Polímeros bacterianos biodegradables: Polihidroxialcanoatos (PHAs)

1. Polímeros biodegradablesLos plásticos son polímeros orgánicos generalmente de origen

petroquímico, cuyo peso molecular varía entre 104 a 106 Da y debido a su estructura pueden ser manipulados y moldeados con facilidad. Presentan resistencia química (ácidos, álcalis y disolventes) y mecánica, son impermeables, tienen una alta relación resistencia/densidad, excelentes propiedades para el aislamiento térmico y eléctrico y pueden ser transparentes y coloridos. Estas características asociadas a su bajo costo de producción hacen que el uso de los plásticos esté generalizado (Dantas, 2005).

Según su origen, las moléculas de los plásticos pueden ser naturales, como la celulosa, cera, caucho natural, o sintéticas como el polietileno y el nylon. Los plásticos sintéticos se clasifican según el proceso de polimerización en polímeros de condensación y de adición. Las reacciones de condensación producen diferentes longitudes de polímeros (nylon, poliuretanos y poliésteres) y pequeñas cantidades de subproductos como agua, amoniaco y etilenglicol. Las reacciones de adición producen longitudes específicas de polímeros (polietileno, polipropileno, policloruro de vinilo y poliestireno) y ningún subproducto. Según la forma en que son procesados, los plásticos pueden ser termoplásticos o termoestables. Los termoplásticos formados por polímeros lineales o ramificados pueden fundirse, se ablandan cuando se calientan y se endurecen al enfriarse. Por el contrario, la mayoría de los plásticos formados por polímeros entrecruzados son termoestables y ganan dureza cuando se calientan.

Según el Consejo Nacional del Ambiente, CONAM, (2006) más del 80 % de los plásticos existentes en el mercado, son termoplásticos, entre los que se incluyen el polietileno tereftalato, PET (envases de gaseosa), polietileno de alta densidad, PEAD (botellas de detergentes, productos alimenticios, tubos, juguetes), cloruro de polivinilo, PVC (muebles de jardín, tubos de caños, zapatillas), polietileno de baja densidad, PEBD (bolsas para basura, contenedores flexibles), polipropileno, PP (envases de yogurt, margarina y leche, piezas de automóviles). Los termoestables se endurecen mediante un fraguado, no se pueden volver a fundir ni a moldear y constituyen el 20 % de los plásticos, como el poliuretano, PU (revestimientos, acabados, colchones, asientos de vehículos), epoxy (adhesivos, embarcaciones, componentes eléctricos) y fenólicos (hornos, tostadores, placas de circuitos).

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El mayor porcentaje de los plásticos se utiliza para embalajes por lo que tienen una vida útil muy corta y después son descartados en grandes cantidades, acumulándose en los vertederos municipales. Puesto que durante periodos relativamente largos no se ha producido alguna biodegradación significativa de estos materiales, se ha pensado en los polímeros naturales para sustituirlos. Dado que cualquier sustancia de origen biológico puede ser degradada por uno o varios microorganismos, la utilización generalizada de plásticos biológicos podría resolver el problema ambiental de los petroplásticos (Madigan et al., 2004).

Los plásticos biodegradables pueden ser divididos en tres categorías: los sintetizados químicamente, los que contienen amidas adicionadas a su estructura y los polihidroxialcanoatos (PHAs). Entre los primeros están el ácido poliglicólico o ácido poliláctico-alcohol polivinílico o poli (óxido de etileno) y la poli-e-caprolactona que son susceptibles a la degradación enzimática microbiana, pero su aplicación comercial es reducida porque no presentan propiedades mecánicas como los plásticos de origen petroquímico. En el segundo grupo están los plásticos que tienen un grupo amida como agente de carga o ligando, ejemplo, el amido-polietileno y los microorganismos degradan fácilmente la amida quebrando la matriz polimérica; sin embargo, algunos de los fragmentos de estos polímeros permanecen en al ambiente por largos períodos. Los polihidroxialcanoatos (PHAs), pertenecen al tercer grupo, son de origen microbiano, totalmente biodegradables, presentan características semejantes a los plásticos derivados del petróleo y pueden ser producidos a partir de recursos renovables (De Almeida et al., 2004; Dantas, 2005).

2. Definición de polihidroxialcanoatos (PHAs)En la literatura se encuentran muchas definiciones de los PHA, algunas

de las cuales se presentan a continuación. Los PHAs son moléculas que muestran propiedades similares a las de algunos plásticos comunes como el polipropileno pero que son reciclables y fáciles de degradar por muchos microorganismos en un tiempo promedio de 6 a 12 meses frente a los plásticos derivados del petróleo que tardan desde 40 hasta 200 años en degradarse (Franco et al., 2009). También son definidos como simples macromoléculas sintetizadas por muchas bacterias Gram positivas y Gram negativas y acumuladas en gránulos (cuerpos de inclusión) hasta niveles del 80% (Avila, 2007) o más del 90 % del peso seco (De Almeida et al., 2004), normalmente bajo condiciones de privación nutricional de elementos como nitrógeno, fósforo, azufre, oxígeno, magnesio y en presencia de un exceso de fuente de carbono.

Los PHAs son una familia de homopoliésteres o heteropoliésteres biológicos ópticamente activos, que contienen unidades del monómero ácido (R)-hidroxialcanoico. La acumulación de PHAs en las células microbianas

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puede representar entre 30 a 80 % de su masa seca; sin embargo, en condiciones optimizadas de cultivo o con uso de la ingeniería genética se puede alcanzar PHAs en más del 90 % de la masa bacteriana y pueden ser producidos utilizando como fuente de carbono materias primas como el acetato, ácido 4-hidroxibutirico, celulosa, glicerol, lignina, metano, aceite mineral y sacarosa entre otros (Dantas, 2005).

Los PHAs son poliésteres isotácticos de origen bacteriano obtenidos mediante fermentación aerobia en un medio de cultivo rico en hidratos de carbono bajo condiciones de estrés nutricional. Los carbohidratos provienen de fuentes naturales renovables como glucosa, sacarosa o bien desechos de la industria alimentaria como mosto de uva u olivo, melaza de caña de azúcar, etc. Si durante el crecimiento, la bacteria detecta falta o reducción de algún nutriente (N, P, S, Mg, K, O2), entonces genera una reserva de energía mediante la acumulación en el citoplasma de PHAs en forma de gránulos (Hermida y Díaz, 2004). Por su origen de fuentes renovables y por el hecho de ser biodegradables se denominan “polímeros doblemente verdes” (Rozsa et al., 2004).

Los PHAs son una serie de poliésteres sintetizados y acumulados por algunos géneros bacterianos como material de reserva de carbono y energía cuando el medio de cultivo se encuentra desbalanceado con limitación de nutrientes como nitrógeno, fósforo, azufre, magnesio, potasio u oxígeno y con exceso de fuente de carbono o con limitaciones físicas como temperatura no adecuada para el crecimiento. Son considerados como candidatos para el reemplazo de los polímeros de origen químico, debido a que son sintetizados por microorganismos a partir de sustratos agrícolas y tienen la posibilidad de ser degradados a dióxido de carbono y agua en aerobiosis o metano en anaerobiosis, en hábitats diversos como suelo, mar, agua estancadas y aguas residuales (Barbosa et al., 2005).

