de predicción del péptido señal se hizo mediante el software SignalP 4.0
(Nordahl-Petersen y col., 2011) (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) y la predicción
20
del destino de la proteína se hizo con el software TargetP 1.1 (Emanuelssony Col., 2000)
(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/). El punto isoeléctrico (pI) y la masa molecular
(MW) fueron predichos con el programa ExPASy (http://www.expasy.org/)
Con el propósito de examinar la variabilidad de las secuencias, los clones fueron alineados
a nivel de ADN, proteína e intrones. El criterio para considerar secuencias distintas fue en
base a la identidad de las secuencias con respecto a TaEXPA6 de la base de datos mediante
el software BLAST NCBI, también se consideró la longitud de la secuencias y el destino
de la proteína.
Para la construcción de los árboles filogenéticos se utilizó el software MEGA 5.05 (Tamura
y col., 2011) con el algoritmo maximum parsimony y para probar la robustez de la hipótesis
de las relaciones filogenéticas se aplicó método Bootstrap con 1000 réplicas. En la
construcción de los arboles filogenéticos se utilizó como secuencia externa TaEXPA2
(AY589584) correspondiente a α-Expansina 2 presente en T. aestivum (Lin y col., 2005).
2.2.7 Comparación de las isoformas con secuencias EST
Las isoformas de TaEXPA6 se analizaron comparativamente con secuencias expresadas
disponibles en la base de datos Cereals DB (www.cerealsdb.uk.net) (Wilkinson y col.,
2012). Se examinó una colección de más de 25.000 ESTs de 35 bibliotecas, que
comprenden secuencias expresadas en distintos órganos y estados de desarrollo del T.
aestivum, principalmente en tejidos de pericarpio, óvulo, embrión, endospermo, tejido
maternal (sin embrión y endospermo), capa de aleurona, hojas y raíz de plántulas sometidas
a diferentes tipos estreses. Las secuencias fueron sometidas a un análisis Blast con intervalo
de confianza CI: 95% y valor de corte E = 0,01(E-valor).
21
2.2.8 Predicción de la región promotora y elementos reguladores
La predicción del promotor putativo y los elementos reguladores del gen TaEXPA6 se
realizó utilizando información disponible en la base de datos Cereals DB (Wilkinson y col.,
2012). Los datos analizados son producto de la secuenciación masiva (Roche 454
tecnology) del cultivar primaveral de trigo panadero “Chinese Spring” con una cobertura
5x, superior al 95% del total del genoma.
La búsqueda de secuencias se efectuó mediante análisis Blast con valor de corte E =
0,00001, valor que por defecto es utilizado en esta base de datos para el montaje de
regiones ricas en genes. Como secuencias objetivo se utilizaron las isoformas obtenidas en
esta investigación. Para obtener la secuencia consenso del promotor, las secuencias
contiguas encontradas fueron montadas mediante el programa CAP3 (http://pbil.univ-
lyon1.fr/cap3.php) (Huang y Madan, 1999). La predicción de los elementos reguladores en
cis se realizó mediante el programa PlantCARE (Lescot y col., 2002).
22
3 RESULTADOS
3.1 Amplificación de regiones codificantes específicas del gen EXPA6
Los ensayos de amplificación mostraron alta especificidad al utilizar los partidores SLIN-2
(829pb) para amplificar TaEXPA6, y los partidores ExpOp-3 (342pb) y ExpOp-4 (331pb)
para amplificar pTaEXPA6, en los cultivares Bacanora y Weebil (Figura 4). Por otro lado,
los partidores SLIN-1, ExpOp-1, ExpOp-2 y Exp-Extd produjeron amplificación
inespecífica de los fragmentos de interés (Tabla 1).
Figura 4. Productos de la amplificación específica en los cultivares Bacanora y Weebil utilizando
partidores específicos.
A:SLIN-2, marcador de peso: 1 kb Ladder, Axygen. B: ExpOp-3 y ExpOp-4, marcador de peso:
GeneRuler 1 kb DNA Ladder, Thermo.
23
Tabla 1. Partidores utilizados para amplificar regiones del gen TaEXPA6 y resultados de
amplificación
Nombre partidor
Objetivo del anclaje
Secuencia 5´- 3´ Producto (pb)
Amplificación
Forward Reverse
SLIN-1 TaEXPA6 GCGCTTCCTGCAGCTGTT GCCATGTGGAGAAGGTCTGT 734 No Específica
SLIN-2 TaEXPA6 ATGCGCTTCCTGCAGCTGTTC GCGTCTGGAGAGTTTCATGC 829 Específica
ExpOp-1 pTaEXPA6 CGACACCAGCAAGTCAAACA GATCCAGGCGGTGTTGGT 340 No Específica
ExpOp-2 pTaEXPA6 CAACAACGGCTTGTCGTG CCCAGTTCCTGGACATCG 401 No Específica
ExpOp-3 pTaEXPA6 GCGACACCAGCAAGTCAAAC GACATGCTCTTAATCGACC 342 Específica
ExpOp-4 pTaEXPA6 CAGTGCTACCTCATCACCTG GACATGCTCTTAATCGACCC 331 Específica
Exp-Extd pTaEXPA6 GTGCAACCCTCCTCGACAC CCACTCCATGCATGTGTACC 690 No Específica
Considerando la longitud de los fragmentos amplificados y la especificad de la
amplificación, tanto la concentración de los reactivos para la reacción PCR como el perfil
de ciclos térmicos de amplificación fueron optimizados. Para amplificar pTaEXPA6 (331pb
y 342pb) se utilizaron los reactivos de acuerdo a la descripción en la sección 1.4 de
materiales y métodos, sin embargo, para la amplificación de TaEXPA6 el volumen de
MgCl2 (25Mm) se modificó a 3,5 µL. El perfil de los ciclos térmicos para todos los
fragmentos se optimizó y se describe en la tabla 2.
Tabla 2. Perfil térmico para la amplificación de regiones del gen TaEXPA6.
Activación Desnaturalización Hibridación Polimeración Extensión Final Conservación
A
Ciclos 32 1
Temperatura 94°C 94°C 55°C 72°C
72°C 4°C
Tiempo(min) 3:00 0:30 0:38 1:00 8:00 ∞
B
Ciclos
35
1
Temperatura 94°C 94°C 57°C 72°C
72°C 4°C
Tiempo(min) 3:00 0:30 0:40 1:00 6:00 ∞
A: ciclos térmicos para amplificar pTaEXPA6 (331pb y 341pb). B: ciclos térmicos para amplificar
TaEXPA6 (829pb).
24
3.2 Secuenciación directa y validación de SNP
Los datos de secuenciación directa correspondientes a los fragmentos amplificados con el
partidor específico ExpOp-3 fueron revisados y corregidos empleando el software Chromas
Lite 2.01.Las dos secuencias de Bacanora y Weebil fueron evaluadas mediante
alineamiento para determinar posibles diferencias genéticas que permitan relacionar con el
tamaño de grano que es contrastante en los dos cultivares. En un fragmento de 323 pb
(ExpOp-3) se encontró una variación en la secuencia de ADN que afectó a un solo
nucleótido (SNP: Single Nucleotide Polymorphism), el polimorfismo correspondió a la
sustitución de una citosina por una timina en el nucleótido 255 (5´-3´) en el cultivar
Bacanora (Figura 5).
Figura 5. Cromatograma de la detección de un SNP en la secuencias pTaEXPA6 (FN556071.1)
entre los cultivares Bacanora y Weebil.
En círculos rojos se indica la sustitución de la citosina por timina.
Para validar la presencia del SNP, mediante el software NEBcutter v.2.0 se encontró la
enzima SacI que permite cortar la secuencia en el sitio del polimorfismo 5´…GAGCT
C…3´ generando dos fragmentos, de 256pb y 67pb respectivamente (Figura 6.A). Sin
embargo, al realizar el corte mediante la enzima de restricción SacI (Thermo), no se
encontró el SNP esperado, como se observa en la Figura 6.B y 6.C. El corte de la secuencia
25
generó los dos fragmentos tanto en Bacanora como en Weebil lo que indica la ausencia del
polimorfismo.
Figura 6. Digestión de fragmentos codificantes de pTaEXPA6 (FN556071.1) en los cultivares
Bacanora y Weebil con la enzima Sac1 para validar un SNP.
A: Esquema de corte del fragmento pTaEXPA6 (FN556071.1) mediante la enzima SacI. B: Diseño
in silico (NEBcutter v.2.0) de las bandas esperadas en el caso de encontrar el SNP. C:
Visualización de la presencia de bandas en gel de agarosa 1,5% (p/v) en los dos cultivares al cortar
con la enzima SacI.
A
B
C
26
3.3 Clonación y secuenciación de fragmentos del gen codificantes de TaEXPA6
Debido a la complejidad de la poliploidía del trigo para el análisis de las secuencias, y
tomando en cuenta que la secuenciación directa de los fragmentos amplificados con los
partidores ExpaOp3 y ExpaOp4 fue poco específica, se clonaron eficientemente fragmentos
de TaEXPA6(Figura 7). Se procedió a la amplificación de la región codificante de
TaEXPA6 utilizando los partidores SLIN-2, esta amplificación permitió analizar regiones
de mayor longitud. Cuarenta clones fueron seleccionados aleatoriamente y enviados para
ser secuenciados (Macrogen Inc); obtenidas las secuencias se concluyó por su alta identidad
(superior al 88%)que todas correspondían a TaEXPA6, la longitud de los fragmentos varió
entre 487 pb y 965 pb (Tabla 3).
Figura 7. Fragmentos clonados usando los partidores SLIN-2 para amplificar TaEXPA6en los
cultivares B= Bacanora y W= Weebil.
Los fragmentos muestran diferentes longitudes, e.g. la flecha amarilla indica un fragmento de 965pb
y la flecha roja de 487 pb.
27
3.4 Análisis de secuencias de ADN.
Las secuencias amplificadas con los partidores SLIN-2 mostraron una alta identidad con el
gen TaEXPA6 cuando fueron comparadas en la base de datos Blast NCBI, la identidad con
la secuencia de referencia TaEXPA6 varió entre 88% y 100% con una cobertura de la
secuencia objetivo que varió desde 81% hasta 100%, mientras que con la secuencia
pTaEXPA6 mostraron identidad desde 92% hasta 98%, pero la cobertura de la secuencia
objetivo fue de 28% hasta 52% (Tabla 3). Al realizar un análisis Blast con las secuencias de
menor identidad, estas mostraron alineamiento significativo sólo con TaEXPA6 por lo
tanto todas las secuencias clonadas pertenecen a este grupo.
En las secuencias clonadas se pudo apreciar que un grupo de trece clones mostraron
identidad entre 88% y 89% con TaEXPA6, mientras que las demás secuencias mostraron
identidad superior al 90%. Se registraron cuatro secuencias de longitud corta que varió
entre 487 y 720 pb incluyendo los intrones, las cuales tenían una identidad superior al 96%
con TaEXPA6, solamente la identidad no fue significativa en la secuencia más corta de 487
pb, no obstante esta secuencia al ser comparada con pTaEXPA6 mostró un 95% de
identidad pero con cobertura baja de 28% (Tabla 3).
Tabla 3. Longitud de secuencias de ADN generadas con el partidor SLIN-2 e identidad con
las secuencias TaEXPA6 (AY543532.1) y pTaEXA6 (FN556071.1).
