terapia_genica
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genicaTRANSCRIPT
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Introduccin a la terapia gnica
Curso de Gentica Molecular
Ciencias Biolgicas
Universidad de Jan
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TERAPIA GNICA
Introduccin de secuencias de ADN (naturales o artificiales) en clulas para alterar su expresin gnica con fines teraputicos.No se incluye el transplante de mdula sea o de hgado.
Dos tipos principales de terapia gnica:
Somtica: Introduccin de ADN en clulas no reproductivas,puede ser in vivo o ex vivo. No permanece en la descendencia del organismo tratado.
Germinal: Introduccin de ADN en clulas reproductivas. Modifica el patrimonio gentico de la especie y puede ser transmitido a la descendencia. Presenta graves inconvenientesticos aunque en animales (ratones) est muy desarrollada (knock-outs y transgnicos).
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TERAPIA GNICA
Tipos de terapia gnica
Reemplazar un gen defectuoso (ciruga gentica),
enfermedades hereditarias monognicas.
1. Manipulacin para aumentar la expresin de genes
(citocinas, etc.)
2. Reducir la expresin de un gen potencialmente daino
(oligonucletidos antisentido)
3. Introducir un gen no-humano (resistencia a metales,
antibiticos, patgenos, etc.)
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TERAPIA GNICA
Tipos de problemas tratables por terapia gnica
1. Enfermedades heredables (fibrosis qustica,
etc.)
2. Enfermedades adquiribles
Infecciosas (virus, bacterias, parsitos)
Cncer
Arteriosclerosis
Etc.
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TERAPIA GNICA
Mtodos de introduccin de ADN
Transfeccin:Fsicos: Biolstica (genegun), electroporacinQumicos: Lipidos catinicos, fosfato clcico, polmeros, etc.Biolgicos: ADN unido a ligandos de receptores de membrana expresados en clulas diana
Transduccin: dependientes de virusRetrovirusAdenovirusVirus Adeno-Asociados (AAV)Herpesvirus
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TERAPIA GNICA
Tipos de reparto del ADN
EX VIVO:Paciente no est directamente expuesto al sistema de transferencia gnica.Posibilidad de monitorizar la expresin del transgenTrabajo sobre poblaciones de clulas especficas
IN SITU:ADN dirigido directamente a un rgano o tumor
IN VIVO:ADN introducido directamente a travs de la sangre
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Crecimiento de la terapia gnicaCrecimiento de la terapia gnica1988 1988 -- 20002000
050
100150200250300350400450
Prot
ocol
os d
e te
rapi
a g
nica
apr
oba d
os
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Progresin de ensayos clnicos Progresin de ensayos clnicos sobre terapia gnicasobre terapia gnica
0
50
100
150
200
250
300
Phase I Phase I-II Phase II Phase III
Prot
ocol
os d
e te
rapi
a g
nica
apr
oba d
os
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Esquema estructura de los retrovirus
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Esquema ciclo de vida de los retrovirus
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Produccin de retrovirus defectivos para terapia gnica
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Problemas de los retrovirus en terapia gnica
Se ha observado la desconexin de los genes a las pocas
semanas de la introduccin. Posiblemente por metilacin. El
cambio de promotores puede aliviar este problema.
Posibilidad de integracin aleatoria que desrregule o inactive
genes celulares imprescindibles.
Dificultad para infectar clulas quiescentes (cerebro, hgado).
Baja eficacia de transduccin viral en tejidos vivos.