Existen tres clases de polímeros producidos intracelularmente en los microorganismos, glucógeno, polihidroxialcanoatos (PHAs) y polifosfatos. Sólo el glucógeno y los PHAs son considerados con polímeros de reserva, mientras que los polifosfatos son disipadores de energía para balancear el contenido celular (Fadhil et al., 2006). Los PHAs tienen función de reserva y asimismo retardan la degradación de los componentes celulares como los ácidos nucleicos y proteínas en períodos de escasez de la fuente de carbono. La utilización de los PHAs es considerada como una estrategia desarrollada por las bacterias para incrementar su supervivencia. Son utilizados como fuente de carbono y energía endógena en condiciones de escasez de nutrientes, como fuente de carbono y energía para el enquistamiento (Azotobacter sp.) y la esporulación (Bacillus sp.), como fuente de poder reductor para la degradación de compuestos tóxicos y como protección de la nitrogenasa de las bacterias fijadoras de nitrógeno, puesto que los PHAs constituyen reductores en ausencia de sustratos exógenos que puedan ser oxidados. Asimismo, los PHAs

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han sido detectados como constituyentes de la membrana citoplasmática en complejos con calcio en polifosfatos o asociados a proteínas (Avila, 2007).

3. HistoriaEl primer PHA descubierto fue el poli 3-D-hidroxibutirato, P(3HB), un

homopolímero detectado en Bacillus megaterium, por Maurice Lemoigne en 1923. Desde entonces, una larga variedad de PHAs con diferente longitud de cadena de carbonos y grupos R se han estudiad, con por lo menos 150 diversos componentes de PHAs y cinco rutas biosintéticas diferentes. Esta variabilidad en la composición depende de la especificidad del sistema de polimerización, de la naturaleza del sustrato suministrado, así como de las rutas metabólicas que llevan a la formación de los monómeros.

Los procesos comerciales para la producción de PHAs fueron desarrollados inicialmente por W.R.Grace en los años 60 y desarrollados más adelante por Imperial Chemical Industries (ICI), en Inglaterra, entre los años 70 y 80. Desde los años 90, Metabolix Inc. y Monsanto han sido las fuerzas impulsoras para la explotación comercial de los polímeros de PHAs en Estados Unidos. Según Lemos et al. (2006), existen cuatro marcas: Biopol (copolímero de hidroxibutirato e hidroxivalerato), Biomer (homopolímero de hidroxibutirato), Nodax (copolímero de hidroxibutirato e hidroxihexanoato) y Biocyde (homopolímero de hidroxibutirato, copolímero de hidroxibutirato e hidroxivalerato).

En los años 70, la empresa ICI desarrolló un proceso para producir a escala industrial el Biopol. Este polihidroxialcanoato es un copolímero de monómeros de cuatro y cinco carbonos denominados hidroxibutirato e hidroxivalerato, (PHBV), respectivamente. Se producía utilizando la bacteria Ralstonia eutropha (hoy Cupriavidus necator), cultivada en un medio con glucosa y propionato como fuente de carbono, alcanzando rendimientos superiores al 80 % de peso seco celular. A pesar de su costo relativamente elevado, el Biopol fue utilizado en varias aplicaciones en Alemania. A fines del siglo XX el precio del petróleo disminuyó y de la misma manera el interés por los PHAs.

En los últimos años la tendencia se ha revertido (Cuadro 1). Además de producirse un aumento en el precio del petróleo, se ha tomado mayor conciencia de que las reservas se están agotando de manera alarmante. Por otro lado, los residuos plásticos se acumulan en grandes cantidades y su reciclado alivia la situación pero sólo en parte. El reemplazo de los plásticos derivados del petróleo por biopolímeros totalmente degradables sería una solución para los diferentes aspectos de este problema; sin embargo, el precio de los bioplásticos sigue siendo demasiado alto (De Almeida et al., 2004). En Latinoamérica polihidroxialcanoatos como el P(3HB), son producidos por la empresa brasileña PHA Industrial S.A. desde el año 2000, con capacidad inicial

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de 50 t año-1. Recientemente copolímeros de 3HB y 3-hidroalcanoatos de cadena media (3 HA mcl) han sido objeto de diferentes patentes. Estos son polímeros de gran interés puesto que presentan propiedades intermedias entre polímeros de cadena corta (PHA scl) y de cadena media (PHA mcl) como elongamiento superior al 600 % (Avila, 2007).

Cuadro 1. Principales compañías productoras de polidroxialcanoatos (PHAs) en el mundo

Compañía Ubicación Producto Nombre comercial

Metabolix/USA(BASF/ADM) EEUU

P(3HB)(3HO)P(3HB-co-3HV)

Mirel

PHB Industrial, S.A Brasil P(3HB)P(3HB-co-3HB) Biocycle

Tianan BiologíaMaterial Co

China PHBV Ecogen

Biotechnology Co. Alemania P (3HB) Biomer

Mitsubishi GAS Chemical

Japón P (3HB) Biogreen

P & G & Kaneca EEUU/Japón P(3HB-co-3HHx) Nodax

Bio-on Italia PHA Minerv- PHA

4. Estructura química

Estructuralmente los PHAs son polímeros lineales de (R) -3-hidroxiácidos en los que el grupo carboxilo de un monómero forma un enlace tipo éster con el grupo hidroxilo del siguiente monómero (Figuras 1 y 2). El radical R puede ser un átomo de hidrógeno o una cadena de hasta trece átomos de carbono, que puede contener insaturaciones, cadenas cíclicas, grupos aromáticos e inclusive otros átomos como bromo, flúor o cloro. La naturaleza del radical R determina la identidad de la unidad monomérica y junto con el valor de x (que puede variar de 600 a 35 000), las propiedades del polímero. Se han identificado más de 100 unidades monoméricas como constituyentes de estos poliésteres (Dantas, 2005).

Los PHAs son poliésteres alifáticos constituidos por monómeros con 100 y 3000 unidades. Cuando R= CH3, se tienen monómeros de hidroxibutirato que dan como resultado el poli-B-hidroxibutirato P(3HB). Si R= CH2-CH3, se tienen

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monómeros de hidroxivalerato que en conjunto constituyen el poli-B- hidroxivalerato (PHV). Estos dos compuestos (Figuras 3 y 4) en forma de homopolímeros o heteropolímeros (Figura 5) ocupan los lugares predominantes de los polihroxialcanoatos comercialmente disponibles en la actualidad (Rivera y Nevárez, 2009).

Según la composición de los monómeros en la cadena, los PHAs pueden ser clasificados en homopolímeros (un tipo de monómero) y copolímeros (más de un tipo de monómero). Dantas (2005) menciona que dependiendo del número de átomos de carbono presentes en la cadena de un monómero, se distinguen tres grupos de PHAs, de cadena corta (3 a 5 átomos), cadena media (6 a 14 átomos) y cadena larga (más de 14 átomos). Por su parte, Revelo et al., (2007), consideran dos clases (Figuras 6 y 7): PHAs de cadena corta (3 a 5 átomos de carbono) o PHAs-scl (short chain length), con ácidos 3-hidroxibutírico (3HB) y 3-hidroxivalérico (3HV) y polímeros de cadena media (6 a 14 átomos de carbono) o PHAs-mcl (medium chain length), que contienen monómeros de C6 (3-hidroxihexanoato a C14 (3-hidroxitetradecanoato). Los PHAs- scl son encontrados en Cupriavidus necator, Alcaligenes latus, Azotobacter vinelandii, A. chrococcum y Methylobacterium organophilum entre otras bacterias, mientras que los PHAs-mcl son encontrados en Pseudomonas oleovorans, P. aeruginosa y otras Pseudomonas fluorescentes.

La investigación sobre PHB, demuestra que la naturaleza química exacta y, por tanto, también las propiedades químicas del polímero producido por una bacteria puede ser controlada variando el sustrato utilizado para su cultivo. Por ejemplo, en algunas bacterias el acetato y el butirato determinan la producción de poli-B-hidroxibutirato, (C4), mientras que el caproato (ácido graso de seis carbonos) lleva a la producción de un polímero que contiene C6, y el valeriato (cinco carbonos) a un polímero que contiene C5. También pueden sintetizarse copolímeros que contienen varias unidades de monómeros que se repiten de manera alterna (Madigan et al., 2004).