Cultivar Longitud
secuencia(pb)
Identidad Cobertura secuencia
Bacanora Weebil TaEXPA6(%) pTaEXPA6(%) TaEXPA6(%) pTaEXPA6(%)
1 0 487 N/S 95
N/S 28
1 0 630 97 94
81 47
0 1 667 96 93
91 59
3 3 928 88 92
100 51
6 9 944 91 99
100 52
4 3 952 89 93
100 52
2 2 961 100 93
100 52
3 1 965 100 93 100 52
N/S: no se encontró identidad significativa.
28
Mediante alineamiento con la secuencia de referencia TaEXPA6 se infirió la localización
de un intrón, el mismo que fue escindido para la predicción de la proteína. En base al
análisis con el programa ORF Finder se identificaron los codones de inicio y término de
traducción de la proteína, por lo tanto, esto permitió conocer dos exones, uno de 121 pb en
el cual está incluido el péptido señal de 60 pb y un segundo exón de 632 pb. También se
identificó parcialmente la región UTR 3´, en los clones que fueron agrupados como
sTaEXPA6 (Figura 8). Por otro lado, un grupo de seis clones presentes equitativamente en
los dos cultivares Bacanora y Weebil se diferenciaron del grupo anterior, el intrón presentó
una longitud de 97 pb, el segundo exón midió 479 pb y las regiones UTR 5´ y 3´ midieron
128 pb y 223 pb respectivamente, estos clones fueron agrupados como mTaEXPA6 (Figura
8).
Figura 8. Esquema de la estructura de TaEXPA6.
Se indican las posiciones de los residuos conservados de cisteína (C), el dominio HFD y los
residuos de triptófano (W). En sEXPA6 se indica el péptido señal (tramado), dos exones (rojo) y un
intrón de tres longitudes (azul), y las regiones UTR (verde). En mEXPA6 no se encontró el péptido
señal, un residuo de W y tres de C, también se indican los exones, intrón y regiones UTR. Las
letras s y m que preceden a TaEXPA6 representan el destino de la proteína secretora y mitocondrial
respectivamente.
29
Además, se encontró que las secuencias agrupadas como mTaEXPA6 muestran un cambio
nucleotídico determinante para la predicción de la proteína, debido a una deleción de un
nucleótido en la posición 233 (5´- 3´). En el grupo de secuencias sTaEXPA6 esta posición
está ocupada por una timina (Figura 9). Esta mutación está ocasionando un cambio en el
marco de lectura, dando como resultado la inserción de aminoácidos diferentes en la
secuencias de las proteínas predichas del grupo mTaEXPA6. Las letras que preceden a
TaEXPA6 representan la predicción del destino de la proteína, en donde “s” tiene
destinación de vía secretora y “m” destinación mitocondrial (ver más adelante en
traducción y predicción de proteínas).
Figura 9. Detección de una mutación en las secuencias del grupo mTaEXPA6.
A: Alineamiento de secuencias parciales de dos clones representantes de sTaEXPA6 y mTaEXPA6.
Se resalta en el cuadro rojo la delección en la posición de nucleótido 233 en mTaEXPA6.B:
Cromatograma de las secuencias sTaEXPA6 y mTaEXPA6, se resalta en círculo rojo la timina en la
posición 253 de sTaEXPA6, mientras que en mTaEXPA se evidencia la deleción de este nucleótido.
30
Con el fin de estudiar la variación en las secuencias a nivel de ADN se realizó un
alineamiento con el software CLUSTALW, identificándose variaciones nucleotídicas que
permitieron diferenciar diez secuencias distintas, incluyéndose el grupo de secuencias
mTaEXPA6, presentes en los dos cultivares Bacanora y Weebil (Anexo 1).
En base al alineamiento de las secuencias clonadas a nivel de ADN, se construyeron dos
filogramas utilizando el software MEGA5.05 (Tamura y col., 2011) que representan las
relaciones filogenéticas entre los clones. En el árbol filogenético de la figura 10, se
utilizaron las secuencias incluyendo los intrones, como secuencia externa se incluyó a
TaEXPA2 (AY589584). Se observa dos clados con buen soporte bootstrap (BS > 98), en el
clado superior es posible observar subclados con BS > 92 y uno con BS= 43. En el clado
inferior se observan subclados con BS >84 y uno BS = 55.
En el filograma de la figura 11, se utilizaron las secuencias de los clones escindiendo los
intrones, además se incluyeron las secuencias de referencia TaEXPA6, pTaEXPA6,
pTaEXPA6(a) y pTaEXPA6(b). Se observa el árbol filogenético con una conformación de
clados similar al filograma de secuencias completas. Se aprecian dos clados, uno superior
con un BS = 99, el segundo clado tuvo BS = 33. En el clado superior, los subclados tienen
un buen BS > 90, además es posible apreciar que pTaEXPA (b) está formando parte del
primer subclado, la identidad de pTaEXPA6 con los clones miembros de este subclado es
de 99% con una cobertura de 100%. En el clado inferior, los subclados tienen un soporte
BS > 72, la secuencia de referencia TaEXPA6 se encuentra en el subclado inferior con BS
= 99. La formación de los clados se ve respaldado por las diferencias nucleotídicas
encontradas en las secuencias de los clones (Anexo 1).
31
Figura 10. Árbol filogenético obtenido a partir de ADN genómico de los clones de TaEXPA6
incluido los intrones.
La longitud de las secuencias alineadas es de 952 pb. Los porcentajes indican la identidad de los
clones con respecto a TaEXPA6 (AY543532.1). Los valores sobre los nodos indica el soporte de
bootstrap (BS). Los códigos a la derecha de los clones indican el número de accesión de las
secuencias nucleotídicas en la base de datos Genbank.
B4
W20
B86
B87
W84
W23
W8
W14
W81
B25
B80
W83
B88
W87
B22
W89
W86
B7
W1
B85
W80
B89
W85
W28
B84
B81
B83
B12
W82
B82
B10
W12
W24
B6
EXPA2
84
99
99
55
99
99
99
92
43
57
99
99
78
98
50
KC441071
KC441067
KC441068
KC441069
KC441070
KC441072
AY589584
84%
84%
84%
97-98%
32
Figura 11. Árbol filogenético obtenido a partir de ADN genómico parcial.
Longitud de las secuencias 435 pb. Los porcentajes indican la identidad de los clones con respecto a
TaEXPA6 (AY543532.1).Los valores sobre los nodos indica el soporte de bootstrap (BS). Los
códigos a la derecha de los clones indican el número de accesión de las secuencias nucleotídicas en
la base de datos Genbank.
W81
W23
W84
W83
B87
B86
B80
W14
W8
B4
W20
pTaEXPA6(b)
B88
B25
B83
W80
B84
W28
B81
W85
B89
W87
W89
W86
B7
B85
B22
W1
pTaEXPA6(a)
pTaEXPA6
B12
W82
B82
TaEXPA6
W12
B6
B10
W24
EXPA2
91
98
99
92
99
72
92
33
100
90
99
98
88
98
10
90-91 %
89-90%
89%
88%
97%
94%
96%
99%
KC441067
KC441068
KC441069
KC441070
KC441071
KC441072
AY589584
33
3.5 Análisis de intrones.
Mediante un análisis de alineamiento incluyendo la secuencia de referencia TaEXPA6 las
secuencias clonadas mostraron diferencias nucleotídicas y de longitud en los intrones en
los cultivares Weebil y Bacanora. En todos los intrones las secuencias de inicio 5„GT y de
término 3„AG están conservadas (Figura 12).
KC441071 GTAAGCTAGCTAATCAAG------------CTTGCTCCGGCACCATCAATTTGCCAAATA 48
mTaEXPA6 GTAAGCTAGCTAA---------------------CCCAGGCACCATCAATTTGCCAAAT- 38
KC441070 GTAAGCTAGATAATCAAGCCTTAACTCCGGCTTGCTCCGGCACCATCACTTTGCCCAAT- 59
AY543532 GTAAGCCAGATAATCAAGCCTTAACTCCGGCTTGCTCCGGCACCATCATTTTGCCCAAT- 59
KC441068 GTAAGCTAGCTAATCAAG------------CTTGCTCCGGCATTATCAGTTTGCCCAAT- 47
****** **.*** * *.**** **** ******.***
KC441071 ATAGTATTACTTATCA--TGCGGG----------TGTGCATGT----CTGACTGTACGGT 92
mTaEXPA6 -----ATTACTTATCA--TGCGTG----------CGTGCATGT----CTGACTGTACGGT 77
KC441070 -----ATTACTTATCT-ATGCAAATATGCAATGCAATGCTTGTGTGCATGTCTGACTTTA 113
AY543532 -----ATTACTTATCT-ATGCAAGTACGCAATGCAATGCTTGTGTGCATGTCTGACTTTA 113
KC441068 -----ATTACTTATCACCTGCTGATACGCA-TGCAGTGCATGT----CTGACTGTATCGA 97
**********: *** . .***:*** .**:***:. :
KC441071 T-TTGCATGTGCAA----TGTGCAG 112
mTaEXPA6 T-TTGCATGTGCAA----TGTGCAG 97
KC441070 TCCTGCATGTGCAA----TGTGCAG 134
AY543532 T-CTGCATGTGCAA----TGTGCAG 133
KC441068 T-CTGCATTTGCAAATAATGTGCAG 121
* ***** ***** *******
Figura 12. Alineamiento de las secuencias de intrones de los clones de TaEXPA6.
Se resalta en cuadro rojo las secuencias conservadas de inicio y termino. Las estrellas aparecen
debajo de cada línea de alineación indican los sitios conservados.
Estudios previos en Arabidopsis y arroz, indican que existen siete posiciones para los
intrones en los genes de expansinas denominadas A, B, C, D, E, F y G (Lee y col., 2001).
En la TaEXPA6 en T. aestivum se ha informado que existe un intrón en la posición C con
una longitud de 121 pb (Lin y col., 2005). En las secuencias en estudio todos los intrones
34
fueron encontrados en la posición C (Figura 13) y la longitud de este intrón varió desde 97
a 134 pb (Tabla 4).
Figura 13. Localización de intrones en la familia EXPA.
En los clones de TaEXPA6 en los cultivares Bacanora y Weebil un intrón está localizado en la
posición C (Adaptado de Lee y col., 2001).
Tabla 4. Longitud de los intrones de los clones de TaEXPA6
Cultivar Intrones
97pb 112pb 121pb 133 134pb
Bacanora
3 6 4 3 1
Weebil 3 7 3 5 1
Se indica el número de secuencias que tienen los diferentes tamaños de intrones en los cultivares
Weebil y Bacanora.
3.6 Traducción y análisis de las proteínas.
Posterior a la escisión de los intrones de las secuencias de ADN, se utilizaron los
programas ExPassy y Orf - Finder para encontrar el marco abierto de lectura ORF (Open
Reading Frame) y confirmar la traducción correcta de la proteínas. Los clones a nivel de
proteína mostraron una longitud que varió entre 140 y 250 aminoácidos con identidad
desde 89% hasta 100% con respecto a la secuencia de referencia TaEXPA6 (Tabla 5). Las
secuencias del grupo sTaEXPA6 tuvieron una cobertura del 100%. El grupo de clones
D E A C B
5’UTR Región codificante
TaEXPA6
35
mTaEXPA6 tuvo una identidad de 89% con una cobertura de 62% con respecto a la
secuencia de referencia TaEXPA6.
Tabla 5. Longitud de las ORF de los clones en los cultivares Bacanora y Weebil e identidad
con respecto a TaEXPA6.
Cultivar ORF (aa) Identidad con TaEXPA6 (aa)
250 160
89% 88% 90% 97% 100%
Bacanora
13 3
11 0 0 2 2
Weebil 13 3
10 2 2 1 2
Los valores de los dos cultivares representan el número de secuencias encontradas para las dos
longitudes de ORF e identidad respecto a TaEXPA6 (AY543532.1).