Limitacin a 7-7,5 Kb
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Citocinas necesarias para la Citocinas necesarias para la hematopoyesishematopoyesis
IL-2,4,6,7,10,13,14,15
IL-2,4,6,7,9,12,15
IL-2,12,15
CFUs
Plaquetas
Monocitos
Polimorfos
G.Rojos
(TPO)/IL-11
GM-CSF
G-CSF/GM-CSF
EPO
Clulas maduras
Natural Killer
Linfocitos T
Linfocitos B
Clulas maduras
clulamadre
CFU-GEMM
Stem CellFactor(SCF),
IL-3
Lnea linfoide
IL-3
Lnea mieloide
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Varios receptores de factores de Varios receptores de factores de crecimiento contienen la cadena crecimiento contienen la cadena comncomn
ILIL--2R2R ILIL--15R15R ILIL--7R7R ILIL--4R4R ILIL--9R9R
TTBB
NKNK
TTBB
NKNK
TTBB
TTBB
TT
ILIL--22 ILIL--1515ILIL--77 ILIL--44 ILIL--99
CC CC CC CC CC
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Terapia gnica para XTerapia gnica para X--SCIDSCID
insercin en el paciente
co-cultivo
cadena comn
vector retroviralY
mdula sea
gen expresado en las clulas precursoras
desarrollo correcto de linfocitos B y NK
reconstitucinde un sistema inmune funcional
cocultivo clulas madre
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1. Aparece durante la infancia con infecciones recurrentes oportunsticas. Los nios suelen tener infecciones tpicas del SIDA como Candida albicans, Pneumocystis carinii. Sin tratamiento es mortal en el 100% de los casos
2. SCID ligado al cromosoma X aparece por una mutacin en la cadena comn del los receptores de citocinas, el gen est situado en el cromosomas X. Presenta una incidencia de 1/50,000. Los pacientes tienen unos niveles muy bajos de linfocitos T y elevadas cantidades de linfocitos B inmaduros no funcionales.
3. La nica terapia curativa es el transplante de mdula. Este sistema es eficaz en el 100% de los casos con HLA idntico.
4. La ciruga gentica es potencialmente curativa
Inmunodeficiencia combinadad severa ligada al cromosoma X
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Deteccin del ARNm de la cadena Deteccin del ARNm de la cadena C mediante RTC mediante RT--PCRPCR
Resultados terapia gnica para XResultados terapia gnica para X--SCID : qu pasa con SCID : qu pasa con los niveles de expresin del transgn?los niveles de expresin del transgn?
M. Cavazzana-Calvo, et. al. Science (2000) 288:669-71
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Paciente 1Paciente 1 Paciente 2Paciente 2
Niveles cuantificados por citometra de flujoNiveles cuantificados por citometra de flujo
Resultados terapia gnica para XResultados terapia gnica para X--SCID : qu pasa con los niveles SCID : qu pasa con los niveles de linfocitos?de linfocitos?
M. Cavazzana-Calvo, et. al. Science (2000) 288:669-71
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Resultados terapia gnica para XResultados terapia gnica para X--SCID : beneficios clnicosSCID : beneficios clnicosM. Cavazzana-Calvo, et. al. Science (2000) 288:669-71
As a likely consequence of development and sustained function of the immune system, clinical improvement was observed in both patients. In P2, protracted diarrhea as well as extensive graft-versus-host disease (GVHD)-like skin lesions disappeared. Both patients left protective isolation at days 90 and 95 and are now at home 11 and 10 months, respectively, after gene transfer without any treatment. Both enjoy normal growth and psychomotor development. No side effects have been noted. A similar result has since been achieved in a third patient 4 months after gene transfer. These results demonstrate that in these patients, a selective advantage was conferred to T and NK lymphocyte progenitors, enabling full-blown development of mature and functioning T and NK lymphocytes.
ILIL--22 ILIL--1515 ILIL--77 ILIL--44 ILIL--99
CC CC CC CC CC
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Virus de ADN utilizados en terapia gnicaAdenovirus:
Potencialmente patognicos
Comn en terapia gnica in situ
Insertos de ADN grandes (35Kb)
Amplio espectro de clulas diana
Puede transducir clulas quiescentes
En cultivo se pueden obtener grandes cantidades (1011/ml)
Problemas: Inmunognicos y expresin transitoria (3 semanas)
AAV:
Virus humanos no patognicos
Sitio de integracin preferente (Cromos. 19)
Amplia variedad de tejidos diana pero no muy eficaz
Slo permite insertos de 5 Kb
No tiene sistema de empaquetamiento eficiente e independiente
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ProblemasProblemas1. A los 10 aos de la aprobacin del primer estudio de terapia gnica ms de 4000 pacientes han recibido este tratamiento en todo el mundo. Muy pocos han tenido beneficios clnicos definitivos. 2. Hace un par de aos muri un paciente despus de un tratamiento de terapia gnica3. Algunos ensayos clnicos han sido suspendidos debido a obscurantismo por parte de los investigadores en los informes preceptivos de la FDA.4. Dos pacientes de X-SCID han desarrollado leucemia
PromesasPromesas1. Recientemente una enfermedad mortal (X-SCID) ha sido curada por terapia gnica2. Avances en la biologa molecular y los sistemas de transferencia gnica acelerarn el uso de la terapia gnica.
Terapia gnica 2003Terapia gnica 2003