Figura 1. Fórmula estructural general de los polihidroxialcanoatos (Dantas, 2005).

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O

R O

x

CH CH2 C=

O

R O

x

Figura 2. Fórmula general de los polihidroxialcanoatos y algunos miembros representativos (Costa, 2005).

n=1 R=hidrógeno Poli (3-hidroxipropionato)R= metil Poli (3-hidroxibutirato) P (3HB)R= etil Poli (3 hidroxivalerato) P (3HV)R= propil Poli (3- hidroxihexanoato) P (3H0)R=nonil Poli (3-hidroxidodecanoato)

n=2 R=hidrógeno Poli (4-hidroxibutirato) P(4HB)R=metil Poli (4-hidroxivalerato) P(4HV)

N=3 R=hidrógeno Poli (5-hidroxivalerato) P(5HV)R=metil Poli (5-hidroxilhexanoato)

N=4 R=hexil Poli (6-hidroxihexanoato)

Figura 3. P (3HB), polihidroxibutirato: poli (3-hidroxibutirato), OP (3HB).

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O

CH3 O

x

CH CH2 C

O

R O100 - 30000

CH (CH2) n C

Figura 4. PHV, polihidroxivalerato: poli (3-hidroxivalerato). OP (3HV).

Figura 5. Estructura química de copolímero butirato-valerato PHBV: P(3HB-co-3HV); b1, carbonilo (C=0); B2, metileno (CH2); B3, metino (CH); B4, metilo (CH3) en la unidad P (3HB); V1, carbonilo (C=0), V2, metileno (CH2); V3, metino (CH); V4, metileno (CH2);V5, metilo (CH3) en P (3HV) (Trong et al., 2006).

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O

CH2CH3 O

x

CH CH2 C

O

CH3 O

x

CH CH2 C O CH

CH2CH3

CH2

O

CB3

B4

B2 B1 V1V2V3

V4 V5

x

R= H.CH3C2H5, n= 1-3

Figura 6. PHA de cadena corta (short side chain), termoplástico.

R=C3H7 a C13H27, n =1-4

Figura 7. PHA de cadena mediana (medium side chain), elastomérico.

5. Características físicasLa masa molecular de los PHAs varía dependiendo del microorganismo

productor, pero en promedio está en el orden de 5 000 a 1 000 000 Da (2 x l03 a 3 x 10 6 Da). Las propiedades físicas y mecánicas como rigidez, ductibilidad, punto de fusión, temperatura de transición vítrea y resistencia a los solventes orgánicos varían considerablemente en función de su composición monomérica (Dantas, 2005). Los polímeros de cadena corta (scl) son duros y quebradizos, mientras que los de cadena media (mcl) son flexibles y tienen un punto más bajo de cristalinidad por lo que cada polímero tiene diferentes aplicaciones. Los PHA scl son catalogados como termoplásticos, mientras que los PHA mcl, por tener cristalinidad y punto de fusión menores son reconocidos como elastómeros. Los PHA mcl tienen un elongamiento para ruptura mayor que 100%, mientras que los PHA scl poseen un elongamiento para ruptura menor que 5 %. La incorporación de unidades de valerianatos, (ésteres del

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O

R O

x

CH (CH2) n C

O

R O

x

CH (CH2) n C

ácido pentanoico, 3HV)al P3HV permite aumentar la flexibilidad y resistencia al impacto, alcanzándose un valor de 50 % en elongamiento para ruptura (Avila, 2009).

Los PHAs son polímeros termoplásticos o elastoméricos, con alto grado de polimerización de hasta 30 000 y un grado de cristalinidad que oscila entre 55 a 80 %. Conforme se incrementa la cadena o el número de co-monómeros la estabilidad aumenta. Prácticamente todos son ópticamente activos debido a la presencia de un carbono quiral en la posición B de la estructura del monómero. Son estables ante los rayos UV y en contraste con otros bioplásticos como los ácidos polilácticos (PLA) tienen una mínima permeabilidad al agua.

La temperatura de fusión (Tm) y la temperatura de transición vítrea (Tg) de los PHA, están íntimamente relacionadas con la estructura de los monómeros y la cantidad de comonómeros en los copolímeros Su temperatura de fusión parcial es superior a los 180 ºC y se tornan altamente viscosos y moldeables en temperaturas cercanas o mayores a su punto de fusión. De esta misma manera, la Tm y la Tg se incrementan conforme aumenta la masa molecular en el caso de los PHA de bajo peso molecular pero el comportamiento se invierte en los PHA con elevado peso molecular. Los homopolímeros como el PHB son materiales muy cristalinos y rígidos pero los heteropolímeros de hidroxibutirato-hidroxivalerato son más dúctiles y resistentes. La adición de monómeros de hidroxivalerato disminuye el punto de fusión pero aumenta su biodegradabilidad. Los copolímeros PHBV se forman cuando se utilizan mezclas de sustratos como glucosa y valerato (Hermida y Díaz, 2004; Dantas, 2005).

Las dos clases de PHAs más comunes son el homopolímero polihidroxibutirato P(3HB) y el copolímero de polihidroxivalerato conocido como polihidroxibutirato-valerato (PHBV). El P(3HB) tienen propiedades similares al polipropileno, puede ser procesado por técnicas de extrusión e inyección, es altamente cristalino y muy frágil, mientras que el copolímero PHBV es menos cristalino, más flexible y fácil de procesar. Un nombre comercial de este copolímero es Biopol y se obtiene agregando ácido propiónico. El más ampliamente estudiado es el P(3HB), que presenta unidades repetidas de ácido 3-hidroxibutirico, todas en la configuración D (-), debido a la estereospecificidad de las enzimas involucradas en la síntesis, lo que lo hace totalmente cristalino y frágil. La masa molecular del P(3HB) bacteriano varía entre 103 a 3 x 106 Da, con una polidispersidad en torno a 2. Las densidades del polímero amorfo y cristalino respectivamente son de 1,18 y 1,26 g /cm3. Es soluble en cloroformo y en hidrocarburos halogenados, presenta poca resistencia frente a los ácidos y las bases, pero es muy resistente a la radiación ultravioleta.

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La temperatura de transición vítrea del P(3HB) es de 5 y la de fusión es 175 ºC, cerca del punto de degradación térmica (200 ºC), lo cual restringe su procesamiento. Presenta propiedades mecánicas similares a las del polipropileno (PP); sin embargo, sus aplicaciones son limitadas. En el módulo de Young se encuentra entre 3,5 a 4,0; su resistencia a la tracción es de 40 MPa, la capacidad de elongación es de 5 % inferior a la del PP, por lo que es muy frágil, característica que puede ser atribuida a la ruptura y degradación de las cadenas poliméricas y la formación de rajaduras en las esferulitas durante el proceso de extracción del polímero. Dentro de la célula, existe en estado líquido y amorfo; sin embargo, después de la extracción de la célula por solventes orgánicos, el P(3HB) se convierte en estado altamente cristalino (55-58 %) lo que le da bastante dureza, pero a su vez lo hace un material muy quebradizo. La incorporación de monómeros (3HV) en el polímero conduce a una disminución en la cristalinidad y punto de fusión, con una disminución de la rigidez y un incremento en la dureza, haciendo a poli (hidroxibutirato-co-hidroxivalerato (PHBV)(3HB-co-3HV)y otros copolímeros relacionados más adecuados para aplicaciones comerciales (Hermida y Díaz, 2004).