El análisis de alineamiento y de agrupamiento en arboles filogenéticos permitió diferenciar
ocho patrones de secuencias pertenecientes al grupo TaEXPA6 y están presentes en los dos
cultivares Bacanora y Weebil (Figura 14 y 15). Las secuencias distintas que codifican
TaEXPA6 fueron depositadas en la base de datos Genbank con los siguientes números de
accesión: KC441067; KC441068; KC441069; KC441070; KC441071 y KC441072.
Se identificó en las proteínas predichas los ocho residuos de cisteína (C) y los cinco
triptófanos (W) conservados en la familia de las α-expansinas, y se muestra el motivo HFD
(histidina-fenilalanina-ácido aspártico) característico de las α-expansinas. En las secuencias
agrupadas como mTaEXPA6 no se identificaron los tres primeros residuos C y el primer
residuo W (Figura 14).
36
AY543532 MRFLQLFAAVLAFCFVQARS---DYWHQAYATFYGGADGAETMGGACGYDNLYAAGYGLN 57
KC441067 MRFLQLFAAVLAFSFVPAKS---DYWHQAYATFYGGADGAETMGGACGYDNLYAAGYGLN 57
KC441070 MRFLQLFAAVLAFSFVPAKS---DYWHQAYATFYGGADGSETMGGACGYDNLYAAGYGLN 57
KC441069 MRFLQLFATVLAFCFVLAKS---GYWLPAHATFYGGADGSDTMGGACGYENLYNAGYGIN 57
KC441068 MRFLQLFAAVLAFCFVLAKS---GYWLPAHATFYGGADGSDTMGGACGYENLYNAGYGIN 57
KC441072 MRFLQLFATVLAFCFVPAKS---GYWLPAHATFYGGADGSDTMGGACGYENLYNAGYGIN 57
KC441071 MRFLQLFAVVLAFSFVPAKS---GYWLPAHATFYGGADGSDTMGGACGYENLYNAGYGIN 57
mTaEXPA6 -----LPAAVRGGSRVLLRARQVRLLAPGPCHLLRRRQRLGHNGWRMWVREPVQRGVPDQ 55
* *.* . . * :: . . : : * : * :
AY543532 NAALSTVLFNNGLSCGQCYLITCDTSKSNMCKPGTSITVSATNLCPPNWALANDNGGWCN 117
KC441067 NAALSTVLFNNGLSCGQCYLITCDTSKSNMCKPGTSITVSATNLCPPNWALANDNGGWCN 117
KC441070 NAALSTVLFNNGLSCGQCYLITCDTSKSNMCKPGTSITVSATNLCPPNWALPNDNGGWCN 117
KC441069 NAALSTALFNNGLSCGQCYLITCDTSKSNMCKPGTSITVSATNFCPPNWALPSDNGGWCN 117
KC441068 NAALSTALFNNGLSCGQCYLITCDTSKSNMCKPGTSITVSATNFCPPNWALPSDNGGWCN 117
KC441072 NAALSTALFNNGLSCGQCYLITCDTSKSNMCKPGTSITVSATNFCPPNWALPSDNGGWCN 117
KC441071 NAALSTALFNNGLSCGQCYLITCDTSKSNMCKPGTSITVSATNFCPPNWALPSDNGGWCN 117
mTaEXPA6 QCGAEHSALQQWLVVRAVLPHTCDTSKSNMCKPGTSITVSATNFCPPNWTLPSDNGGWCN 115
:.. . ::: * **********************:*****:*..*******
AY543532 PPREHFDMSQPAWENLAIYRAGIVPVLYQRVACQRQGGLRFTMSGFNYFELVLVTNIAMS 177
KC441067 PPREHFDMSQPAWENLAIYRAGIVPVLYQRVTCQRQGGLRFTISGFNYFELVLVTNIAMS 177
KC441070 PPREHFDMSQPAWENLAIYRAGIVPVLYQRVACQRQGGLRFTISGFNFFELVLVTNIAMS 177
KC441069 PPRVHFDMSQPAWENLAIYRAGIVPVLYQQVACQRQGGLRFTISGFNYFELVLVTNMAGS 177
KC441068 PPRVHFDMSQPAWENLAIYRAGIVPVLYQQVACQRQGGLRFTISGFNYFELVLVTNMAGS 177
KC441072 PPRVHFDMSQPAWENLAIHRAGIVPILYQQVACQRQGGLRFTISGFNYFELVLVTNMAGS 177
KC441071 PPRVHFDMSQPAWENLAIYRAGIVPVLYQQVACQRQGGLRFTINGFNYFELVLVTNMAGS 177
mTaEXPA6 PPRVHFDMSQPAWENLAIYRARIVPVLYQQVACQRQGGLRFTINGFNYFELVLVTNMAGS 175
*** **************:** ***:***:*:**********:.***:********:* *
AY543532 GSIRSMSVKGTNTAWITMSQNWGANWQCLAGLKGQALSFGITSSGGQYKVFQDVVPAWWL 237
KC441067 GSIKSMSVKGTNTAWIPMSQNWGANWQCLAGLKGQALSFSITSSGGQYKVFQDVVPAWWL 237
KC441070 GSIRSMSVKGTNTAWITMSQNWGANWQCLAGLKGQALSFAITSSGGQYKVFQDVVPAWWL 237
KC441069 GSVKSMSVKGTNTAWIPMSQNWGANWQCLAGLRGQALSFAITSSGGQYKVFQDVVPAWWL 237
KC441068 GSVKSMSVKGTNTAWIPMSQNWGANWQCLAGLQGQALSFAITSSGGQYKVFQDVVPAWWL 237
KC441072 GSVKSMSVKGTNTAWIPMSQNWGANWQCLAGLQGQALSFAITSSGGQYKVFQDVVPAWWL 237
KC441071 GSVKSMSVKGTNTAWIPMSQNWGANWQCLAGLKGQALSFAITSSGGQYKVFQDVVPAWWL 237
mTaEXPA6 GSVKSMSVKGTNTAWIPMSQNWGANW---------------------------------- 201
**::************.*********
AY543532 FGQTFSTWQQFDY 250
KC441067 FGQTFSTWQQFDY 250
KC441070 FGQTFSTWQQFDY 250
KC441069 FGQTFSTWQQFDY 250
KC441068 FGQTFSTWQQFDY 250
KC441072 FGQTFSTWQQFDY 250
KC441071 FGQTFSTWQQFDY 250
mTaEXPA6 -------------
Figura 14. Alineamiento de secuencias de proteínas predichas de TaEXPA6.
37
Se indican con flechas rojas residuos de cisteína (C) y flechas azules los cinco residuos de
triptófano (W) conservados en la familia de las α-expansinas. Se resalta en cuadro rojo el motivo
HFD conservado en la familia EXPA. En azul se indica el péptido señal predicho.
En base al análisis realizado con el software SignalP (Nordahl-Petersen y col., 2011) se
determinó que en los clones agrupados como sTaEXPA6 tenían un péptido señal escindible
en el extremo N-terminal. La longitud de este péptido fue de 20 residuos de aminoácidos.
Sin embargo, en el grupo de clones nombrados mTaEXPA6 no se encontró el péptido señal
(Figura 14).
La predicción de la proteína madura contiene 230 aminoácidos. El pI de los clones del
grupo sTaEXPA6 fue de 8.05 y la masa molecular fue 27.2 KDa. En el grupo mTaEXPA6
todos los puntajes representados en la salida SignalP fueron muy bajos, lo que es
característico de proteínas no secretoras (Nordahl-Petersen y col., 2011). En estas proteínas
el pI fue 10.58 y la masa molecular 22.5 KDa.
La predicción del destino de la proteína indica que todas las secuencias del grupo
sTaEXPA6 son proteínas que se dirigen a una ruta secretora, por lo que poseen el péptido
señal que las dirige. En contraste, las proteínas del grupo mTaEXPA6 fueron predichas que
su destino es mitocondrial.
Posterior a la traducción de las secuencias, estas fueron alineadas y se construyeron dos
filogramas utilizando el software MEGA5.05 (Tamura y col., 2011). Para la construcción
del árbol filogenético de la figura 15 se utilizaron las secuencias de ORF (250
aminoácidos), y como secuencia externa se incluyó a TaEXPA2. Se aprecia dos clados, el
clado superior con BS = 49, en este clado es posible observar cuatro subclados con BS
entre 24 y 99. El clado inferior tiene un buen soporte BS = 97, y los subclados con BS >80.
Se observa que el filograma con las secuencias ORF presenta mucha similitud con la
conformación los arboles filogenéticos de ADN, esto respalda la variación encontrada en
las secuencias de TaEXPA6.
38
En el filograma de la figura 16, se utilizaron las secuencias de los clones alineadas y
cortadas según la longitud de las secuencias de referencia pTaEXPA6, pTaEXPA6(a) y
pTaEXPA6(b) (145 aminoácidos). Se aprecia que el árbol filogenético tiene una
conformación similar a los filogramas de secuencias de ORF y ADN. La secuencia
pTaEXPA(b) está formando parte del primer subclado, la identidad de pTaEXPA6 con los
clones miembros de este subclado es de 99% con una cobertura de 100%. La secuencia de
referencia TaEXPA6 se encuentra en el subclado inferior con BS = 72, cuyos clones tienen
una identidad de 100% y cobertura del 100%.
39
Figura 15. Árbol filogenético obtenido a partir de las secuencias de aminoácidos.
Las secuencias tienen una longitud de 250 aminoácidos. Los porcentajes indican la identidad con
respecto a TaEXPA6 (AY543532.1). Los valores sobre los nodos indica el soporte de bootstrap
(BS). Los códigos a la derecha de los clones indican el número de accesión de las secuencias
nucleotídicas en la base de datos Genbank.
B87
B88
B25
W23
W20
W14
W8
B86
W83
W81
W84
W80
B89
W85
W28
B83
B84
B81
W1
B7
B22
W86
B85
W89
B82
W82
B12
W24
B6
W12
TaEXPA6
B10
TaEXPA2
99
97
80
45
97
82
60
29
42
54
18
49
10
88-89%
90%
89%
89-90%
97%
89%
100%
AY589584
AY543532.1
KC441067
KC441070
KC441070
KC441068
KC441069
KC441072
KC441067
40
Figura 16. Árbol filogenético de regiones parciales de las secuencias de aminoácidos.
Las secuencias midieron 145 aminoácidos. Los porcentajes indican la identidad con respecto a
TaEXPA6 (AY543532.1).Los valores sobre los nodos indica el soporte de bootstrap (BS). Los
B83
B84
B81
W80
W28
W85
B89
B7
W89
W1
W86
B22
B85
W87
B87
B25
W23
W81
pTaEXPA6 (b) (FN556070.1)
W20
B4
W84
B88
B86
W14
B80
W83
pTaEXPA6(a) (FN556069.1)
pTaEXPA6 (FN556071.1)
B12
W82
B82
TaEXPA6 (AY543532)
B6
W12
B10
W24
TaEXPA2 (AY589584)
99
91
90
99
98
100
98
99
91
73
91
36
80
85
10
88%
89%
96%
94%
99%
97%
91%
90%
89%
KC441067
KC441068
KC441072
KC441071
KC441070
KC441070
41
códigos a la derecha de los clones indican el número de accesión de las secuencias nucleotídicas en
la base de datos Genbank.
