tesis con caracter abierto · 2017-12-04 · dedicatoria a esa imagen que ilumina mi vida: mi madre...

TESIS CON CARACTER ABIERTO

PROGRAMA: DOCTORADO EN TECNOLOGÍA DE POLÍMEROS

AUTOR: LIDIA ELIZABETH VERDUZCO GRAJEDA FIRMAe . t/4 ¿-y.

TITULO: Bioconjugación de Papaína y L-lactato deshidrogenasa con Poli (N-vinil-pirrolidona) Sintetizado vía Polimerización Radicálica Controlada! Viviente

ASESORES: Dr. Jorge Romero García FIRMA

Dr. Ramiro Guerrero Santos FIRMA

El Centro de Investigación en Química Aplicada clasifi documento de tesis como ABIERTO.

Un documento clasificado como Abierto se expone en los estantes del Centro de Información para su consulta. Dicho documento no puede ser copiado en ninguna modalidad sin autorización por escrito del Titular del

ii

Centro de Información o del Director General del CIQA.

Saltillo, Coahuila, a 16 de febrero de 2012 ClON

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LC) u o -

C1 ,ello de i1 Institución Dr.4anMedezNoneIl Director General del CIQA

DECLARACIÓN

Declaro que la información contenida en la Parte Experimental así como en la

Parte de Resultados y Discusiones de este documento y que forman parte de

las actividades de investigación y desarrollo realizadas durante el período que

se me asignó para llevar a cabo mi trabajo de tesis, será propiedad del Centro

de Investigación en Química Aplicada.

Saltillo, Coahuila a 16 de febrero de 2012

LIDIA ELIZABETH VERDUZCO GRAJEDA

Nombre y Firma

*

Centro de Investigación en Química Aplicada

Tesis

Bioconjugación de Papaína y L-lactato deshidrogenasa con Poli (vinilpirrolidona) Sintetizado vía Polimerización Radicálica

Controlada! Viviente

Presentada Por:

M.C. Lidia Elizabeth Verduzco Grajeda

Para obtener el grado de:

Doctor en Tecnología de Polímeros

Asesorada por:

Dr. Jorge Romero García

Dr. Ramiro Guerrero Santos

e,

Saltillo, Coahuila, Diciembre de 2012

CENTRO DE INVESTIGACIÓN EN QUÍMICA APLICADA Programa de Doctorado en Tecnología de Polímeros

TESIS

Bioconjugación de Papaína y L-lactato deshidrogenasa con Poli (N-vinil-pirrolidona) Sintetizado vía Polimerización Radicálica Controlada! Viviente

Presentada por:

LIDIA ELIZABETH VERDUZCO GRAJEDA

Para obtener el grado de:

Doctor en Tecnología de Polímeros

Asesorada por:

Dr. Jorge Romero García Dr. Ramiro Guerrero Santos

SINODALES

Dr. Alfredo ler.

orres Lubián lf

Dr. Antonio S. Ledezma Pérez Secretario

Dra. atalina e rumen 2do. Vocal

Dr. Eleazar Moreno Cortez 3er. Vocal

Saltillo, Coahuila

Febrero, 2012

Dedicatoria

A esa Imagen que ilumina mi vida: Mi madre

A la magia que reconstituye el alma y el espíritu: Mi Familia

Aún recuerdo el primer día cuando al llegar a CIQA, tropecé, comenzando ahí una odisea que

cambiaría mi forma de ver y entender la vida. Sin saber, personas maravillosas llegarían a cruzarse

en mi camino quedándose, y entre ese recorrido:

Pláticas y alegrías eternas, así como gratas sonrisas se volvieron parte fundamental de la rutina

diaria, tomar café, coca-cola y mantecadas por las mañanas en compañía de mis grandes amigos: El

orden leal (Hortensia), mis ojos favoritos (Judith), las polifonías de la gorda (Julia), la sonrisa

andante (Miguel), la simpatía presente (Aida), la amistad incondicional (Javier), los agradables

regaños (Dra. Graciela), el mate compartido (Gastón y Yamila), las eternas pláticas de todo (Dr.

Román), el ejemplo de vida (Claudia), mi hennanito guapo (Carlos), la fidelidad simbolizada

(Cristina), la lealtad errante (Isis), mi hermanita consentida (Karla), mi aliento incondicional

(Paola), la palabra concreta (Eddi), el arte de discutir con estilo (Ivan), mi compañera del alma

(Gaby), el consejo claro y sencillo (Tony), mi regalo favorito de cumpleaños, el pastel de flan (Dra

Ivana), las palabras cortas (Dr Eduardo), la sonrisa eterna (Arxel), mi Guru (Elisa), la claridad

personificada (Alondra), el ejemplo de valentía (Liz), la pelea divertida con amistad clara

(Enrique), la fortaleza encarnada (Isela), el rebelde con causa (Pedro), el eterno soñador (Marco

Guillen), las pláticas vespertinas (Florentino), y a todas aquellas personas que compartieron

conmigo horas y horas plenas dentro y fuera del laboratorio.

A todos y cada uno de ellos: Gracias

"La libertad está en ser dueños de la propia vida"

Agradecimientos

A los Doctores Jorge Romero y Ramiro Guerrero, por sus conocimientos compartidos

durante este de proyecto.

A mis sinodales. Dr. Antonio Ledezma, Dr. Román Torres, Dr. Alfredo Rosales, Dr. Iván

Moreno y la Dra. Catalina Pérez por sus comentarios y aportaciones durante la validación

de esta tesis.

A los técnicos que fueron parte fundamental del trabajo, en especial a la M. C. Gabriela

Padrón, ¡ng. Judith Cabello, M. C. Julieta Sánchez, Imelda Vargas García, Nancy Gpe.

Espinoza Pinales y a Silvia Torres por su apoyo incondicional durante todo el trayecto

recorrido para la elaboración de este trabajo.

A la Universidad Autónoma de Sonora en especial la Dra. Dora Rodríguez por su apoyo en

el análisis de dicroísmo circular, así como a todas las personas que fueron parte vital de éste

proyecto a través del tiempo

A CONACYT por el apoyo otorgado con el proyecto C13-2008-01, 103123, así como a la

beca terminal obtenida del mismo. Al mismo tiempo quiero agradecer al Centro de

Investigaciones en Química Aplicada (CIQA) por las instalaciones prestadas para la

realización de este trabajo.

Índice

Resumen

Introducción .1

Antecedentes .............................................. .. ...... .. ............................... ... ................................ . .... IlE

2.1.Síntesis de Polímeros .................................................................................................................... 1

2.1.1. Generalidades sobre la polimerización radicálica por desactivación reversible (RDRP) .......... 2

2.1 .2.Síntesis de polímeros mediante polimerización radicálica por desactivación reversible (RDRP)

................. 4

2.1.3. Polimerización radicálica por adición-fragmentación reversible con transferencia de cadena

(RAFT) .............................. .. .............. . ......................................... .. ........... ... . ............ . .... ............

2.1.4. Selección del agente RAFT ................. . ................... ................................................ . ................. 8

2.1.5. Agentes de transferencia del tipo tritiocarbonato .......................... . ........................................... 9

2.1.6. Agentes de transferencia del tipo Xantato... ........................ .... ................. .. ................. ... ..... . ... 10

2.1.7. Síntesis de polímeros mediante polimerización RAFT con grupos extremos terminales

funcionalizados....................................................................................................................... 11

2.2.Enzimas ...... ... ............................. ... ............ .. ....... . ........... . .................. . ..... . ................................... 15

2.2.1. Actividad Enzimática ................................. . ................... . ... ........................................ . ............ 16

2.2.2. Papaína (EC 3.4.22.2) ............................................................................................................. 17

2.2.3. L-lactato-deshidrogenasa (LDH) (EC 1.1.1.27)...................................................................... 18

2.3.Bioconjugación ........................................................................................................................... 19

2.3.1. Estrategias de Síntesis para el Diseño de Conjugados Polímero - Proteína ........................... 23

2.3.1.1. Bioconjugación vía injerto a ................................................................................................ 23

2.3.1.2. Bioconjugación "injerto a" vía a-terminal mediante enlace covalente ................................ 24

2.3.1.3. Bioconjugación "injerto a" vía a-terminal mediante enlace covalente ........... .. .......... .. ... .... 28

2.3.1.4. Bioconjugación "injerto a" vía a, o-terminal mediante enlace covalente ..... .. ..................... 29

2.3.1.5. Bioconjugación "injerto de" vía enlace covalente ... .. .................................. ... ..................... 30

2.3.1.6. Bioconjugación "injerto a través de" vía enlace covalente.. ................ . ................. . .... . ...... 30

3.Objetivos e Hipótesis .....................................................................................................................

Índice

3.1 Justificación................................................................................................................................. 32

3.2.Hipótesis .................. ... ...... . ..... .. ............... . .................. ... ............................ . .......................... ....... 33

3.3.Objetivo General ............................................................................... . ......................................... 34

3.4.Objetivos Particulares ................................................................................................................. 34

4.Parte Experimental .... .. ................... .. ............................. . .......................... . ............... .. .................. .. iv

4.1.Metodología ................................................................................................................................ 35

4.2.Materiales ... . ................. ... .... ... ..... . ........... . ........ . ........................................................ . ............. . ... 36

4.3.Análisis y equipos ....................................................................................................................... 36

4.3.1. Resonancia MagnéticaNuclear (RMN). .......... ... ................ ... ................. . ............................... 36

4.3.2. Espectroscopia de Infrarrojo por Transformada de Fourier (FTIR)..... ........... .. .......... . ........... 36

4.3.3. Espectroscopia de Ultravioleta-visible (UV-Vis) ......... . ...... . .... .. ................. . .................. . ........ 36

4.3.4. Cromatografia por Exclusión de Tamaños (SEC). La determinación de peso molecular (Mw)

e índice de polidispersidad (DI) de los ...... ... ......... ............................................ . ............... ..... 36

4.3.5. Espectroscopia de Fluorescencia ............ . ....................... ........ ...................... ........................... 36

4.3.6. Dicroísmo circular .............................. . ................. .. .............................................. .. ................. 36

4.3.7. Cromatografia Líquida de Alta Resolución (HPLC) ...................... . ........................................ 37

4.4.Smntesis de agentes RAFT ........................................................................................................... 39

4.4.1. Síntesis de agente de tipo iritiocarbonato 2([(butilsulfani1)-carbOflOtiOil] sulfanil) - ácido

propanóico(ATC-1) .............. .. ............ . ......... . ......... .. ..................... . ................ . ............. ... ... .... 39

4.4.2. Síntesis del agente RAFT de tipo Xantato ácido 4-(etoxicarbonotioiltio) metil benzoico

(ATC-2) ................. . ................ . ....... . ........ . ........................ . ...................... ..40

4.5. Síntesis de poli(N-vinil-pirrolidOna) mediante polimerización RAFT y su caracterización.. .... .40

4.5.1. Determinación de la presencia del grupo ácido carboxílico final en las cadenas de

PVPCOOH-1 mediante el marcaje con pirenmetilamina ............... . ............. .. ......................... 41

4.5.2. Análisis de la presencia del grupo ácido carboxílico final en PVPCOOH-1 mediante

Resonancia Magnética Nuclear de Protón ......................................................... 42

4.6. Aplicación de poli(N-vinil-pirrolidona) en la bioconjugación con enzimas. ......... . ................... 43

4.6.1. Bioconjugación de PVPCOOH-1 con papaína (Carica papaya) y su evaluación catalítica. .. 43

Índice

4.6.2. Activación del grupo ácido-terminal mediante el uso de ésteres activos de N-

hidroxisuccinimida(NHS). ........... . ................... . ......... . ...................... . ............. . .... . ................. 44

4.6.3. Determinación del grado de conjugación mediante el Ácido TrinitrobenceneSulfónico 45 (TNBS)....................................................................................................................................

4.6.4. Evaluación Catalítica del conjugado PVP-COOH—papaína (P-PVPC) y su comparación con la

enzima nativa ................. . .... . ............................................................. . ............. ........................ 45

4.6.5. Evaluación de la estabilidad y respuesta catalítica de P-PVPC y papaína libre a diferentes

temperaturas.................................... ... ........ . ................. . .............. .. .......................................... 46

4.6.6. Determinación de las constantes cinéticas de Michaeles-Menten (1(m) y Velocidad máxima

de reacción (Vmax) para P-PVPC y papaína libre ......... . ...................................................... 46

4.6.7. Evaluación de la estabilidad y su respuesta catalítica de P-PVPC y papaína libre a diferente

pH... ................. .. .............................................. .. ............ . ................. . ....................................... 47

4.6.8. Evaluación de la respuesta catalítica de P-PVPC y papaína libre a metales presentes en el

medio ...................................................................................................................................... 47

4.6.9. Evaluación de la estabilidad de P-PVPC y papaína libre a 37°C y 40°C... ............................. 47

4.6.10. Bio conjugación de PVP COOH-2 con lactato deshidrogenasa de músculo de conejo

(Oryctolagus cuniculus) .......................................................................................................... 48

4.6.11. Evaluación Catalítica del conjugado L-PVPC y su comparación con la enzima nativa ......48

5 Resultados y Discusión .......................................................... . ............ . ........................................... V

5.1 Polimerización R.AFT de poli(N-vinil-pirrolidOna) con un ácido carboxílico terminal.

Utilización de agentes de tipo tritiocarbonato (ATC-1) y Xantato (ATC-2) ... .. .................... 50

5.1.1. Polimerización vía radicales libres en masa de N-vinil-pirrolidOna (NVP) empleando ATC-1. ...................................... ..

50

5.1.1.1. Caracterización de poli (vinilpirrolidofla) (PVPCOOH-l).. ............ . ........ .... ............. 50

5.1.2. Análisis de grupo ácido carboxílico terminal..........................................................................

5.1.2.1. Marcaje de poli (N-vinil-pirrolidona) (PVPCOOH-1) utilizando pirenmetilamina para la

detección espectroscópica del grupo ácido terminal ............ ..................... . ................... .......... 56

5.1.2.2. Análisis de grupo acido carboxílico terminal mediante esterificación del grupo ácido

presenteen PVPCOOH-1 .......................................................................................................

Índice

5.1.3 Polimerización vía radicales libres en masa de N-vinil-pirrolidona (NVP) empleando ácido 4-

(etoxicarbonotioiltio) metil benzoico (ATC-2).... ................................ .. ................................. 61

5.2. Bioconjugación de N-vinil-pirrolidona ácido terminal sintetizado mediante ATC-1

(PVPCOOH-1) a la enzima papaína (Carica papaya) .................... . ........................................ 67

5.2.l.Determinación del peso molecular de P-PVPC mediante Exclusión de Tamaños utilizando

Cromatografía Liquida de Alta Resolución (HPLC). .......... .... ................................ ... ... ... ...... 69

5.2.2. Análisis conformacional de P-PVPC mediante Dicroísmo Circular Ultravioleta lejano (Far-

UV-CD). ................. ......................... . .................................. . ................... .... .............. ........ . ..... 71

5.2.3. Evaluación Catalítica del conjugado PVPC - papaína (P-PVPC) y su comparación con la

enzimanativa........ ........................ . .................. ... ......... .... ............... .. ........................ . ............. 73

5.2.3.1. Determinación de las constantes cinéticas de Michaeles- Menten (Km) y Velocidad

máxima de reacción (V máx) de P-PVPC y papaína nativa ..................... .. ................. 73

5.2.3.2. Evaluación de la estabilidad y su respuesta catalítica de P-PVPC y papaína libre a diferentes

temperaturas....................... . .............. . ............................ . .......................... 74

5.2.3.3. Evaluación de la estabilidad y su respuesta catalítica de P-PVPC y papaína libre a diferentes

pH....................................... . ............................................. .. ................... 76

5.2.3.4. Evaluación de la respuesta catalítica de P-PVPC y papaína libre a iones metálicos presentes

enel medio....... ........................ .............. .. .......................... ........................ 77

5.2.3.5. Evaluación de la estabilidad en solución de P-PVPC y papaína libre...........................79

5.3. Bioconjugación de N-vinil-pirrolidona ácido terminal sintetizado mediante ATC-2

(PVPCOOH-l) a la enzima L-lactato deshidrogenasa de musculo de conejo (Orictoraculus

cuniculus). ............ . ......... ............................. .. ........... . .......................... .... ......... ....................... 81

5.3.1. Análisis de la bioconjugación de PVPC00H-2 a LDH .... ............. .. ....................................... 81

5.3.2. Caracterización de L-PVPC obtenido mediante técnicas espectroscópicas. .... ...................... 82

5.3.3. Determinación del peso molecular de L-PVPC mediante Exclusión de Tamaños utilizando

Cromatografía Liquida de Alta Resolución (HPLC). ....... . ............. . ....................................... 84

5.3.4. Determinación de la actividad catalítica de L-PVPC y enzima libre en presencia de NADH y

NAD+ ......... .. ................................ ......................................... .... ...................................... . ....... 86

5.3.5. Evaluación enzimática a diferentes temperaturas y pH para LDH y L-PVPC.......................90

5.3.6. Determinación de las constantes cinéticas Km y Vmáx para LDH libre y L-PVPC...............90

Índice

5.3.7. Estabilidad en solución de L-PVPC y LDH libre.. .................................................................. 90

Conclusiones.......................................... ........................................................................................... VI

Anexos......................... .. ................. . ............. . ............. .................. ... ............... VII

Referencias................................... .. ............. . .............. .. .................................. VIII

Índice

Índice de Figuras

Figura 2-1 Comportamiento esperado en una polimerización viviente, a) Concentración constante de

especies propagantes, b) número de cadenas constantes ..... .. ...................... . ............ .... ....................... 3

Figura 2-2. Mecanismo de reacción para la polimerización radicálica por transferencia de átomo

(ATRP) ................. ............................ . .......................................... .. ... ................ 5

Figura 2-3. Ejemplos de los distintos tipos de agentes RAFT...... ............ ...... . ..................... 8

Figura 2-4. Estructura química del N-vinil - pirrolidona y su homopolímero poli (N-vinil-

pirrolidona) ....... .. ... ...................................... . ........... ................... ... ................... 12

- Figura 2-5. Estructuras de los diferentes agentes MADIX utilizados en la polimerización de

NVP...... .. ............................................................. .... ... . ............ .. .............. . ..... 13

Figura 2-6. Estructuras de agentes RAFT de tipo tritiocarbonato utilizados en la polimerización de

NVP...................... . ..................................................... .... ............................ ...14

Figura 2-7. Principales estructuras encontradas en las proteínas ..... . ... ........... ... ......... . ....... 16

Figura 2-8, Estructura tridimensional y mecanismo de reacción de la papaína Carica papaya).....18

Figura 2-9. Estructura tridimensional y mecanismo de reacción de la L-lactato deshidrogenasa

(Oiyctolagus cuniculus) ........... ................ . ............................... .... ......... . ............... 19

Figura 2-10. Medios de conjugación i) vía enlace no covalente y u) Vía enlace covalente..........21

Figura 2-11. Esquema representativo del uso de glicopolímeros en conjugación ............................22

Figura 2-12. Selección del sitio o multi-sitios de conjugación. . .................... . .................... 23

Figura 2-13. Estrategia de bioconjugación utilizada en injerto a......................................................24

Figura 2-14. Reacción simplificada de amidación utilizando carbodiimidas .................................... 25

Figura 2-15. Bioconjugación de polímeros a- terminal mediante enlace covalente .........................26

Figura 2-16. Reacción de reducción de tiocarbonil-tio, a) vía aminolisis y b) vía termólisis...... ..... 27

Figura 2-17. Reacción de cuantificación de grupos tiol mediante la técnica de Eliman (arriba) y

funcionalización de polímeros conteniendo grupos tiol terminal con nanopartículas (abajo) . ....... 27

Figura 2-18. Ruta de síntesis en la obtención de o-aldehido terminal ................................. ............. 28

Figura 2-19. Síntesis de polímeros heterotelequélicos para bioconjugación a, co-terminal .............. 29

Figura 2-20. Estrategia de bioconjugación utilizada en injerto de ...... .. ............................................ 30

Figura 2-21. Ruta de síntesis de conjugado BSA-pHEMA a través del residuo cisteína .................31

Índice

Figura 2-22. Bioconjugación en fase sólida en superficies (izquierda) y nanopartículas (derecha) . 31

Figura 4-1 Curva de calibración de proteínas mediante SEC-HPLC ................................................38

Figura 4-2. Marcaje de PVPCOOH-1 utilizando pirenmetilamina. a) Reacción de neutralización del

Pirenmetilamina hidrocloruro, b) reacción de derivatización de PVPCOOH mediante PyMeNH2. 42

Figura 4-3. Reacción de esterificación de PVPCOOH con alcohol bencílico en presencia de

DMAP!EDC. concentración molar en relación al peso molecular del ácido. ...... ............................. 43

Figura 4-4. Reacción de bioconjugación llevada a cabo entre PVPCOOH-1 y la enzima papaína.. 43

Figura 4-5 Reacción del ácido trinilrobencensulfónico en presencia de grupos aminos libres.........45

Figura 4-6. Reacción catalítica de la papaína en presencia de N-benzoil-p-nitroanilida (BAPA) .... 46

Figura 4-7. Reacción de bioconjugación de PVPCOOH-2 con L-lactato deshidrogenasa ...............48

Figura 4-8. Reacción química reversible catalizada por la enzima L-lactato deshidrogenasa (LDH)

en presencia de NAD+ y piruvato .... . ......................... . .......... . .................. .. ........... ... .......... .. ............. 49

Figura 5-1. Esquema de reacción de la polimerización de NVP utilizando ATC-1..........................51

Figura 5-2. Espectro de 1H RMN para PVPCOOH-1 en CDC13 a 300 MHz... ........... ---- ................. 51

Figura 5-3. Espectro de FTIR-ATR para PVPCOOH-1 .................... . ................. .. ........................... 52

Figura 5-4. Grafica de Peso molecular y PDI contra conversión de NVP con AIBN a 60°C en

presenciade ATC-1 .................. --- ................................................................................. .... ................. 54

Figura 5-5. Cromatografía de permeasión en gel de PVPCOOH-1 en DMF con estándares de

PMMAa 40°C ... . ........................... .. ..................................... . ............. . ...... ... ........ . ............................ 55

Figura 5-6. Espectro UV-visible (izquierda) de PVPCOOH-1 antes y después de la derivatización

con PyMeNH2, y el espectro de fluorescencia (derecha) para PyPVPCOOH-1 y PyMeNH2 libre,

excitados a X 340 nm a una concentración 0.2 mg/mL en solvente metanol ....................................57

Figura 5-7. Imagen obtenida de una solución de PyPVPCOOH-1 al ser excitado con una

- lámpara de Uy-visible a 340 nm y su comparación con PVPCOOH-1 sin modificar..................58

Figura 5-8. Espectro RMN 'H obtenido para PVPCOOH-1 esterificado con alcohol bencílico en

CDC13 a300MHz ............................................................................................................................ 60

Figura 5-9. Reacción de polimerización de NVP utilizando ACT-2, en masa a 60°C y relación

molar de 300/2/0.4 (NVP/ACT-2/AIBN) ....... .. ................ .... ...................... .. ...... ... .............. ............. 61

* Figura 5-10. Espectro de lH RMN para PVPCOOH-2 obtenido en CDC13 a 300 MHz.

Perteneciente a PVPCOOH-2, 24h a 60°C.. ... .. ................. . .................... .... ....................... . ............... 67

Figura 5-11. Comportamiento de la polimerización de NVP iniciada con AIBN a 60°C en

presenciade ATC-2 ............................. ...................... . ............ . ......................... . ............... .. ............... 63

Figura 5-12. Gráfica de peso molecular y PDI contra conversión de NVP iniciada con AIBN a 60°C en

presenciade ATC-2... ........................................ . ...................... . .......................... 65

Índice

Figura 5-13. Cromatografia de permeasión en gel para PVPCOOH-2 en DMF a 40°C y 1 mg/mL. 66

Figura 5-14. Espectro FTIR-ATR de polímeros de PVP y bioconjugados de PVP-papaína. a)

PVPCOOH-1, b) PVPCOOH-NHS, c) papaína libre y d) P-PVPC. ..................... ... ................ . ........ 68

Figura 5-15. Análisis de HPLC-SEC para P-PVPC y papaína libre. Comatograma completo (a) y

acercamiento de los cromatogramas (b)............................................................................................ 70

Figura 5-16 Obtención del peso molecular de P-PVPC mediante HPLC-SEC ....................... ..70

Figura 5-17. Espectro de Dicroísmo circular experimental (izquierda) y calculado mediante

SELCON (derecha) obtenido para papaína libre, PVPCOOH y P-PVPC.... ........ . ............................ 72

Figura 5-18. Efecto de la temperatura en la velocidad de actividad enzimática. Concentración de

BAPA 5 mM, con un tiempo de 30 mm... ................... .. ............. . ....... . ....... . ........... . ..... . .................... 75

Figura 5-19. Grafica representativa del cálculo de la energía de activación (SG) para ambos

sistemas............................................................................................................................................ 76

Figura 5-20. Respuesta al pH en la actividad enzimática de a) P-PVPC y b) enzima libre ............. 77

Figura 5-2 1. Inhibición de la actividad catalítica de Papaína y P-PVPC en presencia de iones

metálicos........................................................................................................................................... 78

Figura 5-22. Evaluación de la estabilidad en solución de P-PVPC y papaína libre a 37°C y 40°C 79

Figura 5-23. Espectro de FT]IR-ATR para PVPCOOH-2 (a), PVPCOOH-NHS (b) y L-PVPC (c) 82

Figura 5-24. Espectro de UV-Vis para LDH libre, PVPCOOH-2 y L-PVPC .......... . ....... ... ........... ... 83

Figura 5-25. Cromatograma de HPLC-SEC para LDH libre y L-PVPC .......................................... 85

Figura 5-26. Detenmnación del peso molecular (Mw) de L-PVPC mediante SEC-HPLC .............. 85

Figura 5-27. Respuesta de LDH y L-PVPC a la presencia de NADH a diferentes temperaturas ..... 87

Figura 5-28. Respuesta de LDH libre a ambos sustratos (concentración de 6.6 mM piruvato y

30 mM de lactato) ............................................................................................................................. 88

Figura 5-29. Comportamiento cinético de LDH (en presencia de NADH y piruvato) y L-PVPC

(en presencia de NAD y lactato) a diferentes concentraciones de sustrato y 25°C .......................... 89

Figura 5-30. Estabilidad en solución de LDH libre, PVPCOOH-2 y L-PVPC a 32°C durante 30

días en buffer Tris-HC1 pH 7.5., a) 1 semana, b) 2 semana, c) 3 semana, d) 4 semana . ................... 90

Figura 5-3 1. Posible conformación adoptada por L-PVPC en solución . .............. . .................. . ..... ... 91

Índice

Índice de Tablas

Tabla 4-1. Relación de enzimas utilizadas en la curva de calibración... ............. . .... .......... . ........... 38

Tabla 5-1. Pesos moleculares y polidispersidad obtenidas para PVPCOOH-1, polimerizado en masa en la

presencia de ATC-1 y AIBN a 60°C..... ............................................................................ 53

Tabla 5-2. Relación de pesos moleculares obtenidos en la polimerización de NVP utilizando ATC-2 en

masa a 60°C e iniciada mediante AIBN ...........................................................................62

Índice de Esquemas

Esquema 2-1. Mecanismo general de una RDRP .................................................................. .... .................... 2

Esquema 2-2. Mecanismo de la polimerización radicálica por transferencia de cadena por adición-

fragmentación(RAFT) .... .... ....... . .............. . ............. . ............................ ......................................................... 7

Esquema 4-1. Secuencia de experimentos realizados para llegar al objetivo de esta tesis......................35

Resumen

Resumen

La bioconjugación de moléculas biológicamente activas como las enzimas a superficies o sistemas

acarreadores ha resultado ser una técnica útil en una amplia variedad de usos tanto en sistemas

médicos como industriales y del medio ambiente. Aplicaciones tales como la detección o análisis a

metales en aguas residuales, liberación controlada de fármacos en el torrente sanguíneo o la

búsqueda constante del incremento de la estabilidad en solución del medio biológico a diversas

condiciones de temperatura y pH son sólo algunas de las más importantes.

El uso de polímeros hidrosolubles en bioconjugación ofrece ventajas gracias a la diversidad de

propiedades que pueden ser obtenidas a través de un rango de polímeros con diferentes estructuras y

funcionalidades, así como características definidas que incluyen biocompatibilidad, alta solubilidad,

entre otras.

De manera particular el polímero hidrosoluble poli (vinilpirrolidona) (PVP) ha llamado la atención

- en aplicaciones médicas, esto debido a sus propiedades únicas, tales como, alta solubilidad en agua

y en solventes orgánicos, es no iónico, no tóxico, y ha sido utilizado como sustituto de plasma,

acarreador macromolecular de fármacos, y bioconjugación.

Las técnicas para la obtención de polímeros como el PVP, han incursionado en bioconjugación,

gracias a la factibilidad de otorgar un grupo funcional final, lateral o en ambos extremos de una

cadena polimérica. Tal es el caso de la polimerización radicálica controladalviviente (PRC/V)

también conocida como RDRP (radical desactivation reversible polimerization), la cual engloba

técnicas conocidas como Polimerización radicálica por adición-fragmentación reversible con

transferencia de cadena (RAFT) y Diseño Macromolecular por Intercambios de xantatos (MADIX)

entre otras, las cuales precisan de control sobre el peso molecular así como el índice de

polidispersidad a los polímeros obtenidos, facilitando la selección y conjugación con grupos

definidos presentes en las enzimas.

Por tanto en este trabajo, se propone el uso de las técnicas de RAFT y MADIX para la síntesis de la

poli (vinilpirrolidona) funcionalizada con un grupo activo y su bioconjugación con enzimas modelo

como la papaína y la lactato deshidrogenasa para la obtención de bioconjugados con características

sinérgicas y su evaluación en parámetros como presencia de metales en el medio, estabilidad en

solución y estabilidad a diversas temperaturas y pH.

Res um en

Los resultados obtenidos para papaína demuestran que la conjugación con PVP le otorgó un

incremento en su respuesta catalítica tanto en temperaturas como en el pH, superior a las

presentadas por la enzima nativa, de igual manera, la estabilidad en solución durante 25 días,

demuestra que la conjugación con PVP es una ruta viable en la bioconjugación con esta enzima.

Por el contrario para el caso de lactato deshidrogenasa los resultados obtenidos de respuesta

catalítica demostraron una inherente inestabilidad del bioconjugado, sin embargo estudios

posteriores demuestran que la conjugación es efectiva, logrando con esto incursionar en la

bioconjugación de polímeros como el PVP con dicha enzima, la cual debido a su estructura de gran

tamaño disminuye la capacidad de seleccionar y actuar de manera específica en su bioconjugación

con este u otro medios.