Dependiendo de la longitud de la cadena lateral en las unidades monoméricas del polímero PHA (una propiedad que puede ajustarse modificando la composición del medio de crecimiento o por modificación genética de la bacteria productora), pueden asegurarse PHAs con diversos puntos de fusión, cristalinidad, flexibilidad y resistencia a la tensión (Madigan et al., 2004). En el cuadro 2 se observa una comparación de algunas propiedades entre el polipropileno, un homopolímero polihidroxibutirato (PHB) y un heteropolímero hidroxibutirato-hidroxivalerato (PHBV) en contraste con los polímeros de cadena corta como el PHB o el PHBV, los PHAs de cadena mediana son menos cristalinos y más elásticos.

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Cuadro 2. Comparación de algunas propiedades entre poliésteres sintéticos (polipropileno) y polihidroxialcanoatos (Dantas, 2005)

PropiedadPolipropileno P(3HB) PHBV (20 % HV)

Masa molecular x 103 Da2,2-7,0 1,0-8,0

Densidad (g.cm3)0,90-0,94 1,23-1,25

Temperatura defusión (ºC)

170-186 171-182 145

Temperatura de transición vítrea (ºC)

45 4-10

Cristalinidad (%)65-70 65-80 56

Distribución de masa molecular

5,2-12,0 2,2-3,0

Módulo de Young (GPa)(Fuerza de tensión)

1,7 3,5-4,0 1,2

Resistencia a tracción (MPa)

35 40

Extensión hasta quiebre (%)

400 5-8 50

Resistencias a radiación ultravioleta

Baja Alta

Resistencia a solventesAlta Baja

Permeabilidad de oxígeno (cm3 .m2 .atm-1 d-

1)1700 45

BiodegradabilidadNula Buena Muy buena

6. Organismos que sintetizan PHAsLos PHA son poliésteres termoplásticos sintetizados por diversos

organismos, incluyendo procariotas y algunas plantas, bajo determinadas condiciones de crecimiento. Si bien existen reportes sobre la producción de PHAs en plantas, las células vegetales obtienen rendimientos menores al 10 %, mientras que algunas bacterias logran acumular estos biopolímeros de manera que hasta 80 a 90% del peso seco es atribuible al PHA, convirtiéndolas en candidatos idóneas para la producción de PHAs a nivel industrial (Rivera y Nevárez, 2009).

Los PHAs son producidos por una gran variedad de procariotas (Cuadro 3), siendo acumulados en forma de gránulos en el citoplasma, visibles el microscopio óptico de contraste de fases debido a su elevada refractividad

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(Dantas, 2005). Las bacterias aerobias, anaerobias, heterótrofas y fotosintéticas acumulan PHAs. Las bacterias nitrofijadoras en particular, acumulan estos polímeros como estrategia de supervivencia y de regulación del metabolismo energético tanto en simbiosis como en vida libre.

Se ha detectado la acumulación de PHAs en cerca de 300 especies bacterianas; sin embargo, el porcentaje de acumulación en muchas de ellas es muy bajo, por lo cual se rechazan ante la imposibilidad de industrializar el proceso; no obstante, especies como Cupriavidus necator (Ralstonia eutropha), Methylobacterium spp. Alcaligenes latus, Pseudomonas oleovorans, P. putida, P. denitrificans, P.aeruginosa, Bacillus megaterium, Halomonas boliviensis, Azospirillum brasilense, Escherichia coli recombinante y Azotobacter vinelandii han sido investigadas ampliamente (Barbosa et al., 2005). También son consideradas especies de los géneros Agrobacterium, Actinobacillus, Mesorhizobium, Rhodobacter, Methylocistis, Leptothrix, Rhizobium, Halomonas y Sphaerotilus (Avila, 2007; Guzmán y Guz, 2008).

Existen géneros de bacterias que sintetizan el polímero únicamente en la fase estacionaria de crecimiento, por limitación de un nutriente en presencia de una fuente de carbono en exceso, por ejemplo: C. necator, P. oleovorans, Azotobacter beijerinckii, y Azospirillum brasilense. Otras bacterias acumulan PHAs durante su crecimiento, sin necesidad que se agote un nutriente esencial, ejemplo: Mesorhizobium plurifarium, Alcaligenes latus, Pseudomonas putida, Haloferax mediterranei, Azotobacter chroococcum, los mutantes de Azotobacter vinelandii y las cepas recombinantes de E. coli (Lasala et al., 2004, Chen et al., 2006; Choi et al., 1998).

C. necator produce PHAs de cadena corta (unidades C3 a C5). Además del homopolímero PHB, puede producir polímeros que contienen varias porciones de numerosos monómeros C3 a C5 diferentes. La naturaleza y proporción de estos monómeros están influenciados por la fuente de carbono suministrada en el medio de cultivo (Cuadro 3).Por ejemplo, cuando se suministra ácido propiónico o ácido pentanoico, se obtiene un copolímero aleatorio que contiene monómeros tanto de 3-hidroxibutirato (3HB) como 3-hidroxivalerato (3HV).

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Cuadro 3. Fuente de carbono, compuesto limitante y tipo de PHA producido por diferentes bacterias (Dantas 2005; Rivera y Nevárez, 2009)

Bacteria Fuente de C Compuesto limitante Tipo de PHAAlcaligenes latus

Savia de maple Amonio P (3HB)

Azotobacter vinelandiiAgua residual Oxígeno PHBV

Azospirillum brasiliense

Amonio, carbono, oxígeno, magnesio

Bacillus cereusGlucosa Sulfato de potasio P (3HB)

B. megateriumGlucosa Sulfato de potasio P (3HB-co-3HV)

B. subtilisSulfato de potasio P (3HB)

B. thuringiensisCaldo nutritivo Sulfato de potasio PHB, PHBV

Bacillus spp.Cado nutritivo,sucrosa, alcanoatos

Sulfato de potasio PHB, PHBV

Cupriavidus necatorButírico+valéricoAceite de soya

AmonioP (3HB-co-3HV)P (3HB-co-3HHx)

E. coli recombinanteGlucosa, fructosa, suero de leche

P(3HB), P (3HD)

Halomonas boliviensisAlmidón hidrolizado PHB

Hypomicrobium sp.Carbono

Methylobacterium sp.Metano P (3HB)

Pseudomonas sp.Amonio,fierro,sulfato, magnesio, manganeso.

P. aeruginosaGlucosa Hierro, magnesio P (3HB)

P. oleovorans Acido octanoicoAmonio, fosfato, magnesio,sulfato

P (3HO)

P. stutzeriGlucosa Hierro, magnesio P (3HB)

Rhodopseudomonas palustris

C02, acetato P (3HB)

Rhodosporillum rubrum

AcetatoAmonio, fosfato, sulfato de potasio

P (3HB)

Rhodobacter sphaeroides

Amonio, fosfato, sulfato de potasio

Rhizobium ORS571Amonio, magnesio, oxígeno

S.cerevisiae recomb. Glucosa P (3HB)

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P(3HB)= poli (3-hidroxibutirato); P(3HV)= poli (3-hidroxivalerato); P (3HHx) = poli (3-hidroxilhexanoato); P (3HO)= poli (3-hidroxialcanoato); P(3HD) = poli (3-hidroxidecanoato).

Los primeros reportes de la formación de PHA mcl por Pseudomonas fueron en P. oleovorans, describiendo la producción del polímero con 3-hidroxioctanoato por la asimilación de ácidos grasos de cadena corta y cadena larga; sin embargo, la síntesis de PHA mcl es ahora considerada pertinente no sólo para P. oleovorans, sino también para todas las Pseudomonas fluorescentes. Muchas especies productoras pueden sintetizar estos polímeros con varios grupos funcionales como halógenos, alquilos ramificados, fenilos, fenoxilos, oleofinas y ésteres, cuando son cultivadas con sustratos que tienen las estructuras químicas correspondientes y se ha determinado que estos grupos funcionales pueden mejorar las propiedades físicas de los PHA mcl (Avila, 2007).