3.7 Comparación de las isoformas de TaEXPA6 con secuencias EST
Los emparejamientos se dieron principalmente con secuencias EST encontradas en tejido
de pericarpio a las 24 y 48 horas post-antesis, endospermo a 14 días post - antesis, embrión
1 y 2 días post-germinación, embrión 21 días post antesis. Además, ESTs expresadas en
plántulas de 21 días sometidas a estrés salino e hídrico mostraron identidad superior al
81%. En la Tabla 6 se resumen los emparejamientos de las respectivas secuencias.
Con respecto a la secuencia KC441067, exhibió emparejamiento con secuencias EST
presentes en tejido de pericarpio a las 24 y 48 horas post-antesis, endospermo a 14 días
post-antesis y embrión 1 día post-germinación. Además, se observó emparejamiento con
secuencias expresadas en plántulas de 21 días sometidas a estrés hídrico y salino. La
identidad entre las secuencias comparadas fue desde 82% hasta 95% (Tabla 6).
La secuencia KC441068tuvo emparejamiento con dos secuencias EST para tejido de
pericarpio a las 24 horas y una con tejido de pericarpio a las 48 horas, además, con
secuencias de embrión 1 día post germinación y 14 días post antesis. El emparejamiento
también se dio con ESTs encontradas plántulas de 21 días sometidas a estrés hídrico y
salino. Los porcentajes de identidad entre las secuencias fueron desde 82% hasta 95%
(Tabla 6).
La secuencia KC441069mostró emparejamiento similar al clon anterior para tejido de
pericarpio a las 24 horas, endospermo a 14 días post-antesis y 1 día post germinación.
También de las ESTs en plántulas sometidas a estrés hídrico y salino. La identidad entre las
secuencias fue desde 82% hasta 98% (Tabla 6).
42
La secuencia KC441070 también coincidió con las secuencias EST de pericarpio a las 24 y
48 horas, 1 y 2 día post-germinación y 21 días post - germinación. Asimismo, se emparejó
con secuencias de estrés hídrico y salino. La identidad fue desde 83 hasta 98% (Tabla 6).
De igual manera, la secuencia KC441071mostró emparejamiento con secuencias de tejido
de pericarpio a 24 y 48 horas post-antesis, endospermo a los 14 días post-antesis, embrión 1
día post-germinación, y estrés hídrico y salino. La identidad entre las secuencias fue desde
82% hasta 95% (Tabla 6).
La secuencia KC441072 también coincidió con las secuencias EST de pericarpio a las 24 y
48 horas, endospermo a los 14 días post-antesis, embrión 1 día post-germinación, y estrés
hídrico y salino, La identidad entre las secuencias fue entre 82% y 97% (Tabla 6).
Asimismo, las secuenciasAY543532.1 que comparten 100% de identidad con TaEXPA6
(Lin y col., 2005), también mostraron similitud con ESTs presentes en tejido de pericarpio
a 24 y 48 horas post-antesis, endospermo a 14 días post-antesis, embrión 1 y 2 días post-
germinación, estrés hídrico y salino. La identidad entre secuencias fue de 80 hasta 99%
(Tabla 6).
Las secuencias del grupo mTaEXPA6, también mostraron similitud con secuencias EST de
tejido de pericarpio a 24 y 48 horas post-antesis, endospermo a 14 días post-antesis,
embrión 1 día post germinación. La identidad entre secuencias está entre 83 y 98% (Tabla
6).
43
Tabla 6. Comparación de las isoformas de TaEXPA6 con secuencias EST de T. aestivum de la Base de datos Cereals DB.
Secuencia EST Long Biblioteca Descripción Secuencias objetivo
mTaEXPA6 KC441067 KC441068 KC441069 KC441070 KC441071 KC441072 AY543532.1
ID E ID E ID E ID E ID E ID E ID E ID E
A12_a11_plate_16 228 A1:1 Tejido pericarpio a 24 horas post-antesis
96 0.002
88 0.007 85 0.007 98 0.002 89 3E-05 97 0.027 99 8E-06
G04_a22_plate_15 597 A2:2 Tejido pericarpio a 48 horas post-antesis
90 4E-07 95 0.007 98 0.007 86 5E-07 90 0.007 95 0.007 94 0.030
G06_h116_plate_8 479 H1:16 Endospermo a 14 días post-antesis
85 0.002 85 0.002
85 0.002 85 0.002 86 5E-04
F07_n129_plate_3 598 N1:29
Embrión 1 día post-germinación
90 3E-07 95 4E-07 94 1E-07 94 5E-7 91 5E-07 95 3E-11 93 7E-09 94 1E-07
A04_n129_plate_12 506
87 3E-07 83 3.E-05 83 4E-04 86 0.002
92 0.030
B11_n130_plate_15 678 N1:30 Embrión 2 días post-germinación
98 0.027 97 0.027
D08_j223_plate_3 532 J2:23 Embrión 21 días post antesis
96 0.027
A05_p234_plate_14 473 P2:34
Plántulas de 21 días, con 5 días de estrés hídrico
85 0.024 90 0.008 82 2E-06 82 2E-06
84 7E-06 84 7E-06 92 2E-06
A07_p234_plate_20 585 83 7E-09 82 9E-9 83 1E-13 83 1E-13 89 3E-11 84 8E-15 82 3E-11 84 1E-10
C02_p335_plate_11 486 P3:35
Plántulas a los 21 días de estrés salino
90 0.024 82 3E-05 95 0.008 84 0.007 82 7E-09 82 3E-05 80 4E-04
E10_p335_plate_1 504 86 4E-04
87 0.027 87 0.031 93 0.002 90 3e-08 87 0.027
El análisis Blast se realizó CI = 95% y E-valor = 0.01. En donde: Long = Longitud de las secuencias EST en pb; ID = porcentaje de
identidad de las secuencias objetivo con las EST de la base de datos (Cereals DB) y E = valor de corte.
44
3.8 Predicción de la región promotora y elementos reguladores en Cis del gen
TaEXPA6
Estudios orientados a analizar las regiones promotoras y reguladoras de genes de
expansinas en trigo hasta el momento son escasos. Dado que la región promotora está
controlando el inicio de la transcripción, y las regiones regulatorias influyen a nivel de
traducción o transcripción, es importante el conocimiento de esta región para comprender la
funcionalidad de TaEXPA6.
Una primera aproximación para analizar la región aguas arriba del gen TaEXPA6 se realizó
utilizando información disponible en la base de datos Cereals DB (Wilkinson y col., 2012).
Se encontraron alineamientos significativos para las isoformas de TaEXPA6 reportadas en
esta tesis. La identidad entre las secuencias de la base de datos con las isoformas de EXPA
6 fue desde 84% hasta 99%.La secuencia consenso de mayor longitud (690pb)fue asignada
a la región promotora parcial del gen TaEXPA6, en la cual se analizaron los elementos
regulatorios (Figura 17).
Figura 17. Representación de la región promotora de TaEXPA6.
En rojo se representa el fragmento del promotor obtenido. En azul se indica la región CDS y en
púrpura la región 3‟UTRde TaEXPA6.
Análisis con el programa PlantCARE predijeron 48 elementos reguladores que se muestran
en la figura 18, y en la tabla 7 se resumen los resultados. Se predijeron diversas secuencias
45
reguladoras, entre las cuales se encuentran elementos estructurales del promotor tales como
CAAT box y TATA box. Respecto a las secuencias relacionadas con la regulación
hormonal, fue predicho un elemento de respuesta a las auxinas (TGA-element) encontrados
en coliflor (Brassica oleracea), (Pastuglia y col., 1997). Se encontraron dos elementos de
respuesta al metil jasmonato (CGTCA-motif y TGACG-motif) encontrados en Hordeum
vulgare (Rouster y col., 1997). Un elemento de respuesta al ácido salicílico (TCA-element)
encontrado en Brassica oleracea. Un elemento de respuesta al etileno (ERE) en el clavel
(Dianthus caryophyllus) (Itzhaki y Woodson, 1993).Se hallaron también tres cajas MBS
presentes en Arabidopsis thaliana que son sitios de unión a factores de transcripción MYB
involucrados en inducción por sequía (Urao y col., 1993; Yamaguchi y Shinozaki., 1993).
También fueron predichos varios elementos de respuesta a la luz (ACE; Box1; AE-box;
TGG-motif; TCCC-motif; MRE; GT1-motif; GAG-motif). Además, en un fragmento de
menor longitud probablemente correspondiente a otro promotor de TaEXPA6se predijo un
elemento de respuesta a giberelinas (GARE: Giberellic Acid Responsive Element)
encontrado en coliflor (Brassicaoleracea), (Pastuglia y col., 1997)y un elemento
involucrado en el control circadiano de la expresión (circadian), presente en el gen de LHC
de tomate (Piechulla y Merforth, 1998).
46
Figura 18. Predicción de elementos regulatorios en cis.
Se muestran en la figura los elementos predichos por el programa PlantCARE. Las referencias en
color se indican a la derecha. La descripción de los elementos regulatorios se indican en la tabla 7.
47
Tabla 7. Elementos regulatorios del promotor putativo del gen TaEXPA6 predichos con
PlantCARE.
Nombre Ubicación hebra * Secuencia Función
ACE
543(-)
CTAACGTATT
Elemento regulatorio de acción
en cis involucrado en respuesta
de la luz
AT-rich sequence 230 (+) TAAAATACT
Elemento para la máxima
activación mediada por elicitor
(2copias)
Box I 353 (+); 386 (-) TTTCAAA Elemento sensible a la luz
CAAT-box
55 (+); 584 (+); 101 (+); 524 (+); 417 (-); 577
(-) CAAT Elemento de acción en cis,
común en regiones del
promotor y enhancer
356 (+); 217 (+); 70 (-); 146 (-)
CAAAT
CGTCA-motif 98 (+) CGTCA
Elemento regulatorio de acción
en cis involucrado en respuesta
MeJa
ERE 352 (+) ATTTCAAA Elemento sensible al etileno
G-box 519 (+) CACGAC
Elemento regulatorio de acción
en cis involucrado en respuesta
de la luz
GAG-motif 152 (+); 650 (-) AGAGAGT Parte de un elemento de
respuesta a la luz
GT1-motif 374 (-) GGTTAA Elemento sensible a la luz
MBS 167 (-); 371 (-); 177 (-) TAACTG
Sitio de unión MYB
implicado en la inducción de
sequía
MRE 206 (+) AACCTAA
Sitio de unión MYB
implicado en la respuesta a la
luz
MSA-like 455 (+); 394 (-) TCAAACGGT
Elemento de acción en cis
involucrado en la regulación
del ciclo celular
4 (+); 542 (+); 66 (-) TAATA
Elemento promotor mínimo
cercano a -30 del inicio de la
transcripción
TATA-box
337 (-); 220 (+)
TATAA
230 (-); 227 (+)
TTTTA
338 (+); 326 (+)
TATA
TCA-element 528 (-) GAGAAGAATA Elemento de acción en cis de
respuesta al acido salicílico
TCCC-motif 654 (+) TCTCCCT Parte de un elemento de
respuesta a la luz
TGA-element 19 (-); 407 (+) AACGAC Elemento sensible a las
auxinas
TGACG-motif 98 (-) TGACG
Elemento regulatorio de acción
en cis involucrado en respuesta
MeJa
TGG-motif 184 (+) TGGTGGCTA Parte de un elemento de
respuesta a la luz
*Las posiciones se indican a partir del extremo 5‟ de la región CDS mostrada en la Figura 14; (+)
corresponde a secuencias de la hebra superior; (-) de la hebra inferior.