Introducción Capítulo 1

1. Introduccion


Durante las últimas décadas, la síntesis de polímeros mediante polimerización radicálica controlada

viviente (PRC/V), entre las que se incluye la polimerización radicálica por adición-fragmentación

(RAFT) y la polimerización radicálica por transferencia de átomo (ATRP), entre otras, han facilitado la

obtención de estructuras poliméricas con nuevas arquitecturas, ampliando así el espectro de sus

aplicaciones en diferentes áreas del conocimiento. En particular, la unión covalente de estos polímeros

(funcionalizados con grupos reactivos, tales como NH2, COOH, SH, etc. en su estructura) con moléculas

de origen biológico, principalmente biomacromoléculas (proteínas, ADN, ARN, polisacáridos, etc.,) es un

tema de investigación que ha atraído la atención de un buen número de grupos de investigación alrededor

del mundo. Este tipo de macromoléculas son conocidas como bioconjugados, biomacromoléculas híbridas

o quimeras.

La síntesis de proteína-polímero (bioconjugados) tiene como propósito resaltar y aprovechar las

propiedades intrínsecas, funciones y ventajas de ambos componentes, naturales y sintéticos. Idealmente,

tales moléculas biohíbridas deben minimizar las limitaciones de sus componentes al expresar sus

características de forma sinérgica y mediante la adquisición de nuevas propiedades que predominarían en

complejidad a sus contrapartes individuales. En la síntesis de bioconjugados, la polimerización mediante

la técnica conocida como grafting to o injerto a es preferida sobre otras, esto debido a la posibilidad de

conferir en el extremo terminal de la cadena del polímero un grupo funcional, con la capacidad de

reaccionar con los grupos funcionales presentes en moléculas biológicas.

En las últimas décadas se han sintetizado bioconjugados de polímero-proteína, esencialmente a través

del acoplamiento al azar con el componente biológico, utilizando uno o varias matrices poliméricas. Los

resultados más destacados se ubican en el área terapéutica, en donde la unión covalente de un extremo del

polímero a una proteína o fármaco, en muchas ocasiones ha dado como resultado una mayor

estabilización de la molécula así como mejora en su actividad biológica e inclusive alcanzar una

aplicación práctica. En el caso de las enzimas la bioconjugación busca mejorar la actividad catalítica,

aumentar la solubilidad y estabilidad de estas moléculas en soluciones acuosas o mezclas de solventes

orgánicos con agua, así como evitar la inhibición por sustrato, u otro inhibidores como metales pesados,

además de ampliar la estabilidad a condiciones ambientales como pH y temperatura.

Dentro de las más importantes enzimas con diversas aplicaciones se encuentran las del tipo proteasa,

cuya capacidad de romper enlaces peptídicos las hace versátiles y ampliamente utilizadas. Entre las

proteasa con mayor uso se encuentra la papaína (Carica papaya E.C. 3.4.22.2) la cual, consta de una

cadena simple de péptidos formada por 211 aminoácidos residuales y cuya aplicación se extiende a la

industria alimenticia, farmacéutica, cosmética y textil. Por otro lado tenemos las oxidoreductasas, las


cuales llevan a cabo reacciones de óxido-reducción dentro del sistema celular. Dentro de las más

importantes se conoce a la D-lactato deshidrogenasa (LDH), ésta enzima consta de 4 unidades

monoméricas, constituidas por 334 aminoácidos residuales cada una, formando un complejo globular de

gran tamaño y estabilidad. Cada subunidad contiene un centro activo, y su principal aplicación se sitúa en

la ciencia médica. Primordialmente en la detección de lactato en sangre, donde, elevados niveles de este,

pueden ser indicadores de diversas enfermedades, entre las que se incluyen patologías cardiovasculares y

acidosis láctica, entre otras.

En años recientes los sistemas bioconjugados utilizando poliméricos han constituido una alternativa al

desarrollo del área de inmovilización de enzimas. Es el caso de enzimas como la papaína y la LDH, los

materiales mesoporosos como la silica o polímeros modificados superficialmente como poli(etilen-glicol),

membranas de poli(éter sulfona), polímeros epóxicos, entre otros, los cuales han sido utilizados en el área

de inmovilización de enzimas. La búsqueda constante por mantener la eficiencia de la actividad

enzimática, tiempo de almacenamiento, susceptibilidad a cambios externos, recuperación después de su

uso y una rápida difusión del sustrato hacia la enzima. Uno de los polímeros utilizados en bioconjugación

de enzimas y que promete ampliar sus estudios es el conocido como poli-(vinil-pirrolidona) (PVP), el cual

fue el primer polímero aplicado como una alternativa al uso de poli (etilen-glicol). Sin embargo, su

investigación se vio limitada por la complejidad de su polimerización. Por otro lado el uso de las técnicas

de RAFT y MADIX han facilitado la síntesis de esté polímero con características definidas como peso

molecular, índice de polidispersidad y funcionalidad.

En este trabajo se propone la síntesis del polímero de tipo hidrosoluble denominado poli (N-vinil-

pirrolidona) ácido terminal (PVPCOOH), obtenido a partir de las técnicas de polimerización

RAFT/MADIX, con el propósito de llevar a cabo su bioconjugación con las enzimas papaína y D-lactato-

deshidrogenasa, mediante la técnica de grafting to también conocida como injerto a. Así mismo se

propone la evaluación de propiedades del bioconjugado tales como su estabilidad en solución, respuesta

catalítica y la actividad enzimática en comparación a su forma nativa. Los resultados demuestran la

habilidad de los bioconjugados obtenidos de papaína (Papaína-poli (vinilpirrolidona) conjugado (P-

PVPC)) y lactato deshidrogena (Lactato- poli (vinilpirrolidona) conjugado (L-PVPC)), para incrementar

de manera favorable su respuesta a las propiedades evaluadas, abriendo una alternativa de investigación

en la síntesis de este tipo de compuestos.

Antecedentes Capítulo 2

2. Antecedentes


2.1. Síntesis de Polímeros

La ciencia de los polímeros ha experimentado una evolución constante desde los años 50's hasta

nuestras días, esto gracias al desarrollo de técnicas modernas y multidisciplinarias en el campo de la

investigación de los materiales, lo que ha dado como resultado un avance sin precedentes en el área de la

síntesis de polímeros. A partir de los años 70's la conjunción de la ciencia de polímeros con otras

disciplinas de las ciencias de los materiales y biomédicas ha permitido el desarrollo de diversas

aplicaciones estructurales a nivel tecnológico, médico y biológico. Específicamente en el área biológica,

la síntesis de estructuras supramoleculares de carácter polimérico representa una de las aplicaciones más

prolíferas dentro del conocimiento de los polímeros. Estos estudios pioneros catalizaron el desarrollo de

la polimerización radicálica por desactivación reversible (RDRP por sus siglas en inglés) o

polimerización radicálica controlada viviente (PRC/V) trayendo consigo un importante avance en el

desarrollo de nuevas arquitecturas poliméricas con una alta definición, dificil de obtener por otras técnicas

convencionales de polimerización 111

La RDRP emergió como una ruta alterna a la polimerización jónica viviente para la obtención de

polímeros con propiedades altamente definidas en cuanto a pesos moleculares predeterminados (Mn) e

índices estrechos de polidispersidad (PDI). En forma análoga a la polimerización vía radicales libres

convencional (PRC), la RDRP se puede llevar a cabo en distintos medios de reacción (solución, masa,

dispersión, emulsión, miniemulsión, etc.) 111, dificil de conseguir en una polimerización de tipo iónica. En

contraste con la PRC, la RDRP surgió con la finalidad de mantener un carácter viviente en las cadenas

poliméricas, es decir minimizar considerablemente las reacciones de terminación o de transferencia

propias de una PRC y mantener la capacidad de continuar el crecimiento de las cadenas en una segunda

etapa, proporcionando con esto un control en el peso molecular y en la distribución de éste [2] Aunado a

la posibilidad de generar funcionalidades definidas en las cadenas terminales del polímero sintetizado.

En la actualidad, los polímeros sintéticos forman parte esencial de numerosos y variados productos de uso

cotidiano y también de especialidades. Estas aplicaciones se ven reflejadas en áreas como la electrónica,

óptica, biomédicas, automotriz, aeronáutica, etc [3]• De manera particular, el desarrollo de los polímeros

sintéticos en el área biomédica, se inició fundamentalmente en el plano terapéutico, debido a la necesidad

de incrementar el tiempo de la bioactividad de un determinado fármaco, y al mismo tiempo disminuir la

proteólisis provocada por enzimas y así su eliminación del fármaco en el sistema renal, lo cual se ha

conseguido utilizando polímeros de bajo peso molecular (20,000 g/mol) [4]• De ésta manera la RDRP

ofrece diversas rutas viables para el diseño de nuevos polímeros, las cuales incluyen; diversas condiciones

de reacción, amplia gama de monómeros, control en la longitud de cadena, y funcionalidades a los

1


extremos de las mismas, todo ello aplicable en la unión con diferentes biomacromoléculas en donde la

bioconjugación depende principalmente de la estrategia de RDRP utilizada [5]

2.1.1. Generalidades sobre la polimerización radicálica por desactivación reversible

• (RDRP)

Las diferentes técnicas de RDRP, en general están regidas por un mecanismo de transferencia

degenerativa y otras por terminación reversible. Los ejemplos del primer tipo son la polimerización

radicálica viviente por transferencia degenerativa de electrón (SET-DTLRP) [6], Polimerización Radicálica

por Transferencia de Jodo (RJTP) , Polimerización Radicálica por Adición-Fragmentación (RAFT) y

Diseño Macromolecular por Intercambio de xantatos (MADIX). Las del segundo tipo, incluyen la

polimerización mediada por un radical estable o Polimerización Mediada por Nitróxidos (NMP), y la

polimerización mediada por metales, entre las cuales se incluye la Polimerización Radicálica por

Transferencia de Átomo (ATRP) y polimerización radicálica viviente por transferencia de electrón (SET-

LRP) [8]•

El principio de todas estas estrategias de RDRP es lograr el incremento del tiempo de vida de un

radical propagante vía el establecimiento de un equilibrio reversible entre las especies propagantes (P) y

las especies durmientes (P-X) (Esquema 1-1). Este equilibrio se ve fuertemente desplazado hacia las

especies durmientes disminuyendo significativamente la concentración instantánea de los radicales en

propagación y minimizando reacciones de transferencia y terminación irreversibles entre cadenas [9]

PrwX PIWTj + Monómero

Esquema 2-1. Mecanismo general de una RDRP.

Un sistema ideal de polimerización controlada/viviente debe presentar las siguientes características 1101:

a) La concentración de especies activas (propagantes) se mantiene constante a lo largo de la

polimerización, debido a la gran disminución de los eventos de terminación. Consecuentemente, la

evolución de la gráfica de conversión expresada como ln con el tiempo de reacción (Ecuación 1) es

lineal cuando la concentración de radicales en propagación es constante.

2


La desviación de este comportamiento tiene dos interpretaciones; una curva cóncava significa que la

iniciación es lenta mientras que una curva convexa indica que ocurren reacciones de terminación

irreversible (Figura 2-1)

1n = k[P]t

Ecuación 1

Tiempo Conversión

Figura 2-1 Comportamiento esperado en una polimerización viviente, a) Concentración constante de

especies propagantes, b) número de cadenas constantes 101

b) El grado de polimerización (X) presenta un incremento lineal con respecto a la conversión de

monómero (p) (Ecuación 2). Esto indica un número de cadenas constante a lo largo de la polimerización,

donde un M inferior al comportamiento lineal indica reacciones de transferencias no deseadas, mientras

de forma contraria un M superior revela una ineficiencia del iniciador en la generación de radicales o

reacciones de acoplamiento (ver Figura 2-ib).

Ecuación 2

c) El índice de polidispersidad (PDIMw/Mn) es inferior a 1.5 en reacciones controladas. En una reacción

de polimerización el PDI está íntimamente ligado a la velocidad de iniciación, generalmente en una

iniciación lenta el PDI disminuye conforme avanza la conversión de monómero (Ecuación 3). Un

Donde t= tiempo de polimerización, [M]o y [M] representan la concentración de monómero inicial y al tiempo 1 , k,, = constante de polimerización y [P]= concentración de especies activas.

[ho = concentración inicial del agente de control

3


incremento en el valor de PDI significa que ocurren reacciones de terminación a lo largo de la

polimerización.

M

1 + 1/X Ecuación 3

d) Las cadenas deben presentar un alto porcentaje de funcionalización en los extremos, y estos a su vez

deben ser activas en reacciones subsecuentes. Es decir, las cadenas funcionalizadas tienen la capacidad de

reiniciar la polimerización en una segunda etapa con el mismo monómero (extensión de cadena) o con

otro distinto para formar copolímeros en bloques.

Una polimerización de tipo RDRP puede no cumplir estrictamente con los criterios descritos

anteriormente y aun así considerarse como controlada/viviente. Esto depende de la proporción de cadenas

- inactivas que se generen durante la polimerización (7,8,9, 101

2.1.2. Síntesis de polímeros mediante polimerización radicálica por desactivación

reversible (RDRP)

ATRP y RAFT son las estrategias de polimerización más utilizadas en el área de síntesis de

polímeros con aplicaciones biológicas, esto, debido a su amplia diversidad de grupos químicos

compatibles y condiciones de reacción, que incluyen temperatura, solventes, entre otros y que facilitan su

- uso sobre una amplia gama de monómeros de tipo vinílicos como estireno, N-vinil-pirrolidona, entre

otros.

La polimerización ATRP fue desarrollada independientemente por Matyjaszewski/Wang y Kato "° como

una extensión de la adición radicálica por transferencia de átomo (ATRA) conocida como reacción de

Kharasch en la que mezclas equimolares de compuestos halogenados y alquenos reaccionan

catalíticamente para formar aductos de manera quasi-cuantitativa. En ATRP el mecanismo (Figura 2-2) se

basa en un sistema redox entre un halogenuro de alquilo (RX) y un complejo metálico (MY/L) con una

relación molar alqueno/RX muy superior a la relación estequiometrica. La reacción incluye la transferencia

del halógeno hacia el complejo metálico generando un radical R., iniciándose así la adición al doble

enlace del monómero. El radical resultante oxida al nuevo complejo metálico X-M,1Y/L para regenerar

el enlace C-halógeno y para regenerar el complejo metálico original.

El equilibrio se desplaza hacia las especies inactivas producido por un alto estado de oxidación en el

catalizador, generado por un grado de acoplamientos radical-radical durante las etapas iniciales de la

§ Donde Mw es el peso molecular en masa, Mn es el peso molecular en número yXn es el grado de polimerización

rI


polimerización. La ATRP se ha utilizado en la polimerización con monómeros comunes, estírenos,

metacrilatos, metil-acrilamidas y acrilonítrilo. Además de otros monómeros que contienen grupos

reactivos o altamente lábiles (epóxidos, lactonas o dienos), los cuales pueden ser polimerizados por ésta

técnica. La velocidad de activación y desactivación (ka y kd) de cada monómero en combinación con la

velocidad de propagación (ko) determinan la velocidad de polimerización. Los iniciadores son

halogenuros de alquilo (X=Br o Ci) en los que R debe permitir la estabilización del radical formado. Los

catalizadores están compuestos por un metal de transición (cobre, níquel, rutenio, paladio, etc.) y un

átomo de bromo o cloro principalmente. Este tipo de catalizadores son susceptibles de sufrir oxidación

durante el proceso de polimerización [9,10,11]

R-Br + CuBr(L) R + CuBr2(L) Kd

R-Mn-Br + CuBr(L) RM

CuBr2(L)

Figura 2-2. Mecanismo de reacción para la polimerización radicálica por transferencia de átomo (ATRP)

La síntesis por ATRP de varios polímeros hidrosolubles o amfifilos para aplicaciones en biomedicina y

biotecnología [11] ha sido posible. Recientemente, la combinación de la ATRP con otras técnicas de

polimerización como RAFT, se ha convertido una alternativa viable en el diseño de nuevos copolímeros

con arquitecturas bien definidas. La polimerización ATRP, además permite la post-modificación en la

funcionalidad a, co mediante diversas rutas 1121, lo que hace de ATRP una plataforma promisoria y versátil.

Sin embargo ATRP presenta limitaciones importantes. Por ejemplo, algunos monómeros o iniciadores

con grupos funcionales como ácidos carboxílicos y ciertos grupos jónicos no pueden ser utilizados,

debido a que de alguna forma limitan la catálisis durante la polimerización de estos compuestos. Por otro

lado, monómeros como el acetato de vinilo, alquenos halogenuros cuyo radicales no están estabilizados

por efectos inductivos o de resonancia son difíciles de polimerizar. Otra limitación importante es que el

catalizador debe ser eliminado del polímero resultante o del medio de reacción'°' 11,12

2.1.3. Polimerización radicálica por adición-fragmentación reversible con transferencia de

cadena (RAFT)

La aplicación de agentes de transferencia de cadena (CTA) para control del peso molecular obedece

a la necesidad de obtener polímeros de bajo peso molecular mediante polimerización vía radicales libres.

5


A partir de los 80's, el uso de tioles (R-SH) emergió para este propósito, la labilidad del enlace S-H y la

alta reactividad del radical tioil son la base de la efectividad de estos compuestos [13] Con la aparición de

la polimerización RAFT (por sus siglas en ingles), el uso de CTAs de tipo reversible para el control del

peso molecular y la polidispersidad, se convirtió en uno de los métodos más versátiles para conferir

características vivientes y controladas en la polimerización radicálica.

La polimerización por medio de Diseño Macromolecular vía Intercambio de xantato (MADIX) es una

variante de este tipo de síntesis de polímeros. Los primeros reportes de RAFT y MADIX surgieron en

1998, cuándo de manera simultánea Rizzardo y col y Rhodia Chimie reportaron el uso de compuestos del

tipo Z(C=S)SR y ZO(C=S)R, para la polimerización de una amplia variedad de monómeros vinílicos,

bajo distintas temperaturas de reacción (ambiente hasta 110°C), logrando con ello pesos moleculares

controlados y PDI estrechos (l .2,). El proceso RAFT involucra una polimerización vía radicales libres

en la presencia de CTAs del tipo ditiocompuestos [14]

Estas reacciones pueden ser conducidas en masa, solución, emulsión o suspensión y se inician en

presencia de azo-compuestos o peróxidos. El mecanismo de polimerización RAFT conlleva un

intercambio reversible del grupo controlador S=C(Z)S- entre especies activas y durmientes mediante una

reacción de adición-fragmentación. Esto permite mantener el carácter viviente de la polimerización y

donde la constante de transferencia de cadena es la métrica que determina la eficiencia de cada CTA. En

otra palabras, esto significa que la capacidad para realizar un intercambio rápido entre las especies

(activas y durmientes) generaría polímeros con baja polidispersidad. La selección de los grupos Z y R es

esencial para asegurar una alta eficiencia, donde Z tendrá la capacidad de estabilizar y activar al grupo

tiocarbonilo, mientras que R deberá ser un buen grupo saliente y capaz de reiniciar el proceso de

polimerización. El mecanismo propuesto para una polimerización RAFT se representa en el Esquema 2

6


EL Iniciación

Iniciador kd

> 1 • M

J> M

00 P11

• Transferencia de cadena

Pn • + kadi. k p_s_S + R kp (\ ) Z Z kf Z

1 2 3 Reiniciación

• M R' ___

M ___

Equilibrio

+ sTSPn kadip kadi,p

P m_SS + p.

k UM Z k..a(1i p 4 k.aa'i.p Z k1, UM

• Terminación

P1 + Pffl • k1

Polímero inactivo

Esquema 2-2. Mecanismo de la polimerización radicálica por transferencia de cadena por adición-

fragmentación (RAFT)'14'

En este proceso la reacción se inicia con la ruptura homolítica del iniciador para dar lugar a la formación

de radicales libres los cuales en presencia de un monómero iniciará el crecimiento de la cadena

polimérica, dando lugar a los radicales propagantes (P). Estas especies químicas se adicionan al doble

enlace C=S del agente de transferencia (1) dando lugar a la especie radicálica intermediaria (2), está a su

vez mediante una reacción de fragmentación forma el polímero durmiente (3) y libera un nuevo radical

re-iniciante (R'). Éste radical reinicia la polimerización formando nuevas cadenas activas en crecimiento

(P), las cuales en contacto con las especies durmientes establecen un rápido equilibrio dinámico

mediante el proceso de adición-fragmentación (4). Si la velocidad de este equilibrio es suficientemente

alta, la posibilidad de que dos especies propagantes (P y P . ) se encuentran por difusión se hace muy

pequeña y en consecuencia, la velocidad de terminación bimolecular irreversible es despreciable. En otras

palabras, la concentración de cadenas en crecimiento se mantiene en un mínimo en comparación con las

especies durmientes 3 lo que limita las reacciones de terminación. Sin embargo, las reacciones de

7


terminación por combinación o desproporción no pueden evitarse en su totalidad ya que son propias del

mecanismo de polimerización radicálica [12, 13, 141

2.1.4. Selección del agente RAFT

La selección de los grupos sustituyentes Z y R son una parte crucial en la estructura del agente

RAFT, ya que el grupo R se convierte en radicales libres en la etapa de pre-equilibrio y Z provee efectos

inductivos que favorecen el ataque del doble enlace C=S. Además R debe tener mayor labilidad que el

radical propagante, así como la capacidad de reiniciar eficientemente la polimerización. Algunos factores

que deben ser considerados para la selección de estos grupos, son entre otros los factores estéricos,

estabilidad del radical formado, y los efectos polares que son los elementos determinantes en la capacidad

de este grupo R para fragmentarse y reiniciar. Por lo contrario, el grupo Z determina la reactividad y

estabilidad para facilitar la fragmentación del agente y participa en el control de la eficiencia en la

mediación de la polimerización [10, 141

Los CTA se clasifican de acuerdo al grupo sustituyente Z. Estos incluyen a los ditioésteres (Z=R'),

tritiocarbonatos (Z=S-R'), xantato (Z=O-R') y ditiocarbamatos (Z=N-R'), en donde R' es un grupo

alquilo o arilalquilo (Figura 2-3). Los CTA tienen una estrecha relación con las constantes de velocidad

de adición y de transferencia es decir, tienden a incrementarla de acuerdo a su sustituyente. Dependiendo

de la naturaleza y la estabilidad del grupo Z (fuerte o débil) los CTA tienen una actividad más o menos

acentuada. Un CTA demasiado activo puede producir un periodo de inducción o retardación en la

velocidad de polimerización. El grupo R tiene un papel importante en la cinética de polimerización, es

decir, un agente RAFT con un grupo R dificilmente fragmentable que reaccione ineficientemente en la re-

iniciación no proveerá de control a la polimerización o provocará una fuerte acción de inducción [15]

°

J

O-R S-R

/ o C:>-<S---\-JC0OH (:3~o

Ditioéster Tritiocarbonato Xantato Ditiocarb amato

Figura 2-3. Ejemplos de los distintos tipos de agentes RAFT

8


2.1.5. Agentes de transferencia del tipo tritiocarbonato

Los agentes del tipo tritiocarbonato presentan una menor constante de transferencia que los del tipo

ditiobenzoato, sin embargo presentan un excelente control sobre monómeros de tipo (meta)-acrilatos y

estirénicos. Una ventaja que ofrece este tipo de agentes es que tienen un tiempo de retardación mínimo,

además presentan constantes altas de transferencia. Estos tipo de agentes al igual que los ditioésteres

presentan como desventaja la coloración, la cual le confieren al polímero final, además de un olor

desagradable (provocado por la descomposición del grupo tiocarbonil-tio) [14, 151

Los agentes tritiocarbonatos se han estudiado ampliamente en la síntesis de polímeros potencialmente

útiles en aplicaciones biológicas. Kujawa y col [16] reportaron la polimerización de NIPAM empleando S-

n-octadecil-S'-(a.a'-dimetil-a"-N-octadecilacetamida) tritiocarbonato para la obtención de un polímero

-

telequélico conteniendo un grupo terminal hidrofóbico (n-octadecil) logrando con ello un buen control en

el peso molecular y polidispersidad (Mn = 12-49 kDa y PDI =1.2) del PNTPAM obtenido. Wang y col 1171

diseñaron una serie de agentes tritiocarbonatos diácidos simétricos para la obtención de poli (acrilato de

butilo) (poli(nBuA)) en la síntesis de polímeros telequélicos y su subsecuente síntesis directa de un

copolímero BAB funcionalizado a,Ú)-ácido terminal, los autores observaron qué las estructuras del CTA

influyen en la efectividad del control del Mn (20,000) y PDI (1.14-1.20).

En donde un radical generado a partir de un radical primario es más estable qué aquel generado de un

radical terciario. Un caso particular de CTA fue propuesto por He y col 181, quienes reportaron un agente

de tipo tritiocarbonato. Estos autores conjugaron covalentemente el grupo Z (ácido) de este agente a una

molécula de DNA previamente anclada mediante interacciones no covalentes sobre un sustrato de oro.

Éste agente RAFT se utilizó para la obtención de un poli (OEGMA) - ácido terminal (Mn = 32,000

g/mol y PDI=1.4) mediante la polimerización de oligo(etilen-glicol) metacrilato (OEGMA) en presencia

de AIBN, el polímero resultante tiene aplicación como sonda molecular en la detección de ADN.

Los agentes tritiocarbonatos pueden ser simétricos o no simétricos, en función del número de grupos

salientes con los que cuenten, uno en el primer caso y dos en el segundo. Este último permite diseñar

estructuras en forma tribloque. Por ejemplo Postma y col [191, reportaron la síntesis de una serie de agentes

CTA conteniendo un grupo ftalimidometil como grupo Z, para la obtención de poliestireno (PS)

funcionalizado con un grupo amino terminal. Las principales diferencias presentadas entre estos CTA's

fueron de carácter estructural, en donde estos agentes mostraron una constante de transferencia superior

en el agente de tipo simétrico con respecto a su contraparte asimétrica. Aunado a que la eficiencia de

9


derivatización del grupo ftalimida-a un amino terminal mediante hidrazinólisis fue bastante elevada en

ambos casos (80%).

Sin embargo, los agentes de tipo tritiocarbonato presentan cierta limitación al utilizarse en la

polimerización con algunos monómeros, (ej. acetato de vinilo (VAc), N-vinil-pirrolidona (NVP), acrilato

de octadecilo, entre otros). Esto se atribuye a la estabilidad relativa del radical intermediario y a la baja

labilidad del grupo saliente formado por este tipo de monómeros. Pero a pesar de ello, existen reportes

relativos a su polimerización pero con limitado control en el Mn y PDI 20'211. Un ejemplo de ello es la

síntesis de terpolimeros en gradiente de PVP con estireno y anhídrido maléíco fotoiniciada con rayos Uy,

en la presencia de S,S '-dibencil-tritiocarbonato [22] La homopolimerización de NVP con este CTA fue

deficiente, sin embargo el control en la terpolimerización fue aceptable, esto último atribuido al complejo

de carga formado entre el NVP y el anhídrido maléíco.

2.1.6. Agentes de transferencia del tipo xantato

La polimerización con agentes de tipo xantato se denominada MADIX, el mecanismo de reacción es

similar a la polimerización RAFT con la diferencia de que el grupo Z en el CTA es un grupo O-alquil.

Una ventaja que ofrecen los agentes MADIX es la posibilidad de utilizarse con monómeros cuyo radical

intermediario presenta baja labilidad [23] Las constantes de transferencia son bajas ( :5 1.0) y cuando se

utilizan monómeros de tipo estirénicos, metacrílicos y acrílicos no proveen de un buen control en la

polimerización de estos. Sin embargo, con la selección apropiada del grupo O-alquil, este control se

puede mejorar. Es conocido que la efectividad del agente xantato utilizado en la polimerización depende

del grado de sustitución del grupo O-alquil. La estabilidad del radical saliente aumenta en el siguiente

orden; O-tert-butil ? O-arilo ? 0-isopropilo > O-etilo ? O-metilo, en consecuencia la reactividad del

xantato aumenta en el mismo orden [23] Aunque en todos los caso el grupo R debe tener la capacidad de

reiniciar la polimerización 114,23]•

Postma y col [24] compararon la polimerización de NVP con agentes (CTA's) de tipo xantato y

tritiocarbonato. A diferencia del tritiocarbonato la polimerización con el agente xantato resultó ser más

eficiente en cuanto al control del peso molecular y el índice de polidispersidad (Mn -64 kDaJ PDI 1.6 y

Mn -32 kDa y PDI 1.1 respectivamente). Resultados similares se obtuvieron en la copolimerización

mediada por xantatos de los monómeros NVP y YAc. Por otra parte Mori y col [25] reportaron la síntesis

de un polímero de poli (vinilcarbazol) (pVC) tipo estrella de cuatro brazos. En estas polimerizaciones se

utilizaron agentes de tipo MADIX monofuncional y MADIX tetrafuncional, respectivamente. Asimismo,

dichos autores reportaron valores de Mn controlados desde inicios de la polimerización. Estos reportes

10


demuestran que el uso de xantatos como CTA's, son útiles en el control de la polimerización de los

monómeros VAc, pVC y NVP. Para ello es determinante tener un control apropiado en la selección del

grupo R.

- 2.1.7. Síntesis de polímeros mediante polimerización RAFT con grupos extremos

terminales funcionalizados

Una característica importante que presenta la síntesis de polímeros mediante polimerización RAFT,

es la retención de los grupos funcionales presentes en el agente de transferencia en ambos extremos del

polímero. Esto permite la funcionalización directa a-terminal y a-terminal con grupos funcionales

específicos en los extremos de la cadena del polímero. Así la selección apropiada del agente RAFT o la

post-modificación de los grupos mediante diversas rutas de reacción126' como aminólisis [27], reducción

por radical inducido, hidrólisis [28] eliminación térmica, etc., conduce a la obtención de diversos grupos

funcionales (ácidos carboxílicos, grupos arilo, hidroxilos, aminas, esteres o éteres), facilitando su

aplicación en la conjugación con las biomoléculas. Los ácidos carboxílicos presentes en los polímeros

sintetizados por esta estrategia han sido los más utilizados para este propósito, esto debido a que son

capaces de reaccionar covalentemente con los grupos funcionales de las moléculas biológicas para formar

amidas o esteres. En este caso, la eficiencia de la reacción de conjugación dependerá de la reactividad de

las contrapartes y de la longitud de la cadena polimérica.

La síntesis de agentes RAFT conteniendo grupos ácidos carboxílicos (-COOH) en su estructura, se ha

utilizado en la polimerización de diversos monómeros. Moad y col sintetizaron y compararon una serie de

agentes RAFT conteniendo grupos ácidos carboxílicos en la polimerización de metil-metacrilato. Estos

autores observan un control eficiente del peso molecular (126,000), PDI estrechos (1 .5) y conversiones

de hasta el 99%.