Franco et al. (2009), detectaron PHAs en actinomicetos aislados de suelos rizosféricos y observaron el mayor rendimiento, Y p/x, (27,48 % en peso seco), en una cepa identificada como Streptomyces subrutilus. Por su parte, Azotobacter sp. FA8 es una bacteria productora de PHB, aislada de muestras de suelo y puede utilizar sacarosa o melaza de caña. Además este microorganismo no forma cápsula, lo cual significa que no deriva la fuente carbonada para la síntesis de exopolisacáridos.

Los productores naturales de PHAs como Azotobacter sp. FA8 se han adaptado a la acumulación de este polímero durante su evolución, pero normalmente tienen un tiempo de generación largo y temperaturas de crecimiento relativamente bajas. Además son difíciles de lisar y poseen enzimas que degradan el polímero acumulado. E. coli no tiene la capacidad de sintetizar o degradar PHA, pero crece rápido y es fácil de lisar. Se han expresado los genes pha de varias especies bacterianas en E. coli, obteniéndose buenos rendimientos del polímero. Asimismo, al no poseer enzimas que degradan a los PHA, E. coli permite la acumulación del polímero de alto peso molecular.

Los genes necesarios para la síntesis de PHB en Azotobacter sp. FA8, phaA, phaB y phaC han sido clonados y caracterizados en el laboratorio y transferidos a una cepa de E. coli, para lo cual se construyó un plásmido recombinante introduciendo los genes de Azotobacter sp. FA8 bajo la regulación del promotor lactosa en un vector de expresión de alto número de copias. Este plásmido se transfirió a E. coli y permitió la obtención de PHA en la cepa recombinante a partir de glucosa. Esta cepa bacteriana también degrada lactosa por lo que se analizó la producción del polímero utilizando lactosa y también lactosuero en un medio salino, obteniéndose PHAs en ambos casos (De Almeida et al., 2004).

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7. BiosíntesisLa biosíntesis de P(3HB) o de otros PHAs se inicia con el transporte

facilitado y difusión pasiva de una fuente de carbono hacia el citoplasma, para ser convertida en un tioéster (coenzima A) de un hidroxialcanoico, que puede ser utilizado como sustrato por la PHA sintetasa y a través de varios caminos anabólicos o catabólicos se forma un poliéster por acción de la enzima sintetasa. Independientemente de la fuente de nutriente utilizada, la síntesis de PHAs depende de la formación de acetil-CoA, un intermediario en las vías degradativas de los carbohidratos y del ciclo de Krebs. Durante el crecimiento vegetativo, el acetil CoA sigue el ciclo del ácido tricarboxílico y es oxidado hasta dióxido de carbono y agua generando energía en forma de ATP y GTP. En ausencia de restricciones nutricionales, el nivel de CoASH se incrementa y el acetil-CoA sigue el ciclo de Krebs. Cuando el crecimiento es limitado por los nutrientes el nivel de CoASH se reduce y se favorece la síntesis de PHAs (Dantas, 2005).

Existen cuatro rutas metabólicas para la síntesis de PHAs, relacionadas con el tipo de microorganismo productor, el sustrato fuente de carbono y el tipo de PHA producido. Tres de estas rutas pueden ser utilizadas para la síntesis de P(3HB). En la primera ruta C. necator utiliza sustratos como carbohidratos, piruvato o acetato para la síntesis inicial de acetil-CoA. En el mecanismo de síntesis de PHAs de cadena corta (C3 a C5), intervienen básicamente tres enzimas β-cetoacil-CoA tiolasa, acetoacetil-CoA reductasa y P (3HB) polimerasa.

En el primer paso de la biosíntesis, las cetotiolasas catalizan la adición reversible de un grupo acetil a una molécula de acetil- CoA. Dependiendo de la especificidad por el sustrato existen dos grupos de β-cetoacil-CoA tiolasas. El primer grupo consiste en tiolasas con una amplia especificidad por el β -cetoacil-CoA en un rango de C4 a C16, son involucradas en la degradación de ácidos grasos y están localizadas en el citoplasma de procariotas y en mitocondrias y peroxisomas de células vegetales y de mamíferos. El segundo grupo de tiolasas está considerado como biosintético, tiene un estrecho rango de especificidad por el tamaño de la cadena de C3 a C5 y presentan dos sitios activos de cisteína. Inicialmente en la reacción, un sitio activo con cisteína ataca una molécula de acetil-CoA para formar el intermediario acetil-S-enzima. A continuación, una segunda cisteína deprotona otra molécula de acetil-CoA, resultando una molécula inactiva de acetil-CoA que es capaz de atacar el complejo acetil-S-enzima y formar de esta manera acetoacetil-CoA.

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En el segundo paso de la biosíntesis, una acetoacetil-CoA reductasa que es una (R)-3 hidroxiacil-CoA deshidrogenasa dependiente de NADPH reduce (de manera reversible) las moléculas de acetoacetil-CoA en D (-) - 3-hidroxibutiril-CoA (reacción estereoselectiva). En C. necator se han encontrado dos tipos de acetoacetil- CoA reductasas con diferente estereospecificidad a sustratos y coenzimas. La enzima NADH dependiente es activa con sustratos D (-) y L (+), en tanto que la NADPH dependiente y estereospecífica solo se activa con sustratos de cadena C4 a C6 (D (-) 3-hidroxiacil-CoA.

En el tercer paso, la P(3HB) polimerasa o sintetasa cataliza la reacción de polimerización entre moléculas de hidroxibutirato, formándose el PHB (Figuras 8,9 y 10), como un polímero de l05 a l06 unidades de monómeros y se acumula en los gránulos, conteniendo cada uno aproximadamente 1000 cadenas de polímero. La actividad de polimerización de la sintetasa se basa en la formación de enlaces éster con un residuo de cisteína como sitio activo. Se presume que el rol de la PHA polimerasa en la transferencia de monómeros en la cadena, incluye algún control en el peso molecular del polímero producido, lo cual es una característica típica de cada microorganismo. El gen phaC es esencial para la actividad de la sintetasa de la cual se distinguen dos formas: una activa en las células que acumulan PHA y una forma no activa en las células que no están acumulando y donde el phaC es más susceptible a la degradación. Durante el crecimiento no limitado predomina la forma soluble. Cuando cambian las condiciones del medio con limitación de nutriente se favorece la formación de PHA y aparece la forma asociada a los gránulos de PHA, desapareciendo la forma soluble.

2 acetil – CoA → acetoacetil-CoA → 3 hidroxibutiril-CoA → P (3HB) + CoA SH

CoASH NADPH NADP+ + H+

En la segunda ruta, Rhodopseudomonas rubrum utiliza sustratos como acetato y anhídrido carbónico. El acetoacetil-CoA formado por la B-cetotiolasa es reducido por una reductasa NADH dependiente, originando S-3-hidroxibutil-CoA, el cual es convertido a R-3-hidroxibutil-CoA por dos enol-CoA

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hidratasas. El último paso de la polimerización es catalizado por la P (3HB) sintetasa.

La tercera ruta de biosíntesis de PHAs es observada en la mayoría de especies de Pseudomonas grupo I (P. olevorans), utilizando sustratos como ácidos grasos (Figura 11) y sustancias que pueden ser convertidas en alcanos o ácidos alcanoicos. Estos ácidos son activados por una tioquinasa y son normalmente degradados vía β-oxidación, resultando en la formación de acetil-CoA o propionil-CoA. El P(3HB) puede ser formado a partir de acetil-CoA como en la primera ruta y los copolímeros pueden ser formados a partir de acetil-CoA más propionil-CoA. Los intermediarios de la ruta de β-oxidación pueden ser direccionados a la síntesis de P(3HB) u otros PHAs de cadena media. Una coenzima tioéster de un ácido 3-cetoalcanoico con cuatro o más átomos de carbono puede ser reducida a su correspondiente tioester R-3-hidroxiacil-CoA por una 3-cetoacil-CoA reductasa. También pueden ser utilizados otros intermediarios como los tioésteres S-3-hidroxiacil-CoA y enoil CoA, a través de la conversión a sus correspondientes tioésteres R-3-hidroxiacil-CoA que servirá de sustrato para las PHA sintetasas (Figura 11). Una cuarta ruta, está presente en todas las especies de Pseudomonas pertenecientes al grupo II (P. aeruginosa), utilizando sustratos como gluconato o acetato para la síntesis de PHAs de cadena corta.