48
4 DISCUSIÓN
Genes de expansinas se han identificado en muchas plantas, incluyendo el trigo (Lin y col.,
2005). Estudios realizados en esta especie (Calderini y col., 2006; Lizana y col., 2010),
considerando la importancia de los carpelos florales y el alargamiento del pericarpio en la
determinación del peso de los granos, sugieren que algunos miembros de la α-expansinas
tendrían gran importancia en el crecimiento del pericarpio de los granos, ya que estas
expansinas estarían regulando la elongación y posiblemente el contenido hídrico máximo
de los granos.
Particular importancia ha mostrado TaEXPA6, cuyas expansinas homologas pTaEXPA6,
pTaEXPA6(a) y pTaEXPA6(b) han mostrado altos niveles de expresión en el tejido del
pericarpio durante el crecimiento de los granos (Lizana y col., 2010), sugiriendo que
TaEXPA6 tendrían un rol importante en el crecimiento del pericarpio de los granos trigo.
En la presente tesis los ensayos para amplificar el gen TaEXPA6 fueron eficientes, si bien,
algunos partidores de diseño propio para captar regiones específicas del gen produjeron
amplificaciones inespecíficas, se logró amplificar la región conocida de TaEXPA6 en
Triticum aestivum L. previamente reportada por Lin y col. (2005) y Lizana y col. (2010).
Las condiciones para la amplificación fueron optimizadas, tal es el caso que para amplificar
el fragmento (829pb) con el par de partidores denominados SLIN-2, empíricamente se
determinó que con la concentración de MgCl2 3,5µl el producto generado fue muy
específico. Se conoce que bajas o excesivas concentraciones de MgCl2 pueden reducir la
eficiencia de la amplificación debido a que la concentración de magnesio libre disminuye
proporcionalmente con la de agentes quelantes como el EDTA (Dorado, 2007), asimismo
los nucleótidos y el ADN estarían reduciendo el magnesio (Espinosa, 2007).
49
Por otro lado, las temperaturas de amplificación fueron optimizadas tomando en cuenta la
longitud del producto esperado, es así que siendo los productos inferiores a 1kb, el tiempo
de extensión fue de 1 minuto (Henegariu y col, 1997). Además, para optimizar la
temperatura de alineamiento, ésta se incrementó a valores cercanos a la temperatura de
fusión (Tm), debido a que la amplificación es específica visualizándose una sola banda
(Espinosa, 2007).
Considerando la importancia de TaEXPA6 en el crecimiento del pericarpio de los granos,
(Calderini, 2010; Lizana y col., 2010), se analizaron secuencias específicas de TaEXPA6
(partidor ExpOp-3) con el fin de determinar posibles diferencias genéticas entre los
cultivares Bacanora y Weebil, que pudieran ser relacionadas con el tamaño de los granos.
Si bien se encontró un SNP (Figura 5) entre los cultivares en estudio, este no pudo ser
validado al cortar con enzima de restricción (Figura 6).
Tomando en cuenta que el trigo (Triticum aestivum L.) es un organismo alohexaploide (2n
= 6x = 42) (Jahan y Vahidy, 1989), probablemente las diferencias genéticas encontradas a
nivel de secuencia de ADN no pudieron ser detectadas con la enzima de restricción, debido
a que en la amplificación no hay certeza de capturar la misma copia del gen.
Además, la dificultad para la detección de polimorfismos en las secuencias en los dos
cultivares, está dada por el elevado número de isoformas que codifican para TaEXPA6, si
bien presentan diferencias nucleotídicas, estas exhiben alta homología entre sus secuencias
tanto en Weebil como en Bacanora, lo que provoca la detección de polimorfismos falsos
positivos.
En los productos clonados se evidenciaron variaciones en la longitud de los fragmentos
(Tabla 3), es así que, tres fragmentos mostraron menor tamaño de lo esperado, midiendo
487pb, 630pb y 667pb, respectivamente. Si bien, estos fragmentos mostraron identidad con
TaEXPA6, no se pudo predecir la proteína de estos productos. Probablemente estas
secuencias corresponden a pseudogenes, que son copias no funcionales de los genes.
Estudios recientes en Arabidopsis (Yang y col., 2011) y en trigo (Wicker y col., 2011),
50
demostraron que los pseudogenes posiblemente se originan por duplicación génica y en
promedio tienen una longitud más corta siendo menos probable que se expresen como
genes funcionales, tal sería el caso de las secuencias cortas encontradas en este estudio,
cuya traducción no produjo una proteína.
La caracterización de las secuencias TaEXPA6 en los cultivares Bacanora y Weebil
mostraron la estructura propia de la familia EXPA. En los clones agrupados como
sTaEXPA6 se determinó la existencia de dos exones que resultan en una ORF 753
pb(Figura 8), datos que están de acuerdo con los resultados reportados en trigo (Lin y col.,
2005). En un estudio en fresa (Dotto y col., 2006) la longitud ORF fue de 780pb que está
dentro de los tamaños reportados para las EXPA.
La región 3‟UTR en el grupo sTaEXPA6 tuvo una longitud de 81 pb y 82 pb. En trigo, Lin
y col (2005) indican que esta región tiene una longitud de 79 pb, estos resultados son muy
similares considerando las variaciones nucleotídicas encontradas en las secuencias del
presente estudio, mientras que en Arabidopsis (Shcherban y col., 1995) se indica que esta
región tiene una longitud de 122 pb y en arroz (Choi y col., 2003) 402 pb, evidenciándose
diferencias de longitud de esta región en otras especies.
La región 5‟UTR no fue amplificada, debido a que el diseño de los partidores excluía esta
región. Hasta el momento en TaEXPA6 no existen reportes sobre información de esta
región. Sin embargo, en arroz (Choi y col., 2003) la región 5‟UTR tiene 15 pb y en
Arabidopsis (Shcherban y col., 1995) 75 pb. De particular interés sería el conocimiento de
las regiones UTR tomando en cuenta que en los genes eucariotas tendrían gran importancia
en la regulación de la expresión génica (Kuersten y Goodwin, 2003).
El grupo mTaEXPA6 cuyas secuencias están presentes equitativamente en Weebil y
Bacanora se diferenciaron claramente de las secuencias del grupo sTaEXPA6, es así que las
variaciones nucleotídicas influyeron sobre la deducción de la estructura de estas secuencias.
Una deleción en la posición 233 (5´-3´) provocó cambios en el marco de lectura para la
predicción de la proteína. Esta mutación puntual es conocida como frameshift mutation
51
(Fox, 1987), y debido a la naturaleza de la expresión genética, en forma de triplete, esta
deleción estaría alterando la agrupación de los codones, provocando una traducción
diferente a la proteína original (Streisinger y Col., 1966; Fox, 1987; Harfe y Robertson.,
1999).Es así que el exón tuvo una disminución en la longitud a 479 pb provocando cambios
sustanciales en las regiones conservadas. La región 3‟UTR se extendió a 223 pb, y la región
5‟UTR fue de 128 pb (Figura 8).
A nivel de proteína, los clones del grupo sTaEXPA6 mostraron una longitud pequeña de
250 aminoácidos siendo de naturaleza alcalina con un punto isoeléctrico PI 9.05 y
contienen un péptido señal escindible en el extremo N-terminal constituido por 20
aminoácidos que según la predicción del programa SignalP 4.0 (Nordahl-Petersen y col.,
2011) sugieren que las proteínas codificadas son dirigidas a la pared celular como se
supone para los miembros de la familia de las α-expansinas (Cosgrove, 2000; Lee y Kende,
2001; Lee y col., 2001). La eliminación de los péptidos señal dan lugar a la formación de
las proteínas maduras, cuyas masas moleculares se encuentran cercanas a 27 kDa. Estos
datos están de acuerdo con reportes previos de genes de α-expansina provenientes de
diversas especies (Nakai y Horton, 1999; Sharova, 2007).
La variación de las secuencias del grupo sTaEXPA6 a nivel proteico respalda la variación
encontrada a nivel de ADN con identidad de secuencia aminoacídica desde 88% hasta las
más conservadas con 100% (Tabla 5). Estas proteínas contenían ocho cisteínas conservadas
dentro de la región rica en cisteína en la mitad N-terminal, cuatro triptófanos en el extremo
C-terminal y un triptófano en el extremo N-terminal, así como el motivo HFD
características propias de α-expansinas (Shcherban y col., 1995; Choi y col., 2006). Los
aminoácidos conservados tendrían gran importancia para las funciones estructurales y
catalíticas de las α-expansinas (Cosgrove, 2000; Reidy y col., 2001).
El análisis de los clones del grupo mTaEXPA6 mostró que solo cuatro cisteínas, tres
triptófanos y el motivo HFD se mantenían conservados, el extremo N-terminal tuvo
cambios sustanciales en la traducción de la proteína (Figura 14). Análisis de la predicción
52
del péptido señal con el programa SignalP 4.0 (Nordahl-Petersen y col., 2011) en los clones
del grupo mTaEXPA6 no produjeron resultados, mientras que al realizar la predicción del
destino de la proteína con el programa TargetP (Emanuelsson y col., 2000) el destino de
estas proteínas sería mitocondrial. Sin embargo, no existen evidencias en la literatura que
las expansinas se dirijan a las mitocondrias. Por lo tanto, estos resultados sumados a la
modificación de los aminoácidos provocados por la mutación encontrada en estos clones,
sugieren que probablemente las secuencias del grupo mTaEXPA6 pertenezcan a una copia
no funcional del gen.
La identificación de la secuencia de los clones mTaEXPA6 a nivel de ARNm podría ser
una vía para comprobar la funcionalidad de este gen. Sin embargo, esta estrategia parecería
ser compleja considerando la alta homología a nivel de ADN en el sitio de interés entre las
secuencias, pues se trata de la deleción de un solo nucleótido, lo que hace poco probable el
diseño de partidores específicos para capturar esta secuencia.
Estudios de los patrones de los intrones en α-expansinas han sido previamente informados
en Arabidopsis y arroz, sugiriendo que los intrones pueden estar presentes en siete
posiciones diferentes (figura 13) (Lee y col., 2001; Li y col., 2002). En este estudio la
comparación de todas las secuencias genómicas mostraron la existencia de un intrón en la
posición C, coincidiendo con datos registrados por Lin y col. (2005) para TaEXPA6 en
trigo. La longitud de los intrones varió entre 97pb, 112pb, 121pb, 133pb, y 134pb,
correspondiendo el intrón más pequeño (97pb) a los clones del grupo mTaEXPA6. Las
cuatro longitudes siguientes se encontraron en los clones del grupo sTaEXPA6, los
distintos tamaños de los intrones estuvieron presentes en los dos cultivares Weebil y
Bacanora, de esta manera se mantiene la variación encontrada a nivel de secuencia
nucleotídica y aminoacídica (Tabla 4).
Lin y col. (2005) reportaron que en TaEXPA6 el intrón mide 121pb coincidiendo con los
resultados encontrados en cuatro clones del cultivar Bacanora y tres clones del cultivar
Weebil de este estudio. Un intrón está ocupando la posición C en algunos genes de α y β
53
expansinas en Arabidopsis, arroz y trigo (Frugoli y col., 1998; Li y col., 2002; Sampedro y
col, 2005), lo que hace presumir que este intrón estaría presente en el ancestro común de
las expansinas.
Además, en una comparación con la secuencia del intrón de Triticum monococcum (Datos
proporcionados por el Dr. Manuel Muñoz) se encontró que el intrón de longitud 133 pb
tenía una similitud de 99 %, encontrándose variación de un solo nucleótido mediante la
sustitución de una adenina por una guanina.