Recientemente Boyer y col, han reportado la síntesis de polímeros solubles en agua, mediante

polimerización RAFT, resultando ser una herramienta muy versátil en la conjugación con moléculas de

origen biológico. Para ello se han utilizado monómeros como ácido-láctico (LA), ácido acrílico (AA) y

vinil alcohol entre otros. (VA), etc. Un ejemplo importante a destacar es la N-vinipirrolidona, la cual es

uno de los monómeros de mayor aplicación en la síntesis de polímeros dirigida a la obtención de

bioconjugados para aplicaciones biotecnológicas, biomédicas y de nanotecnología

La poli (vinilpirrolidona) es un polímero con múltiples aplicaciones entre otras razones debido a su

excelente biocompatibilidad, alta solubilidad en agua, buen estabilizante de nanopartículas 1291,

11


dispersante de nanotubos de carbono, (sustituto de plasma en sangre), acarreador de medicamentos [301,

bioconjugacion, hidrogeles, hemocompatible, membranas para ultra filtración, válvulas bioprostéticas,

entre otras.

La estructura química del monómero de N-vinil-pirrolidona (NVP) y su homopolímero poli(N-vinil-

pirrolidona) se representan en la Figura 2-4, en donde la unidad repetitiva muestra un ciclo altamente

polar con un grupo lactama (amida cíclica) capaz de formar interacciones de tipo puente de hidrogeno. El

resto de la estructura está formada por grupos metinos y metilenos que le confieren carácter nopolar,

altamente hidrófobo. Este monómero es soluble en un amplio intervalo de solventes poco polares y no

polares, entre los que se incluyen como ejemplos cloroformo, metanol y cloruro de metileno [31]

—CH2CH—

Polimerización vía

radicales libres CY NVP PvP

Figura 2-4. Estructura química de la N-vinilpirrolidona y su homopolímero poli (vinilpirrolidona)

La síntesis de poli (vinilpirrolidona) se reportó en los 40s, mediante polimerización en masa o solución,

- vía radicales libres. Sin embargo algunos reportes indican la baja reproducibilidad de los experimentos

cinéticos, atribuyéndolo principalmente a la impureza del monómero, y la capacidad del radical

propagante para abstraer protones generando alta frecuencia de reacciones de transferencia. Además se

estima que su velocidad de polimerización así como su correspondiente energía de activación dependen

- fuertemente de la naturaleza del solvente utilizado, en ambos casos atribuido a la influencia de la

polaridad del solvente durante la reacción de propagación [32]

En aplicaciones con sistemas biológicos, la funcionalidad, peso molecular y PDI de los polímeros son

factores importantes. La polimerización de NVP utilizando agentes de polimerización tipo

RAFT/MADIX se ha estudiado ampliamente [28.321• Varios autores han reportado la síntesis de agentes de

transferencia tipo MADIX con diferentes grupos funcionales para la polimerización de NVP, y que son

útiles en la conjugación con moléculas de origen biológico. MacDowall y col [33] diseñaron un agente

MADIX para polimerizar PVP con un grupo final N-succinimidil-éster (Figura 2-5 (1)) que permitió

conjugar de manera directa a este polímero con la lisozima. En la síntesis del polímero se pudo obtener

un buen control en el peso molecular (33,000 gImo!), así como un índice de polidispersidad estrecho

(1.12), requisitos deseables para la obtención de bioconjugados con alto desempeño.

12


s

00 -

0_\

0 \ rN0>O'

1 2

o

3

Figura 2-5. Estructuras de los diferentes agentes MADIX utilizados en la polimerización de NVP

Wan y col [34] llevaron a cabo la polimerización de NVP mediante MADIX, utilizando fluoroalcoholes.

Estos autores consiguieron (Figura 2-5 (2)) no sólo un buen control en Mn y PDI (26,700 g/mol y 1.3

respectivamente), pero además consiguieron un buen control en la tacticidad del PVP a bajas

conversiones de monómero.

Mishra y col 1351 obtuvieron copolímeros en bloques de tipo amfifilos, mediante la utilización de un

macroagente MAIIX de caprolactona obtenido por polimerización por apertura de anillo (ROP Ring

open polymerization) y su posterior aplicación como CTA en la polimerización de NVP (Figura 2-5 (3)),

logrando un buen control en la síntesis de esta macromolécula (Mn 7,200 g/mol, 1.25)

Algunos agentes de tipo tritiocarbonato también han sido utilizados en la polimerización de NVP. Hu y

col, llevaron a cabo la síntesis de polímeros en gradientes vía 'y irradiación (utilizando PVP con estireno y

metil acrilato), (Figura 2-6 (1)) logrando un buen control en la polimerización y en la formación del

terpolimero. Postma y col ensayaron la polimerización con un grupo ftalimidometil tritiocarbonato

(Figura 2-6 (2)) con NVP sin embargo aunque se logró un control en el Mn (8,000 g/mol) el PDI

obtenido fue relativamente alto (~:1.48). En este trabajo también se reportó un agente similar al

ftalimidometil tritiocarbonato, pero de tipo xantato, confiriéndole a PVP de un buen control de Mn y PDI

(6,000 g/mol, 1.15), inclusive a altas conversiones.

13


s o s

y C N--/ S—\— s o

1 2

Figura 2-6. Estructuras de agentes RAFT de tipo tritiocarbonato utilizados en la polimerización de NVP

Hay reportes de la síntesis de PVP mediante polimerización ATRP. Lu y col [36] reportaron la síntesis de

PVP utilizando Me6Cyclam, un ligante cíclico, en la síntesis de este polímero se obtuvo buen control en

Mn y PDI (7,800 g/mol, 1.21) así como también la copolimerización de NVP con otros monómeros Sin

embargo, los reportes de la polimerización de PVP utilizando ATRP son escasos.

Debuigne y col reportaron la polimerización de NVP utilizando PRMC (Polimerización Radicálica

Mediada por Cobalto) mediante el uso un macroagente de poli (vinilacetato). En donde el índice de

polidispersidad fue bajo y el peso molecular Mn experimental, fue próximo a el peso teórico calculado

esperado.

En resumen la polimerización a través de las diferentes estrategias de tipo RAFT ofrece, una plataforma

versátil para la síntesis controlada de polímeros funcionales en donde las ventajas más importantes de esta

técnica son:

- La capacidad para controlar la polimerización con una amplia gama de monómeros y solventes,

incluyendo agua.

- Obtención de polímeros con una amplia variedad de grupos funcionales, permitiendo la obtención

de polímeros con grupos laterales (pendientes) y funcionalidades en los extremos de la cadena, lo

cual es deseable para la unión covalente con moléculas biológicas.

- El diseño de diversas arquitecturas poliméricas incluyendo copolímeros (alternados), gradientes,

injertados y en bloques.

- Compatibilidad de RAFT con diferentes métodos de polimerización (masa, solución, emulsión,

dispersión, etc.) y modificación superficial y generación de polímeros conjugados in situ.

- Potencialidad de conjugar los polímeros obtenidos con sistemas biológicos mediante diversas

rutas (o injerto a, injerto de, injerto a través de, entre otras).

14


Por todas esas características, RAFT es una alternativa muy útil y efectiva. Este conj unto de estrategias

junto con RDRP han permitido la síntesis de bio-macromoléculas con alto potencial tecnológico y

comercial.

2.2. Enzimas

La unión de 2 o más aminoácidos (aa), llegan a formar grandes cadenas llamadas polipéptidos o

proteínas. Su estructura y característica está determinada por la secuencia y numero de aminoácidos que

la conforman. Donde su estructura determina tanto su función como su forma tridimensional. Las

proteínas participan en gran variedad de procesos biológicos los cuales son determinados por su

capacidad de interaccionar con otras moléculas. Siendo uno de sus principales roles en las células su

función como catalizadores biológicos, los cuales reciben el nombre de enzimas.

Las enzimas presentan alta selectividad en sustratos y especificidad en reacciones. Se encuentran en

cuatro estructuras principales: La primaria es la forma más básica y está conformada por la secuencia

principal de aminoácidos de la cadena proteica. La secundaria, es un arreglo o conformación local de

segmentos de aa, resultado de la formación de enlaces puentes de hidrógeno entre ellos (Figura 2-7). Las

conformaciones más frecuentes encontradas en una estructura secundaria son:

Hélice alfa: La cadena polipeptídica se desarrolla en espiral sobre sí misma y es conformada por

los enlaces de hidrógeno formados entre -C=O del aminoácido "n" y el -NR del "n+4" (cuatro

* aminoácidos más adelante en la cadena).

Hoja plegada beta: La cadena principal se estira al máximo que permiten sus enlaces covalentes,

y establece una configuración espacial, formada entre dos o más cadenas paralelas (que corren en

el mismo sentido) o antiparalelas (que corren en direcciones opuestas) las cuales se adosan

estrechamente por medio de puentes de hidrógeno y diversos arreglos entre los radicales libres de

los aminoácidos. Esta conformación tiene una estructura laminar y plegada.

La estructura terciaria es resultado de interacciones polares o no polares producida por el

posicionamiento de los aminoácidos durante el doblamiento. Dado que esta estructura tridimensional es

estabilizada principalmente por enlaces débiles no covalentes, tiende a perderse cuando la proteína es

extraída de su medio ambiente natural. Lo anterior se le conoce con el nombre de "desnaturalización";

una proteína que sufre desnaturalización ya no puede llevar a cabo ninguna de su funciones biológicas. La

cuaternaria es el resultado de la agrupación de dos o más cadenas polipeptídicas dentro de una

conformación altamente estable y es estabilizada por interacciones van der Waals y enlaces jónicos. [37, 381

15


4

o o . 2

1L N

N' -

H -r -

Primaria Secundaria

Alpha hhil

TJ Terciaria Cuaternaria

Figura 2-7. Principales estructuras encontradas en las proteínas.

Las enzimas pueden catalizar de manera independiente o por medio de un cofactor o coenzima, los cuales

actúan como "acarreadores" de un grupo específico en la función catalítica de la enzima. El sitio más

importante de estas es llamado sitio activo, el cual contiene grupos sustituyentes que enlazan al sustrato y

catalizan su transformación química. Lá actividad enzimática depende de varios factores entre los que se

encuentran la temperatura, el pH, la concentración de sustrato, entre otras. Donde la sensibilidad a estos

factores en un medio biológico determina su eficiencia catalítica [38]

2.2.1. Actividad Enzimática

La actividad catalítica de las enzimas fue observada por Leonor Michaelis y Maud Menten

(1913) quienes postularon una expresión matemática basada en un estado estacionario para la

determinación de la velocidad enzimática de reacción. Ellos proponen la formación de un complejo

intermediario (ES) entre el sustrato (5) y la enzima (E) durante el proceso de conversión, dicho complejo

es reversible. Al descomponerse ES, la velocidad de reacción (V) se mantiene constante a ciertos pasos de

reacción, coincidiendo con la velocidad inicial (Vo) de manera que al aumentar la concentración inicial de

sustrato se desplaza el equilibrio hacia la formación de ES al igual que Vo alcanzando un valor constante

el cual se conoce como velocidad máxima (V max). En este punto la enzima se encontrará en condiciones

de saturación de sustrato, por lo que un aumento en la concentración de este ya no tendrá efecto en la

catálisis. Este valor no es fácilmente medible por lo que Michaelis —Menten, determinan que la

concentración de sustrato en este punto es determinada por una constante Km la cual relaciona V maxl2 y

16


es única para cada afinidad de determinado sustrato. Lo anterior es expresado en lo que hoy se conoce

como la ecuación de Michaelis-Menten:

Vmax [S] V0 = Ecuacion 4 Km + [SI

4

Esta ecuación puede ser transformada algebraicamente en una ecuación experimentalmente más práctica,

mediante la derivación y reacomodo simple de los recíprocos de ambos lados de la ecuación, a partir de

esto se obtiene la ecuación de Lineweaver - Burk:

L_ Km ___ + Ecuación 5

yo - VMAX VMAX

La cual permite obtener parámetros importantes de una reacción enzimática como son la V máx y la 111 constante de Michaelis-Menten Km ,

Dentro de las enzimas más importantes se encuentran las proteasas cuya función es romper enlaces

amidas para reducirlos a aminoácidos o cadenas polipéptidicas para la formación de proteínas de menor

tamaño, y las oxidorreductasas, las cuales catalizan el proceso de óxido —reducción en determinadas

reacciones biológicas. Entre las enzimas proteasas más importantes se encuentran las cisteínas proteasas

como las catepsinas, bromelaina y la papaína. De igual manera para las oxidorreductasas existen la

glucosa-oxidasa, alcohol deshidrogenasa y la L- lactato —deshidrogenasa.

2.2.2. Papaína

La papaína (EC 3.4.22.2) es una cisteína proteasa hidrolasa, está basada en la requisición de un grupo

tiol residual para su actividad catalítica, también conocida como sulfidril proteasa, se encuentra

principalmente en el látex de la fruta Carica papaya. Está enzima ha sido estudiada ampliamente ya que

presenta una alta actividad proteolítica, ha sido utilizada en la síntesis de péptidos, oligómeros y como

biosensor.

Su actividad enzimática puede ser determinada por la velocidad de digestión (rompimiento) de proteínas o

por la hidrólisis de sustratos como esteres o amidas derivados de aminoácidos. Está proteína consiste de

una cadena simple de péptidos de 212 residuos, y un grupo tiol en su centro activo. Tiene un peso

molecular de 23 kD ± 1000 D (1 D= g/mol en unidades) y su estructura conformacional es estabilizada

por tres puentes disulfuro. La cadena principal esta plegada, en dos formas principales formando una

hendidura, donde se encuentra el sitio activo (triada Cisteína (Cys —25), Asparagina (Asp-158 e Histidina

17


(His-159) Figura 2-8. Puede funcionar entre pH 6 - 8, se activa en presencia del aminoácido cisteína, y

se inhibe en presencia de metales pesados que pueden reaccionar con los grupos sulfidrilos [39,401

4 HN

- H2N

NWH

Figura 2-8, Estructura tridimensional y mecanismo de reacción de la papaína Carica papaya.

2.2.3. L-lactato-deshidrogenasa (LDH)

La forma activa de la LDH está conformada por cuatro sub-unidades monómericas (tetrámero),

cada unidad está provista de un centro activo, y un peso molecular aproximado de 36 kD. Para llevar a

cabo su actividad catalítica, es co-catalizada por el cofactor Nicotinamida adenina dinucléotido (NADH),

donde dependiendo de las condiciones puede actuar en la reducción de piruvato a lactato o en su forma

reducida (NAD) en la reacción inversa (Figura 2-9). Existen 2 sub-unidades las cuales se distinguen

principalmente del tejido obtenido, es decir, la sub-unidad M (músculo) es producida en tejidos

encontrados en el riñon y los músculos esqueléticos, contrario a la sub-unidad H (Heart, corazón), la cual

es producida en dicho órgano.

Su centro activo está conformado por la triada Arginina (Arg -109), Histidina (His-195) y Arginina (Arg-

171), los cuales anclan en sustrato lactato y el cofactor NADH, llevando a cabo el proceso de conversión.

La LDH es ampliamente utilizada en el análisis de L-lactato en sangre, el cual es un factor importante en

la determinación de ciertas enfermedades. Un ejemplo de ello, es el sistema cardiovascular, donde un

indicio de la presencia de actividad enzimática encontrada en suero, puede ser síntoma de daño producido

en determinado órgano.

18


MW MP

14

1 11 Mi

1 -

NAD- NA1 + I1 + 21 .--.-.-.....-'- NAUJI

HIC 1.1)11 HC,Jt

NAIY NADIJ

Figura 2-9. Estructura tridimensional y mecanismo de reacción de la L-lactato deshidrogenasa.

- Una de las características que son frecuentemente buscadas en las enzimas es la conservación de su

actividad biológica, así como su estabilidad a diversas condiciones de reacción 1 38, 401 Existen métodos,

como la inmovilización que son aplicados inclusive a nivel industrial. A nivel terapéutico se están

desarrollando sistemas que involucren a las enzimas como biosensores, los cuales determinan de manera

rápida la presencia de arialítos, disminuyendo el tiempo de análisis y pronta obtención de resultados, he

aquí donde las enzimas en conjunto con medios sintéticos como los polímeros están siendo investigados,

mediante una técnica relativamente nueva conocida como bioconjugación.

2.3. Bioconjugación

En las últimas décadas emergió un campo de investigación centrado en la combinación de moléculas

biológicamente activas y polímeros de origen sintético o natural para fabricar materiales avanzados

dirigidos a ciertas aplicaciones específicas. En estos materiales híbridos, las características individuales de

- ambos componentes se combinan para obtener moléculas nuevas con propiedades y aplicaciones únicas,

principalmente en áreas como la farmacéutica, recuperación de enzimas, modulación de propiedades en el

enlace de péptidos y materiales nanoestructurados para diagnóstico y usos terapéuticos, biosensores y

marcadores biológicos.

En años recientes la investigación de la conjugación de biomoléculas con polímeros sintéticos se ha

incrementado de forma sorprendente debido a la importancia y expectativas de la combinación de ambos

componentes para diferentes aplicaciones biomédicas y biotecnológicas. La síntesis de bioconjugados se

inició a mediados de los setentas por Ringsdorf y col [41] quienes trabajaron con modelos de reacción para

la obtención de conjugados centrados en la idea de desarrollar un copolímero soluble en agua unido a la

doxorubicina (fármaco utilizado en el tratamiento de ciertos tipos de cáncer) para prolongar y retener su

19


actividad biológica. En la actualidad las técnicas de polimerización controlada incluida la RDRP han

permitido la bioconjugación de una amplia variedad de biomoléculas con polímeros sintéticos

La RDRP se desarrolló principalmente para aplicaciones en el área biomédica, esencialmente en

tratamientos terapéuticos y farmacológicos, con el propósito de diseñar compuestos unidos a fármacos

para prolongar la permanencia de estos últimos dentro del cuerpo humano y simultáneamente conservar

sus propiedades fisicoquímicas inherentes tales como solubilidad y estabilidad. Aunado a que estos

polímeros no deberían ocasionar efectos secundarios no relacionados con la actividad del fármaco. Más

tarde Zelikin y col [42] conjugaron moléculas biológicas al polímero sintético poli (etilenglicol) (PEG)

mediante la estrategia conocida como PEGilación. Mediante este procedimiento se consiguió aumentar la

estabilidad, la solubilidad, la biodisponibilidad, disminución en la inmunogenicidad, mayor resistencia a

la proteólisis y al tiempo de vida media dentro del torrente sanguíneo de la nuevas moléculas híbridas, así

el PEG se convirtió en uno de los polímeros de mayor aplicación e investigación en esta área.

El uso de polímeros sintéticos en el diseño de compuestos bioconjugados se amplió con el uso de otros

monómeros. Actualmente, polímeros como el poli (isopropilacrilamida) (PNTPAM), glicopolímeros, poli

(etilen-glicol)-metacrilato (PEGMA), poli (ácido acrílico) (polAA), poli(L-lisina) (PLL), poli(vinil-

alcohol) (PVA), poli(estireno) (PSt), han emergido como respuesta a demandas estructurales y de

funcionalidad.

Entre la diversidad de factores que debe presentar un polímero para su aplicación en bioconjugación

destacan: la biocompatibilidad, alta hidrofilicidad, estabilidad en solución, grupos funcionales

compatibles y reactividad con la biomolécula objetivo, además de poseer un peso molecular controlado e

índice de polidispersidad estrecho. Estas características proporcionan a las biomoléculas (proteínas,

péptidos, ácidos nucleicos, carbohidratos etc.) propiedades como alta estabilidad y aumento en la

disolución en diversos solventes orgánicos y además permite el diseño de macromoléculas híbridas con

propiedades sinérgicas [43]

Las macromoléculas hibridas o bioconjugados se obtienen básicamente a partir de la unión química o

covalente entre un polímero de origen sintético y una biomolécula, además de este, se han preparado

bioconjugados de manera no-covalentee inclusive encapsulación (Figura 2-10). La selección del tipo de

conjugación se determina en función de su aplicación y se consideran factores como la estructura,

tamaño, forma, superficie y sitio de conjugación así como los grupos funcionales disponibles y la

estructura tridimensional de la biomolécula [42, 43, 441

20


(i) No covalente

Ligando

4 _00 _

+.

Péptido

rJA

(ji) Covalente

a)

1

NH2 HN

49 b)

b1 +

N3 ,

Figura 2-10. Medios de conjugación i) vía enlace no covalente y u) Vía enlace covalente

En la actualidad la bioconjugación no se limita únicamente al uso de biomoléculas. Sistemas

biomiméticos también pueden ser unidos químicamente y participar de manera similar a su contraparte

biológica. Por ejemplo oligonucleótidos sintéticos u oligopéptidos preparados mediante ingeniería

21


genética y que de alguna forma imitan al sistema biológico, inclusive en su aspecto catalítico [451 pueden

ser sintetizadas y aplicados en ésta área.

Las enzimas, glicoproteínas, nucleótidos, péptidos y oligosacáridos son las principales biomoléculas que

se han utilizado en la preparación de bioconjugados. Narain y col 1461 llevaron a cabo la funcionalización

de glicopolímeros mediante ATRP utilizando un macroiniciador PEG-biotinilado para posteriormente

llevar a cabo la conjugación con la proteína Streptavidina para la identificación de sitios específicos de

enlace. Ladmiral y col [471 sintetizaron glicopolímeros ct-funcionalizados mediante CuLRP (polimerización

radicálica mediada por cobre), con grupos N-succidimil —éster, convirtiendo a éste tipo de polímeros los

candidatos idóneos para la síntesis de nuevos materiales biohibridos (Figura 2-11).

Figura 2-11. Esquema representativo del uso de glicopolímeros en conjugación (Lamidal y col., 2005)

Los métodos modernos de bioconjugación utilizan estrategias para colocar, de forma predeterminada, el

sitio o multi-sitios de la funcionalidad para la unión a las biomoléculas. Estos sitios suelen estar en los

extremos de la cadena polimérica o en una determinada superficie de conjugación. Esto permite la unión

directa o indirecta con biomoléculas, minimizando así perturbaciones que puedan alterar la forma activa

de la biomolécula [46,47]

En la actualidad para la preparación de bioconjugados se prefiere obtener polímeros con la funcionalidad

en un sitio específico (preferentemente en el extremo de la cadena) a el uso de polímeros con el grupo

funciona] al azar (Figura 2-12). Los sitios preferidos en las biomoléculas para la conjugación de manera

específica han sido los residuos de cisteína y usina, debido a la abundancia de estos aminoácidos en la

estructura de las proteínas. La selección del sitio o multi-sitios es determinada por la ruta o técnica a

utilizar para llevar a cabo la bioconjugación.

22


Molécula con un solo tipo de MoI&ula con niulti-sitios

sitio de conjugación de conjugación

Figura 2-12. Selección del sitio o multi-sitios de conjugación.

Otro aspecto importante a considerar en la bioconjugación es la estrategia de síntesis para el diseño de los

conjugados, es decir la dirección de la inserción de la biomolécula. Esta es por el sitio de enlace y que se

- puede direccionar en tres vías: "injerto a" (a través de una parte de la molécula biológica se enlazan

covalentemente con uno o más sitios reactivos del polímero sintético). "injerto de" (la biomolécula

participa como macroiniciador para permitir el crecimiento in situ de un segmento de polímero a partir de

esta unión) e "injerto hacia" (la biomolécula se enlazada a un polímero en crecimiento) [48]

Una característica que posee injerto a e injerto de es la eficiencia de conjugación, que a su vez depende

de la reactividad de la funcionalidad del polímero y del grupo reactivo de la biomolécula. Esta eficiencia

decrece de forma importante para el caso de la estrategia injerto a, cuando se utilizan polímeros de alto

peso molecular. En el caso de la estrategia injerto de se requiere de una distribución homogénea del grupo

funcional en la biomolécula de forma tal que se favorezca la iniciación del polímero que se desea injertar.

2.3.1. Estrategias de Síntesis para el Diseño de Conjugados Polímero - Proteína

2.3.1.1. Bioconjugación vía injerto a

La vía injerto a es de las técnicas mayor uso en la obtención de conjugados, polímero-proteína (Figura 2-

13). Esta estrategia se inició a principios de los ochentas con los trabajos pioneros de Abuchowski y col [49] con la PEGilación de ciertas biomoléculas En esta etapa de investigación los polímeros de tipo PEG

utilizados en la conjugación mostraban como única opción de grupo funcional, el grupo hidroxilo en la

cadena terminal del polímero, y una estructura rígida y químicamente inerte que no permitía la

conjugación lateral. Pero más tarde con el empleo de las técnicas RDRP, particularmente RAFT o ATRP

ofrecen nuevas oportunidades para incrementar el grado de funcionalización de los extremos del

23


polímero, siendo esto posible gracias al uso de iniciadores funcionales, agentes de transferencia

funcionalizados y/o modificación posterior al polímero sintetizado.

COOH + N2H jJv\rJCONH---0

Polímero sintético con carboxílíco terminal Biomolécula

Bioconjugado

Figura 2-13. Estrategia de bioconjugación utilizada en injerto a

2.3.1.2. Bioconjugación "injerto a" vía a-terminal mediante enlace covalente

La síntesis de moléculas conjugadas con funcionalidad a-terminal es sin duda la ruta más explorada

en bioconjugación. La obtención de polímeros con grupos funcionales reactivos permite el acoplamiento a

otros grupos reactivos presentes en las biomoléculas para formar enlaces covalentes. La conjugación de

biomoléculas mediante injerto a con polímeros sintéticos está limitada al tipo de grupo funcional presente

en estos últimos. A la fecha se han sintetizado polímeros con grupos hidroxilos, ácidos carboxílicos,

aminas, fosfatos, y grupos aldehídos todos ellos capaces de reaccionar covalentemente con moléculas

biológicas para formar esteres, carbonates, carbamatos y amidas entre otros [50, 51]• En la actualidad los

enlaces de tipo éster formados a partir de un grupo ácido carboxílico son los más utilizados en la

bioconjugación, debido a la simplicidad de su síntesis y a la alta labilidad del enlace lo que permite la

sustitución por grupos amidas en presencia de grupos amina.

La formación del enlace tipo amida en la síntesis de un bioconjugado, frecuentemente se realiza a partir

de polímeros conteniendo un grupo amino o ácido carboxilo en el extremo de la cadena. En la amidación

de un determinado polímero con una biomolécula se utiliza un agente esterificante que participa como

acoplante, comúnmente del tipo carbodiimida (ejem.: N, N'-diciclohexilcarbodiimida (DCC)) y además la

reacción esta mediada por activadores como la N-hidroxisuccinimida (NI-lS) (Figura 2-14), ambos

compuestos son altamente selectivos para el acoplamiento a grupos aminos libres, localizados fundamente

en los residuos de las proteínas [52]•

24


R. O

R1

N=C=N )_1,0H + H2N R11'N-2

H

Figura 2-14. Reacción simplificada de amidación utilizando carbodiimidas

El uso de ésta ruta de síntesis ha permitido no sólo realizar conjugaciones de amidación directa sino

también el diseño de polímeros a partir de iniciadores o agentes de transferencia funcionalizados que

contienen el grupo N-hidroxisuccinimida u-terminal y son utilizados en la bioconjugación con una amplia

variedad de biomoléculas. Heredia y col [53] utilizó ATRP para la síntesis de poli (isopropilacrilamida)

(poliNIPAAm) a-funcionalizado con un grupo ácido carboxílico y activado con NIHS para llevar a cabo la

conjugación con la Albúmina sérica bovina (BSA), logrando un rendimiento de conjugación de] 80%.

McDowall y col [541 sintetizaron poli (vinilpirrolidona) (PVP) u-funcionalizado a través de la técnica de

MADIX (Figura 2-15). El uso de este agente de transferencia de tipo Xantato con un grupo Nl-lS,

permitió un buen control en la polimerización de PVP (Mn 6000 y PDI 1.3), obteniéndose un rendimiento

alto de bioconjugación al conseguir una estructura molecular de tipo estrella, conteniendo siete cadenas

de PVP unidas a la enzima BSA. Ishihara y col 1551 reportaron la conjugación de la papaína con poli (2-

metilacriloiloxietil- fosforilcloline) (PMPC)- NHS u-terminal, polímero sintetizado mediante

polimerización mediada por foto-iniferter (4-N-N-dietilditiocarbamilmetil) ácido benzoico). La ventaja

que se apreció de PMPC en esta bioconjugación es su similitud a la estructura de un tipo de fosfolípido

natural encontrado en las membranas celulares. Estos autores observaron que el incremento en el peso

molecular de PMPC-NIHS disminuía el grado de modificación y consecuentemente la actividad catalítica

retenida.

25


SH

HOOC— NH2

HO

+

Q = -NI!2 , -COOH, -Sil

Biomolécula

Polímero funcionalizadol

Bioconjugado enzima-polímero

Figura 2-15. Bioconjugación de polímeros a- terminal mediante enlace covalente

Emrick y col, sintetizaron un polímero funcionalizado con NHS mediante ATRP utilizando un iniciador

funcionalizado con un estér activo de NHS para posteriormente conjugarlo con la lisozima. Este sistema

mostró un comportamiento muy similar al descrito en el párrafo anterior.

El acoplamiento a moléculas mediante NHS y carbodiimidas, resultó ser efectiva no solo en solución,

sino que además películas de polímeros con un grupo funcional reactivo, pueden ser acopladas a sistemas

biológicos mediante estos procesos de bioconjugación. Yan y col [56], prepararon una película con el

grupo funcional expuesto hacia la superficie de la misma. El grupo funcional del polímero sintetizado se

utilizó para formar un enlace covalente con la enzima peroxidasa de rábano, dicho bioconjugado fue

evaluado en la formación de un complejo con las enzimas biotina —streptavidina

Una alternativa al uso del NHS es el uso de los polímeros con grupo tiol en su extremo terminal, estos

también se han utilizado para unir residuos de cisteína presentes en las proteínas, aunque estos residuos

están en una proporción mucho más baja en comparación con la lisina. Sin embargo, éste aminoácido con

cierta frecuencia es parte esencial del sitio activo y en consecuencia la actividad catalítica de la enzima

puede ser alterada. Actualmente una manera de obtener polímeros tiol terminal es mediante la

modificación directa de los polímeros sintetizados vía RAFT. La reacción se realiza a través de la tio-

aminación (aminólisis), en donde el grupo tiocarbonilo del agente de transferencia que participa en esta

reacción es susceptible a ser post-modificado por medio de ataque nucleofihico, temperatura o agentes

reductores [15,57]• (Figura 2-16). El grupo terminal tiol en la cadena del polímero presenta alta afinidad

hacia superficies de oro y con frecuencia estos materiales se utilizan en el reconocimiento molecular de

bioconjugados con nanopartículas (Figura 2-17).