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Figura 8. Diagrama de flujo que presenta las etapas de la síntesis de PHB por Cupriavidus necator a partir de carbohidratos, piruvato o acetato.

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Azucares

Acetil CoA

Acetil – S - enzima

Acetoacetil - CoA

(R) – 3 – hidroxibutiril - CoA

PHB

NADPH + H+

NADP+

CoASH P (3HB) polimerasa o sintetasa

Acetoacetil – CoA reductasa

B – cetoacil – CoA tiolasa

Acetil CoA

CoASH

Figura 9. Serie de reacciones de la síntesis de PHB en Cupriavidus necator.

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Figura 10. Metabolismo de polihidroxibutirato (Cholula,2005).

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Figura 11. Ruta metabólica para la síntesis de polihidroxialcanoatos a partir de ácidos grasos (Dantas, 2005).

Avila (2007), menciona que la biosíntesis de PHAscl involucra dos rutas metabólicas diferentes, dependiendo del sustrato empleado, la primera está mediada por el uso de monómeros generados durante la oxidación de ácidos grasos como el enoil-CoA, por lo que no implica a las enzimas tiolasa y reductasa. Se produce PHA principalmente con monómeros de 3-hidroxivalerato (3HV), pero también se encuentran pequeñas cantidades de 3HB. La segunda vía envuelve el uso de carbohidratos, por la ruta metilmalonil-CoA. Se acumula PHA con monómeros de 3HV, con acetil-CoA y propionil-CoA como precursores: el succinil-CoA es convertido a metilmalonil-CoA, el cual es descarboxilado a propionil-CoA. Por su parte, el acetil-CoA proviene de la glicólisis. Este tipo de vía es característica de los actinomicetos.

Cuando el microorganismo es cultivado con carbohidratos como única fuente de carbono, el PHA producido está compuesto principalmente por monómeros de C10 y C8. Por este motivo se sugiere que estos monómeros

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son derivados de intermediarios de la biosíntesis de ácidos grasos a partir de glucosa. Se forman moléculas de 3-hidroxiacil a partir de la condensación de moléculas de Acetil-CoA, vía malonil-CoA, para formar el hidróxido que será incorporado al polímero, que a su vez es transferido de la Acyl Carrier Protein (ACP) para la coenzima A por la transacilasa para luego realizar la reacción de polimerización catalizada por la PHA sintasa.

Cuando la fuente de carbono está constituida por ácidos grasos de C6 a C12, los monómeros de PHAs tienen la misma longitud que el sustrato disponible o tienen dos, cuatro o seis átomos menos. Cuando se administran ácidos grasos de C13-C18, la composición del PHA no está relacionada con la longitud del sustrato, puesto que el monómero más largo insertado tiene 11 a 12 carbonos, aunque es dependiente para configuraciones como insaturaciones. Cuando se utilizan los ácidos heptadecanoico u octadecanoico, no se observa acumulación de PHAs, puesto que esta fuente de carbono no permite el crecimiento de los microorganismos. Como los intermediarios de la oxidación de los ácidos grasos presentan una conformación (S)-3-hidroxiacil-CoA, se necesita un paso adicional para transformarlos a (3)-3-hidroxiacil-CoA, puesto que la polimerasa para PHAmcl presenta especificidad para este tipo de monómeros; por lo tanto enzimas como una (R)-específica enoil-CoA hidratasa, una hidroxiacil-CoA epimerasa y una 3-cetoacil reductasa han sido postuladas para unir la β-oxidación con la biosíntesis de PHAs.

En Azotobacter sp. al igual que en C. necator, el polímero PHA se sintetiza mediante un camino metabólico que involucra tres enzimas, una cetotiolasa que condensa dos moléculas de acetil-CoA para formar acetoacetil-CoA, una acetoacetil-CoA reductasa que convierte este compuesto en 3-hidroxibutiril-Coa y una sintetasa que polimeriza los monómeros (De Almeida et al., 2004).

En Azospirillum sp. el metabolismo de PHB es un proceso cíclico, donde la proporción entre reacciones biosintéticas y degradativas está determinada por las condiciones de crecimiento. La vía para la producción de PHB consiste de tres reacciones básicas a partir de acetil-CoA. Primero, la condensación de dos moléculas de acetil-CoA en acetoacetil-CoA por la enzima β-cetoacil-CoA tiolasa (codificada por el gen phhA). La segunda reacción es la reducción de (R)-3 hidroxibutiril-CoA por la deshidrogenasa acetoacetil-CoA dependiente de NADPH (gen phhB), siendo un proceso reversible y en la tercera reacción, los monómeros de (R)-3-hidroxibutiril-CoA son polimerizados para formar poli (3-hidroxibutirato) por la polimerasa P(3HB), codificada por el gen phhC. Esta enzima mayormente conocida como PHB polimerasa determina la composición del polímero resultante además de estar estrechamente relacionada al nivel de la producción, largo de la cadena y polidispersidad del PHB generado, así como en la variación de la composición de los copolímeros (Cholula, 2005).

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La disponibilidad de acetil-CoA y NADPH son los factores más importantes que afectan la biosíntesis de PHB tanto en C. necator como en su recombinante E. coli. La vía de las pentosas fosfatadas (PP) también genera NADPH; sin embargo, su poder reductor es dirigido en su mayoría a la formación de ácidos nucleicos y aminoácidos. La función primaria de la vía Entner-Doudoroff (ED) en E. coli es catabolizar la fuente de carbono y la expresión del operón de la vía es inducida bajo condiciones de fermentación de gluconato. A través de esta vía una molécula de NADPH, NADH y ATP es producida por mol de glucosa y dos moles de ATP y dos moles de NADH son producidos a través de la vía Embden- Meyerhof-Parnas (EMP). Bajo condiciones de acumulación de PHB, las células prefieren la vía ED ya que permite la formación de NADPH que es requerido para la formación del biopolímero. Variando los flujos metabólicos intracelulares en células transformadas de E. coli, que pueden acumular PHB hasta en un 78 %, se observó que una cantidad significativa fue dirigida a la producción de PHB, en comparación con una cepa silvestre no productora donde la vía ED fue muy activa, con un decremento proporcional del ciclo de Krebs, de la via PP y de la síntesis celular, cuando se incrementaba el contenido de PHB (Cholula, 2005).

Generalmente, el PHB es sintetizado en una vía similar a la de los ácidos grasos excepto que: 1) los intermediarios de PHB son derivados de CoA y no de proteínas acarreadoras, 2) la síntesis de PHB es específica para el estereoisómero D (-)-3-hidroxibutirato y, en muchos casos, por NADPH, 3) las enzimas involucradas en la síntesis de PHB no se ensamblan en un complejo, y 4) la polimerización del hidrobutirato produce gránulos de PHB en la interfase del citoplasma (Trotsenko y Belova, mencionados por Cholula, 2005).