Considerando que se cree que Triticum monococcum es una de las especies cultivadas más
antiguas de trigo, y puede ser una de las especies de las que desciende todo el trigo
cultivado (Nesbitt, 2001), posiblemente este intrón se encuentra conservado en T. aestivum
y correspondería a la información genética aportada por T. monococcum.
Por otro lado, los intrones en la mayoría de los vegetales, poseen secuencias conservadas
de inicio 5„GT y de término 3„AG (Ying-Ying y col., 2006), lo que está de acuerdo con los
resultados obtenidos, ya que en todos los intrones estas secuencias están conservadas.
(Figura 12).
Los resultados obtenidos en la presente tesis sugieren que EXPA6 en T. aestivum está
codificada por muchos genes, debido a la gran variabilidad encontrada a nivel de
secuencias genómicas, aminoacídicas y de intrones. Esto se ve respaldado por el análisis de
agrupamiento en arboles filogenéticos (Tamura y col., 2011) de ADN y proteína, cuyos
resultados mostraron agrupamientos en ocho subclados, algunos de estos compartían alta
identidad con las secuencias de referencia TaEXPA6 (Lin y col., 2005), pTaEXPA6,
pTaEXPA6-a y pTaEXPA6-b (Lizana y col., 2010).
En síntesis, en el presente estudio se determinaron diferencias nucleotídicas en secuencias
codificantes de TaEXPA6, estas diferencias nucleotídicas están correspondiendo a por lo
menos ocho isoformas distintas del gen TaEXPA6 presentes en los dos cultivares, aquí se
54
incluyen siete isoformas del grupo sTaEXPA6 y una del grupo mTaEXPA6 (Figura14), lo
que sustenta la hipótesis de este trabajo de investigación.
Cabe recalcar que una isoforma (KC441070) fue encontrada solamente en el cultivar
Bacanora. No obstante, esta secuencia necesita ser validada para confirmar su presencia,
debido a que para la secuenciación, los clones fueron seleccionados aleatoriamente,
existiendo la posibilidad de ser encontrados en los dos cultivares al incrementar la
población al momento de la selección.
El gran número de genes que codifican TaEXPA6 parecería seguir el patrón de especies
vegetales en las que se ha estudiado otras expansinas, en las cuales es un rasgo
característico la presencia de un elevado número de genes (Cosgrove, 2000). Una de las
hipótesis acerca de las razones de la gran cantidad de genes de expansina sugiere que la
expresión de los mismos es redundante, con lo cual su expresión se solaparía en ciertos
casos (Brummell y col., 1999).
La gran diversidad del gen TaEXPA6 en trigo podría reflejar la necesidad de un control
puntual sobre las actividades de esta expansina en varios tejidos y en diferentes etapas de
desarrollo de la planta. Los resultados de comparación con secuencias EST sugieren que
TaEXPA6 y sus isoformas, en el trigo tendrían acción en varios tejidos de grano,
principalmente en pericarpio, endospermo y embrión.
La redundancia en la expresión de TaEXPA6 ha sido detectada en tejido de pericarpio en
trigo, en donde se determinó altos niveles de expresión de al menos tres expansinas
putativas de TaEXPA6: pTaEXPA6, pTaExpA6-a y pTaExpA6-b a los 141°Cd (11 días)
post antesis, disminuyendo los transcriptos a los 247°Cd (18 días) después de antesis, en
coincidencia con la estabilización del largo del grano (Lizana y col., 2010). En los
genomas de Arabidopsis y arroz se ha expuesto que las familias de proteínas conocidas y
putativas que actúan sobre la pared celular están codificadas por docenas de genes, lo que
sugiere un proceso altamente complejo (Rose y col., 2004).Las especies vegetales poseen
55
un elevado número de genes de expansinas, por los tanto se espera que EXPA6
corresponda a un grupo comprendido por varias isoformas.
La predicción de elementos reguladores en cis en regiones promotoras parece ser una labor
complicada dado que se trata de secuencias cortas, por lo que algunas secuencias
reguladoras putativas predichas in silico, no ejercen in vivo un efecto regulador sobre el
gen de interés (Wang y Storni, 2003). Sin embargo, en casos como el del gen
TaEXPA6donde no existen estudios sobre la actividad del promotor, este tipo de
predicciones permite obtener indicios de los posibles factores de regulación y asimismo
orientar futuras investigaciones.
El análisis in silico de la secuencia obtenida revela posibles regulaciones hormonales a
través de las giberelinas, auxinas, etileno, metil jasmonato y ácido salicílico, pero hay que
considerar que la región obtenida es parcial, por lo que existe la posibilidad que más
elementos estén presentes.
Se ha demostrado que la expresión de algunos genes de α-expansinas están regulados por
las auxinas (Hutchison y col., 1999; Catalá y col., 2000), giberelinas (Cho y col., 1997;
Lee y col., 2001), citoquininas (Wrobel y col., 2001; O‟Malley y Lynn, 2002) y etileno
(Vriezen y col., 2000; Kim y col., 2000). En análisis de las regiones promotoras de
expansinas de arroz se ha reportado la presencia de elementos de respuesta al ácido
abscísico, auxina, giberelina y etileno. La presencia de tales elementos sensibles a
reguladores de crecimiento parece ser frecuentes en α-expansinas (Kende y col., 1998: Lee
y Kende, 2001).
Existen importantes evidencias de la participación de las auxinas en la acidificación de la
pared celular para el crecimiento auxina dependiente en las gramíneas (Sharova, 2007). En
un estudio en soya, auxinas y citoquininas sinérgicamente mejoran la acumulación de
proteína EXPB Cim1 (Downes y col., 2001).
56
Por otro lado, se ha reportado que el ácido salicílico estaría alterando la síntesis y/o
señalización de otras hormonas que incluyen la vía del ácido jasmónico, etileno, y auxinas
(Broekaert y col., 2006; Loake y Grant 2007; Balbi y Devoto, 2008).
Los resultados expuestos en el presente estudio indican quelas diferentes isoformas del gen
TaEXPA6tienen un complejo proceso de regulación, en donde están interviniendo muchos
elementos reguladores que responderían a la acción individual o conjunta de varios
reguladores de crecimiento. Sin embargo, como se mencionó anteriormente, los resultados
obtenidos mediante los programas son orientativos y estas predicciones deben ser
confirmadas experimentalmente.
Para futuras investigaciones, este trabajo deja información importante acerca de las
secuencias nucleotídicas de genes TaEXPA6que será de utilidad en la búsqueda de
polimorfismos que puedan ser relacionados con variables del peso de grano.
De igual forma, la información generada puede utilizarse para amplificar estas isoformas a
nivel de ADN considerando el elevado polimorfismo a nivel de intrones. Asimismo estas
secuencias podrían ser amplificadas a nivel de ARNm y comprobar su expresión.
En base a la predicción de elementos regulatorios presentes en el promotor sería interesante
evaluar la influencia de diferentes niveles de reguladores de crecimiento sobre la expresión
del gen TaEXPA6 y sus isoformas.
Se propone identificar la región promotora completa de las isoformas de TaEXPA6 y
continuar con estudios de diversidad nucleotídica, permitiendo explorar posibles
diferencias alélicas asociadas a esta región. Además, la obtención y caracterización de un
fragmento mayor permitiría analizar la presencia de elementos reguladores adicionales en
la región promotora.
57
5 CONCLUSIONES.
En base a los resultados obtenidos se concluye:
En dos genotipos de trigo contrastantes en peso grano, el gen TaEXPA6 esta codificado por
un grupo numeroso de isoformas, se encontraron por lo menos ocho isoformas diferentes,
exhibiendo diversidad en las regiones codificantes y de intrones.
En las isoformas existen diferencias nucleotídicas entre cultivares, sin embargo, con el
nivel de información generado no se puede asegurar si son variantes alélicas o copias
génicas.
Las proteínas predichas de las isoformas presentan las características generales de la familia
de las α-expansinas: residuos de W y C conservados, motivo HFD, péptido señal predicho
que las dirige a la ruta secretora y proteínas maduras de masa molecular alrededor de 27.2
kDa.
Análisis in silico soportan la importancia del gen TaEXPA6 en tejidos de pericarpio y
semilla en desarrollo, sin embargo, no se pudo reconocer a que isoforma del gen
corresponden debido la alta homología de las secuencias.
Mediante programas bioinformáticos y datos de secuenciación masiva se obtuvo un
promotor putativo del gen TaEXPA6, y se identificaron elementos regulatorios de respuesta
hormonas y luz, que sugieren un complejo proceso de regulación.
58
6 BIBLIOGRAFÍA
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7 ANEXOS
Anexo 1. Alineamiento múltiple de las secuencias de ADN de diez clones distintos de
TaEXPA6.