26


Ph S Ph

THF, 60°C Ph Ph H

N

Ph O

c4H9y A S Ph

Ph

SH1N Ph

Ph O

rh'P~h~o-~b/_

Figura 2-16. Reacción de reducción de tiocarbonil-tio, a) vía aminolisis y b) vía termólisis 1571

R2

R1—S R1S2 + R3—S

HO0 HOYO HO0 HO0

H + NO2 J (L(NO2 NO2J + NO2L

LSH

Figura 2-17. Reacción de cuantificación de grupos tiol mediante la técnica de Eliman (arriba) y

funcionalización de polímeros conteniendo grupos tiol terminal con nanopartículas (abajo).

Recientemente Zelikin y col [58] reportaron una ruta para la modificación de PVP. La reacción se inicia

con la hidrólisis del grupo RAFT xantato previamente unido al PVP para dar como resultado cadenas de

PVP funcionalizadas con grupo final tiol (PVP-SH), seguido de la protección y activación mediante

puente disulfuro con el reactivo de Eliman para evitar la oxidación inmediata del grupo tiol. Esta ruta

facilita el uso de los polímeros con grupo tiol (tiol-maleimida, tiol-isocianato intercambio de tiol-

27


disulfuro) útiles en la conjugación con biomeléculas. Ésta técnica también se ha utilizado en la obtención

de polímeros con grupos hidroxilos terminales, que una vez trasformados vía termólisis al grupo aldehído,

reaccionan fácilmente con aminas 1591•

La preparación de éste tipo de bioconjugados generalmente puede llevarse a condiciones ambientales. El

rendimiento de la reacción en este caso, depende en gran medida del número de sitios disponibles en la

biomolécula delimitando así el número posible de injertos obtenidos en el bioconjugado. Adicionalmente,

es conocido que en la estructura tridimensional de las estructuras biológicas, particularmente las

proteínas, solo existe un número disponible de grupos reactivos para reaccionar con el grupo tiol del

polímero que permita formar el bioconjugado. De ahí que para aumentar el rendimiento de la reacción de

bioconjugación es necesario optimizar condiciones de reacción y parámetros típicos de los polímeros,

entre ellos el peso molecular promedio en número (Mn), longitud de la cadena, índice de polidispersidad

(PDI), estructura, impedimentos estéricos y comportamiento en solución.

2.3.1.3. Bioconjugación injerto a vía co-terminal mediante enlace covalente

La conversión del grupo o-terminal generada por la funcionalización de polímeros sintetizados

mediante RDRP ha demostrado ser una ruta eficiente para la introducción de grupos funcionales, útiles en

la bioconjugación. La fracción "viviente" del polímero puede ser utilizada en una reacción post-

conjugación. Dentro de RDRD, RAFT es una opción que ofrece la oportunidad de realizar éste tipo de

modificación. El grupo R del agente de transferencia se puede post-modificar a un grupo funcional activo

tales como aldehído, tiol, o piridil-disulfuro. Por citar algunos. Pound y col 1 6 sintetizaron

poli(vinilpirrolidona) utilizando RAFT/MADIX. Para ello la funcionalidad 0-etil incorporada al

polímero, se convirtió a un grupo w-terminal de tipo aldehído mediante hidrólisis acuosa a 40°C, para

obtener un w-hidroxil-PVP para finalmente llevar su oxidación térmica (90° C) y obtener un grupo

aldehído con un 90% de rendimiento. (Figura 2-18). El polímero funcionalizado de esta forma se utilizó

para hacerlo reaccionar con la lisozima, mediante aminación reductiva y así conseguir bioconjugado

altamente estable.

O CN ~-D

0

la) H20 C>Ç II CN H o NSS

ío Ot'5

OH ib) A

» 'ZE-

Figura 2-18. Ruta de síntesis en la obtención de n-aldehido terminal

28


Otra ruta alternativa que permite la funcionalización del grupo terminal omega de un polímero, es a través

del grupo piridil disulfuro. Esta transformación se puede realizar llevando a cabo una polimerización de

RAFT, utilizando agentes de tipo tritiocarbonato 611 o ditioéster que pueden ser convertidos a grupo tiol w-

terminal vía aminólisis en presencia de aminas. A partir de aquí el polímero puede ser conjugado vía

intercambio de tioles, con diferentes moléculas. Polímeros como poli(estireno) (PS),

poli(isopropilacrilamida) (PN1PAAm) 62 , entre otros, se han polimerizado en presencia de agentes RAFT.

Esto permitió el control eficiente de la polimerización y la funcionalización del grupo tiocarbonil en la

mayoría de las cadenas poliméricas, así mismo la aminolisis de este grupo final con una amina como la

2,2'-ditiopiridina derivaron en polímeros co-terminal con factibilidad de ser acoplados a medios

biológicos como péptidos [63] y enzimas [64]•

2.3.1.4. Bioconjugación injerto a vía a,co-terminal mediante enlace covalente

La mayoría de los bioconjugados consisten en la unión de una biomolécula con una o más cadenas de

polímero. Sin embargo, en algunos casos la naturaleza de la molécula biológica requiere del uso de otros

factores que permitan conservar la capacidad catalítica del bioconjugado. Este tipo de bioconjugación ha

sido posible gracias a la síntesis de polímeros de tipo telequélicos. En donde durante la síntesis del

polímero mediante una post-funcionalización, una vez ya sintetizado este, se obtiene un polímero con la

misma funcionalidad en ambos extremos de la cadena. En trabajos más recientes inclusive no solo se han

reportado el uso de polímeros telequélicos, sino también heterotelequélicos (diferente funcionalidad

terminal) en la síntesis de bioconjugados (Figura 2-19) [65,661•

ivj SlS.C2H5

R-NNR wR

»

Figura 2-19. Síntesis de polímeros heterotelequélicos para bioconjugación a, o-terminal

La bioconjugación ha permitido la síntesis de una amplia gama de conjugados para diferentes

aplicaciones. En la actualidad la mayoría de las moléculas híbridas son bioconjugadas utilizando la

técnica injerto a. Una variante de esta misma estrategia es la conjugación en medio de la cadena o en la

cadena lateral del polímero. En donde los grupos funcionales están localizados en medio de la cadena o de

29


grupos colgantes o laterales, distribuidos a lo largo de la cadena poIimérica 671. La relevancia de éste tipo

de estrategia en el diseño de bioconjugados aplicados en liberación controlada de fármacos por citar un

ejemplo, se ve reflejada en el efecto conocido como "umbrella-like" (efecto sombrilla), el cual permite

una mayor protección contra la degradación proteolítica de las enzimas en comparación con el uso de

polímeros de tipo linealt68 .

2.3.1.5. Bioconjugación injerto de vía enlace covalente

Una ruta opuesta de injerto a, es la conocida como injerto de, que mediante polimerización RDRP, se

crece una cadena de polímero a partir de una proteína o péptido, el cual funciona como macroiniciador

(Figura 2-20). Ésta estrategia ofrece ventajas que han incremento su utilidad en bioconjugación, entre las

principales: i) la eficiencia en la bioconjugación se garantiza ya que los impedimentos estéricos se ven

minimizados, ji) la purificación final del material es relativamente "fácil", ya que moléculas de

monómero sin reaccionar son las únicas que son eliminadas del medio de reacción al igual que residuos

de catalizadort691 (ARTP) o agente de transferenciat701 (RAFT), en comparación con otras estrategias de

conjugación.

Monómero

RDRP

.Macroiniciador Polímero obtenido a través d

Iniciador ATRP o agente RAFT

Figura 2-20. Estrategia de bioconjugación utilizada en injerto de

2.3.1.6. Bioconjugación injerto a través de vía enlace covalente

Éste método de conjugación se ha utilizado en la síntesis de monómeros funcionalizados con un segmento

de péptido. La conjugación con éste tipo de polímeros es una ruta que permite el diseño de bioconjugados

de tipo peine, donde el péptido queda como un segmento colgante o grupo lateral, enlazado químicamente

a la cadena principal de polímero (Figura 2-21). Los aminoácidos como L-Valina, L-péptido o residuos de

cisteína se han utilizado como macroiniciadores en la polimerización de tert-butil-acrilato (tBA), (2-

hidroxietil metacrilato) (pI-lEMA) y estireno (PS) por medio de ATRP

30


41

Recientes avances en química de polímeros y el número creciente de aplicaciones de los conjugados

péptidos/polímero en medicina y ciencia de los materiales incrementa la utilidad de ésta técnica, de igual

forma la síntesis de agentes de tipo RAFT [71] y ATRP [72] conteniendo segmentos de péptidos generan una

estrategia versátil en la innovación del diseño de bioconjugados.

LI JIEMA

O CuBr, bipy j Ir

N SO B metanol-d4

2

__ OH

. SH pHEMA 2 H » w S-S-pHEMA

+MeOHJ fosfatobuffert (pH 8.0) U,-

conjugado 2-piridinetiona

Figura 2-21. Ruta de síntesis de conjugado BSA-pHEMA a través del residuo cisteína [73]

La técnica de bioconjugación en la actualidad avanza a pasos agigantados no sólo en medicina, sino

también en biotecnología, nanotecnología, injerto en fase sólida [74] entre otros (Figura 2-22). Enzimas de

gran tamaño como la glucosa oxidasa ha sido posible conjugarlas, mostrando un alto grado de libertad

conformacional en un medio hidrofílico. El resultado de ello es una mayor estabilidad durante el

almacenaje y mayor conservación de su actividad catalítica en comparación con la enzima nativa.

Figura 2-22. Bioconjugación en fase sólida en superficies (izquierda) y nanopartículas (derecha) [75, 761

La funcionalización en medios sólidos abrió las puertas a una alternativa que en años recientes sólo estaba

limitada al estudio químico. Además otra área que está alcanzando altos niveles de aplicación y que

fungen también en plataforma sólida a nivel de nanopartículas e inclusive a sub niveles como los puntos

cuánticos (quantum dot) 75 es conocida como nanobioconjugación 77'78 .

31

Objetivos e Hipótesis Capitulo 3

3. Obj*et¡vos e Hipotesis

-0


3.1. Justificación

La bioconjugación de enzimas utilizando polímeros sintetizados por medio de RDRP es una de las

herramientas con mayor aplicación en las áreas de biotecnología y médica. De manera específica el

conocer la concentración de un analito en muestras médicas para la detección temprana de enfermedades,

determinar el tiempo de liberación controlada de un fármaco en el torrente sanguíneo o en su efecto

incrementar el tiempo de estabilidad y actividad enzimática de ciertas enzimas en un reactor industrial,

conlleva a la investigación de nuevas y diversas estrategias que incrementen el tiempo de vida y la

eficacia de dichas moléculas biológicas en determinada aplicación.

A nivel industrial y farmacológico las proteasas son enzimas con una alta demanda debido a su capacidad

para provocar hidrólisis de enlaces tipo amida y ésteres, lo que permite disminuir el peso molecular o en

efecto acortar un fragmento de péptido que se desee aislar. La papaína se obtiene del látex de papaya

(Carica papaya), y aunque presenta una alta estabilidad a 4°C, sufre una pérdida de ésta, así como de su

actividad catalítica de aproximadamente el 20%, al ser almacenada por un tiempo superior a 6 meses.

Por otro lado esta enzima ha sido ampliamente estudiada en soportes sólidos lo que restringe el

movimiento de la molécula al ligarla químicamente a un cuerpo inerte, minimizando el grado de

perturbación en su estructura y función, contribuyendo en cierta medida a mantener su actividad, sin

embargo, la inmovilización de la enzima sobre soportes como la silica o nanotubos de carbono de forma

fisica, se limita al tamaño de poro, tipo de soporte, así como la inherente liberación de la misma durante el

proceso de purificación lo que disminuye el grado de enzima absorbida, así como restricciones en

condiciones como pH o temperatura. Por otra parte el uso de la conjugación química minimiza los

problemas mencionados anteriormente, y además conlleva beneficios tales como mayor estabilidad, un

mayor porciento de unión y además se han encontrado un mayor número de soportes que permitan llevar

este tipo de conjugación aunque la evaluación enzimática es conducida en un ambiente heterogéneo

(sólido/líquido). Una opción ha sido la conjugación en solución mediante la bioconjugación a polímeros

sintéticos, los cuales permiten la unión de enzimas a su núcleo mediante técnicas de conjugación química,

incrementando su estabilidad en solución, tiempo de respuesta a condiciones adversas (pH y temperatura),

así como una opción a los soportes sólidos.

Por otra parte, las enzimas oxidorreductasas son utilizadas principalmente a nivel médico en la detección

temprana de enfermedades de tipo cardiovascular, así como en biología clínica, determinación del

crecimiento celular y en la industria alimenticia, tal es el caso de las fermentaciones. Lo anterior es

conducido principalmente por la enzima lactato deshidrogenasa (LDH). La estimación de lactato en

sangre es importante principalmente en medicina deportiva ya que determina estados patológicos así

32


como deficiencias respiratorias y enfermedades del corazón e hígado [791 Sin embargo la búsqueda

constante por incrementar la eficiencia de la enzima LDH en la detección temprana de problemas

provocados por una alta concentración de lactato en el sistema sanguíneo o en un reactor de fermentación,

conlieva a la búsqueda de condiciones que permitan incrementar la estabilidad y efectividad en sus

funciones catalíticas. Los sistemas de liberación controlada conocidos para la conjugación de LDH en

medios fisicos o químicos, incluyen soportes sólidos y actualmente polímeros. Dentro de los polímeros

con mayor aplicación en liberación terapeútica de proteínas están el alcohol polivinílico (nanofibras), poli

anilina (películas), entre otros. Estos medios en fase sólida, han arrojado resultados favorables en la

determinación de lactato [80]•

Hasta nuestro alcance la conjugación química de la LDH con la poli (vinilpirrolidona) (PVP) no ha sido

reportada, por lo que los resultados derivados de la revisión realizada muestran que el trabajo propuesto

sería una opción viable a los métodos ya establecidos de conjugación de esta enzima. Además, para el

caso de papaína su aplicación como enzima modelo otorgaría una propuesta en la investigación de esta

enzima a las ya existentes. Asimismo dentro de las ventajas que ofrece el uso de PVP como polímero

sugerido es su alta estabilidad en solución, biocompatibilidad, es no ionico, puede sintetizarse mediante

RDRP, y además se ha comprobado que otorga mayor estabilidad enzimática aun a condiciones adversas

de reacción y por tiempo prolongados, a enzimas como la Albúmina Sérica Bovina (BSA), entre otras.

Por lo que en éste trabajo, se propone la bioconjugación de papaína y lactato deshidrogenasa con PVP

sintetizado previamente por polimerización RAFT para la obtención de PVP funcionalizado en el extremo

alfa con un grupo ácido con la finalidad de:

- Determinar la factibilidad de conjugación mediante técnicas viables de bioconjugación.

- Determinar la capacidad de respuesta de los bioconjugado obtenidos y

- Proponer una opción en la bioconjugación de éste tipo de enzimas, para aplicaciones posteriores

en la determinación de analítos.

32. Hipótesis

"La conjugación de enzimas como la papaína y la L-lactato deshidrogenasa al polímero poli

(vinilpirrolidona) con bajo peso molecular e índice de polidispersidad estrecho incrementarán la

estabilidad de las enzimas bajo factores ambientales como cambio de temperatura y de pH, sin una

aparente pérdida de sus actividades catalíticas".

33


3.3. Objetivo General

Realizar la conjugación de las enzimas papaína y L-lactato-deshidrogenasa por medio de la unión

covalente al polímero poli(vinilpirrolidona) obtenido previamente mediante polimerización RAFT,

utilizando agentes de transferencia de tipo tritiocarbonato y xantato poseyendo la funcionalidad ácido-

terminal para la caracterización y evaluación de la estabilidad enzimática así como sus constantes

cinéticas como velocidad máxima y constante de Michaelis-Menten de los bioconjugados obtenidos y su

comparación con la enzima nativa.

3.4. Objetivos Particulares

3.4.1. Síntesis de los agentes de transferencia tipo tritiocarbonato y xantato conteniendo un grupo

ácido carboxílico en su estructura.

3.4.2. Síntesis del poli (vinilpirrolidona) (PVP) en presencia de los agentes de transferencia por

medio de polimerización RAFT y MADIX para la obtención de polímeros con peso

molecular e índice de polidispersidad controlados.

3.4.3. Caracterizar los polímeros obtenidos y selección del idóneo para su aplicación en

bioconj ugación con papaína y L-lactato-deshidrogenasa.

3.4.4. Bioconjugación de PVP con papaína y su evaluación catalítica en solución.

3.4.5. Bioconjugación de PVP con L-lactato-deshidrogenasa y su evaluación catalítica en

solución.

34

Parte Experimental Capitulo 4

4. Parte Experimental


4.1. Metodología

En el Esquema 4-1 se resumen los experimentos realizados en este trabajo. El desarrollo experimental se

dividió en dos etapas. En la primera se realizó la polimerización de NVP mediante la técnica RAFT con el

fin de obtener un polímero con una funcionalidad a-terminal de tipo ácido carboxílico (-COOH) y su

caracterización mediante técnicas Cromatográficas, Espectroscópicas y de Resonancia Magnética Nuclear

(RMN). En la segunda etapa el PVP fuñcionalizado fue utilizado en el proceso de bioconjugación con la

enzima papaína (PP) y L-lactato deshidrogenasa (LDI-I), para obtener nuevos bioconjugados los cuales

fueron caracterizados y evaluados catalíticamente, con el fin de determinar la ventaja otorgada por la

unión con un polímero sintético con respecto a su estado nativo.

í íntesisde poli(N-vLnil-pirrolldona) mediante RAFT y su aplicación en bioconjugacion

Stesis de agente de transferencia de Sesis de agente de trsferencia de cadena de cadena de tipo Tritiocarbonato tipo Xantato

ATC 1 TC 2

Polimerización de NVP utilizando Polimerización de NVP utilizando ATC-1 J AT-C-2

Caracterización

Evaluación catalítica

Evaluación catalítica

Secuencia de experimentos realizados para llegar al objetivo de esta tesis

35


4.2. Materiales

Los materiales utilizados en este trabajo se citan en la Tabla 6-1 de la sección de anexos.

4.3. Análisis y equipos

4.3.1. Resonancia Magnética Nuclear (RMN). Los análisis Resonancia Magnética Nuclear (RMN) de

protón ('H) y de carbono ('3C) se llevaron a cabo en un espectrómetro marca Jeol Eclipse de 300 MHz La

- adquisición y el manejo de los datos se realizaron mediante el software DELTA. Los compuestos

obtenidos se disolvieron en cloroformo deuterado (CDC13), acetona deuterada (Ac-d6) y agua deuterada

(D20) utilizando tubos de cuarzo de 5 mm de diámetro. Todos los espectros se obtuvieron a temperatura

ambiente.

4.3.2. Espectroscopia de Infrarrojo por Transformada de Fourier (FTIR). Los espectros de FTIR de

los compuestos y polímeros se obtuvieron en un espectrofótometro FTIR Nicolet Magna 550 equipado

con un accesorio de ATR (Reflexión Total Atenuada) de cristal de diamante en un intervalo de 400-4000

cm 1 . El manejo de datos se realizó mediante el software OMNIC E.S.P. 5.2.

4.3.3. Espectroscopia de Ultravioleta-Visible (Uy-Vis) Los espectros de UV-Vis de las diferentes

muestras, así como la evaluación de la actividad catalítica de ambas enzimas se llevaron a cabo en un

Espectrofotómetro Shimadzu 2401PC, equipado con un doble haz y con control de temperatura a

través de un sistema de recirculación, conectado a un baño termostatado (Polystat Cole Parmer).

4.3.4. Cromatografía de Exclusión por Tamaños (SEC). La determinación del peso molecular en

número (Mn) e índice de polidispersidad (PDI) de los polímeros sintetizados se realizó por medio de SEC

utilizando un equipo HPLC (Waters modular system 155 equipado con automuestreador 717 plus y un

refractómetro diferencial Water 2487). Como eluente se utilizó DMF y el equipo se operó a un flujo de 1

mg/mL y temperatura de 40°C.

4.3.5. Espectroscopia de Fluorescencia El análisis de grupo final se realizó mediante espectroscopia de

fluorescencia utilizando un equipo Espectrofluorimetro Perkin Elmer LS50B, con una longitud de

excitación de 340 nm, un slit de 2.5 - 5 y una velocidad de 500 nnilmin.

4.3.6. Dicroísmo circular Los análisis de Dicroismo Circular para los bioconjugados obtenidos se

realizaron en un Espectrofótometro Shimadzu 1218 C con un rango de 190 - 399 nm, conteniendo un

doble haz y acoplado a un sistema de inyección de nitrógeno con recirculación a un baño termostatado.

36


Los datos fueron analizados en Dicroweb.com data system link http://dichroweb.cryst.bbk.ac.uk

disponible para usuarios con licencia y utilizando el método SERCOM.

4.3.7. Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC) Los análisis de cromatografia líquida para

el cálculo del peso molecular de los bioconjugados obtenidos se realizaron en un equipo Agilent serie

Infinity 1260, acoplado a un detector de 15V-vis serie 1200 con arreglo de diodos (190 - 1100 nm), con

columna para cromatografia de exclusión de tamaños Agilent Zorbax, Bioseries GF-200 de -4.6 mm, 9.4

mm de ID x 250 mm L y tamaño de poro de 150 °A (Armstrogs) y una restricción de tamaño de 4000 a

400,000 Daltons. El sistema está acoplado a un inyector manual con límite de volumen de 20 iL en loop.

Los cromatogramas se corrieron a un flujo de 1 mL / mm, la concentración de cada una de las muestras

inyectadas fue de 1 mg/ mL. El eluente utilizado se filtró utilizando una membrana de 0.2 Vun. previo a su

elución.

La determinación del peso molecular se realizó de la siguiente manera. Se elaboró una

curva de calibración con diferentes soluciones de proteínas (lmg/mL) de peso molecular conocido

(Figura 4-1) en el intervalo de 250 kDa a 10 kDa (Da = g/ mol) y utilizando azida de sodio como frente**

(Tabla 4-2). Como fase móvil se utilizó buffer de fosfatos salino (20 mM de Na2HP03 y 130 mM de

NaCl), a un flujo de 1 mL/mm. El cálculo de Rf(relación con el frente) se realizó utilizando la Ecuación 8

donde se relacionan el tiempo de elución del frente (tRF) con respecto al tiempo de elución de cada una

de las proteínas (tPT). La elución de las proteína a través de la columna, se realizó con un detector Uy-

visible a una longitud de onda ( 2.) de 210 nm.

tiempo de retención de proteína (tPT) Ecuación 8 - Rf

= tiempo de retención del frente (tRF)

** Se le conoce frente o patrón interno a un compuesto que pueda resolverse completamente en tiempos totalmente diferentes de los picos adyacentes, y que no esté presente en la mezcla problema y además no produzca ningún efecto interferente.

37


Eqadon ydnbn

Adj. R-Sqo

0.51G71 Standard Error VakJe

e Inlartntrt .2003 O3d01

5.4 C .&d5003 O5SO Siop. Piruvato kinasa

Glucosa oxidasa 5.2 -

Lactato deshidrogenasa

5.0

4.8 BSA

4.6 " Peroxidasa de rabano u

Bromelina 4.4 , Papaina

4.2 Lizosima

4.0 0.60 0.65 0.70 0.75 0.80 0.85

Rf (mm)

Figura 4-1 Curva de calibración de proteínas mediante SEC-HPLC

Las proteínas utilizadas en la elaboración de la curva de calibración para la determinación del peso molecular de los bioconjugados se describen la Tabla 4-1.

Tabla 4-1. Relación de enzimas utilizadas en la curva de calibración

Enzima

Piruvato Quinasa

Mw

237000

vriv 5.3747

TiempoLQD

8.42

Rf

0.5989

Glucosa oxidasa 160000 5.2041 8.63 0.6137

L-lactato deshidrogenasa 134000 5.1271 9.40 0.6687

Albúmina Sérica Bovina (BSA) 66000 4.8195 9.63 0.6846

Peroxidasa de rábano picante 40000 4.602 9.86 0.7012

Bromelina 33000 4.5185 10.54 0.7460

Papaína 23406 4.3696 11.11 0.7908

Lisozima 14400 4.1583 12.85 0.8517

Azidadesodio 65.01 1.8129 14.06 1

38


4.4. Síntesis de agentes RAFT

4.4.1. Síntesis del agente de tipo tritiocarbonato 2_([(butilsulfanil)-carbOflotioitl sulfanil) - ácido

propanóico (ATC-1) La síntesis del agente de transferencia 2_([(butilsulfaflil)-carbOnotioifl sulfanil) - ácido

propanóico, que en lo sucesivo denominaremos ATC-1, se realizó de acuerdo a la metodología reportada

por Ferguson y coI 811

-sisJ o OH

La reacción se llevó a cabo en un matraz bola de tres bocas (500 mL) acoplado con un sistema de

reflujo, un termómetro y un embudo de adición. Una mezcla de butanotiol (36.0 g, 400 mmol) y agua (60

mL) se agregó al matraz, después se adicionó una solución acuosa de NaOH al 50% (p/p) (32 g). La

mezcla de reacción se agitó durante 15 minutos a temperatura ambiente. Transcurrido este tiempo, se

adicionó acetona (20 mL), obteniéndose una solución transparente que se mantuvo en agitación durante

30 mm. Posteriormente esta solución se colocó en un baño de hielo a una temperatura < 10 oc. A

continuación se adicionó disulfuro de carbono (27.06 mL, 34.2 g, 450 mmol), manteniendo la mezcla en

agitación y temperatura constante durante 0.5 h. Una vez que la solución cambió a color naranja intenso,

se le adicionó el ácido 2-bromopropanoíco (37 mL, 62.7g, 410 mmol), cuidando que la temperatura

interna del reactor no excediera más allá de los 10 °C. Consecutivamente se agregó una solución acuosa

de NaOH al 50 % (3 2.8 g, 410 mmol)) a < 10 °C. El baño de hielo se retirá y se añadieron 60 mL de agua.

La reacción se mantuvo en agitación durante otras 24 h, a temperatura ambiente.

Al término de este tiempo se agregaron 100 mL de agua a la mezcla de reacción y se enfrío nuevamente a

10 °c. Está mezcla se acidificó, agregando lentamente HC1 10 N (60 mL), cuidando no rebasar la

temperatura inicial de la reacción. De esta forma se obtuvo un aceite de color amarillo intenso, seguido de

un cambio de fase, de líquido a sólido. Los cristales se separaron por filtración y se lavaron con agua fría

y se secaron a vacío. 1 g de ellos se recristalizaron en hexano. Rendimiento 87 %, Punto de fusión 54.2

°C, IR estiramiento 1065 (C=S), flexión 1709 (C=O), EM Ion molecular, 238.5 m/z. 'H RMN 3 (ppm)

11.5 (114, c02H), 4.85 (IH, SCH), 3.42 (2H, cH2S), 1.7 (21-1, CH2CH2S), 1.58 (SCH, cH3), 1.35 (21-1,

cH3cH2CH2), 0.93 (314, cH3CH2). '3C RMI"J 3 (ppm) 222.1 (CS), 178.0 (C0), 48.0 (SCH), 30.1

(CH2CH2S), 23.5 (cH3CH2), 18.5 (scl-lcI-13), 13.5 (CH2CH3). Los espectros obtenidos son desglosados

en la sección de Anexos apartado 6.2.

39


4.4.2. Síntesis del agente RAFT de tipo Xantato ácido 4-(etoxicarbonotioiltio) metil benzoico

(ATC-2).

La síntesis del agente de transferencia de tipo xantato ATC-2, 4-(etoxicarbonotioiltio) metil ácido

benzoico se sintetizó de acuerdo a la metodología reportada por Wan, y col [82] con algunas

modificaciones, según Macias y col [83]•

HO JIÍ

La reacción para la síntesis de este compuesto se llevó a cabo en un matraz bola de dos bocas equipado

con sistema de agitación magnética, un sistema de reflujo y una manta de calentamiento. El sistema se

saturó en atmósfera de argón. Posteriormente se colocó una solución de KOH (0.56 g, 10 mmol) y etanol

(4 mL). La reacción se mantuvo en agitación durante 30 min hasta formar una solución transparente.

Posteriormente se agregó disulfuro de carbono (2.53 g, 33 mmol), manteniéndose en agitación durante un

tiempo de 10 horas a temperatura ambiente. Transcurrido este tiempo se adicionó una solución de ácido

a-bromo-p-tolueníco (1 .77g, 8.25 mmol) previamente disuelto en etanol (40 mL), la mezcla se mantuvo

en agitación constante a 60 oc por un tiempo de 5 horas. Inmediatamente después, el medio se llevó a pH

2 mediante acidificación con HC1 10 M.

La fase orgánica se extrajo con éter dietílico (2 x 30 mL). Después de la separación de fases, se dejó en

agitación, con sulfato de magnesio por un periodo aproximado de tres horas, y a continuación se separó

mediante filtración. La solución obtenida se rota-evaporó a sequedad, obteniéndose un sólido de color

blanco. Rendimiento. 68 % IR estiramiento 1052 (C=S), flexión 1704 (C=O), 'H RMN 8 (ppm) (1H,

CO2H) no detectado, 8.0-7.6 (4H, ArH), 4.7 (2H, cH3cH20), 4.5 (2H, -c(=s)-s-cH2-Ar), 1.4 (CH3-

CH2-0-). '3C RMN S (ppm) 213.5 (C=S), 167.0 (C=O), 142.0-130.0 (ArC), 70.1 (CH3CH20), 39.5 (-S-

CH2-Ar), 13.1 (CH3-CH2-0-). Los espectros obtenidos son desglosados en la sección de Anexos apartado

6.3.

4.5. Síntesis de poli(N-vinil-pirrolidona) mediante polimerización RAFT y su caracterización.

Para la síntesis de Poli(N-vinil-pirrolidona) se preparó una mezcla conteniendo los siguientes

componentes: N-vinil-pirrolidona (5g, 43.8 mmol), AIBN (0.0098, 0.0596 mmol) y agente de

transferencia ATC-1 (0.0712g, 0.2985 mmol) y N-vinil-pirrolidona (8g, 70.077 mmol), AIBN (0.0157,

0.0956 mmol) y agente de transferencia ATC-2 (0.123g, 0.4959 mmol). La mezcla se agitó hasta la total

disolución de los componentes en el monómero. Posteriormente se adicionaron 1 g en peso de la solución

40


a 5 tubos de ignición, seguido de tres ciclos de desgasificación por vacío, mediante el proceso de

congelaciónldescongelación con nitrógeno líquido. Los tubos se sellaron a flama y se colocaron en un

baño de aceite a 60 oc durante un tiempo determinado. Transcurrido este tiempo, la reacción de

polimerización se detuvo mediante inmersión de los tubos en un baño de hielo Finalmente, el polímero se

purificó mediante disolución en cloruro de metileno y precipitación en éter etílico, el proceso se repitió

dos veces.