8. Formación de gránulosLos gránulos de PHAs tienen un diámetro típico entre 0,1 y 0,8 um (Dan

et al.,2008) y poseen una membrana como cobertura de cerca de 2 nm de grosor, compuesta por lípidos y proteínas, representando el 0,5 y 2 % respectivamente del peso del gránulo. Parece que el número de gránulos por célula es fijado en los estados tempranos de la acumulación del polímero y durante la acumulación, la célula pierde su conformación típicamente cilíndrica para acomodar polímero adicional, hasta el punto en que la síntesis de PHAs disminuye. El cese en la acumulación de polímero puede deberse a la cantidad acumulada, puesto que al alcanzar su porcentaje máximo de reserva, la PHA polimerasa permanece activa, lo que sugiere que una constricción física opera e impide que la célula acomode más polímero dentro de ella, a pesar de la disponibilidad de sustrato y de la polimerasa activa.

Avila (2007), menciona que la formación de los gránulos puede seguir cuatro pasos: a) La polimerasa soluble actúa con concentraciones cada vez

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mayores de 3-hidroxibutiril-CoA en el citoplasma. Durante la fase lag los oligómeros de hidroxibutiril (HB) son formados y se mantienen unidos con la enzima. b) Estos oligómeros de HB forman micelas que aumentan en tamaño e hidrofobicidad. Consecuentemente estas películas proveen una unión de dos fases, con la polimerasa en la interfase. c) La enzima entonces procede rápidamente con la síntesis de P(3HB) dentro del gránulo en crecimiento, lo cual precisa de una superficie disponible. d) Eventualmente las micelas coalescen formando grandes gránulos que pueden ser fácilmente visualizados en el microscopio de contraste de fases (Figura 12).

Figura 12. Mecanismo propuesto para la formación de gránulos de PHAs (Avila, 2007).

La PhaP es una proteína de unión de PHA que determina el tamaño de los gránulos. Esta proteína parece que está involucrada en el mantenimiento de las condiciones óptimas para la síntesis de PHA y la formación de los gránulos; actúa de manera similar a las oleosinas de las plantas productoras de aceites y mantiene la integridad de los cuerpos oleosos previniendo su coalescencia. Las inclusiones de P(3HB) en el citoplasma bacteriano son amorfas, insolubles en el agua y se observan en forma de esferulitas cuyas superficies son regiones dinámicas en donde se encuentran las proteínas involucradas en la formación y estabilización de las inclusiones. Además también están presentes lípidos y fosfolípidos.

9. Regulación nutricional de la síntesis de PHAsDesde el punto de vista nutricional, los PHAs, se acumulan en respuesta a

un factor nutricional limitante, como puede ser falta de nitrógeno, fósforo, magnesio o del oxígeno y en presencia de un exceso de la fuente de carbono y energía.

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En C. necator que es la bacteria más estudiada al respecto, el control de esta ruta se lleva a cabo a nivel de las actividades de las enzimas biosintéticas. El principal blanco de la regulación es la condensación de acetil-CoA, mediada por la β-cetotiolasa. Este paso se inhibe por el CoA libre, generado principalmente en el ciclo de Krebs, eliminándose esta inhibición cuando se incrementa la concentración de acetil-CoA. Así la relación acetil-CoA/CoA controla la actividad de la primera enzima de esta ruta biosintética y, como consecuencia, el destino de acetil-CoA hacia el ciclo de Krebs o hacia la biosíntesis de PHB. Por su parte, la limitación de oxígeno aumenta la relación NADH/NAD por no existir un aceptor final de electrones en la cadena respiratoria llevando a la formación de P(3HB). Cuando existe limitación de nitrógeno, las células no producen proteínas y se acumula el ATP cuyo exceso provoca una disminución de la fosforilación oxidativa y así mimo acumulación de las enzimas reducidas (NADH) que permiten la formación de P(3HB) cuya vía metabólica reoxida estas coenzimas. De esta forma las condiciones necesarias para la síntesis de PHAs son elevada concentración de NADPH, baja concentración de CoA y elevada concentración de acetil CoA.

La ruta biosintética de PHAs en E.coli recombinante tiene varias vías que compiten por los sustratos e incluyen la formación de ácido cítrico, ácido acético, etanol y síntesis de ácidos grasos (Figura 13). Por tanto, la cantidad de acetil CoA disponible para la síntesis de P(3HB) es dependiente del estatus metabólico celular. En un medio complejo, un mayor número de precursores como aminoácidos y vitaminas están disponibles para la síntesis de macromoléculas, lo cual genera una disponibilidad de acetil-CoA para la vía de PHAs. Por el contrario, en un medio definido, existe menos disponibilidad de acetil-CoA, por cuanto este compuesto se debe utilizar para la síntesis de precursores en otras rutas metabólicas. La regeneración del NADPH también es importante debido a que la segunda enzima en la síntesis de PHAs, (reductasa) lo requiere como cofactor. La síntesis de aminoácidos también requiere NADPH, por ejemplo se necesitan 8 moles de NADPH para la síntesis de 1 mol de metionina a partir del oxalacetato. Esta puede ser otra razón para la menor acumulación de P (3HB) en un medio definido en el cual los aminoácidos deben ser sintetizados. Asimismo, es conocido que la β-cetotiolasa es inhibida por las moléculas libres de CoA. Las células operan el ciclo de Krebs intensivamente para cubrir los requerimientos biosintéticos en un medio definido lo cual deja libre moléculas de CoA por acción de la primera enzima del ciclo, citrato sintetasa. Todo esto ocasiona una baja acumulación de P(3HB) en un medio definido o semidefinido comparado con los medios complejos.

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En Azospirillum brasilense se ha observado que la acumulación de PHB aumenta drásticamente al final del crecimiento exponencial, siempre y cuando la fuente de carbono no sea un factor limitante y se observa que en la fase estacionaria el contenido de PHB disminuye (Cholula, 2005).

Figura 13. Vías metabólicas que compiten con la síntesis de PHAs en Escherichia coli recombinante

10. Regulación genética de la biosíntesis de PHAsEn C. necator las enzimas biosintéticas de PHAs son sintetizadas

constitutivamente y su regulación es a nivel enzimático, con la CoA como molécula clave reguladora. Las fasinas son proteínas estructurales asociadas a los gránulos de PHAs que impiden que otras proteínas puedan asociarse inespecíficamente por lo que se relacionan con su tamaño y pureza. Las fasinas (phaP) se consideran proteínas claves en la formación de gránulos de PHAs, relacionadas con las proteínas represoras de fasinas (phaR), que se unen a la región promotora de phaP bloqueando la expresión de phaP en ausencia de PHA y se desplazan en presencia del mismo, por lo que CoA es considerado un importante regulador de fasina y biosíntesis de PHAs.

En C. necator y A. vinelandii existe una relación de la acumulación de los poliésteres intracelulares con el sistema de regulación metabólica conocido como PTS (sistema fosfotransferasa de azúcar), ya que mutaciones en genes que constituyen este sistema se manifiestan en una menor acumulación de PHB en estas bacterias. La síntesis de PHB en A. vinelandii está controlada a

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Glucosa

PiruvatoLactato

Acetil CoAAcetil PAcetato Acetaldehido Etanol

Síntesis de ácidos grasos

Acetoacetil- CoA

3 hidroxibutiril- CoA

Poli (3 – ácido hidroxibutírico)

Ciclo de Krebs

nivel postranscripcional. Cuando el oxígeno es limitado, se incrementa la actividad de la β-cetotiolasa que cataboliza el primer paso de la síntesis del polímero; sin embargo, también existe una regulación a nivel transcripcional por la proteína activadora phbR.

El operón PHA de Acinetobacter sp. también se transcribe constitutivamente y existe una inducción adicional por medio de un activador transcripcional llamado phoB que se une a promotores del regulón pho, inducida por la limitación de fosfato. En P. aeruginosa, la regulación del PHA ocurre a nivel transcripcional por un mecanismo que requiere un factor cuando crece con glutamato pero no con octanato.