Clon_W87 CGCTTCCTGCAGCTGTTCGCGGTGGTTCTCGCCTTCTCCTTCGTGCCCGCCAAGTCCGGC 60
mTaEXPA6 CGCTTCCTGCAGCTGTTCGCGGTGGTTCTCGCGTTCTCCTTCATGCCCGCCAAGTCCGGC 60
KC441071 CGCTTCCTGCAGCTGTTCGCGGTGGTTCTCGCCTTCTCCTTCGTGCCCGCCAAGTCCGGC 60
KC441069 CGCTTCCTGCAGCTGTTCGCGACGGTTCTCGCGTTCTGCTTCGTGCTGGCCAAGTCCGGC 60
KC441072 CGCTTCCTGCAGCTGTTCGCGACGGTTCTCGCGTTCTGCTTCGTGCCGGCCAAGTCCGGC 60
KC441068 CGCTTCCTGCAGCTGTTCGCGGCGGTTCTCGCGTTCTGCTTCGTGCTGGCCAAGTCCGGC 60
AY543532.1 CGCTTCCTGCAGCTGTTCGCCGCCGTTCTCGCGTTCTGCTTCGTGCAGGCCAGGTCCGAC 60
Clon_B10 CGCTTCCTGCAGCTGTTCGCCGCCGTTCTCGCGTTCTGCTTCGTGCAGGCCAGGTCCGAC 60
KC441067 CGCTTCCTGCAGCTGTTCGCCGCCGTTCTCGCGTTCAGCTTCGTGCCGGCCAAGTCTGAC 60
KC441070 CGCTTCCTGCAGCTGTTCGCCGCCGTCCTCGCGTTCAGCTTCGTGCCGGCCAAGTCTGAC 60
******************** ** ***** *** **** *** **** *** * *
Clon_W87 TACTGGCTGCCGGCCCATGCCACGTTCTACGGCGGCGCCGACGGCTCTGACACAATGGGT 120
mTaEXPA6 TACTGGCTCCCGGCCCATGCCACCTTCTACGGCGGCGCCAACGGCTCGGACACAATGGGT 120
KC441071 TACTGGCTGCCGGCCCATGCCACGTTCTACGGCGGCGCCGACGGCTCTGACACAATGGGT 120
KC441069 TACTGGCTGCCGGCCCATGCCACGTTCTACGGCGGTGCCGACGGCTCTGACACAATGGGT 120
KC441072 TACTGGCTGCCGGCCCATGCCACGTTCTACGGCGGTGCAGACGGCTCTGACACAATGGGT 120
KC441068 TACTGGCTGCCGGCCCATGCCACGTTCTACGGCGGTGCCGACGGCTCTGACACAATGGGT 120
AY543532.1 TACTGGCATCAGGCCTACGCCACCTTCTACGGCGGCGCCGACGGTGCTGAAACAATGGGT 120
Clon_B10 TACTGGCATCAGGCCTACGCCACCTTCTACGGCGGCGCCGACGGTGCTGAAACAATGGGT 120
KC441067 TACTGGCATCAGGCCTACGCCACGTTCTACGGCGGCGCCGACGGTGCGGAAACAATGGGT 120
KC441070 TACTGGCATCAGGCCTACGCCACCTTCTACGGCGGCGCCGACGGTTCTGAAACAATGGGT 120
******* * **** * ***** *********** ** **** * ** *********
Clon_W87 AAGCTAGCTAATCAAGC------------TTGCTCCGGCACCATCAATTTGCCAAATAAT 168
mTaEXPA6 AAGCTAGCTAACCCAG---------------------GCACCATCAATTTGCCAAATA-- 157
KC441071 AAGCTAGCTAATCAAGC------------TTGCTCCGGCACCATCAATTTGCCAAATAAT 168
KC441069 AAGCTAGCTAATCAAGC------------TTGCTCCGGCATTATCAGTTTGCCCAATA-- 166
KC441072 AAGCTAGCTAATCAAGC------------TTGCTCCGGCATTATCAGTTTGCCCAATA-- 166
KC441068 AAGCTAGCTAATCAAGC------------TTGCTCCGGCATTATCAGTTTGCCCAATA-- 166
AY543532.1 AAGCCAGATAATCAAGCCTTAACTCCGGCTTGCTCCGGCACCATCATTTTGCCCAATA-- 178
Clon_B10 AAGCCAGATAATCAAGCCTTAACTCCGGCTTGCTCCGGCACCATCATTTTGCCCAATA-- 178
KC441067 AAGCCAGATAATCAAGCCTTAACTCCGGCTTGCTCCGGCACCATCATATTGCCCAATG-- 178
KC441070 AAGCTAGATAATCAAGCCTTAACTCCGGCTTGCTCCGGCACCATCACTTTGCCCAATA-- 178
**** ** *** * ** *** **** ***** ***
Clon_W87 AGTATTACTTATCA--TGCGGGT------------------GTGCATGTCTGACTGTACG 208
mTaEXPA6 ----TTACTTATCA--TGCGTGC------------------GTGCATGTCTGACTGTACG 193
KC441071 AGTATTACTTATCA--TGCGGGT------------------GTGCATGTCTGACTGTACG 208
KC441069 ----TTACTTATCACCTGCTGATACGCA---------TGCAGTGCATGTCTGACTGTATC 213
KC441072 ----TTACTTATCACCTGCTGATACGCA---------TGCAGTGCATGTCTGACTGTATC 213
KC441068 ----TTACTTATCACCTGCTGATACGCA---------TGCAGTGCATGTCTGACTGTATC 213
AY543532.1 ----TTACTTATCTA-TGCAAGTACGCAATGCAATGCTTGTGTGCATGTCTGACTTTATC 233
Clon_B10 ----TTACTTATCTA-TGCAAGTACGCAATGCAATGCTTGTGTTCATGTCTGACTTTATC 233
KC441067 ----TTACTTATCTA-TGCAAATACGCAATGCAATGCTTGTGTGCATGTCTGACTTTATC 233
KC441070 ----TTACTTATCTA-TGCAAATATGCAATGCAATGCTTGTGTGCATGTCTGACTTTATC 233
********* *** ** *********** **
Clon_W87 GTTTTGCATGTGCAA----TGTGCAGGTGGCGCATGTGGGTACGAGAACCTGTACAACGC 264
mTaEXPA6 GTTTTGCATGTGCAA----TGTGCAGGTGGCGCATGTGGGTACGAGAACCTGTACAACGC 249
KC441071 GTTTTGCATGTGCAA----TGTGCAGGTGGCGCATGTGGGTACGAGAACCTGTACAACGC 264
KC441069 GATCTGCATTTGTAAATAATGTGCAGGTGGCGCATGTGGGTACGAGAACCTGTACAACGC 273
74
KC441072 GATCTGCATTTGCAAATAATGTGCAGGTGGCGCATGTGGGTACGAGAACCTGTACAACGC 273
KC441068 GATCTGCATTTGCAAATAATGTGCAGGTGGCGCATGTGGGTACGAGAACCTGTACAACGC 273
AY543532.1 ----TGCATGTGCAA----TGTGCAGGTGGCGCATGTGGGTACGATAACCTGTACGCTGC 285
Clon_B10 ----TGCATGTGCAA----TGTGCAGGTGGCGCATGTGGGTACGATAACCTGTACGCTGC 285
KC441067 ----TGCATGTGCAA----TGTGCAGGTGGCGCATGTGGGTACGATAACCTGTACGCTGC 285
KC441070 C---TGCATGTGCAA----TGTGCAGGTGGCGCATGTGGGTACGATAACCTGTACGCTGC 286
***** ** ** ************************** ********* **
Clon_W87 GGGGTACGGGATCAACAACGCGGCGCTGAGCACAGCGCTCTTCAACAATGGCTTGTCGTG 324
mTaEXPA6 GGGGTACCGGATCAACAATGCGGCGCTGAGCACAGCGCTCTTCAACAATGGCTTGTCGTG 309
KC441071 GGGGTACGGGATCAACAACGCGGCGCTGAGCACGGCGCTGTTCAACAACGGCTTGTCGTG 324
KC441069 CGGGTACGGGATCAACAACGCTGCGCTGAGCACGGCGCTCTTCAACAATGGCTTGTCGTG 333
KC441072 CGGGTACGGGATCAACAACGCTGCGCTGAGCACGGCGCTCTTCAACAATGGCTTGTCGTG 333
KC441068 CGGGTACGGGATCAACAACGCTGCGCTGAGCACGGCGCTCTTCAACAATGGCTTGTCGTG 333
AY543532.1 GGGGTACGGGCTCAACAACGCGGCGCTGAGCACGGTGCTGTTCAACAACGGCTTGTCCTG 345
Clon_B10 GGGGTACGGGCTCAACAACGCGGCGCTGAGCACGGTGCTGTTCAACAACGGCTTGTCCTG 345
KC441067 GGGCTACGGGCTCAACAACGCGGCGCTGAGCACGGTCCTGTTCAACAACGGCTTGTCGTG 345
KC441070 GGGCTACGGGCTCAACAACGCGGCGCTGAGCACGGTGCTGTTCAACAACGGCTTGTCGTG 346
** *** ** ******* ** *********** * ** ******** ******** **
Clon_W87 CGGGCAGTGTTACCTCA-CACCTGTGACACCAGCAAGTCGAACATGTGCAAGCCTGGCAC 383
mTaEXPA6 CGGGCAGTGTTACCTCA-CACCTGTGACACCAGCAAGTCGAACATGTGCAAGCCTGGCAC 368
KC441071 CGGGCAGTGCTACCTCATCACCTGCGACACCAGCAAGTCAAACATGTGCAAGCCCGGCAC 384
KC441069 CGGGCAGTGTTACCTCATCACTTGTGACACCAGCAAGTCGAACATGTGCAAGCCCGGCAC 393
KC441072 CGGGCAGTGTTACCTCATCACCTGTGACACCAGCAAGTCGAACATGTGCAAGCCCGGCAC 393
KC441068 CGGGCAGTGTTACCTCATCACTTGTGACACCAGCAAGTCGAACATGTGCAAGCCCGGCAC 393
AY543532.1 CGGGCAATGCTACCTCATCACCTGCGACACCAGCAAGTCGAATATGTGCAAGCCCGGCAC 405
Clon_B10 CGGGCAATGCTACCTCATCACCTGCGACACCAGCAAGTCGAATATGTGCAAGCCCGGCAC 405
KC441067 CGGGCAGTGCTACCTCATCACCTGCGACACCAGCAAGTCGAATATGTGCAAGCCCGGCAC 405
KC441070 CGGGCAATGCTACCTCATCACCTGTGATACCAGCAAGTCGAATATGTGCAAGCCCGGCAC 406
****** ** ******* *** ** ** *********** ** *********** *****
Clon_W87 GTCCATCACCGTCTCCGCCACCAACTTCTGCCCTCCCAACTGGACTCTCCCCAGCGACAA 443
mTaEXPA6 GTCCATCACCGTCTCCGCCACCAACTTCTGCCCTCCCAACTGGACTCTCCCCAGCGACAA 428
KC441071 GTCCATCACCGTCTCCGCCACCAACTTCTGTCCCCCCAACTGGGCTCTCCCCAGCGACAA 444
KC441069 GTCCATCACCGTCTCTGCAACCAACTTCTGCCCTCCCAACTGGGCTCTCCCCAGCGACAA 453
KC441072 GTCCATCACCGTCTCTGCAACCAACTTCTGCCCTCCCAACTGGGCTCTCCCCAGCGACAA 453
KC441068 GTCCATCACCGTCTCTGCAACCAACTTCTGCCCTCCCAACTGGGCTCTCCCCAGCGACAA 453
AY543532.1 ATCCATCACCGTGTCCGCCACCAACTTGTGCCCTCCCAACTGGGCTCTCGCCAACGACAA 465
Clon_B10 ATCCATCACCGTGTCCGCCACCAACTTGTGCCCTCCCAACTGGGCTCTCGCCAACGACAA 465
KC441067 GTCCATCACTGTGTCCGCCACCAACTTATGCCCTCCCAACTGGGCTCTCGCCAACGACAA 465
KC441070 GTCCATCACCGTGTCCGCCACCAACTTGTGCCCTCCCAACTGGGCTCTCCCCAACGACAA 466
******** ** ** ** ******** ** ** ********* ***** *** ******
Clon_W87 CGGAGGCTGGTGCAACCCTCCCCGTGTCCACTTCGACATGTCCCAACCCGCCTGGGAGAA 503
mTaEXPA6 CGGAGGCTGGTGCAACCCTCCCCGTGTCCACTTCGACATGTCCCAACCCGCCTGGGAGAA 488
KC441071 CGGTGGCTGGTGCAACCCTCCCCGCGTCCACTTCGACATGTCCCAGCCCGCCTGGGAAAA 504