4.5.1. Determinación de la presencia del grupo ácido carboxílico final en las cadenas de

PYPCOOH-1 mediante el marcaje con pirenmetilamina.

Para identificar la presencia en la cadena de PVPCOOH-1 del grupo ácido terminal derivado del

agente ATc-1, este polímero se hizo reaccionar con pirenmetilamina. Este último es un colorante que

emite a 340 nm, cuando se excita con luz ultravioleta. Esta modificación se realizó de acuerdo a la

metodología reportada por Duhamel y col [84] (Figura 4-2). En resumen este procedimiento consiste en

disolver el hidrocloruro de pireninetilamina (PyMeNH HC1) (1 g, 3.7 nimol) en agua desionizada (50 mL)

y ajustar la solución a pH 7.0, con una solución de hidróxido de amonio 0.5 M (N1-140H). Posteriormente

se realizó una extracción, colocando la solución de PyMeNH en un embudo de separación al cual se le

adicionó hexano (100 mL) para separar la fase orgánica, este proceso se repitió 2 veces. La fase sólida

(PyMeNH) se extrajo y se llevó a sequedad en una estufa de vacío durante 4 h (Figura4-2a). La reacción

del grupo amino con el grupo carboxilo del PVPCOOH-1 se llevó a cabo disolviendo este polímero (0.50

g, 0.022 mmol) en agua ultrapura y dejándolo en agitación por 30 mm. A continuación se adicionó THF

(100 mL). Después, se agregaron el PyMeNH (0.Olg, 0.43 mmol) e hidrocloruro de l-[3 -(dimeti lamino)

propil]-3-etilcarbodiimida (EDC) (0.08g, 0.42 mmol). La reacción se mantuvo en agitación magnética

durante 5 h, a temperatura ambiente (Figura 4-2b).

41


NH2 HCI + N114011

Hidrocloruro de pirenmetilamina

NH2

CH2 + N1140 + H20

Pirenmetilamina neutra PyMeNH2

NH2

CH2

Ç7 NN

o

Óá) + s

*13C—' -

neutra PyMeNH2 Poli(vinil-pirrolidona) (PVPC00111) PVPC0011I-PyMeNH2

Figura 4-2. Marcaje de PVPCOOH-1 utilizando pirenmetilamina. a) Reacción de neutralización del

Pirenmetilamina hidrocloruro, b) reacción de derivatización de PVPCOOH mediante PyMeNH2

El polímero funcionalizado se purificó mediante ultrafiltración, utilizando un cilindro de una membrana

de ultrafiltración de fibra hueca con un límite de corte de peso molecular (Mw) de 1x103 Daltons (AIG

Technology Corporation, Needharm, MA, USA), esto con el fin de eliminar el exceso de PyMeNH2 sin

reaccionar. El retenido y permeado fueron se secados por medio de liofilización. Los materiales obtenidos

se caracterizaron mediante espectroscopias de UV-Vis y fluorescencia, preparando una solución acuosa

con una concentración de 0.25 mg/mL.

4.5.2. Análisis de la presencia del grupo ácido carboxílico final en PVPCOOH-1 mediante

Resonancia Magnética Nuclear de Protón (RMN H').

- Alternativamente, la incorporación del grupo carboxilo en el extremo terminal de las cadenas de

PVP se determinó mediante análisis por resonancia magnética nuclear de protón (RMN 'H), posterior a la

-

esterificación entre el grupo ácido presente en PVPCOOH-1 y el alcohol bencílico (Figura 4-3). La

reacción se llevó a cabo mezclando una solución de PVPC001-1-1 (0.3 g, donde se consideró el peso

molecular del ácido para obtener la relación molar de 4.16 mmol, disuelto en CH202 (5 mL)) y EDC

(0.05 g, 4.16 mmol, previamente disuelto en CH2C12 (2 mL)). La mezcla de reacción se colocó en un baño

de hielo hasta alcanzar una temperatura 5 °C. Posteriormente se adicionó un exceso de alcohol bencílico

(10 mL), inmediatamente se agregó dimetilaminopiridina (DMAP) (-0.002g) cómo catalizador. La

reacción se mantuvo en agitación durante 5 horas a temperatura ambiente. Transcurrido éste tiempo el

baño de hielo se retiró y se permitió la continuación de la reacción durante 20 horas. El polímero

42


modificado se purificó mediante precipitación/disolución en dos ciclos, utilizando cloruro de

metileno/éter etílico como disolventes.

s

C4H9S

CH3 OH

DMAP/EDC

OH n

Figura 4-3. Reacción de esterificación de PVPCOOH con alcohol bencílico en presencia de DMAP/EDC.

Rendimiento 54%

1HRIvIJ\T5 (ppm) 7.4-7.2 (IOH, ArH), 4.8 (21-1, ArCH20), 3.9 (IH, -C(=S)-S-CH-N), 3.28 (CH2-N-), 3.24

(CH2-S-), 2.5(C1-1-CH2-CH), 2.16 (CH2-C=0), 2.1(CH2-CH2) 31.22 (CH3-CH-COOH), 1.1(CH3-CH2-

CH2)

4.6. Aplicación de poli(N-vinil-pirrolidona) en la bioconjugación con enzimas.

4.6.1. Bioconjugación de PVPCOOH-1 con papaína (Carica papaya) y su evaluación catalítica.

La reacción de bioconjugación se llevó a cabo de acuerdo a la metodología propuesta por

Miyamoto y col [85] (Figura 4-4), a través del grupo ácido terminal de PVPCOOH- 1 y los grupos aminos

de la enzima papaína después de la activación del grupo carboxilo.

s N-hidroxisuccinimida EDC

ç_r0 O

1 2 PVPCØØH-LHS activado

Papaina-NH2 2

Pus çjOo

P-PVPC (Conjugado con papina)

Figura 4-4. Reacción de bioconjugación llevada a cabo entre PVPC00H-1 y la enzima papaína

43


4.6.2. Activación del grupo ácido-terminal mediante el uso de ésteres activos de N-

hidroxisuccinimida (NHS).

La reacción de activación del grupo carboxil se realizó disolviendo PVPCOOH-1 (0.3 g, 1.18x10

mol) y N-hidroxisuccinimida (0.0859 g, 0.746 mmol) en CH2Cl2 (5 mL). Esta mezcla se mantuvo en

agitación magnética constante, hasta alcanzar la disolución total de los reactivos. Posteriormente la

mezcla se colocó en un baño de hielo a una temperatura < 5.0 °C. A continuación se agregó 1-[3-

(dimetilamino) propil]-3-etilcarbodiimida hidrocloruro (0.140 g, 7.30 x 10- mol), la reacción se mantuvo

en agitación por una hora a esta temperatura, posteriormente se retiró del baño de hielo y la reacción se

dejó completar a temperatura ambiente por un periodo más de 5 horas.

Una vez activado el PVPCOOH-1 con la NHS se precipitó en éter etílico y se secó durante 24 h a 40°C.

La EDC y NHS sin reaccionar se eliminaron por ultrafiltración a través de membranas de fibras huecas

con restricción de peso molecular lx iO3 como límite de corte (AIG Technology Corporation, Needharm,

MA, USA). El producto retenido se liofilizó (73.0 % eficiencia). La conjugación de PVPCOOH-l-NHS

(0.250 g, 9.82 x 10 5 mo!) con papaína (0.lg, 4.16 x 10.6 mol) se realizó disolviendo ambos productos en

buffer de fosfatos salino (PBS) (60 mL, 0.1M pH 7.5) y la mezcla se incubó durante 2 horas a 5°C.

Posteriormente la mezcla de reacción se purificó mediante ultrafiltración utilizando membranas de fibra

hueca con restricción de peso molecular 3x104 daltons (AIG Teclinology Corporation, Needharm, MA,

USA) con el fin de separar el polímero (PVPCOOH-l-NHS) y a la papaína sin reaccionar o no

bioconjugada. La cantidad de proteína conjugada fue evaluada mediante el método de microensayo

Biorad (Anexos).

44

Parte Experimental ¡tulo 4

4.6.3. Determinación del grado de conjugación mediante el Ácido Trinitrobencenesulfónico (TNBS).

La determinación de la cantidad de grupos aminos conjugados a PVPCOOH- 1 se llevó a cabo mediante el método de Habbeb y col [861

Para ello se preparó una solución al 0.1% de reactivo TNBS en una solución al 4% de NaHCO3, pH 8.5. En un tubo de ensayo con rosca, se colocó 1 mL de la solución

de TNBS al cual se le adiciono 1 mL de NaHCO3 y 1 ml de solución de enzima o bioconjugado según sea

el caso, se homogenizó la mezcla y los tubos fueron llevados a un baño de aceite precalentado a 40°C por

2 h. Transcurrido el tiempo a los tubos se les agregó 1 mL de dodecil-sulfato de sodio (SDS) al 10 % para

solubilizar la proteína y prevenir su precipitación, subsecuentemente se adicionó 0.5 mL de 1-ICJ 1N. La lectura de las muestras se llevó a cabo mediante Uy-visible a una longitud de onda de 335 nm, la cual es característica del grupo trinitrobenceno. La cuantificación se realizó mediante la ley de Beer. La reacción

se muestra en la Figura 4-5:

0 0 N 0

R-NH

+ so31.

R-HN ¡

O_N LN 0

II II ti It o 0 0 0

TNRIQ Derivado color naranla 1

Figura 4-5 Reacción del ácido trinitrobencensulfónico en presencia de grupos aminos libres

4.6.4. Evaluación Catalítica del conjugado PVP-COOH—papajna (P-PVPC) y su comparación con la enzima nativa

La actividad catalítica de la enzima nativa y del bioconjugado se determinó utilizando N-Benzoil-

Arginina-p-Nitroanilina (BAPA) como sustrato, determinando la absorción a 410 nm de la p-nitroanilina,

formada durante la hidrólisis del sustrato (Figura 4-6). Esta actividad proteasa se expresa en unidades

BAPA producidas por unidad de tiempo, el ensayo está basado en el método de Earlanger y col [87],

adaptado para papaína. Para el cálculo de las unidades BAPA se utilizó la siguiente ecuación 9:

Unidades BAPA = A

tmtn*1000* VR

- 8800

Ecuación 9.

45

Parte Experimental tulo 4

Donde A es la absorbancia obtenida a 410 nm de la p-nitroanilina liberada, t es el tiempo estimado de

reacción, 1000 es el factor de conversión (mL a L), VR es el volumen de reacción (3 mL) y 8800 cm' es el coeficiente de absorción molar de la p-nitroanilina a 25°C. La actividad catalítica representa el tiempo

que tarda 1 mol de papaína en convertir un micromol de BAPA a nitroanilina y se expresa como tmol*L tmin'. En algunos casos la actividad se reportó como actividad específica en porciento que relaciona la

actividad catalítica con la cantidad de proteína presente en el medio, expresada como unidades BAPA/ mg

de proteína o U/mg.

La solución de BAPA (0.0435g) se preparó disolviendo este compuesto en dimetilsulfóxido (DMSO) (1

mL) y ajustado el volumen total a 100 mL con una solución conteniendo L-Cisteína hidrocloruro (5mM)

y ácido etilendiaminetetracético (EDTA) (2 mM), disueltos previamente en buffer Tris 50 mM, pH 7.5

(99 mL). La formación de p-nitroanilina se realizó mediante espectroscopia UV-Vis monitoreando el

cambio de absorción a X 410 nm en el trascurso de 30 mm. El medio de reacción consistió de: 2.5 mL de buffer Tris, 0.25 mL de solución BAPA y 0.25 mL de solución de P-PVPC (1 mgI mL) o papaína (1

mg/mL). Con excepción de los casos en donde se indique lo contrario.

H .NO2

H2C H Papaína CH2

H2C NH

H2N NH

BAPA Sitio activo p -nitroanilida

Figura 4-6. Reacción catalítica de la papaína en presencia de N-benzoil-p-nitroariil ida (BAPA)

4.6.5. Evaluación de la estabilidad y respuesta catalítica de P-PVPC y papaína libre a diferentes temperaturas

El ensayo de respuesta a la temperatura se realizó en un intervalo de 35 a 85 °C. A una

concentración de 5 mM de solución BAPA, manteniendo las concentraciones de L-cisteína (5mM),

EDTA (2mM) y condiciones de reacción constantes.

4.6.6. Determinación de las constantes cinéticas de Michaeles-Menten (Km) y Velocidad máxima de reacción (Vmax) para P-PVPC y papaína libre

Para la determinación de las constantes cinéticas se prepararon concentraciones de la solución

activadora descrita anteriormente (sección 4.7), variando únicamente las concentraciones de BAPA en un

46


intervalo de 2mM a 5 mM y manteniendo las concentraciones de L-cisteína (5mM) y EDTA (2mM)

constantes. La reacción se llevó a cabo a 65 oc en un tiempo de reacción de 30 mm.

4.6.7. Evaluación de la estabilidad y su respuesta catalítica de P-PVPC y papaína libre a diferente

pH

El ensayo de respuesta se realizó en un intervalo de pH 4.0 - 8.5 A una concentración de 5 mM

de solución BAPA, manteniendo las concentraciones de L-cisteína (5mM), EDTA (2mM) y condiciones

de reacción constantes (65°C y 30 mm). El sistema de buffers utilizado fue el siguiente: citrato (pH 4.0-

6.0), buffer fosfato de sodio (pH 6.4 - 7.0) y buffer TrispH (7.5 - 8.5).

4.6.8. Evaluación de la respuesta catalítica de P-PVPC y papaína libre a metales presentes en el

medio

La respuesta a metales de P-PVPC y papaína libre se realizó de la siguiente manera: se prepararon

soluciones de 10 mg U', 5 mg U' y 2.5 mg U' de sales de plata (NH4Ag), cobre (CuC12) y magnesio

(HgCl2). Posteriormente en una gradilla se colocaron tubos de ensayo conteniendo 2.5 mL de sustrato

(solución BAPA), 0.25 mL de la solución de metal, los cuales se llevaron a un baño de aceite

precalentado a 65°C, para su temporización. Consecutivamente se agregaron 0.25 mL de solución de P-

PVPC o papaína libre (previa temporización (5 segundos máximo) para evitar el choque térmico) y la

reacción se continuó por 30 mm. Transcurrido el tiempo los tubos fueron retirados del baño e

* inmediatamente fueron agregados a cada tubo una solución de ácido acético 30% (y/y) (1 mL) para

detener la reacción enzimática. Se leyó la cantidad de p-nitroanilina formada a los 30 minutos de haberse

detenido la reacción.

4.6.9. Evaluación de la estabilidad de P-PVPC y papaína libre a 37°C y 40°C

La evaluación de estabilidad del bioconjugado fue evaluada a 37°C y 40°C durante un periodo de

30 días con medición de actividad cada 5 días. Una solución de 1 mg/mL de P-PVPC y papaína fueron

colocadas dentro de una incubadora para mantener la temperatura constante. El medio de reacción

contenía 2.5 mL de buffer Tris, 0.25 mL de solución BAPA y 0.25 mL de solución de P-PVPC (1 mg/

mL) o papaína (1 mg/mL) los cuales reaccionaron durante 30 minutos. Transcurrido el tiempo los tubos

fueron retirados del baño e inmediatamente fueron agregados a cada tubo una solución de ácido acético

30% (y/y) (1 mL) para detener la reacción enzimática. Se leyó la cantidad de p-nitroanilida formada a X

4lOnm.

47


4.6.10. Bioconjugación de PVPCOOH-2 con lactato deshidrogenasa de músculo de conejo

(Oryctolagus cuniculus)

La activación de LDH se realizó de acuerdo al procedimiento descrito en la sección 4-6 para la

papaína y es presentado en la Figura 4-7. En una reacción típica se mezclaron PVPCOOH-2 (0.680 g,

8.30 x10 5 mol) y NT-lS (0.01467 g, 1.30 x 10 4mo1) en C1-1202 (5 mL). Posteriormente, la mezcla se

incubó a una temperatura de < 10°C en un baño de hielo. Consecutivamente se agregó una solución de

EDC (0.02435 g, 1.30 x 10 mol) previamente disuelto en CH202 (2 mL). La reacción continúo durante 5

h a estas condiciones. Transcurrido el tiempo el baño fue retirado y la reacción se mantuvo a temperatura

ambiente durante 21 h, el polímero activado se purificó mediante ciclos de solución / precipitación con

éter etílico / cloruro de metileno (el proceso se repitió dos veces), para finalmente secarlo a vacío. La

eliminación del EDC y NHS sin reaccionar se llevó a cabo utilizando un sistema de ultrafiltración a través

de membranas de fibras huecas con peso molecular lxi como límite de corte (A/G Technology

Corporation, Needharm, MA, USA). El producto retenido se liofilizó. El rendimiento de la reacción para

obtener PVPC001-1-2-NHS alcanzo el 79.0 %. Subsecuentemente PVPC00H-2-NHS (0.540 g, 6.60 x 10

mol) y LDH (300 ptL, 0.0033 g, 2.64 x 10.8 mol) se disolvieron en buffer Tris HC1 (30 mL, 0.02 M pH

7.3) y la mezcla se incubo a una temperatura de < 10°C durante 3 h.

s ço o si-

EDCINHS o—N 11 o CkMe2 5°C

1

ço 2 Tris HCI LDH

10°C

Figura 4-7. Reacción de bioconjugación de PVPCOOH-2 con L-lactato deshidrogenasa

4.6.11. Evaluación Catalítica del conjugado L-PVPC y su comparación con la enzima

nativa

LDH cataliza la reacción reversible de piruvato a lactato en donde utiliza como cofactor NADH

(Nicotinamida adenina dicnucleótido en su forma reducida), el cual participa en el intercambio de

electrones durante la reacción química, este compuesto absorbe fuertemente 340 nm en la región del

ultravioleta. Én la reacción inversa, lactato a piruvato, la LDH reduce el cofactor NAD (Nicotinamida

48


adenina dicnucleótido en su forma oxidada) a NADH observándose en UV un incremento en la

absorbancia a 340 nm durante el proceso de reducción (Figura 4-8). En este trabajo, la actividad catalítica

de LDH-PVPC y LDH nativa se determinó utilizando L-lactato como sustrato y NAD como cofactor. El

coctel de la reacción consistió de 2.75 mL de buffer Tris-HCI (20 mM, pH 7.3), 100 ILL de solución de

NADH o NAD (6.6 mM, en buffer Tris- HCI (0.02 M, pH 7.3), y 100 1tL de L-lactato (30 mM, en buffer

Tris-HCI (20mM, pH 7.3)), y 50 .iL de solución de L-PVPC o LDH (1 mgI mL en buffer Tris-HCI (20

mM, pH 7.3)). Para las evaluaciones de temperatura y obtención de parámetros cinéticos se utilizó el

procedimiento descrito anteriormente.

ADP ------------

O ADP

Ribo ADP

RIbo

J-o

Reducción

0.

/NH2 OH OH

NAD NAD+H+2e - NADB

H3c ç0 LDH H3c\10

NAD NADH OH

Figura 4-8. Reacción química reversible catalizada por la enzima L-lactato deshidrogenasa (LDH) en presencia de NAD y piruvato

49

Resultados y discusión Capítulo 5

!;.Resultados y

D iscusión

Resultados y Discusión Capitulo 5

5.1. Polimerización RAFT de poli(N-vinil-pirrolidona) con un ácido carboxílico

terminal. Utilización de agentes de tipo tritiocarbonato (ATC-1) y xantato (ATC-2)

La N-vinil-pirrolidona, al pertenecer a los monómeros no conjugados del grupo de las N-vinil

amidas, se caracteriza por poseer un átomo de nitrógeno enlazado directamente al grupo vinílico y difiere

de las acrilamidas al no estar conjugado con el grupo carboxilo; de manera que la polimerización vía

radicales libres produce polímeros con alto peso molecular y con un porcentaje de funcionalización menor

al 40 %. Además, estos monómeros no son capaces de formar radicales estabilizados por resonancia o

efectos inductivos, por lo que su polimerización mediante RDRP no se ha logrado de forma eficiente, es

decir el control de peso molecular y el índice de polidispersidad en la mayoría de los casos no se ha

controlado, esto atribuido a que predominan las reacciones de transferencia hacia el solvente y al

monómero.

Desde el uso de los tioles como agentes de transferencia, el diseño y uso de los de tipo tritiocarbonato ha

demostrado gran utilidad en la obtención de polímeros controlados y funcionalizados. Por lo que en este

trabajo, se utilizó el agente de transferencia denominado ATC-1 el cual contiene una función ácido

carboxílico en su estructura para la polimerización de NVP en masa. Con esto, se otorgó la funcionalidad

al polímero obtenido y además permitió realizar la unión con grupos aminos libres presentes en la enzima

papaína. Por lo que a continuación se describen los resultados obtenidos.

5.1.1. Polimerización vía radicales libres en masa de N-vinil-pirrolidona (NYP) empleando

ATC-1.

5.1.1.1. Caracterización de poli (vinilpirrolidona) (PVPCOOH-1)

La reacción de polimerización mediada por el agente ACT-1, para la obtención del poli (NVP) el cual fue

denominado PVPCOOH-1 se esquematiza en la figura 5-1. Donde el polímero, resultó ser un polvo sin

olor de color blanco, el cual al ser caracterizado mediante RMN 'H permitió asignar las señales con las

correspondientes al PVPCOOH-1 (Figura 5-2). El protón del metino unido al átomo de nitrógeno del

anillo heterocíclico (d) se asoció con la señal ubicada a 33.2 ppm, la señal a 33.8 ppm se relacionó con el

metileno unido directamente al nitrógeno y que forma parte del anillo (b), mientras que las señales a 5 1.9

(a) y 32.5 (c) ppm respectivamente se relacionaron a los metilenos pertenecientes a el anillo de la

pirrolidona, empalmándose a su vez con el metileno de la cadena alifática (e). Las señales asignadas al

agente de transferencia y las cuales se asocian al grupo metilo del ácido propanóico y al metileno

50


adyacente al átomo de azufre de la cadena hidrocarbonada no fueron observadas, atribuido esto al alto

peso molecular del PVP (22 000 glmol).

s CH3

AIBN, 60°C » C4H9SXS OH ATC-1 ço O

Figura 5-1. Esquema de reacción de la polimerización de NVP utilizando ATC-1

Figura 5-2. Espectro de 'H RMN para PVPCOOH-1 en CDC13 a 300 MHz

Para corroborar la estructura del PVPC00H-1 y en particular la presencia del grupo carboxilo en este

polímero, el material se caracterizó por medio de análisis FTIR. La Figura 5-3 muestra el espectro

obtenido para PVPCOOH-1, en donde se pueden observar las señales correspondientes al PVP y el cual

presenta los siguientes picos. La poli (NVP) tiene la capacidad de absorber hasta un 40% de su peso en

agua, esto debido a los grupos carboxilos presentes en su estructura. En base a esto la primera señal a

3462 cm' puede ser atribuida al estiramiento (—O-H) formado por puentes de hidrógeno intermoleculares,

formados por el grupo carboxilo del anillo y el hidrógeno del agua absorbida durante su exposición a la

atmósfera; la presencia de las señales a 2950 cm' y a 1422 cm' representan los movimientos de

estiramiento (—C-H) y tensión (—C-C) pertenecientes a la cadena alifática. Por último la señal intensa a

51


1673 cm es asignado como la flexión del enlace carbonilo (—C=O) presente en el anillo adyacente al

nitrógeno. Sin embargo la presencia de la funcionalidad ácida, no fue observada de igual manera por ésta

técnica, por lo que el uso de un experimento alterno para determinar la presencia de la funcionalidad

requerida.

o Ca

E (1) = 1 1-

3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

Numero de onda (cm 1)

Figura 5-3. Espectro de FTIR-ATR para PVPC00H-1

5.1.1.2. Estudio cinético de la polimerización de NYP en presencia de ATC-1

Los resultados del estudio cinético de la polimerización de NVP en presencia del agente

tritiocarbonato ATC-1 se muestran a continuación. Esta reacción se llevó a cabo a 60°C y se empleó

AIBN como iniciador. La principal característica de esta polimerización es la ausencia de color en el

medio de reacción, lo que sugiere que el ATC-1 se consumió en su totalidad. Este fenómeno se podría

atribuir a la baja capacidad del radical carboxilo formado durante la fragmentación de ATC-1 para

reiniciar la polimerización de PVP I881 Otra característica a resaltar es el incremento repentino de la

viscosidad del medio en un tiempo muy breve (3 horas) de iniciada la reacción, esto se atribuyó a un

incremento repentino del peso molecular producido posiblemente por reacciones de terminación entre

cadenas poliméricas E91

A las 12 horas de iniciada la reacción, se observó una alta viscosidad en el medio cuando se alcanzó un

40% de conversión, lo que sugiere que esta y el peso molecular del polímero producido se incrementaron

rápidamente. Este comportamiento se puede atribuir a un proceso de autoaceleración en la velocidad de

polimerización de NVP en presencia de ATC-1, por consecuencia de un aumento en la viscosidad del

52


sistema, situación comparable a una polimerización vía radicales libres. Este efecto se observa en mayor

medida en polimerizaciones en masa [90]

Este comportamiento influyó en las características del polímero obtenido lo cual resultó en altos pesos

moleculares (Mn) e índices de polidispersidad (PDI). Los resultados para los polímeros obtenidos son

presentados en la Tabla 5-1. Estos resultados no concuerdan con las características esperadas en una

polimerización de tipo RDRP, por lo que posiblemente este fenómeno se deba a un intercambio lento

entre el agente ATC-1 y el radical propagante de PVP, lo cual dio como resultado la formación de un

intermediario estable, minimizando así la capacidad de desactivación y por ende un pobre control de la

polimerización [911

Tabla 5-1. Pesos moleculares y polidispersidad obtenidas para PVPCOOH-1, polimerizado en masa en la

presencia de ATC-1 y AIBN a 60°C

2 150 1242 4685 1.9 6.03

5 150 3453 8322 1.6 20.72

12 150 6297 10363 1.7 36.35

24 150 6495 22591 1.5 38.97

aAZObjS (isobutironitrilo) (AIBN) concentración 7.5 x10 M. CMLWC [M]0/[RAFT] x convn x 111 + 239. °GPC en DMF como

eluente a 40°C y estándares de PMMA. e Conversión del monómero determinada gravimétricamente

Lo anterior se confirmó mediante el análisis del peso molecular e índice de polidispersidad obtenidos por

GPC para el PVP en presencia de ATC-1 a lo largo de la reacción de polimerización (Figura 5-4). El Mn

se incrementó con el tiempo hasta alcanzar una conversión final de monómero del 39% en un periodo de

24 h. Por otro lado el PDI fue alto a bajas conversiones de monómero, pero disminuye gradualmente con

el tiempo. Este comportamiento es clásico en polimerizaciones con características "vivientes", en donde

el PDI disminuye conforme aumenta el porciento de conversión y el peso molecular. Sin embargo la

presencia de altos pesos moleculares (tres veces mayor al esperado), sugiere un periodo de iniciación

rápido y una terminación bimolecular (cabeza-cabeza) entre cadenas propagantes. Esto trae como

consecuencia cadenas de alto peso molecular, y a su vez indica que la velocidad de transferencia no fue lo

suficientemente rápida en comparación a la velocidad de propagación [92]

Por otro lado en la curva teórica de Mn contra conversión (Figura 5-4) se aprecia un incremento lineal

conforme aumenta la conversión. Este comportamiento no concuerda con el Mn experimental calculado

53


por medio de análisis de GPC. El doble de incremento de Mn al 40 % de conversión, sugiere una posible

autoaceleración (4 punto) en el proceso de la polimerización o un mayor porciento de reacciones de

terminación biomoleculares, lo cual podría ser provocado por efectos difusivos dentro del sistema de

reacción, lo que significa que al alcanzar altos pesos moleculares hay un incremento en la viscosidad del

medio por lo que las cadenas solo reaccionan con monómeros propagando aceleradamente y por ende

incrementando el peso molecular de forma repentina [931

25000 MnGPC PDI

20000

15000 5 5

O)

10000 4

5 5 3

5000 2

O

1 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5

Conversión

Figura 5-4. Grafica de Peso molecular y PDI contra conversión de NVP con AIBN a 60°C en presencia de

ATC-1

De igual manera, en la misma gráfica se observa el comportamiento del PDI (Figura 5-4) el cual presenta

una disminución conforme aumenta el grado de conversión con respecto al tiempo. Esto también se puede

atribuir a la participación de una polimerización viviente vía radicales libres, es decir, una rápida

iniciación acompañada de la disminución de las reacciones de terminación e intercambio rápido durante el

equilibrio entre especies durmientes y activas [94]

Sin embargo para una de polimerización controlada, los valores de PDI deben ser inferiores a 1.5, valor

que no se alcanzó aun después de 24 h de reacción. Reportes en la literatura mencionan que la velocidad

de polimerización está determinada no solo por la concentración de agente de transferencia sino también

por la naturaleza del grupo saliente. En nuestro caso, la relación monómero/CTA-1 fue de 150, lo que

podría sugerir que la velocidad de polimerización se vio disminuida en comparación con una

54


polimerización vía radicales libres de NVP. Sin embargo el efecto de autoaceleración es comúnmente

observado en una polimerización viviente vía radicales libres a bajas concentraciones de agente de

transferencia, por lo que en este caso la presencia de ATC-1 no minimizó este comportamiento aún a

conversiones relativamente altas (40%) [90, 92, 94]

La Figura 5-5 muestra los resultados de caracterización mediante cromatografia de permeación en gel

(GPC) del PVPCOOH-1 a diferentes tiempos de reacción. En la gráfica se aprecia un desplazamiento

hacia bajos volúmenes de elución lo cual está relacionado con el incremento del peso molecular con el

tiempo. Además la presencia de un hombro en las diferentes curvas sugiere un comportamiento bimodal

de las especies presentes4. Comportamiento atribuido a la baja eficiencia en el control de la

polimerización por el agente RAFT y a la presencia de cadenas poliméricas muertas [95]

60 65 70 75 8:0 85

Volumen de elucion (mL)

Figura 5-5. Cromatografia de permeación en gel de PVPC00H-1 en DMF con estándares de PMMA a

40°C.

Este comportamiento del ATC-1 en la polimerización de NVP puede ser atribuido a su propia estructura,

y ha una limitación en la capacidad de ATC-1 de transferir durante el proceso de polimerización [96]

Convertine y col .Reportes en la literutura donde se realizó la polimerización de NVP con tritiocarbonatos

de tipo simétrico conteniendo la funcionalidad COOH en ambos extremos, se observó que el

comportamiento cinético presentado en este tipo de polimerizaciones es atribuido a la eficacia del radical

propagante formado por el PVP, aunado a la disminución de la labilidad del grupo saliente del agente

provocada por la presencia del grupo ácido, así como la baja capacidad de estabilizase del grupo R, al

igual que las condiciones específicas de cada reacción y las reacciones secundarias que pudieran

presentarse las cuales son comunes en la síntesis de PVP [97]


En base a los resultados obtenidos de Mn y PDI para PVPCOOH- 1 se proponen los siguientes factores

que podrían haber influido en la obtención de polímeros con alto peso molecular: la desactivación del

agente RAFT, y la desactivación del radical 2-carboxil-2-propil formado durante el proceso de

fragmentación el cual resultó ser un pobre grupo saliente en relación al radical propagante formado por

pyp 181' 981.