KC441069 CGGTGGCTGGTGCAACCCTCCCCGTGTCCACTTCGACATGTCCCAGCCGGCCTGGGAGAA 513
KC441072 CGGTGGCTGGTGCAACCCTCCCCGTGTCCACTTCGACATGTCCCAGCCCGCCTGGGAGAA 513
KC441068 CGGTGGCTGGTGCAACCCTCCCCGTGTCCACTTCGACATGTCCCAGCCGGCCTGGGAGAA 513
AY543532.1 CGGCGGGTGGTGCAATCCTCCCCGTGAACACTTCGACATGTCCCAGCCTGCCTGGGAGAA 525
Clon_B10 CGGCGGGTGGTGCAATCCTCCCCGTGAACACTTCGACATGTCCCAGCCTGCCTGGGAGAA 525
KC441067 CGGTGGGTGGTGCAACCCTCCCCGCGAACACTTCGACATGTCCCAGCCCGCCTGGGAGAA 525
KC441070 CGGCGGGTGGTGCAACCCTCCCCGCGAACACTTCGACATGTCCCAGCCCGCCTGGGAGAA 526
*** ** ******** ******** * ***************** ** ******** **
Clon_W87 CCTCGCCATCTACCGCGCCCGCATCGTCCCCGTCCTTTACCAGCAGGTCGCGTGCCAGAG 563
mTaEXPA6 CCTCGCCATCTACCGCGCCCGCATCGTCCCCGTCCTTTACCAGCAGGTCGCGTGCCAGAG 548
KC441071 CCTCGCCATCTACCGCGCCGGCATCGTCCCCGTCCTCTACCAGCAGGTCGCGTGCCAGAG 564
KC441069 CCTCGCCATCTACCGCGCCGGCATCGTCCCCGTCCTCTACCAGCAGGTCGCGTGCCAGAG 573
KC441072 CCTCGCCATCCACCGCGCCGGCATCGTCCCCATCCTCTACCAGCAGGTCGCGTGCCAGAG 573
KC441068 CCTCGCCATCTACCGCGCCGGCATCGTCCCCGTCCTCTACCAGCAGGTCGCGTGCCAGAG 573
AY543532.1 CCTCGCCATCTACCGCGCTGGCATTGTCCCTGTCCTCTACCAGCGGGTCGCGTGCCAAAG 585
Clon_B10 CCTCGCCATCTACCGCGCTGGCATTGTCCCTGTCCTCTACCAGCGGGTCGCGTGCCAAAG 585
KC441067 CCTCGCCATCTACCGTGCCGGCATTGTCCCCGTCCTCTACCAGCGAGTCACGTGCCAGAG 585
75
KC441070 CCTCGCCATCTACCGCGCCGGCATTGTCCCCGTCCTCTACCAGCGGGTCGCGTGCCAGAG 586
********** **** ** **** ***** **** ******* *** ******* **
Clon_W87 GCAGGGCGGCCTGCGCTTCACCATTAACGGCTTCAACTACTTTGAGCTCGTGCTGGTGAC 623
mTaEXPA6 GCAGGGCGGCCTGCGCTTCACCATTAACGGCTTCAACTACTTTGAGCTCGTGCTGGTGAC 608
KC441071 GCAGGGCGGCCTGCGCTTCACTATCAACGGCTTCAACTACTTTGAGCTCGTGCTGGTGAC 624
KC441069 GCAGGGCGGCCTACGCTTCACCATCAGCGGTTTCAATTACTTCGAGCTTGTGCTGGTTAC 633
KC441072 GCAGGGCGGCCTACGCTTCACCATCAGCGGTTTCAATTACTTCGAGCTTGTGCTGGTTAC 633
KC441068 GCAGGGCGGCCTACGCTTCACCATCAGCGGTTTCAATTACTTCGAGCTTGTGCTGGTTAC 633
AY543532.1 GCAGGGTGGCCTGCGTTTCACCATGAGCGGCTTCAACTACTTCGAGCTGGTACTGGTGAC 645
Clon_B10 GCAGGGTGGCCTGCGTTTCACCATGAGCGGCTTCAACTACTTCGAGCTGGTACTGGTGAC 645
KC441067 GCAGGGTGGCCTGCGGTTCACCATCAGCGGCTTCAACTACTTCGAGCTGGTGCTGGTGAC 645
KC441070 GCAGGGTGGCCTGCGATTCACCATCAGCGGCTTCAACTTCTTCGAGCTCGTGCTGGTGAC 646
****** ***** ** ***** ** * *** ***** * *** ***** ** ***** **
Clon_W87 TAACATGGCCGGAAGCGGGTCGGTCAAGAGCATGTCAGTCAAGGGGACCAACACGGCGTG 683
mTaEXPA6 TAACATGGCCGGAAGCGGGTCGGTCAAGAGCATGTCAGTCAAGGGGACCAACACGGCGTG 668
KC441071 CAACATGGCCGGGAGTGGGTCAGTCAAGAGCATGTCGGTGAAGGGGACCAACACCGCATG 684
KC441069 CAACATGGCCGGGAGCGGGTCGGTCAAGAGCATGTCAGTCAAGGGGACCAACACCGCGTG 693
KC441072 CAACATGGCCGGGAGCGGGTCGGTCAAGAGCATGTCAGTCAAGGGGACCAACACCGCGTG 693
KC441068 CAACATGGCCGGGAGCGGGTCGGTCAAGAGCATGTCAGTCAAGGGGACCAACACCGCGTG 693
AY543532.1 CAACATCGCCATGAGCGGGTCGATCAGGAGCATGTCAGTGAAGGGGACCAACACGGCGTG 705
Clon_B10 CAACATCGCCATGAGCGGGTCGATCAGGAGCATGTCAGTGAAGGGGACCAACACGGCGTG 705
KC441067 CAACATCGCCATGAGCGGGTCGATCAAGAGCATGTCGGTGAAGGGGACCAACACGGCGTG 705
KC441070 CAACATCGCCATGAGCGGGTCGATCAGGAGCATGTCGGTGAAGGGGACCAACACGGCGTG 706
***** *** ** ***** *** ********* ** ************** ** **
Clon_W87 GATCCCCATGTCCCAGAATTGGGGCGCTAACTGGTAGTGCCTAGCGGGGCTGAAAGGACA 743
mTaEXPA6 GATCCCCATGTCCCAGAATTGGGGCGCTAACTGGTAGTGCCTAGCGGGGCTGAAAGGACA 728
KC441071 GATTCCGATGTCCCAGAACTGGGGCGCTAACTGGCAGTGCCTAGCGGGGCTGAAAGGACA 744
KC441069 GATCCCCATGTCCCAGAACTGGGGCGCTAACTGGCAGTGCCTAGCGGGGCTGCGAGGACA 753
KC441072 GATCCCCATGTCCCAGAACTGGGGCGCTAACTGGCAGTGCCTAGCGGGGCTGCAAGGACA 753
KC441068 GATCCCCATGTCCCAGAACTGGGGCGCTAACTGGCAGTGCCTAGCGGGGCTGCAAGGACA 753
AY543532.1 GATCACGATGTCCCAGAACTGGGGCGCTAACTGGCAGTGCCTAGCGGGGCTGAAAGGGCA 765
Clon_B10 GATCACGATGTCCCAGAACTGGGGCGCTAACTGGCAGTGCCTAGCGGGGCTGAAAGGGCA 765
KC441067 GATTCCGATGTCCCAGAACTGGGGCGCTAACTGGCAGTGCCTAGCGGGGCTGAAAGGGCA 765
KC441070 GATCACAATGTCCCAAAACTGGGGCGCTAACTGGCAGTGCCTAGCGGGCCTGAAAGGGCA 766
*** * ******** ** *************** ************* *** *** **
Clon_W87 AGCGCTTAGCTTCGCCATCACCTCCTCTGGAGGCCAGTACAAGGTGTCCCAGGACGTCGT 803
mTaEXPA6 AGCGCTTAGCTTCGCCATCACCTCCTCTGGAGGCCAGTACAAGGTGTTCCAGGACGTCGT 788
KC441071 AGCGCTCAGCTTCGCGATCACCTCCTCCGGTGGACAGTACAAGGTCTTCCAGGACGTCGT 804
KC441069 AGCGCTCAGCTTCGCGATCACCTCCTCCGGTGGACAGTACAAGGTCTTCCAGGACGTCGT 813
KC441072 AGCGCTCAGCTTCGCGATCACCTCCTCCGGTGGACAGTACAAGGTCTTCCAGGACGTCGT 813
KC441068 AGCGCTCAGCTTCGCGATCACCTCCTCCGGTGGACAGTACAAGGTCTTCCAGGACGTCGT 813
AY543532.1 GGCGCTCAGCTTCGGCATCACCTCCTCCGGCGGCCAGTACAAGGTCTTCCAGGACGTCGT 825
Clon_B10 GGCGCTCAGCTTCGGCATCACCTCCTCCGGCGGCCAGTACAAGGTCTTCCAGGACGTCGT 825
KC441067 GGCGCTCAGCTTCTCCATTACCTCCTCCGGCGGCCAGTACAAGGTCTTCCAGGACGTTGT 825
KC441070 GGCGCTCAGCTTCGCCATCACCTCCTCCGGCGGCCAGTACAAGGTCTTCCAGGACGTCGT 826
***** ****** ** ******** ** ** *********** * ********* **
Clon_W87 GCCGGCCTGGTGGTTGTTCGGACAGACGTTCTCCACCTGGCAACAGTTTGACTACTAGCT 863
mTaEXPA6 GCCGGCCTGGTGGTTGTTCGGACAGACGTTCTCCACCTGGCAACAGTTTGACTACTAGCT 848
KC441071 GCCGGCATGGTGGTTGTTCGGACAGACGTTCTCCACCTGGCAACAGTTCGACTACTAGCT 864
KC441069 GCCGGCGTGGTGGTTGTTCGGACAGACGTTCTCCACCTGGCAACAGTTCGACTACTAGCT 873
KC441072 GCCGGCGTGGTGGTTGTTCGGACAGACGTTCTCCACCTGGCAACAGTTCGACTACTAGCT 873
KC441068 GCCGGCGTGGTGGTTGTTCGGACAGACGTTCTCCACCTGGCAACAGTTCGACTACTAGCT 873
AY543532.1 GCCGGCCTGGTGGCTGTTCGGACAGACCTTCTCCACATGGCAACAGTTCGACTACTAGCT 885
Clon_B10 GCCGGCCTGGTGGCTGTTCGGACAGACCTTCTCCACATGGCAACAGTTCGACTACTAGCT 885
KC441067 GCCGGCCTGGTGGCTGTTCGGACAGACCTTCTCCACCTGGCAACAGTTCGACTACTAGCT 885
KC441070 GCCGGCCTGGTGGCTCTTCGGACAGACCTTCTCCACCTGGCAACAGTTCGACTACTAGCT 886
****** ****** * *********** ******** *********** ***********
Clon_W87 AGTATAAACATTGTACAATTTTTATTCCGATTA---TCAGTTCGCTTCATTCAGAGCGGA 920
mTaEXPA6 AGTATAAACATTGTACAATTTTTATTCCGATTA---TCAGTTCGCTTCATTCAGAGCGGA 905
76
KC441071 AGTATGAACATTGTACAATTTGTATTACGATTA---TCAGTTCGCTTCGTTCAGAGCGAA 921
KC441069 AGTATGAACATTGTACAATTTGTATTTCGATTA---TCAGTTCGCTTCATC-AGAGCGAA 929
KC441072 AGTATGAACATTGTACAATTTGTATTTCGATTA---TCAGTTCGCTTCATC-AGAGCGAA 929
KC441068 A---TAATATTTGTATAATTCGTATTACTACTACTATCAGTTCGCTTCGTTTAGGGCGAA 930
AY543532.1 A---TAACATTTCTATAATTTGTATTACTATTA---TCAGTTCGCT-CGCTCAGGGCGAA 938
Clon_B10 A---TAACATTTGTATAATTCGTATTACTACTACTATCAGTTCGCTTCGTTTAGGGCGAA 942
KC441067 A---TAATATTTGTATAATTCGTATTACTACTACTATCAGTTCGCTTCGTTTAGGGCGAA 942
KC441070 AC-GTACAATTTGTATTACCC-TACTATTATTA----CAGTTTGCTTCGTTCAGGGCGAA 940
* * ** ** * ** * * ** ***** *** * ** *** *
Clon_W87 CATGCATGAAACTCTCCAGACGC 943
mTaEXPA6 CATGCATGAAACTCTCCAGACGC 928
KC441071 CATGCATGAAACTCTCCAGACGC 944
KC441069 CATGCATGAAACTCTCCAGACGC 952
KC441072 CATGCATGAAACTCTCCAGACGC 952
KC441068 CATGCATGAAACTCTCCAGACGC 953
AY543532.1 CATGCATGAAACTCTCCAGACGC 961
Clon_B10 CATGCATGAAACTCTCCAGACGC 965
KC441067 CATGCATGAAACTCTCCAGACGC 965
KC441070 CATGCATGAAACTCTCCAGACGC 963
***********************