Por otra parte la desviación del Mn (obtenido por GPC), con respecto a lo esperado, diversos autores lo

atribuyen a interacciones con la columna de SEC, parámetros de Mark-Houwink utilizados o un

incremento en las reacciones de terminación. Sin embargo una alternativa que ofrece la polimerización

vía RAFT es la incorporación de grupos activos al final de cadena lo que podría sugerir la existencia de la

funcionalización de la cadena aún que el control no haya sido el adecuado. Por tanto el uso de ATC-1 en

NYP ofrece una alternativa viable para la síntesis de PVP portando un grupo ácido carboxilo terminal.

5.1.2. Análisis de grupo ácido carboxílico terminal

5.1.2.1. Marcaje de poli (vinil-pirrolidona) (PVPCOOH-1) utilizando pirenmetilamina

para la detección espectroscópica del grupo ácido terminal

Una de las mayores limitaciones a las que se enfrenta la síntesis de polímeros con monómeros como

el NVP, es la introducción de grupos funcionales finales, tales como el ácido carboxílico, y al mismo

tiempo mantener un buen control sobre la distribución molecular del mismo. De esta manera el uso de

agentes o iniciadores conteniendo dicha funcionalidad ha sido un factor clave. Sin embargo su

identificación mediante técnicas como resonancia magnética nuclear e infrarrojo no siempre es tan

efectiva cuando la presencia de dicho grupo es mínima o por la existencia de señales que pueden interferir

en su interpretación. Una alternativa es el análisis por espectroscopia de UY-visible y fluorescencia las

cuales permiten, mediante la unión de un compuesto cromóforo como el pireno, llevar a cabo el marcaje

de grupos específicos y detectar estructuras o interacciones entre moléculas [991 así como la detección de

grupos funcionales.

El pireno es un hidrocarburo aromático policíclico formado por la unión de cuatro anillos bencénicos, esta

estructura lo hace uno de los colorantes más atractivos en pruebas de emisión de compuestos

fluorescentes. Una molécula de pireno es capaz de emitir a 340 - 350 nm, sin embargo presentan la

capacidad de formar complejos bimoleculares conocidos como excimeros, los cuales son formados

cuando al establecerse un complejo bimolecular entre dos moléculas de pireno pasa a un estado excitado

mientras que la otra se encuentra en estado basal provocando una emisión en fluorescencia a 450 - 600

nm perteneciente al excimero.

56

2 co

800

700

600

500

400

300

D 200

a 900

100

c O

0.20j

PVPCOOH-1 0.15-II

0.101

0.00j


Para corroborar la presencia del grupo ácido carboxílico terminal, este grupo final fue derivatizado con el

grupo cromóforo 1 -pirenmetilamina (PyMeNH2). La detección del cromóforo fue realizada mediante Uy-

visible y fluorescencia empleando una longitud de onda en UV a 340 nm. La Figura 5-6 presenta los

espectros de absorción y de emisión obtenidos para PVPC00H-1 marcado con PyMeNH2, que en lo

sucesivo denominaremos PyPVPC00H-1, así como el polímero sin modificar. Reportes en la literatura

indican que el PyMeNH2 libre presenta dos picos máximos de absorción a 328 nm y 344 nm

respectivamente 1100,1011.Como se puede observar en el espectro de Uy-visible, el polímero PVPCOOH-1

sin modificar (a), presenta un pico máximo de absorción a 219 nm, atribuido al grupo carboxilo de la

unidad repetitiva del PVP. Por el contrario el espectro de absorción del PyPVPCOOH-1 (b) mostró

señales de baja intensidad a 274 nm, 324 nm y 340 nm, las cuales se relacionan con el PyMeNH2 libre.

Además se observa un desplazamiento hipsocrómico del pico máximo de absorción de 219 a 216 nm, lo

cual puede ser promovido por el ambiente químico del pireno presente.

250 300 350 400 450 500 360 380 400 420 440 460 480 500

Longitud de onda (nm)


- Figura 5-6. Espectro UY-visible (izquierda) de PVPCOOH-1 antes y después de la derivatización con

PyMeNH2, y el espectro de fluorescencia (derecha) para PyPVPCOOH- 1 y PyMeNH2 libre, excitados a

340 nm a una concentración 0.2 mg/mL en solvente metanol.

Estos datos coinciden con la información reportada por Zhou y col °', donde se reporta la

funcionalización de estireno utilizando un agente de transferencia el cual provee de un grupo pireno en el

extremo de la cadena y observando un máximo de absorción por UY-Visible a 344 nm atribuido a este

grupo, Por otro lado el análisis por espectroscopia de fluorescencia de PyMeNH2 libre presentó dos

máximos a 375 nm y 393 nm, los cuales son originados por la emisión exhibida por el grupo pireno

presente84' 102]

57


La estructura vibrónica promovida por Py-PVOCOOH-1 es similar al PyMeNH2 no enlazado, sin

embargo se observa un incremento en la intensidad de fluorescencia de Py-PVPCOOH, en comparación

con PyMeNH2 libre. Esto podría ser relacionado por el ambiente químico provocado por la unión del

polímero al pireno así como a la concentración de pireno presente, de esta manera, el diferencial en

intensidad puede ser atribuido a la imposición de la estructura conformacional adoptada por el

PVPCOOH en metanol, presentando una conformación extendida por la influencia de la polaridad del

solvente. Ou y col [102], reportan la conjugación de pireno a nanotubos de carbono, en donde la similitud

en ambos espectros (fluorescencia) es provista por el medio ambiente polar en que se encuentran ambos

compuestos (metanol), dicho comportamiento es semejante al encontrado en este trabajo.

Para determinar la capacidad de emisión del PyPVPCOOH-1 se expuso una solución de este material bajo

una lámpara de luz UY y se comparó con el polímero sin modificar (Figura 5-7). Al ser excitados a 340

nm, la solución que contenía el polímero modificado emitió una coloración azul intensa la cual es propia

del colorante, corroborando una vez más la presencia de este, así como la funcionalidad del ácido

carboxílico.

Figura 5- 7. Imagen obtenida de una solución de PyPVPC001-1-1 al ser excitado con una lámpara de Uy-

visible a 340 nm y su comparación con PVPCOOH-1 sin modificar.

La concentración de pireno enlazado a PNVP se cuantificó mediante la ley de Lambert-Beer, utilizando

un coeficiente de extinción molar de 40 000 mol/L 184, 1021 y tomando como base el valor de la absorbancia

a 340 nm en los espectros de UV-Visible. Los valores obtenidos de concentración de PyMeNH2 fue de 7

x 10 M, estimando una concentración de PyMeNH2, en el polímero de 2.8 x 10 mol/g de polímero. En

base a esto se podría asumir que si por cada mol de PyMeNH2 reacciona 1 mol de ácido unido a

PVPCOOH- 1, se sugiere que el total de cadenas que podrían estar funcionalizadas con grupos ácidos son

un total de 2.8 x 1 0 mol/g de polímero. Sin embargo este es un valor estimativo y puede variar de forma

58


importante, dependiendo de varios factores entre los que se incluye la reactividad de los grupos

acoplantes.

De ésta forma el uso del marcaj e de grupos cromóforos permite la identificación de grupos funcionales

presentes en moléculas y que son factibles de ser acopladas a moléculas biológicas, un ejemplo de ello es

reportado por G. Hermanson y col 11031, quienes analizaron el uso de pireno en el marcaje de moléculas

utilizadas en bioconjugación para la localización de grupos funcionales terminales que son factibles de

acoplarse a otras moléculas. De igual forma S. Hilf y col utilizaron esta técnica en el análisis de grupos

finales presentes en la esterificación de olefinas con tricloroetanol, donde la señal atribuida al grupo

metilo adyacente al oxígeno del éster aparece a E4.8 ppm, por lo que se utilizó como referencia en este

trabajo para la identificación del grupo ácido terminal presente en PVPCOOH-1.

5.1.2.2. Análisis de grupo acido carboxílico terminal mediante esterificación del grupo ácido

presente en PVPCOOH-1

Para corroborar los resultados obtenidos mediante la derivatización del ácido terminal con un

grupo cromóforo, se realizó un experimento paralelo de derivatización a un grupo éster conteniendo un

grupo bencénico, el cual permitiera su visualización mediante RMN. 'H Con esto se confirma la

funcionalización de PVPCOOH-1 con un grupo ácido terminal, resultando provechoso para su aplicación

en bioconjugación con la enzima papaína.

En este caso, el análisis mediante resonancia magnética nuclear de protón también reveló la presencia del

ácido carboxílico terminal, mediante la esterificación con un alcohol bencílico. La Figura 5-7, muestra el

espectro de RMN 'H, obtenido después de la esterificación. Éste presenta las señales a S 7.5 -7.4 ppm

atribuidas al anillo aromático del alcohol bencílico y 3 4.7 ppm, el cual se atribuye al grupo -CH2 alfa al

oxígeno y perteneciente al alcohol bencílico (a). Estudios de análisis final de grupos ácidos mediante

RMN es comúnmente utilizado mediante la modificación de éste con compuestos cuyo ambiente químico

-

provoque desplazamiento o en su efecto la aparición de señales diferentes al espectro obtenido. Este

análisis permitió estimar el peso molecular del polímero por RMN 'H, tomando como referencia la

integración de las señales del anillo bencílico y su comparación con las integrales obtenidas para

PVPCOOH-1 de acuerdo a la metodología reportada por Zhou y col, y mediante la Ecuación 10.

Mn = (=174-

\) * PM de NVP Ecuación (10) 5

Donde las integrales 1 de 61.2 a 64.3 ppm son asignados a los protones de la unidad repetitiva de

PVPCOOH-1 y la señal de 1 de 67.4 a 67.5 ppm a los protones pertenecientes al anillo aromático. El Mn

59


absoluto obtenido por resonancia de protón fue de 18,250 gImo! (considerando la señal del cloroformo

despreciable).

SC4H9

- ss

N3

b) a) A, ÇQ /.

7.0 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0

id,p1i[llI

Figura 5-7. Espectro RMN 'H obtenido para PVPCOOH-1 esterificado con alcohol bencílico en CDCI3 a

300MHz

Al comparar estos resultados con los obtenidos mediante GPC (22 000 g/mol) se observan un valor

ligeramente menor. Esto puede ser atribuido a la integración de las áreas lo cual puede provocar errores

en el cálculo de Mn, así como el grado de funcionalización ya que mediante RIVIN, el número de grupos

carboxilos por molécula para polímeros de alto peso molecular tiende a ser menor al encontrado mediante

otras técnicas; debido a la alta proporción de cadenas derivadas del iniciador [102,1031 por lo que una

alternativa es el uso de iniciadores con funcionalidad similar al grupo funcional en este caso ácido.

Por lo que para el caso de PVPC00H-1 sólo fue factible visualizar las cadenas poliméricas que tuvieran

unido el grupo éster. Los estudios anteriores permitieron determinar la presencia del grupo ácido termina]

en PVPCOOH-1, resultando conveniente el proceso de polimerización mediante ATC-1. De igual manera

la funcionalidad requerida permitió su posterior aplicación en la bioconjugación de este polímero a la

enzima papaína, resultando benéfico para este trabajo.

60


5.1.3. Polimerización vía radicales libres en masa de N-vinil-pirrolidona (NVP)

empleando ácido 4-(etoxicarbonotioiltio) metil benzoico (ATC-2).

Los reportes de la polimerización de NVP con agentes del tipo xantato han demostrado ser eficientes,

otorgando un control simultáneo en el peso molecular e índice de polidispersidad. Esto último es

atribuido a que monómeros como NVP producen un radical de propagación con baja labilidad y alta

reactividad similar al acetato de vinilo 1041, en comparación con monómeros de tipo estirénicos o acrílicos.

Los agentes RAFT-MADIX se han presentado como una alternativa ya que cuentan con una baja

capacidad de intercambio del grupo O-X (O-alquil) 05 y que además otorgan un incremento en la

eficiencia de polimerización de monómeros de tipo vinílico como el NVP. La Figura 5-8 muestra la

reacción de polimerización de NVP mediante el agente de transferencia de tipo xantato ATC-2, la cual se

llevó a cabo en masa a 60 oc y en presencia de AIBN. Una de las principales característica que ofrece

ATC-2 es su grupo reiniciante de tipo bencílico, lo cual podría otorgar un buen control en la

polimerización de NVP.

0-0

s

1 60°C

+ AIBN +

HO

ATC-2 NVP

HOO+± 0

Cr-

O FVPCOOH-2

- Figura 5-8. Reacción de polimerización de NVP utilizando AcT-2, en masa a 60°C y relación molar de

300/2/0.4 (NVP/ATC-2/AIBN)

El análisis de RMN 'H del polímero resultante se presenta en la Figura 5-9. El espectro de RMN 1 H

muestra los desplazamientos típicos para PVP descritos anteriormente. Además se puede observar los

desplazamientos a S 7.2 - 7.9 ppm, atribuidos al anillo bencénico del ACT-2, asimismo, muestra a S 5.7 y

5.2 ppm las señales asignadas al —CH2 alfa al oxígeno del grupo 0-etil y al —CH de la cadena alifática de

pvpcOOH-2. Las señales no asignadas son atribuidas a impurezas.

61


OH

b

ppm

Figura 5-9. Espectro de 'H RMN para PVPCOOH-2 obtenido en CDC13 a 300 MT-Iz. Perteneciente a

PVPC00H-2, 24h a 60°C.

El comportamiento de la polimerización de NVP con ATC-2 se muestra en la Tabla 5-2. Donde se puede

observar que ATC-2 influyó de forma importante en el control del Mn (14,000 g/mol) y PDI (1.18),

inclusive a altas conversiones (70%). Esto sugiere que la relación molar utilizada de Mónomero/ATC-2

resultó ser la apropiada para la obtención de polímeros de bajo peso molecular además de permitir un

buen control en el PDI. La coloración del medio de reacción fue transparente a lo largo de la

polimerización. Si bien es sabido que NVP no es fácilmente polimerizable mediante la técnica de PRC/V,

estos resultados demuestran que el uso de xantato es una alternativa posible en la obtención de polímeros

con Mn y PDI controlados.

- Tabla 5-2. Relación de pesos moleculares obtenidos en la polimerización de NVP utilizando ATC-2 en

masa a 60°C e iniciada mediante AIBN

2.0 150 4507 8194 1.18 27.66

5.0 150 8010 12057 1.15 50.36

7.0 150 9626 12515 1.13 60.84

24.0 150 11149 14905 1.10 70.71

Azobis(isobutironitrilo) (AIBN) concentración 9.57 x10 5 M. aMcI [M]Q/[RAFT} x convn x 111 + 258. b.CSEC en DMF como

eluente a 40°C y equivalentes de PMMA. dConversión del monómero fue determinada gravimétricamente.


Una vez que se consiguió la incorporación del grupo xantato con un grupo carboxilo en el extremo de las

cadenas de PVP, se decidió estudiar el comportamiento cinético de esta reacción. La Figura 5-10 muestra

la relación de Ln (M0/M) contra el tiempo así como la relación del Mn obtenido por RMN 11-1 contra la

conversión. Como se puede observar los resultados obtenidos exhibieron una estrecha relación entre el

Mn y el PDI aún a bajas conversiones.

Sin embargo al incrementar la conversión (-50%), el peso molecular se desvió por debajo del teórico

calculado. Este comportamiento indicó la presencia de reacciones de transferencia, las cuales son

comunes en la polimerización en masa de NVP. No obstante, en la gráfica semilogarítmica de conversión

con respecto al tiempo, se observó un periodo de inhibición de aproximadamente 1 h, el cual pudo ser

causado por una lenta fragmentación durante el pre-equilibrio [105, 1061 De igual manera la velocidad de

polimerización presentó un comportamiento de segundo orden con respecto al tiempo, atribuido a que el

agente de transferencia se consumió de forma paulatina, alcanzado el consumo total al final de la

polimerización. El máximo de conversión se alcanzó a las 24 h de reacción (76 %) y se mantuvo lineal a

tiempos bajos de reacción, iniciando una autoaceleración a partir de las 5 h de polimerización, lo que

provocó una rápida conversión de monómero y desvió el peso molecular por debajo del teórico.

1.4 - 1.2

1.0 0.8 0.6

0.4 •

0.2 •..0

0.0 - . . • 0 5 10 15 20 25

TemDo (horas Mn

QUUV teorico MnRMN

— 6000 A A

—4000 2?

2000

o 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8

Conversion

Figura 5-10. Comportamiento de la polimerización de NVP iniciada con AIBN a 60°C en presencia de

ATC-2

Una forma de explicar el comportamiento de la polimerización de NVP en masa y las razones del porque

la mayoría de los trabajos de PR/V de NVP se han realizado en solución está relacionado con su

63


estructura, en donde las reacciones de terminación y transferencia al monómero en el caso de PVP son

altas. Este monómero presenta una velocidad de polimerización más elevada en solución acuosa que en

solventes orgánicos y en masa. Este incremento está relacionado a una fuerte hidratación de ambos, el

NVP y PVP, vía interacciones de puente de hidrógeno, entre el agua y el átomo de oxígeno del grupo

carbonilo, afectado la densidad de carga electrónica del grupo vinil 07]•

En la gráfica de Mn calculado por medio de análisis de grupo final mediante RMN 1H, (Figura 5-10)

indicó un valor máximo de 7 600 g/mol, el cual fue cercano a los valores calculados, por lo que si se

supone que una cadena de polímero de PVP formado fue generado por una molécula de ATC-2, las

cadenas de polímero contendrán la funcionalidad en el extremo alfa de la cadena en la mayoría de estas.

Por otra parte en la curva de Mn contraconversión mostró que el valor de Mn determinado por GPC para

el PVPCOOH-2 (Figura 5-1 1), está por encima del teórico calculado. Esto fue atribuido a la habilidad del

agente ATC-2 para llevar a cabo un eficiente proceso de trasferencia. Es conocido que los agentes que

presenten esta característica tienden a un comportamiento donde el peso molecular es mayor en relación

al teórico esperado, principalmente durante la etapa inicial de la polimerización. Ciertos reportes [108]

sugieren que la síntesis de NVP donde se utiliza el xantato en la polimerización de este monómero, la

naturaleza del grupo saliente es determinante en el mecanismo de iniciación y por ende en el nivel de

control sobre la polimerización y la obtención de PDI estrechos (Figura 5-11). Por otra parte, conforme

aumentó el grado de conversión, se obtuvieron PDI estrechos incluso a bajas conversiones de monómero,

sugiriendo que el radical metil-fenilo al ser un buen grupo saliente y con una alta capacidad de

estabilizarse fue consumido de una manera más rápida, lo que dio como resultado la obtención de una

distribución de pesos moleculares más estrechos, comportamiento característico de una polimerización

radicálica controlada [107, 1081

64


£fl 15000

12500

10000

7500

2 5000

2500

0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7

conversion

Figura 5-11. Gráfica de peso molecular y PDI contra conversión de NVP iniciada con AIBN a 60°C en

presencia de ATC-2

Los cromatogramas obtenidos mediante GPC (Figura 5-12) revelan la evolución del peso molecular con

respecto al tiempo. Estos se caracterizan por presentar un comportamiento unimodal, sin la presencia de

hombros. La ausencia de reacciones secundarias, el incremento progresivo del Mn (determinado por

GPC) con la conversión y la obtención de índices de polidispersidad estrechos, incluso a altas

conversiones, es un indicativo típico para una polimerización controlada y viviente 1 1091 Sin embargo los

valores de Mn obtenidos por RMN y GPC (Tabla 5-2) no son coincidentes entre sí.

Este hecho podría ser atribuido a que las condiciones utilizadas durante el análisis mediante GPC no

fueron las indicadas (eluente, curva de calibración), sobrestimando así, el peso molecular en relación al

teórico y al calculado por RMN. Además es conocido que la cuantificación del Mn por RMN es

atribuida solo a las cadenas funcionalizadas, a diferencia de lo que ocurre cuando el Mn se determina por

medio de GPC, en el cual solo depende del volumen hidrodinámico y del número total de cadena sin

distinción de la funcionalización.

4.5

4.0

3.5

2.5 0.

2.0

1.5

1.0

65


Incremento del Mn

6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5

Volumen de elucion (mL)

Figura 5-12. Cromatografia de permeasión en gel para PVPCOOH-2 en DMF a 40°C y 1 mg/mL.

Comportamientos similares a ATC-2 fueron observados en la polimerización de NVP utilizando

RAFT/MADIX características como ausencia del periodo de inhibición, control de Mn y PDI" 10] así

como la obtención de una estructura controlada con un alto grado de tacticidad, pueden ser obtenidos por

esta técnica [11 1]• Estos reportes mostraron que MADIX resultó ser un buen sistema de polimerización de

NVP, lo que ofreció un sistema viable en la bioconjugación de enzimas, proveyéndole al polímero

resultante un estrecho índice de polidispersidad, bajo peso molecular y alto grado de funcionalidad.

De acuerdo a estos resultados, los agentes de transferencia ATC- 1 y ATC-2, aun no evaluados para la

polimerización en masa de N-vinil-pirrolidona, ofrecieron una ruta alternativa de síntesis para la

obtención del polímero PVP funcionalizado con un grupo ácido terminal, el cual pudo ser empleado para

la bioconjugación con enzimas como la papaína y la L-lactato deshidrogenasa.

66


5.2. Bioconjugación de N-vinil-pirrolidona ácido terminal sintetizado mediante

ATC-1 (PVPCOOH-1) a la enzima papaína (Carica papaya).

La bioconjugación de PVPC00H-1 con la enzima papaína se realizó a través de la unión química de los

grupos aminas libres pertenecientes al aminoácido usina presentes en la papaína (112] y el grupo ácido

carboxílico terminal de PVPCOOH-1. Esta metodología fue propuesta por Veronese y col como una

alternativa de bioconjugación de la papaína con polímeros de carácter hidrofilico y así poder evaluar su

capacidad de incrementar la respuesta a parámetros como temperatura o pH de ésta enzima en

comparación con su contraparte nativa

Una razón para llevar a cabo esta reacción es que de acuerdo a la revisión bibliográfica realizada por el

equipo de trabajo involucrado en esta tesis, no se ha encontrado en la literatura la bioconjugación de

papaína con poli (vinilpirrolidona) ácido terminal sintetizado bajo las condiciones propuestas.

El bioconjugado obtenido, denominado P-PVPC, se caracterizó por ser un sólido color café claro, y un

presentar un ligero olor a pescado (olor característico de la enzima). Por otra parte el proceso de

activación del grupo ácido carboxílico terminal mediante los esteres activos de NHS permitió unir de

manera selectiva a grupos aminos accesibles, resultando eficiente en la síntesis de P-PVPC.

La Figura 5-13 presenta los datos revelados al llevar a cabo el análisis mediante ATR-FTIR del

PVPCOOH-1 (a), PVPCOOH-NHS activado (b), P-PVPC bioconj ugado (c) y de la papaína libre (d). La

estructura de PVPCOOH-1 presentó tres bandas importantes, la primera se ubicó a 3420 cm1 la cual es

asignada al estiramiento —O-H lo cual se atribuye a los puentes de hidrógeno intermoleculares producidos

por el carboxilo y el agua absorbida de la atmósfera, la segunda a 1659 cm' pertenece al estiramiento del

grupo carbonilo del anillo pinol y la tercera ubicada a 1290 cnf' se asoció al movimiento de tensión C-C

de la cadena alifática. El espectro perteneciente a PVPC00H-1 activado con NHS, se diferencia con el

PVPCOOH-1 por poseer una señal ubicada a 1560 cm' la cual es atribuida al enlace éster activo (-0-

00-) derivado del ataque nucleofihico del NHS al ácido carboxílico. Además se logra observar un

desplazamiento hacia bajas frecuencias de absorción en las bandas ubicadas a 3392 y 1669 cm"atribuido

muy probablemente al ambiente químico provocado por las interacciones del NHS. El espectro de

papaína libre presentó cuatro señales características. La primera ubicada a 3284 cm' fue atribuida a la

banda de la amina 1, seguida por las señales a 1640 cm' y 1545 cm' atribuidas a la banda amida II,

además de otra señal a 1084 cm1 del estiramiento —C-N de la amida.

67


Por otro lado el espectro de P-PVPC exhibió las bandas características de PVPCOOH-1 ligeramente

desplazadas hacia 3293, 1663, 1293 cm" así como las correspondientes a la papaína nativa a 1541 cm' y

1071 cm t las cuales son atribuidas a las bandas de absorción pertenecientes a la banda amida II (-CONH)

y al estiramiento —C-N de la amida, los cuales son grupos abundantes en la estructura de las proteínas [113]

3293 T 41Vfl1291071

63

3284 1640 1545

i392 ÇflÇ' 1669

1659.

3500 3000 1500 1000

Numero de onda (cm 1)

Figura 5-13. Espectro FTIR-ATR de polímeros de PVP y bioconjugados de PVP-papaína. a) PVPC00H-

1, b) PVPCOOH-NHS, c) papaína libre y d) P-PVPC.

El contenido de papaína en el bioconjugado se cuantificó mediante el microensayo de Bio-Rad (Anexo 6)

El resultado arrojó un total de 0.117 mg de proteína/mg de bioconjugado. Este valor correspondió a un

13.56% del total de proteína enlazada al PVPCOOH-NHS, el cual es un valor similar a reportes existentes

en la literatura, empleando soportes como alúmina (4 y 13%), sílice (13-16%) y quitosán (36 %)[l141151

Se ha observado que el uso de polímeros hidrosolubles ha incrementado su aplicación en la

bioconjugación, principalmente aplicados a enzimas como la papaína. Sin embargo, como ya se ha

mencionado anteriormente, factores como el peso molecular del polímero influyen de manera

considerable en el grado de conjugación, principalmente por existencia de un impedimento estérico

mayor, lo que reduce la eficiencia de acoplamiento a la superficie de la proteína, trayendo como

consecuencia una baja eficiencia de modificación y por ende una reducción en la actividad enzimática de

la proteína [116] De esta manera los resultados obtenidos en el grado de modificación se vio reducido por

las características del PVPC00H-1 sintetizado el cual presentó un Mn de - 22,000 g/mol y un PDI de

68


1.5, afectando la eficiencia de bioconjugación. Otro factor atribuido al grado de modificación, es la

naturaleza del polímero o soporte utilizado principalmente, el carácter hidrofilico o hidrofóbico. Esto fue

observado por Biasutti y col 11171 quienes realizaron sin éxito la inmovilización por inmersión de papaína

en albCimina. Encontrando que su carácter hidrofihico o arreglo conformacional en solución afecta su

capacidad de absorción hacia el soporte.

Lo anterior permitió inferir que las características de PVPCOOH-1 (22 000 gImo!, PDI 1.5) fueron

determinantes en el grado de conjugación. Sobre todo los efectos de impedimento estérico producido por

las cadenas de mayor peso molecular los cuales minimizaron la capacidad del polímero de difundir hasta

los grupos aminos aprovechables de la enzima, conjugando solo los que se encontraban con mayor

disponibilidad. Este rendimiento puede ser incrementado si se logra obtener un polímero con las

características necesarias que permitan lograr una efectiva conjugación [116, 1171

5.2.1. Determinación del peso molecular de P-PVPC mediante Exclusión de Tamaños

utilizando Cromatografía Líquida de Alta Resolución (HPLC).

La determinación del peso molecular de P-PVPC se llevó a cabo mediante SEC-HPLC y

utilizando una curva de calibración obtenida a partir de proteínas de peso molecular conocido. La Figura

5-14 presenta la curva obtenida para P-PVPC en comparación con la papaína libre. Donde se observa un

tiempo de elución menor para P-PVPC a 9.87 minutos en comparación con la papaína la cual tuvo un

tiempo de elución a 11.19 minutos. También se observa un incremento en la intensidad de absorbancia de

P-PVPC, la cual fue atribuida a la absorción producida por la presencia de PVPCOOH-1 en conjunto con

la papaína, los cuales presentaron un máximo de absorción en el UY a 210 nm característico del enlace

amida. La Figura 5-1 4b muestra un acercamiento de la curva, esta se caracterizó por ser unimodal, lo que

indicó que no existen especies a altos pesos moleculares, que intervengan en la caracterización, además se

infirió que no hay presencia de enzima residual ni PVPCOOH-1 el cual tuvo un tiempo de elución a 12.60

minutos (cromatograma no presentado).

69

70

60

1— Paoeir,a libre

50

o


6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Tiempo de elucion (mm)

b)

11'lPapaina

7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 11.0 11.5 12.0 12.5

Tiempo de elucion (mm)

Figura 5-14. Cromatogramas obtenidos para el análisis de HPLC-SEC para P-PVPC y papaína libre.

En el análisis del peso molecular, Figura 5-15, se observó para el P-PVPC un Rf de 0.7034 con un log

Mw de 4.7885 1, el cual corresponde a un peso molecular (Mw) de 61, 448 g/mol. Mientras que la enzima

libre presentó un Rf de 0.7908 y log Mw de 4.3693 con un Mw de 23 406 g/mol. Estos resultados

indicaron que dos cadenas de PVPCOOH-1 se unieron a la papaína, considerando el peso molecular de

22,000 g/mol. Sin embargo, el PVPCOOH-1 presentó una amplia PDI, lo que podría sugerir que no solo 2

cadenas fueron enlazadas a la papaína, ya que en el medio existen cadenas de diversos tamaños las cuales

pueden ser mayores o menores, lo que sugiere que podría ser mayor el grado de conjugación. Además, el

análisis de cuantificación de grupos aminos mediante el método de TNBS arrojó un porciento de aminas

conjugadas de 32.3 % lo cual es inconsistente con el peso molecular.

5.4 • Piruvaco kinas

. Glucosa oxidasa 5.2

Lactato deshidrogenasa

5.0

4.8 BSA •'ppvpc papaina

4.6 Peroxidasaderabano u

Bromeflna • 4•4 Pepsina

4.2 • Lizosima

4.0 0.60 0.65 0.70 0.75 0.80 0.85

Rf (mm)

Figura 5.15. Obtención del peso molecular de P-PVPC mediante HPLC-SEC.

70


La diferencia encontrada en el peso molecular puede ser atribuida además del grado de conjugación, al

desdoblamiento de la enzima dentro de la columna de HPLC al igual que en un gel de electroforesis, al no

ser estos sistemas homogéneos, ejercen cierto impedimento a la enzima al pasar a través de ellos,

obligándola a adoptar una conformación que le permitió no sufrir hidrolisis y por ende su

desnaturalización. [lIS, 119]

5.2.2. Análisis conformacional de P-PVPC mediante Dicroísmo Circular Ultravioleta

lejano (Far-UV-CD).

Los espectros de dicroísmo en la región del ultravioleta lejano, se deben principalmente a los

enlaces amida que unen los residuos de los aminoácidos entre sí. La asimetría de estos cromóforos se

debe al arreglo espacial de la cadena principal de la proteína, por lo cual, las señales de dicroísmo circular

se pueden interpretar en términos del contenido de estructura secundaria presentes, es decir, del

porcentaje de residuos que se encuentran en alguna conformación estructural (hélices, hojas, giros y otros

tipos estructurales). Además el estudio por dicroísmo circular (DC), permite conocer si las moléculas son

ópticamente activas, que en buena medida, depende de su conformación (rígida o flexible).

En las proteínas, el análisis mediante dicroísmo permite determinar la cuantificación de conformaciones

a-hélices y láminas 3-plegada, conformación que suelen adoptar las enzimas debido a las interacciones

entre los grupos dentro de su estructura (puentes de hidrógeno, fuerzas de Van der Waals, etc). Por lo que

el conocimiento del tipo de arreglo provee de información de cómo la enzima responderá ante

condiciones adversas a su medio nativo, al adoptar varias posibles conformaciones dependiendo de su

interacción con el medio. Así que al modificar la enzima se produce un cambio conformacional, donde el

solvente y otros factores fisicoquímicos son determinantes en la conservación de la conformación y en

última instancia de la estabilidad y actividad catalítica de la proteína en cuestión. Por tanto en este trabajo

se determinó si PVPCOOH-1 al ser conjugada con papaína provocaba un cambio conformacional en la

estructura tridimensional de esta.

El análisis mediante DC experimental se presenta en la Figura 5-15 (izquierda) y el DC calculado es

presentado en la Figura 5-15 (derecha). Los resultados de DC experimental, arrojó una fuerte absorción a

279 nm, lo cual es característico de las interacciones t-ir' de los grupos aromáticos presentes en los

aminoácidos triptófanos de la estructura primaria de las proteína. Además el espectro se acompaña de una

banda intensa a 238 nm atribuido a la interacción nir* de la amida de la estructura primaria de la enzima (120] El bioconjugado P-PVPC presenta un desplazamiento hipsocrómico de la señal a 228 nm lo que

puede ser provocado por la conjugación con PVPCOOH-1, acompañado de un efecto hipocrómico en la

71


sefíal a 279 nm asociado con un cambio conformacional de la proteína, así como interacciones de tipo

puente de hidrógeno y por ende una disminución en la absorción de los aminoácidos triptófanos.

PVPCOOH Enzima lib p_PvPc

ZO

220 240 260 280 300 320 340 360


Figura 5-15. Espectro de Dicroísmo circular experimental (izquierda) y calculado mediante SELCON

(derecha) obtenido para papaína libre, PVPCOOH y P-PVPC

De igual forma el espectro de DC calculado exhibe bandas negativas a 215 nm y 220 nm, y bandas

positivas a 198 nm, las cuales son características de la papaína en agua, donde el porciento de aH

predomina en comparación con otras conformaciones'20' 1211, La elucidación del cálculo del porcentaje de

alfa-hélice (aH) y beta- plegada (o-hoja) fue determinado mediante el Modelo SELCON de

dicroweb.com. Los resultados arrojados para papaína libre se estimaron en aH 6.110 % y para -hoja

5.736 %, y para P-PVPC aH 3.652 % y para 3-hoja 5.567 %.

Estos resultados indican un cambio de conformación en el porciento de alfas hélices presentes en el

bioconjugado con respecto a la enzima en su estado nativo. Revelando que la modificación con

PVPCOOH-1 fue eficiente provocando un reacomodo de la enzima y por ende un arreglo conformacional

más estable [121]• Además este cambio conformacional también puede ser atribuido a la formación de un

estado intermediario entre el estado nativo y el estado de desdoblamiento, el cual es usualmente

característico cuando incrementa el grado f3-plegada o aH dependiendo del solvente y método aplicado.

Los resultados encontrados en este trabaj o de la papaína nativa, difieren de reportes en la literatura,

reflejando valores inferiores en el porciento de alfa hélice [1221 Estos resultados podrían sugerir que el

comportamiento encontrado en nuestro trabajo fue inferido por la presencia de PVPCOOH-1 o por un

estado intermediario donde la enzima sufrió de un desdoblamiento o desnaturalización posiblemente por

hidrólisis.

72


5.2.3.Evaluación Catalítica del conjugado PVPC - papaína (P-PVPC) y su comparación

con la enzima nativa.

Para determinar si la modificación de la papaína debida a la bioconjugación experimentó algún

cambio en su actividad catalítica con respecto a la enzima nativa se realizaron ensayos modificando las

condiciones de reacción óptimas para la adecuada actividad de la enzima o bioconjugado (pH,

temperatura y exposición a metales pesados). La evaluación catalítica se llevó a cabo mediante la

interacción específica con el sustrato N-benzoil-arginina-p-nitroanilina (BAPA) a través del residuo de

fenilalanina. La hidrólisis de este enlace peptídico genera, la p-nitroanilida, que confiere un color amarillo

a la reacción, lo que permite seguir espectrofotométricamente el progreso de la reacción mediante la

medida de la velocidad de formación de este producto.

5.2.3.1. Determinación de las constantes cinéticas de Michaeles- Menten (Km) y Velocidad

máxima de reacción (V máx) de P-PVPC y papaína nativa. Los valores de Km y velocidad

máxima de la enzima libre fue de 12.19 mM (0.1249 x 10 2 M, 0.00534 g/mL) y 8.7 x 10 l.tmol*L

'*mjn', respectivamente, mientras que para el bioconjugado P-PVPC, estos valores fueron de a 16.39

mM (0.1639 x 10.2 M, 0.00711 g/mL) y 4.4 x 10.8 tmol*U'*min'. En ambos casos las Kms muestran un

orden de magnitud muy similar, lo que sugiere que la modificación de la papaína con el polímero

utilizado en la bioconjugación no altera de forma importante la afinidad del sustrato por el sitio activo de

la enzima modificada con respecto a la enzima nativa.

Sin embargo, las diferencias en el orden de magnitud en la velocidad máxima, indican que la unión de

PVPCOOH-1 con papaína provoca un cambio conformacional [124] en la enzima, y por ende crean cierto

impedimento estérico durante la difusión del sustrato hacia el sitio activo, reflejándose en el cambio de la

velocidad de reacción'251. Mole y colU26I reportaron la cinética de hidrólisis de BAPA con papaína

basándose en la actividad enzimática a diferentes valores de pH a temperatura ambiente, encontrando

diferentes valores de Km (4.07 a 6.20 mM), inferiores a los encontrados en este trabajo. Por lo que se

puede concluir que la Km depende directamente de las condiciones de reacción y es independiente de la

concentración de enzima. En un estudio similar Liang y col [127] reportan un valor de Km para papaína

libre y de su bioconjugado de 0.5830 g/mL y 0.3401 g/rnL obtenidos en la inmovilización de papaína con

nano partículas de Fierro, un valor 47 veces mayor que en nuestro sistema. Además otros autores'

reportaron que el uso de metales para inmovilizar de manera coordinada y mediante fuerzas

electrostáticas a las enzimas puede elevar hasta 100 veces su actividad catalítica, lo que podría justificar

los valores obtenidos128' 129] También se ha mencionado que la inmovilización de la enzima lipasa dentro

lt

73


de una matriz de PVP le provee una velocidad de reacción 50 veces mayor en comparación con la enzima

libre. Sugiriendo que la retención de la actividad e inclusive la limitación de difusión del sustrato puede

ocurrir por las condiciones de reacción dadas, así como el tipo de unión (covalente o no covalente) entre

el soporte y la enzima (Zelikin y col). Lo que podría justificar el comportamiento encontrado en nuestros

estudios.

5.2.3.2. Evaluación de la estabilidad y su respuesta catalítica de P-PVPC y papaína libre a

diferentes temperaturas.

El efecto de la temperatura en la actividad catalítica de la enzima libre y P-PVPC se presenta en

la Figura 5-16. La enzima libre presentó dos máximos de actividad enzimática a 45 y 55°C. Por el

contrario P-PVPC, mostró un incremento de io oc en la temperatura óptima logrando un máximo de

actividad enzimática a 65°C. Este aumento en la temperatura de reacción puede ser inferido por la

presencia del PVPCOOH- 1 el cual le otorgó una mayor estabilidad y respuesta a estas condiciones. Al

incrementar la temperatura tanto la papaína y P-PVPC presentan una disminución en la velocidad

enzimática y un decaimiento a 85 y 90°C, siendo más visible en la enzima libre que en P-PVPC.

Este comportamiento en P-PVPC puede ser atribuido a la relativa configuración extendida de la enzima

provocada por el ambiente químico de PVPCOOH- 1 y a un arreglo conformacional de la estructura

terciaria por influencia de la temperatura, o por un proceso de desnaturalización térmica. Estudios

reportados por Liang y col, reportaron una temperatura óptima de 75°C al emplear papaína conjugada

sobre nanopartículas carboximetiladas de Fe304 y observaron un decaimiento en la actividad enzimática

tanto en la enzima libre como en el bioconjugado a una temperatura de 85 y 90°C. Este comportamiento

es principalmente a la ruptura de los enlaces no covalentes presentes entre los grupos laterales a lo largo

de la cadena de aminoácidos presentes en la enzima, pudiendo inducir su desnaturalización por termólisis

y por consecuencia su inactivación.

74

30

11


Temperatura (°C)

Figura 5-16. Efecto de la temperatura para a) enzima libre y b) P-PVPC en la velocidad de actividad

enzimática. Concentración de BAPA 5 mM, y un tiempo de 30 mm.

Para corroborar lo anterior se determinó la relación que pudiese tener la temperatura con la actividad

enzimática mediante el cálculo de la energía de activación (Ea) la cual se define como la energía

necesaria para llevar a cabo la actividad catalítica y es dependiente de la temperatura (Figura 5-17). Para

llevar a cabo su determinación se empleó la ecuación de Arrhenius (Ecuación 9).

2.3*R*log VmaxlTlT2 Ea

=

2

Ecuación (T2—T1)

Donde R es la constante de los gases en cal/mol °K, V máx., 1 y 2 son las velocidades a las temperaturas

T1 y T2 respectivamente. La Ea calculada para P-PVPC es de 8.8lkJ/mol (2.10 kcal/mol) y para la enzima

libre es de 9.24 kJ/mol (2.20 keal/mol). La diferencia entre ambos valores es mínima sin embargo en

términos de energía de activación estos resultados sugieren que la enzima bioconjugada tolera

temperaturas más elevadas, requiriendo menor consumo energético para llevar a cabo la reacción de

hidrólisis del BAPA. Esto corrobora que la P-PVPC, presenta una mayor estabilidad en comparación a su

contraparte en respuesta a estas condiciones [126, 127, 128, 1291

tt Donde Ti para papaína libre se consideró 45 oc y T2, 55 oc, y para P-PVPC se consideró 550c y 650c.

75


1.20

1.15

1 : 1.00

E 0.95

0.90

0.00305 0.00310 0.00315 0.00320 0.00325 1/T (°K)

Figura 5-17. Grafica representativa del cálculo de la energía de activación (SG) para ambos sistemas

5.2.3.3. Evaluación de la estabilidad y su respuesta catalítica de P-PVPC y papaína libre a

diferentes pH.

La Figura 5-18 presenta la respuesta de la actividad enzimática de la enzima libre así como de

P-PVPC al cambio de pH. La velocidad máxima de actividad catalítica fue observada para la enzima libre

a un pH óptimo de 6.0, seguido de una caída en la curva a un pH de 7.5 y por ultimo un declive a pH 8.5.

Esta respuesta se refleja en una pérdida de la actividad enzimática de 10 % y 68 % respectivamente. Este

comportamiento de la actividad de la enzima al pH del medio es resultado de la presencia y concentración

de iones, lo cual podría provocar una inapropiada forma jónica del sustrato o del sitio activo de la enzima

provocando su inactivación' En estudios similares reportan este mismo comportamiento tal es el caso de

Shukor y col, quienes muestran un intervalo de pH óptimo de papaína entre 5.0-7.0 encontrando una

pérdida de la actividad de 20 y 40% respectivamente.

Para el P-PVPC, el pH óptimo obtenido resultó similar al de la papaína libre. Sin embargo la pérdida de

actividad catalítica disminuye en el intervalo de pH 8.5- 9.0, manteniéndose más estable 95% y 72 %

respectivamente, en comparación con la enzima libre. Esta tolerancia del P-PVPC a los cambios de pH

puede ser atribuida a un cambio en la estructura de la papaína después de la bioconjugación con

PVPCOOH-1 30 . Además de factores externos como su comportamiento ácido-base, fuerza iónica,

temperatura, naturaleza química del buffer, entre otros que pudieran intervenir en el proceso de catálisis51.

76


1.0

Z 0.8

0.6

0.4 E

0.2

0.0

4 5 6 7 8 9

pH

Figura 5-18. Respuesta al pH en la actividad enzimática de a) P-PVPC y b) enzima libre

Los resultados de temperatura y pH para la enzima libre, son similares a los reportados por otros

autores't'2843° . Una particularidad que podría presentar la modificación química de proteínas con

polímeros sintéticos es la de otorgar características mejoradas como en el aumento del intervalo de

temperatura óptima de trabajo, así como de respuesta a diversos valores de pH. Esto podría ampliar las

aplicaciones de la enzima libre y por ende las estrategias de conjugación con polímeros sintéticos.

5.2.3.4. Evaluación de la respuesta catalítica de P-PVPC y papaína libre a iones metálicos

presentes en el medio.

El valor de actividad enzimática de la enzima papaína y de P-PVPC, en presencia del agente

quelante EDTA se estimó en 4.84 X 102 unidades BAPA para papaína libre y 5.28 x 10.2 Unidades

BAPA para el bioconjugado. Estos valores son considerados como referencia (actividad al 100 %) para el

cálculo de la inhibición de la actividad enzimática en presencia de iones metálicos. La Figura 5-19

muestra el porciento de actividad catalítica de P-PVPC y la papaína en presencia de iones metálicos.

Como se puede observar la papaína presentó una disminución en su actividad catalítica con el aumento de

la concentración de iones en el medio. Para la plata se observó una retención de la actividad de 20 % a 10

ppm, reduciendo su actividad en un 10 % al cambiar de una concentración de 2.5 a 10 ppm. Sin embargo

para el caso del mercurio la mayor inhibición es observada en 10 ppm con una menor retención de la

actividad en no más del 50% en comparación a 2.5 ppm. Para el caso de cobre, la papaína mostró una

pérdida de su actividad al disminuir un 15% en cada una de las concentraciones evaluadas. Por el

contrario para P-PVPC la evaluación de la actividad catalítica mostraba inconsistencias al incrementar la

77


concentración de iones en el medio, presentado una mayor sensibilidad hacia la plata al retener casi el 50

% de su actividad inicial y presentando un máximo de inhibición del 3% al incrementar la concentración.

Para mercurio la actividad no fue mayor del 40% en todas las concentraciones evaluadas, contrario a los

resultados encontrados para la papaína libre. En el caso del cobre, el P-PVPC mostró una menor actividad

catalítica en las tres concentraciones evaluadas, donde la actividad presentada a 2.5 ppm y 10 ppm fue del

5 % y 28% respectivamente, por lo que este metal provoca una mayor inhibición enzimática

Papaína

60

50

40

30

20

10

o

10 1= 5

2.5

¡miII' :r. Ag Hg Cu

<0

Figura 5-19. Inhibición de la actividad catalítica de Papaína y P-PVPC en presencia de iones metálicos

Si se considera que la papaína está unida covalenternente a PVPCOOH-1 y que además éste polímero es

utilizado como agente estabilizante de nanopartículas de plata, se puede inferir que P-PVPC presenta un

comportamiento similar al presentado por Wong y col. Zelikin y col utilizaron PVP para la conjugación

de péptidos a nano-partículas de sílice, observando que el péptido inmovilizado mantuvo su conformación

nativa durante el proceso de conjugación y mantuvo Lina capacidad de respuesta superior al de la enzima

libre.

Shukor y col, determinaron la inhibición de la actividad enzimática en muestras de ríos utilizando un

bioensayo con papaína a temperatura ambiente. Los resultados de inhibición encontrados para papaína

libre se estimaron en 94.7 %, 57.8 %, y 59.75 % para mercurio, plata y cobre respectivamente, a una

concentración de 1 ppm. Sin embargo en nuestro ensayo, la temperatura se mantuvo constante a 65 oc y

una concentración mínima de metal de 2.5 ppm, presentando valores de inhibición superiores (25%, 35%

y 45%).

Esto considera que a condiciones óptimas de pH y temperatura la adición de agentes quelantes (ejem.

EDTA), y agentes protectores del grupo sulfidrilo proveen protección al sitio activo de la enzima evitando

una posible inactivación u oxidación. El metal utilizado generalmente para este propósito es el mercurio,

78


por lo que, la sensibilidad a este metal aumenta sin el atrapamiento de estos en el medio. Una razón por la

cual P-PVPC podría presentar una mayor retención de la actividad con respecto a papaína libre, es

posiblemente la presencia de PVPCOOH-1 el cual le podría conferir a la enzima la capacidad de reducir

la afinidad de adsorción del metal durante la actividad catalítica evitando la interacción prolongada con

esta y por ende su inactivación.U27130]

5.2.3.5. Evaluación de la estabilidad en solución de P-PVPC y papaína libre.

La evaluación de la estabilidad en solución de P-PVPC a 37°C y 40°C fue evaluada en un

periodo de 23 días, con el fin de determinar la capacidad de retención de la actividad enzimática durante

un tiempo determinado a esas condiciones. En la Figura 5-20 se muestra la estabilidad a 37°C de la

enzima libre mostrándose un incremento en la actividad a los 7 días de evaluación. Sin embargo una vez

alcanzado este máximo, se originó un decaimiento de la actividad a los 15 días del 30%, hasta llegar a una

pérdida de más del 80% a los 20 días. Otra característica observada fue que la papaína presentó turbidez

llegando a precipitar a los 18 días de incubación, contrario a P-PVPC el cual se mantuvo estable aun a los

30 días de permanecer a dichas condiciones con un máximo de pérdida de actividad del 30%. Esto se vio

reflejado en la retención de la actividad catalítica de P-PVPC del 70% por 25 días.

40°C 37°C 120

100

a 811

a 60

40

[_ Papaina] < 20 PVPÇj

0 5 10 15 20 25

0 5 10 15 20 25 Tiempo (Dias)

Tiempo (Dias)

Figura 5-20. Evaluación de la estabilidad en solución de P-PVPC y papaína libre a 37°C y 40°C

Por otra parte la estabilidad a 40°C, de la papaína y P-PVPC presentó un decaimiento a los 21 días. La

papaína mantuvo el 55% de su actividad catalítica en comparación con P-PVPC el cual conservó cerca del

45% de actividad catalítica residual. Además la papaína precipitó a los 20 días mientras que el P-PVPC

solo mostró una ligera precipitación sin llegar a turbidez. Estos resultados sugieren que, aunque la

papaína presenta un buen comportamiento en solución no es capaz de retener su actividad catalítica y

79


evitar su desnaturalización a esas condiciones, ya que el permanecer a 37°C y 40°C durante 21 días se

genera un nivel de estrés en la enzima llevándola a auto-hidrólisis.

El mismo comportamiento fue observado por Szabó y col quienes sugieren que la papaína puede llegar a

desestabilizarse e inclusive a desnaturalizarse a altas temperaturas como resultado de un desdoblamiento

de la enzima y autolisis. Miyamoto y col evaluaron la estabilidad de la papaína inmovilizada con PMPC y

PEG a 40°C, observando un decaimiento dramático a la semana de incubación de la enzima nativa. Sin

embargo observan que el conjugado P-PEG sufrió una caída a la primer semana pero manteniéndose

estable por tres semanas al disminuir solo un 50% de su nivel inicial, corroborando los resultados

obtenidos en este trabajo con P-PVPC. Al comparar estos trabajos se observan similitudes en el

comportamiento del bioconjugado de P-PMPC con un peso molecular de PMPC de 40,000 g/mol, lo que

sugiere que los resultados obtenidos con PVPCOOH-1 son consistentes con los trabajos reportados.

De igual forma Miyamoto y col, sugieren que la reducción de la actividad enzimática de papaína debida al

almacenamiento es atribuida a un cambio conformacional y auto digestión. Por lo que la conjugación de

la enzima con PVPCOOH-1 no produjo un cambio conformacional que indujera la auto digestión,

posiblemente inducida por impedimentos estéricos provocados por el mismo polímero, manteniendo la

actividad enzimática por periodos mayores.

Estudios realizados por Kitano y col [131] quienes determinaron la estructura de polímeros en solución

acuosa, mencionan que los polímeros que pueden producir puentes de hidrógeno otorgan una mayor

estabilidad a enzimas ya que, considerando que la estabilidad de las proteinas en solución se ve

influenciada por las interacciones con las moléculas del solvente (agua). Lo que sugiere que la capacidad

de PVPCOOH-1 de formar puentes de hidrógeno produce la estabilización de la enzima hacia una

conformación más estable en solución y por ende de mayor capacidad de retención catalítica. Además el

grado de modificación el cual resulto efectivo con PVPC00H-1 también puede influir en la estabilidad

de la enzima.

80


5.3. Bioconjugación de N-vinil-pirrolidona ácido terminal sintetizado mediante

ATC-2 (PVPCOOH-1) a la enzima L-lactato deshidrogenasa de músculo de conejo

(Orictoraculus cuniculus)

La bioconjugación de LDH a polímeros sintéticos se ha visto limitada. Esto debido a su tamaño tan

complejo y su relativa estabilidad estructural proveía por su estructura cuaternaria, por lo que ha resultado

más conveniente su inmovilización en medios sólidos como grafito 11321 nano-tubos de carbono'331 o sol-

gel'341, para su uso en aplicaciones como biosensores de lactato. Siendo la principal problemática la

pérdida de su estructura tetramérica necesaria para su actividad catalítica. En base a esto en nuestro

trabajo se pretendió llevar a cabo la conjugación de LDH en medio acuoso utilizando un polímero

hidrofihico PVPCOOH-2 el cual se caracteriza por contener un grupo carboxilo terminal. Para esto se

empleó la técnica de injerto y posteriormente se evaluó su actividad y respuesta catalítica.

5.3.1. Análisis de la bioconjugación de PVPCO011-2 a LDH

La bioconjugación de LDH con PVPC00H-2 qué en lo sucesivo denominaremos L-PVPC, se

realizó de acuerdo a la metodología empleada para la papaína. Los resultados obtenidos mediante el

método de TNBS indican un grado de modificación del 10.23% de grupos aminos conjugados, si se

considera que la LDH posee alrededor de z 96 grupos aminos 34 en forma de lisinas en su complejo

tetramérico, entonces sólo se lograron conjugar el 9.8 % de los grupos aminos factibles, un menor grado

de conjugación en comparación con la papaína.

Metelitza y col midieron el grado de modificación con TNIBS a LDH modificada con cortisona a 22°C

obteniendo un grado de conjugación del 40 % de los grupos aminos. Al aumentar la temperatura a 40°C

se observó un incremento hasta de 80 % de los grupos aminos presentes. Estos resultados sugieren que la

temperatura de reacción a la cual el TNBS es llevado a cabo, provoca el desdoblamiento de la enzima

aumentando el número de grupos aminos disponibles. Sin embargo la enzima pierde su actividad

catalítica. En el caso de nuestro trabajo, el valor obtenido es menor lo que podría sugerir que al ser el

PVPCOOH-2 un polímero con una longitud de cadena mayor a la molécula de cortisona y considerando

que la enzima es 4 veces más grande que la papaína, el proceso de conjugación pudo verse limitado por

impedimento estérico, efectos difusivos de las cadenas poliméricas o inclusive por un cambio

conformacional de la enzima, provocando que los grupos aminos se oculten de manera tal que no se logre

un contacto con PVPCOOH-2.

81


5.3.2. Caracterización de L-PVPC obtenido mediante técnicas espectroscópicas.

La obtención del bioconjugado L-PVPC se confirmó mediante el análisis de FTIR-ATR. El

espectro de PVPCOOH-2 muestra tres bandas principales a 1288 cml, 1660 cm 1 y 3260 cm 1 las cuales

ya fueron reportadas con anterioridad (Figura 5-21 a). De igual forma el polímero activado mediante NT-lS

presentó tres bandas adicionales dos a 1712 y 1748 cm' atribuidas al CO del anillo succinimida, así

como una a 1548 cm' indicativa del éster activo (-O-CO) de NI-lS (Figura 5-21b). Finalmente, el

bioconjugado L-PVPC (Figura 5-21c) mostró tres bandas importantes a 3170 cm', 1640 cm' y 1531 cm

',dichas señales atribuidas a las bandas de absorción pertenecientes a la amida (-CONH-) y al —NH de la

banda amida II, características de la cadena principal de las enzimas. Adicionalmente se observan las

bandas propias de PVPCOOH-2 las cuales fueron descritas anteriormente en la sección 5.1, indicativo de

la formación del enlace amida entre el grupo amino de la LDH y el carboxilo de PVPCOOH-2.

Otra característica observada es un desplazamiento e incremento en la intensidad de las banda ubicada a

1660 cm 1 hacia 1640 cm 1 y de la banda a 3260 cm1 hacia 3180 cm'. Este comportamiento se relaciona

con el ambiente químico provocado por la conjugación con PVPCOOH-2. Aunado a ello se observa una

banda aguda superpuesta en la banda de tensión de las aminas en 3167 cm', la cual es asociada a la

presencia de aminas secundarias. Esto podría sugerir que un alto porcentaje de aminas presentes en la

LDH no fueron conjugadas por PVPCOOH-2, o indicativo de la presencia de enzima libre en el medio [135-13 7]

{ O s1299lfl

1531

1660

1748

3260 288

3500 3000 2500 2000 1500 ldoO

Numero de onda (cm 1) Figura 5-21. Espectro de FTIR-ATR para PVPCOOH-2 (a), PVPCOOH-NHS (b) y L-PVPC (c)

82


La Figura 5-22 muestra los espectros UV-vis obtenidos para PVPCOOH-2, LDH libre y L-PVPC en

buffer tris HC1, respectivamente. El espectro de PVPCOOH-2 exhibe un máximo de absorción a 215 nm,

característicos de los grupos cromóforos amidas presentes en la unidad repetitiva de PVPCOOH-2.

Además se observa una ligera banda a 281 nm la cual se atribuye al anillo aromático de la funcionalidad

a-terminal en el extremo de la cadena. Por otro lado la enzima LDH presenta un máximo de absorción a

216 nm, al igual que PVPCOOH-2, esta banda es característica de los enlaces amida a lo largo de la

estructura primaria de la enzima. Aunado a esto se observa un ligero hombro a 230 nm, el cual es

asignado al ion carboxilato el cual se puede formar durante la exposición de los aminoácidos que

contienen un grupo lateral ácido (ej. glutamato o aspartato).

1.0

0 0.8 N

0.6

o z c 0.4

. 0.2 o u, < 0.0

* PVPCOOH-2 LDH Libre

1 —L-PVPC

200 225 250 275 300 325 350

Longitud de onda (nm) Figura 5-22. Espectro de UV-Vis para LDH libre, PVPC00H-2 y L-PVPC

La banda intensa en 280 nm se asocia a las transiciones ir-it' del anillo aromático presente en los

aminoácidos triptófanos y fenilalanina de la enzima. El L-PVPC presentó un desplazamiento

hipercrómico de 216 nm a 225 nm, esto puede ser atribuido a una contribución inducida por el medio

ambiente de los grupos amidas enlazados entre la cadena de polímero' 138 y la enzima, además de los

propios grupos amida del polímero. También se presentó una disminución del hombro a 230 nm, así

como un desplazamiento batocrómico de 280 nm a 256 nm del hombro encontrado a 281 nm.

Estos resultados podrían indicar cambio en la estructura terciaria de la LDH modificada por la unión del

PVPCOOH-2 o un cambio de los anillos aromáticos de los grupos fenilalanina y triptófano de la LDH,

provocado por el arreglo conformacional inducido por el ambiente polimérico. Esto conileva a un fuerte

83


cambio en el coeficiente de absorción durante las transiciones i-ir de los anillos bencílicos. Además,

además estos cambios también pueden ser atribuidos a la presencia de fuerzas intermoleculares como

puentes de hidrógeno o sales en el medio (buffer Tris-HCI) que pueden provocar un complejo jónico con

la enzima misma o la enzima y el polímero, ocasionando un posible cambio conformacional del L-PVPC

[139[

5.3.3. Determinación del peso molecular de L-PVPC mediante Exclusión de Tamaños

utilizando Cromatografia Líquida de Alta Resolución (HPLC-SEC).

La determinación del peso molecular mediante HPLC-SEC de L-PVPC es mostrado en la

Figura 5-23 y Figura 5- 24. En la Figura 5-23 se muestran los cromatogramas obtenidos para la enzima

libre y L-PVPC. Se puede observar que LDH muestra un solo pico de elución lo que indica que la enzima

es mono dispersa. Para el caso de L-PVPC se observa una amplia distribución de pesos moleculares lo

que podría indicar que el bioconjugado está conformado por moléculas de polímero de diversos

tamaños 140 .

Sin embargo, el bioconjugado al contener una molécula con características diferentes y al adoptar una

conformación distinta a la enzima, posiblemente está conformación extendida puede verse minimizada, es

decir, podría compactarse de manera tal que su volumen hidrodinámico sea menor y por ende su tiempo

de elución a través de la columna sea mayor. También la amplitud de la curva de L-PVPC puede ser

debida a que la enzima sufre un desdoblamiento, disociándose en sus unidades tetraméricas y por lo tanto

eluyendo de forma independiente, de manera que al ser de igual masa molecular eluyen al mismo tiempo.

Incluyendo las que han sido modificadas con PVPCOOH-2 cuya masa molecular no se alteró de manera

importante debido al bajo grado de modificación11411

84


—L-PVPC

'5 0.8

N

0.6

0.4

(5 . 0.2 o '5

0.0

5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 1

Tiempo (mm) Figura 5-23. Cromatograma de HPLC-SEC para LDH libre y L-PVPC

Equan ya,b0 Adj. a-Sao 091971

54- Piruvato kinasa vuo StandordErrw a C lotorcopt 8.20030 0.38381

Glucosa oxidasa C Otopo -4.88003 0.5303

5.2- 1. a Lactato deshidrogenasa

5.0-

4.8- BSA ..

L-PVPC 4.6- Peroxidasa de rabano • -.

.J Bromelina A 4 . Papaina

4.2 Lizosima a

4.0 0.60 0.65 0.70 0.75 0.80 0.85

Rf (mm)

Figura 5-24. Determinación del peso molecular (Mw) de L-PVPC mediante SEC-HPLC

La determinación de los pesos moleculares es presentada en la Figura 5-24, donde LDH libre presentó un

tiempo de elución de 940 min obteniendo un Rf de 0.669 con un log Mw de 5.1247 el cual dio como

peso molecular (Mw) un total de 133.260 gImo!. Contrario a L-PVPC el cual eluyo a un tiempo de 10.2

min y un valor de Rf de 0.7251 con un log Mw de 4.683 y un peso molecular Mw de 48,236 g/mol

menor al encontrado para LDH y ligeramente mayor al valor presentado por sus unidades monoméricas.

Si se considera que la LDH es una enzima tetramérica la cual consta de 4 unidades monoméricas

conformadas por un Mw de 32,000 gImo! (análisis obtenido mediante SDS-PAGE), en teoría su Mw se

85


encontraría en 128,000 g/mol. Estos resultados concuerdan con lo reportado en la literatura donde indican

que el Mw debe encontrarse dentro de un intervalo de 125 a 138k g/mol 142 (kD= kiloDaltons=g/mol).

Estos resultados indicaron una gran eficacia del método propuesto para el cálculo del peso molecular. Por

lo que los valores encontrados para L-PVPC pueden ser debido al desdoblamiento de la enzima. Otros

trabajos reportan que moléculas con la misma masa molecular pero de diferentes formas presentan

características distintas de elución. En el caso de proteínas esto es común. Además otro factor importante

es la fuerza jónica donde la presencia de adsorción electrostática del soluto por puntos ocasionalmente

cargados que existan en el gell 1411 puede inducir que L-PVPC presente un peso molecular y

comportamiento diferente al esperado.

5.3.4. Determinación de la actividad catalítica de L-PVPC y enzima libre en presencia de

NADH y NAD

El análisis de actividad catalítica no fue fácil de obtener, esto atribuido a dos factores

importantes: 1) El proceso de purificación de L-PVPC no fue eficiente, ya que debido al tamaño de la

enzima la separación de la enzima libre de L-PVPC no fue fácil, además de que no se contaban con las

técnicas adecuadas para este tipo de complejos de mayor tamaño, y 2) el bajo grado de modificación lo

cual no permitió observar una clara separación entre la LDH libre y L-PVPC es decir los cromatogramas

no presentaban consistencia durante la evaluación, previendo de pesos moleculares menores a los

esperados.

Aun así es conocido que cuando una enzima es inmovilizada en un medio sólido conteniendo una amplia

superficie activa los grupos superficiales del soporte pueden inducir cambios conformacionales a la

enzima, provocando pérdida de actividad. Por lo que una alternativa a este es la bioconjugación o la

unión covalente de enzimas a polímeros dando como resultado un ambiente más estable comparado con

una absorción fisica 1441. En nuestro trabajo, la conjugación de LDH con PVPCOOH-2 presento un

comportamiento diferente al esperado, principalmente en la evaluación catalítica. Ya que la sensibilidad

de L-PVPC en el medio se vio limitada posiblemente debido a problemas difusivos del sustrato o

producto o impedimentos estéricos del.sitio activo que delimitó una efectiva catálisis11451, observándose

con lo anterior una inhibición e inestabilidad del bioconjugado en comparación con la enzima libre.

Reportes en la literatura han demostrado la efectiva conjugación de LDH a diversos medios sólidos, sin

embargo hasta nuestro alcance no se ha reportado la bioconjugación con poli (vinilpirrolidona) por lo que

los resultados obtenidos aquí abren un panorama de investigación en esta área.

1.0

0.8

1

6

::

02

—35°C 0.0

1.0

0.8

0.6 E

0.4

0.2 .0 1

o U) 0.0 .0

35


La actividad catalítica fue evaluada en presencia del cofactor NADH y NAD con la finalidad de

determinar la eficiencia de L-PVPC en comparación con LDH libre. La Figura 5-25 presenta el

comportamiento cinético de LDH libre y L-PVPC a el rango de temperaturas en la cual LDH presenta un

óptimo de reacción en presencia de piruvato como sustrato y del cofactor NADH***. Como se puede

observar la curva de respuesta de LDH libre presento una conducta típica del progreso de una reacción

enzimática. Sin embargo al evaluar L-PVPC el comportamiento fue diferente al deseado. No muestra

iniciación, estabilidad, equilibrio, es decir, no hay una reacción típica de conversión de sustrato a

producto. Por lo que se llevó a determinar qué factores podrían influir en este comportamiento.

LDH Ubre L-PVPC

0 20 40 60 80 100

Tiempo (seq) 0 2040 60 80 100

Tiempo (seg)

Figura 5-25. Respuesta de LDH y L-PVPC a la presencia de NADH a diferentes temperaturas

Las enzimas son específicas a un sustrato determinado, al cual su velocidad de conversión a producto será

influencia por parámetros como temperatura o pH. Por lo que al observar la respuesta de L-PVPC a

NADH y piruvato como sustrato, se evaluó la capacidad de LDH de utilizar tanto NADH como su forma

reducida NAD y determinar si un cambio de sustrato permitía una mayor respuesta de L-PVPC. La

Figura 5-26 presenta la respuesta de LDH a ambos sustratos.

Como se puede observar LDH presenta una respuesta favorable, sin embargo L-PVPC no mostró el

mismo proceder en uno y otro sustrato. Estudios hechos en biosensores de LDH y alcohol deshidrogenasa

(ADH) con NADH como cofactor45' 146] indican que estos son inestables debido a que la oxidación

"De forma directa LDH utiliza NADH para conversión de piruvato a lactato. Por está razón se considero como

cofactor principal ya que la afinidad a este es mayor que NAD.

87

- 1 mm 1.4

3min 1.2 —4min 1.0

5 min . 0.8

0.6 o

04

0.2

0.0

1 2.0

0.0


electroquímica del NADH requiere de altos potenciales provocando interferencia de otros componentes

electroactivos, generalmente presentes en muestras reales. Lo que conileva a buscar componentes

orgánicos o inorgánicos que permitan disminuir este potencial. Además se ha demostrado que LDH para

conservar su actividad presenta un reacomodo en sus subunidades la cual incluye un cambio de los

aminoácidos residuales que participan como sitio activo o en su efecto el sitio de enlace del cofactor 471.

NADH

200 250 300 350 400 Logitud de onda (nm) Logitud de onda (nm)

Figura 5-26. Respuesta de LDH libre a ambos sustratos (concentración de 6.6 mM piruvato y 30 mM de

lactato)

Por lo tanto se sugiere que la PVPCOOH-2 provoco un cambio conformacional en LDH de manera tal

que al proponer la enzima un reacomodo más estable, su estado de rigidez se vio incrementado de manera

tal que llego a un grado de inestabilidad llevando a cabo el proceso catalítico por procesos difusivos.

Autores como Santos y col mencionan que un incremento en el Km (respuesta y afinidad hacia el

sustrato) puede ser debido a cambio estructural del sitio activo para el enlace del NAD y lactato después

de la inmovilización o en su efecto en el incremento de la resistencia al transporte de masa del sustrato.

Aunado a esto se ha determinado que al mantener constante la concentración de NAD o NADH la

actividad catalítica (potencial de oxidación durante el proceso de conversión de sustrato a producto)

dependía de la concentración de sustrato en el medio.

En base a lo anterior se realizó un estudio de la respuesta de LDH y L-PVPC a diferentes concentraciones

de sustrato, para lograr determinar si la concentración de sustrato sería un factor determinante en el

comportamiento de L-PVPC (Figura 5-27). La LDH presentó una sensibilidad favorable a la presencia de

88


ambos cofactores aún a concentraciones altas. En comparación con LDH, para el bioconjugado L-PVPC

la sensibilidad presentada a piruvato en presencia de NADH no fue congruente, lográndose obtener

cinéticas de reacción solo a concentraciones altas en presencia de lactato (12, 18 y 20 mM) y NAD.

LDH Libre L-PVPC

—4mM 0.12 —l2mM --8mM —18mM - l2mM

20 mM 18 mM 0.09

— -- 20 mM

0.06

0.03

0.14

0.12

0.10

0.08

. 0.06

U) 0.04 12

0.02

0.00

e

00I

, ..,.... . 0 20 40 60 80 100 0.00 . 0 20 40 60 80 100

Tiempo (seg) Tiempo (seg)

Figura 5-27. Comportamiento cinético de LDH ( en presencia de NADH y piruvato) y L-PVPC (en

presencia de NAD y lactato) a diferentes concentraciones de sustrato y 25°C.

Este comportamiento posiblemente sea debido a que a bajas concentraciones de enzima la velocidad de

conversión de NAD a NADH se lleva a cabo a una velocidad de reacción más lenta 11481 Por lo que a una

alta concentración de sustrato permite una mayor difusión de este hacia el sitio activo en un tiempo mayor

de reacción. Además al ser una concentración de NAD relativamente baja (6.6mM) esta posiblemente

minimizo la competencia por el sitio activo de la enzima por el NAD y el lactato, logrando una respuesta

favorable de L-PVPC. Por lo que se consideró utilizar a NAD como sustrato para la evaluación catalítica.

Pereira y col, reporta la inmovilización de NAD sobre nanotubos de carbón (NTC) multicapas, reportando

que cuando el NAD es incorporado en las capas de los NTC la sensibilidad hacia el lactato es mayor a la

que presenta en solución70. Por lo que este comportamiento puede ser influenciado por este fenómeno.

5.3.5. Evaluación enzimática a diferentes temperaturas y pH para LDH y L-PVPC

Típicamente las enzimas son sensibles a la temperatura pudiendo verse modificada su actividad por este

factor. Es decir los intervalos de temperaturas óptimos pueden llegar a variar sustancialmente de unas

enzimas a otras. Normalmente, a medida que aumente la temperatura, una enzima verá incrementada su

actividad hasta el momento en que comience la desnaturalización de la misma, dando lugar a una

reducción progresiva de dicha actividad. En este trabajo la temperatura óptima para LDH libre fue

89


encontrada a 35°C y pH 8.0 concordando con reportes de la literatura71 . Contrario a L-PVPC no se logró

una respuesta favorable haciendo difícil su determinación (datos no incluidos).

5.3.6. Determinación de las constantes cinéticas Km y Vmáx para LDH libre y L-PVPC

Los valores de Km y Vmáx encontrados para LDH son 0.029 mM y 3.45 x 10 rnmol * mm, mientras S que para L-PVPC se encontraron valores de 0.039 mM S5 y 6.28 x 10 4 rnmol mio. Esto indica

encontrándose que la afinidad del sustrato por L-PVPC es menor que LDH, donde efectos de

conformación, difusión e impedimentos estéricos pueden influir en este comportamiento atípico de una

enzima (datos no reportados, el cálculo de Km y Vmáx., fue realizado de acuerdo al gráfica reportada en

anexos para el papaína).

5.3.7. Estabilidad en solución de L-PVPC y LDH libre

La estabilidad en solución del bioconugado fue realizada a 32°C durante 30 días. Debido al

comportamiento presentado por L-PVPC durante la evaluación catalítica, esta no fue evaluada por lo que

se desconoce si exista actividad residual. La Figura 5.29 presenta la respuesta de ambos medios.

Figura 5-28. Estabilidad en solución de LDH libre, PVPCOOH-2 y L-PVPC a 32°C durante 30 días en

buffer Tris-HCI pH 7.5., a) 1 semana, b) 2 semana, e) 3 semana, d) 4 semana.

Una característica que presentan las enzimas en solución es su capacidad de establecer diversas formas

estables mediante puentes de hidrógeno o interacciones electrostáticas entre grupos laterales, para

mantener una actividad catalítica efectiva y además minimizar los efectos de desnaturalización. Los

polímeros solubles en agua también tienen la capacidad de crear puentes de hidrógeno y mantenerse

**Valor encontrado a 12, 18 y 20 mM de Lactato y 6.6 mlvI de NAD, valores no reproducibles por lo que se reportan para electo de análisis.

99


estables sin sufrir precipitación, lo que les permite adoptar una forma más estable. L-PVPC presento un

comportamiento altamente estable a las condiciones evaluadas en comparación con LDH. Su estabilidad

en solución se vio incrementada por la presencia de PVPCOOH-2 en comparación con la enzima libre, la

cual presentó total precipitación y turbidez a los 30 días de evaluación. Este resultado es muy conveniente

si se considera que la estabilidad de las enzimas a largos periodos de almacenamiento puede disminuir los

costos y prolongar la aplicabilidad de estas en la detección de analítos. Una propuesta de como la L-

PVPC podría estar conformado en solución se presenta en la Figura 5-29.

71

Figura 5-29. Posible conformación adoptada por L-PVPC en solución.

Si se considera que la enzima tiene forma globular y el polímero una configuración extendida, la cadena

de PVPCOOH se une intermolecularmente entre las moléculas de enzima provocando un grado de

inmovilización de manera tal que aunque no presente actividad catalítica su estructura cuaternaria no se

ve afectada y no precipita.

Otra alternativa es que al disociarse la LDH y separarse en sus unidades monoméricas estas queden

ocluidas dentro de una red formada por el polímero, de manera tal que no llegan a precipitarse.

-

Reportes 1421471 en la literatura indican que la enzima al ser inmovilizada en medios solidos han exhibido

actividad catalítica durante tiempos de almacenamiento diferentes. Este comportamiento indica que la

enzima sigue manteniendo una conformación estable capaz de catalizar, sin embargo no se encontró un

reporte que corroborara nuestra propuesta. Los resultados obtenidos en la evaluación de L-PVPC

permiten determinar que la bioconjugación con PVPCOOH es conveniente ya que si se logra una efectiva

91


separación de la enzima libre de la conjugada, posiblemente se llegue a resultados más alentadores sobre

la aplicación de esta en la detección de analítos.

92

Conclusiones

Conclusiones

Conclusiones

La hipótesis fue confirmada al comprobarse la efectividad en la bioconjugación de ambas

enzimas papaína y L- lactato deshidrogenasa con el polímero poli(vinil-pirrolidona)

funcionalizado con un grupo ácido terminal.

La polimerización de PVP utilizando ATC-1 fue caracterizada por altos pesos moleculares (4.5K

a 22.5K g/mol) y por altos índices de polidispersidad (1.5 - 1.7), lo que indica que las

condiciones propuestas para la obtención de PVPCOOH-1 son efectivas, aún en el caso de no

lograr un control en la polimerización, logrando con esto la obtención de polímeros

funcionalizados.

- 3. El uso de técnicas espectroscópicas para la caracterización de grupos funcionales finales, es una

técnica efectiva y oportuna para la determinación de estos en polímeros funcionalizados.

La polimerización de PVP en presencia de ATC-1, presento características de una radicálica

viviente pero no controlada. Estos resultados proveen de una alternativa de búsqueda para la

síntesis de PVP controlado utilizando dicho agente.

Para el caso de PVPCOOH-2, la polimerización presento características controladas. Se

obtuvieron bajos pesos moleculares ( 8k -15k g/mol) e índices de polidispersidad controlados

(1.18 - 1.10) por lo que el uso de ATC-2 en la polimerización de NVP es una ruta viable para la

obtención de polímeros controlados.

La diferencia del Mn obtenidos para PVP en presencia de ATC-2, calculado mediante RMN y

GPC es atribuida a que mediante la técnica de RMIN solo las cadenas funcionalizadas puede ser

visualizadas y por ende cuantificadas, a diferencia de la técnica de GPC que no hace distinción

entre ellas.

ATC-2 previó de una alta eficiencia de funcionalización de las cadenas para PVPCOOH-2 ,(76

%), confirmando la eficiencia de dicho agente.

El peso molecular del bioconjugado P-PVPC se estimó en aproximadamente 50 kD y un 13.56 %

de proteína unida químicamente. Esto sugirió que solo 1 grupo amino de los 11 posibles presentes

en la papaína fueron modificados por el polímero.

93

Conclusiones

La bioconjugación de papaína con PVPCOOH-1 otorgó a la enzima mayor resistencia a la

desnaturalización por temperatura, aumentando su temperatura óptima de trabajo de 55°C a 65°C

y disminuyendo su energía de activación de 9.24 kJ/mol, a 8.81 kJ/mol, lo cual indica una mejora

en la eficiencia enzimática.

P-PVPC mostró mayor estabilidad y retención de la actividad a cambios de pH por encima del

óptimo (pH 6.0), manteniendo hasta en un 72% su actividad catalítica a pH 8.5, en comparación

con la enzima libre.

La respuesta de P-PVPC en presencia de metales pesados mostró una mayor eficiencia en

- presencia de plata y mercurio, Aunque para el caso de cobre, papaína fue más eficiente.

Las constantes de Michaeles Menten (Km) y de velocidad enzimática (Vmax) encontradas fueron

de 12.19 mM (0.00534 g/mL) y 8.7 x 10 tmol*E'*min4 y P-PVPCOOH a 16.39 mM

(0.00711 g/mL) y 4.4 x lO tmol*L4*min1, éstos resultados sugieren una respuesta de la

papaína de 1.33 veces mayor en la reacción de actividad del bioconjugado. Sin embargo, la

estabilidad en solución y sensado fue incrementada por la presencia del PVPCOOH- 1 en el

ambiente químico de la enzima.

La obtención de L-PVPC fue efectiva, sin embargo la actividad catalítica presento dificultades

para su evaluación, esto atribuido a un posible arreglo conformacional de la enzima que le

impedía estabilizarse de manera tal que su sitio activo presento una conformación no viable para

el anclaje del sustrato.

La estabilidad en solución de L-PVPC presento una respuesta favorable en comparación con la

enzima libre. Esto demuestra que la unión con el polímero le otorgó una mayor estabilidad

evitando su precipitación.

94

Anexos

Anexos

93

NVP PyMeN}-12

BAPNA

AIBN

NHS EDC

DMSO Cys

EDTA AA

LDH

Destilación Aldrich Monómero Ninguna Aldrich Derivatización

Ninguna Aldrich Sustrato Papaína

Ninguna Aldrich Cuantificación de proteinas

cristalizació n metanol

Fluka Iniciador

Ninguna Fluka Activador Ninguna Fluka Agente

esterificante Ninguna Aldrich Solvente Ninguna Merck Activante

Papaína Ninguna Aldrich Agente guelante Ninguna Aldrich Solvente Ninguna Sigma Bioconjugación

Anexos

Anexo 1. Tabla de reactivos

N-vinil-pirrolidona Pirenmetilamina hidrocloruro

N-Benzoil-Arginina-p-Nitroanilina hidrocloruro Bio-Rad

azobis(isobutironitrilo)

N-hidroxisuccinimida 1 -etil-3-(3 -dimetilaminopropil) carbodiimida Dimetilsulfoxido L-Cisteína hidrocloruro

Acido etilendiaminetetracético Ácido acético L-Lactato deshidrogenasa (E.C. 1.1.1.27) tipo II de músculo de conejo en solución de sulfato de amonio (811 U/mg) Tris(hidroximetil)amino metano hidrocloruro -nicotinamida adenina dinucleotido sal

de sodio (Grado III) L-lactato Ácido trinitrobenzene sulfonate

Butanotiol

Acetona Etanol Hidróxido de potasio Hidróxido de sodio Ácido clorhídrico Nitrato de plata

Cloruro de cobre

Cloruro de mercurio

Agua ultrapura (Milli-Q, 18 mU*cm

Tris-HCI Ninguna Sigma Buffer

NAD Ninguna Aldrich Activante LDH

Ninguna Fluka Sustrato LDH TNBS Ninguna Aldrich Medición de

grupos aminos BuSH Ninguna Aldrich Síntesis de

ATC-1 Ac Ninguna Aldrich Solvente

EtOH Ninguna Aldrich Solvente KaOH Ninguna Fluka Buffer NaOH Ninguna Aldrich Buffer

HC1 Ninguna Aldrich Buffer (NH4Ag) Ninguna Aldrich Censado de metales

en papaína (CuCl2) Ninguna Aldrich Censado de metales

en papaína (HgC12) Ninguna Aldrich Censado de metales

en papaína Ninguna Aldrich Solvente

95

Anexos

Anexo 2. Síntesis de agentes de transferencia de tipo tritiocarbonato y xantanto conteniendo un

grupo ácido carboxílico.

Síntesis y caracterización del agente RAFT S' butilo, S'2 ácido propanóico tritiocarbonato.

El agente S butilo- S'2 ácido propanóico que en lo sucesivo denominaremos ATC-1, es un sólido

(cristales) de color amarillo, con olor intenso y desagradable. El rendimiento de la reacción fue de 86 %, y

el análisis mediante espectroscopia de RMN ('H y '3C) son presentados en las Figuras 1 y 2

respectivamente. ATC-1 presentó un punto de fusión de 54.2 oc y un peso molecular determinado

mediante CG-masas de 238.8 g/mol. Los cristales fueron totalmente solubles en solventes orgánicos así

como en los monómeros N-vinil-pirrolidona y estireno, sin embargo mostraron insolubilidad en medio

acuoso y solubilidad parcial en el metanol.

Figura 1. Espectro de 1 H RMN para ATC-1 en CDC13 a 500 MHz.

96

Anexos

El espectro de ATC-1 no exhibe señales que pudieran ser atribuidas a reacciones laterales o impurezas

durante el proceso de purificación, indicando una reacción con alto rendimiento y de buena pureza. La

Figura 2 presenta el espectro de RMN '3C para ATC-1 así como sus desplazamientos desplegados

donde de igual manera no se muestran señales que interfieran en la designación de las asignaciones

obtenidas. En el espectro de RMN '3C ATC-1 son observadas a campos bajos las señales del carbono

perteneciente a el carbono cuaternario asignado a la formación del grupo tiocarbonil-tio (22 1 ppm,), se

observa de igual forma el carbono cuaternario del grupo carbonilo atribuido al ácido (177 ppm).

Figura 2. Espectro de '3C RMN para ATC-1 en CDC13 a 300 MHz

Anexo 3. Síntesis del agente RAFT de tipo Xantato ácido 4-(etoxicarbonotioiltio) metil benzoico

(ATC-2)

HO SON

97

Anexos

La ruta de síntesis del agente RAFT de tipo Xantato ácido 4 (etoxicarbonotioiltio)metil benzoico, que en

lo sucesivo denominaremos ATC-2, es presentada en el siguiente esquema:

± KOH ± H20 0 K

s

+ cs2 "k S- K'

s

+ Br OH

1

HO SO

-Y 1

o

Esquema 1. Ruta de síntesis para la obtención de ATC-2

El Esquema 1 presenta la ruta de síntesis seguida para la obtención deATC-2. La formación del grupo O-

etilo es mediante la reacción del etanol con el hidróxido de potasio (KOH), en donde es formada una sal

intermediaria, la cual al hacer contacto con el disulfuro de carbono (CS2), forma la sal de Xantato

(ROC(=S)SH), o puente tiocarbonilo, donde el átomo de potasio funge como contraión, seguido de una

reacción de alquilación con el ácido a-bromo- p-tolueico, el átomo de bromo es desplazado junto con el

átomo de potasio para la obtención de bromuro de potasio además del agente ATC-2 El producto

recuperado fue un sólido de color blanco, con ligero olor desagradable. La eficiencia de reacción fue de

68.2%. El peso molecular determinado por GC-masas fue de 254.3 g/mol. El producto es soluble en

solventes orgánicos, parcialmente soluble en agua y presentó solubilidad en el monómero de NVP. El

análisis mediante espectroscopia de RIvIN ('H y13C) son presentados en las Figuras 3 y 4

respectivamente.

98

Anexos

s b

o a

HO c

- Figura 3. Espectro de 1H RMN para ATC-2 en acetona (Ac-d6) a 300 MHz

El espectro de ATC-2 no exhibe sefíales que pudieran ser atribuidas a reacciones laterales o impurezas

durante el proceso de purificación, indicando una reacción con alto rendimiento y de buena pureza La

Figura 4 presenta el espectro de 13C RMN para ATC-2 así como sus desplazamientos. El espectro de '3C

RMN muestra las señales principales obtenidas para ATC-2, los desplazamientos fueron asignados de la

siguiente manera: el carbono cuaternario del ácido carboxílico (g), los carbonos del anillo bencénico (e y

d), el grupo —CH2 (c) que enlaza el carbono (1) del anillo bencílico al grupo Xantato. El carbono

cuaternario del grupo Xantato (h) se encontró a 3 213 ppm. Los carbonos de los grupos —Cl-12 - CH3 (a y

b) y que se encuentran a campos altos, corroboran la síntesis del agente de transferencia como efectiva.

11

Anexos

a

Ac-d6

d

f c UN

b

S'h oc

Ac-d6

Ho

m.

Figura 4. Espectro de C RMN para ATC-2 en Ac-d6 a 500 MHz.

Anexo 4. Método para la determinación de proteína por el método de Brandford utilizando el

sistema comercial Biorad.

Pesar 2 mg de proteína Albúmina Sérica Bovina (BSA) y disolver en 10 mL de agua ultrapura. De esta

solución tomar 1 mL y aforar en 10 mL de agua ultrapura para obtener una concentración de 2

microgramos/mL de proteína.

La preparación de las soluciones Stock se describen a continuación así como las concentraciones

pertenecientes y su intervalo de absorbancia esperado.

Sol stock Agua Concentración Concentrado Absorbancia Absorbancia destilada Biorad jmL2

0.2 0.6 4 0.2 0.199 0.237

0.5 0.3 10 0.2 0.450 0.504 '01- o 9709 0701 0.8 0 16 0.2 0.811 0.811

En todos los casos se agregan 0.2mL de concentrado de Biorad para la obtención de la concentración de

proteína. La absorción se lleva a cabo a 595 nm de longitud de onda en la cual absorbe el enlace del

100

Anexos

colorante con la proteína. Los datos son llevados a la grafica y la ecuación obtenida es utilizada para el

cálculo de la concentración buscada.

Anexo S. Determinación de grupos aminos mediante el método del acido trinitrobencensulfónico

(TNBS).

Está técnica fue propuesta por Adier en 1979 y se basa en la reacción del ácido trinitrobencensulfonico

(TNBS) con las aminas primarias en condiciones ligeramente alcalinas (pH 8.2). La reacción que se lleva

a cabo es presentada en la Figura 5

NO2 NO2

02N_cO3H 10 02N—c -_NH- + S03 2 + H

NO2 :H2N-.... R

NO2

Figura 5. Reacción del ácido trinitrobencensulfónico (TNBS) con grupos aminos primarios.

Procedimiento.

NaHCO3 al 4%, pH 8.5 o un buffer definido dependiendo de la aplicación.

Soluciones de proteína en un intervalo de 0.6 - lmg/ml

* 3. Solución de TNBS al 0.1%

SDS (dodecilsulfato sádico) al 10 %.

HC1IN

Se mezclan 1 ml de solución de proteína, 1 ml de NaHCO3 al 4%, pH 8.5, y 1 ml de TNBS al 0.1%. Se

cubren los tubos con papel aluminio para evitar la entrada de luz y se llevan a un baño de aceite o agua a

40°C durante 2 h. Transcurrido el tiempo se retiran los tubos del baño y se agregan 1 ml de SDS para

solubilizar la proteína y evitar la precipitación, posteriormente, se adicionan 0.5 ml de HC1 1 N. Se lee la

absorbancia a 335 nm. Se utilizó la enzima papaína para el cálculo de coeficiente de absortividad molar

el cual resultó en 1.09 x 104 M'cm 1

101

Anexos

.quaOon ya*Dx Adj R-Squ ø97327

V,Ie Stdrd Err

O r*t,c,pt .aO.152 0.01003 0.15 D Sp21.O1i9l4j

•

0.10

o 1)

-12 0.05

0.00 0.002 0.004 0.006 0.008 0.010

Concentracion de TNBS (mq/mL

Figura 6. Cálculo del coeficiente de absortividad molar para TNBS

Anexo 6. Medición de la actividad de la enzima libre e inmovilizada.

Se evaluó la actividad amidasa de la papaína empleando como sustrato al N-alfa-Benzoil-L-Arginina-4-

Nitroanilida (BAPA), el ensayo está basado en el método de Earlanger y col., adaptado para papaína. Se

prepararon soluciones de papaína y P-PVPC de lmg/mL. Se colocaron en un tubo de ensayo 1 mL de

cada solución. A estas muestras se les agrega 5 ml de la solución de sustrato activador de la enzima y se

deja reaccionar por espacio de 25 minutos (a temperatura ambiente), posteriormente la reacción se detiene

con la adición de 1 ml de ácido acético al 30%. Posteriormente se leyó el cambio en la absorbancia a 410

nm correspondiente a la presencia de p-nitroanilina liberada como resultado de la acción amidasa de la

papaína sobre el substrato BAPNA. Esta absorbancia se tomó por espacio de 60 segundos. Un mililitro de

agua destilada fue usado como blanco.

La actividad enzimática se expresa en unidades BAPA

Unidades BAPA 410nm/min X 1000 X 3/8800

Donde 8,800 es el coeficiente de extinción molar del sustrato BAPNA, 3 es el volumen en ml de la celda,

410 /min es la absorbancia a 410 nm por minutos de reacción y 1000 es un factor de conversión que

resulta de convertir moles a micromoles y mililitros a litros. La actividad específica se obtiene al dividir

las unidades BAPA entre la cantidad de la enzima presente y es expresada en unidades BAPA por

miligramo de proteína. Las concentraciones son ajustadas al volumen de reacción.

Anexo 7. Cálculo de Km y Velocidad Máxima para una enzima dada

La medida de Velocidad máxima de reacción y la constante Km proveen información sobre la afinidad de

la enzima hacia el sustrato, así como su velocidad de reacción bajo determinadas condiciones de reacción.

102

t

Anexos

En base a esto la afinidad presentada por la enzima hacia un sustrato específico dependerá del valor de

Km obtenido, es decir a valores altos de Km representa menor afinidad y viceversa. Por otro lado la

velocidad máxima de reacción dependerá del sustrato y de la concentración de enzima presente en el

medio. Estos datos ofrecen en una reacción cinética información básica del comportamiento de la enzima

y su capacidad de hidrolizar dicho sustrato.

Como ejemplo se reporta la grafica de Lineweaker-Burk, P-PVPC donde el intercepto con el eje Y de la

recta linealizada representa el valor de 1/Vmax, y el intercepto con el eje X el valor de 1/Km (mM).

P-PvPG

/ / 5- /

E /

a, 4-

1'

3

/

4.2 -01 0.0 01 02 03 04 l/S mM

Figura 7. Cálculo de Km y V max para la P-PVPC

103

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tesis con caracter abierto · 2017-12-04 · dedicatoria a esa imagen que ilumina mi vida: mi madre...

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