11. Producción de polihidroxialcanoatosCerca de 300 especies de bacterias pueden sintetizar PHAs (Cuadro 4);

sin embargo, solo algunas han sido utilizadas para la producción a gran escala (C.necator, Alcaligenes latus, Azospirillum brasilense, Azotobacter vinelandii, Pseudomonas oleovorans algunos metilótrofos y Escherichia coli recombinante). Cada bacteria requiere condiciones de crecimiento específicas para la síntesis de PHA, pero pueden ser divididas en dos grupos: uno que requiere condiciones limitantes de algún nutriente esencial como carbono o nitrógeno para poder incrementar la eficiencia de la producción de PHAs, por ejemplo C. necator, P. oleovorans y algunos metilótrofos y un segundo grupo conformado por los que no requieren estas condiciones y acumulan PHAs durante el crecimiento, por ejemplo A. vinelandii, A. latus y E. coli recombinante (Franco et al., 2009).

Los procesos para la producción de PHAs se realizan en su mayoría en fermentación sumergida, principalmente en cultivos alimentados o fed batch obteniendo una elevada concentración de biomasa (necesaria para una elevada productividad), que conduce a la formación del polímero. Las fermentaciones continuas permiten una alta productividad pero sólo cuando el cultivo puede ser mantenido estable sin contaminación. Los estudios en fermentadores muestran la influencia del tipo y concentración de la fuente de carbono así como de los niveles de aireación sobre el éxito productivo.

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Cuadro 4. Producción de polihidroxialcanoatos en diversas bacterias

Bacteria PHA Fuente de carbonoTiemp

o(h)

Concentración

celular (gL-1)

Conc PHA (gL-1)

RendimientoYp/s

(gg-1)

Contenido

PHA (%)Yp/x

Rendimiento Y x/s (g g-1)

Productividad(g.L-1.h-1)

Referencia

Cupriavidus necator P(3HB) Glucosa 50 164 121 76,0 2,42

Lee et al., 1995

Cupriavidus necator P(3HB) Glucosa 49 124 92 74,0 1,87

Lee et al., 1995

Cupriavidus necator P(3HB)

C02 / H2

Etanol GlucosaGlucosa

Hidrolizado mandioca Torta de soya+melaza

4050

59

36

85,0063,50164,067,1

106,0

126,0

61,547,0121,

047,6

61,9

94,8 0,00065

72,8074,076,072,1

57,5

32,8

1,540.942,421,23

0,99

Dantas, 2005

Cupriavidus necator

P(3HB) CO2 40 85,0 61,5 72,0 1,54Lee et al.,1995

Cupriavidus necator

P(3HB)-co-P(3HV)

Glucosa-propiónico

46 158,0 117 74,0 2,55Lee et al., 1995

29

Cupriavidus necator

P(3HB)-co-P(3HV)

Glucosa-propiónico

39 113,0 64,0 56,5 1,64Lee et al., 1995

Cupriavidus necator P(3HB)

FructosaGlucosa

0,2840,1 a 0,3

66,276,0

0,1245Barbosa et al.,2005

Cupriavidus necator P(3HB)

Almidón de papa sacarificado

68 179,0 94,0 0,22 53,0 0,46 1,47Haas et al,, 2008

Cupriavidus necator

P(3HB) Glucosa 68 181,0 99,0 55,0Haas et al., 2008

Cupriavidus necator

P(3HB) Glucosa 36 13,45 8,1145,33

60,00.42

0,135El Sayed et al., 2009

Alcaligenes latusP(3HB) Sacarosa 18 145,0 71,4 50,0 3,9

Finkler, 2006

Alcaliges latus P(3HB)P(3HB/3HV)

SacarosaSucrosa-propiónico

4,6516,22,0 43,0

2,60,3

Lee et al., 1995

Azospirillum brasilense

Azospirillum brasilense

P(3HB)P(3HB)

TomateTomate

3624

1,671,95

0,161,20

9,6

Martínez et al.,2004

Azospirillum brasilense

P(3HB) 4,0 0,36 17,0

30

Azotobacter vinelandii P(3HB) Glucosa 47 40,1 32,0 79,8 0,68

Lee et al.,1995

Azotobacter vinelandii

P(3HB/3HV)

Beterraga+ácido pentanoico

19-22

59-71Lee et al.,1995

Chromobacterium violaceum

P(3HV) Acido valérico 39,5 24,5 62,0Finkler, 2006

Haloferax mediterranei

PHBVAlmidón hidrolizado.

39,4 20,01-1,7

50,8Will et al., 2006

Haloferax mediterranei Glucosa 85,5 23,0 27,0

Ting et al., 2006

Haloferax mediterranei

PHBV

Paja de arroz- almidón maíz hidrolizadadoAlmidón maízhidrolizadoGlucosa

140,0

62,6

85,8

77,8

24,2

23,0

55,6

38,7

27,0

Ting et al., 2006

Haloferax mediterranei

P(3HB)-co-3HV)

P(3HB)-co-3HV)

Suero hidrolizado

31,5 12,20,29

0,20

72,8

87,5

0,09

0,14

Koller et al., 2007

31

Suero hidrolizado 14,7

Haloferax mediterranei

P(3HB)-co-3HV)

Glucosa 117 85,0 48,6Ting et al., 2006

Halomonas boliviensis P(3HB) Glucosa 27

0,346

48,7

Klebsiella aerogenes P(3HB) Residuos 32 37,0 24,0 65,0 0,75

Lee et al.,1995

Methylobacterium organophylum

P(3HB) Metanol 70 250,0 130 52,0 1,36

Rhizobium tropici P(3HB)SacarosaSacarosasacarosa

363636

4,023,581,82

18,8319,8418,55

Franco et al., 2009

Mesorhizobium plurifarium

P(3HB)

TomateLactosaSacarosaManitolMelazaGlucosa

484848484848

0,7240,7160,9710,9671,1521,169

0,299

0,279

0,361

0,336

0,146

0,192

41,3239,0737,2734,8212,6811,05

Lasala, 2004

32

Methylobacterium extorquens

P(3HB) Metanol 170 233,0 149 64,0 0,88Lee et al., 1995

Methilobacterium extorquens

P(3HB) Metanol 121 223,0136,

061,0 1,12

Lee et al., 1995

Paracoccus denitrificans

P(3HB/3HV)

Metanol+alcohol n- amílico

120 9,0 2,34 26,0 0,02Lee et al., 1995

Pseudomonas fluorescens

Melaza 150 3,39 3,34 98,5Ramírez et al,

Pseudomonas oleovorans

P(3HH-co-3HO)

n-octano 11,6 2,9 25,0 0,58Lee et al., 1995

Pseudomonas oleovorans

P(3HH-co-3HO)

n- octano 38 37,1 12,1 33,0 0,32Lee et al., 1995

Pseudomonas oleovorans

P(3HH/3HO)

n-octano 2,25 1,05 46,7 0,09Lee et al., 1995

Pseudomonas oleovorans

P(3HH/3HO)

n-octano 45 41,8 15,5 37,1 0,34Lee et al., 1995

Pseudomonas putida PHAs-mcl Acido oleico 69 30,22

13,52

0,102 44,9 0,188

Marsudi et al., 2007

Escherichia coli recomb.

P(3HB) Glucosa 39 101,4 81,2 80,1 2,08

Klebsiella aerogenes recomb.

P(3HB) Melaza 32 37,0 24,0 65,0 0,75

33

34

La estrategia actual en la producción de PHAs es realizar lotes alimentados o fed batch para alcanzar elevadas densidades celulares en una primera etapa, evitando además la posible inhibición por el sustrato. En una segunda etapa se reducen los niveles de suministro de oxígeno (o se fuerza otra condición de estrés apropiada) para alcanzar la acumulación del producto. En esta etapa la concentración de biomasa permanece constante. Existen dos maneras para alcanzar la formación de PHAs en las bacterias. El proceso en paralelo se ha demostrado en Rhodospirillum rubrum y P. oleovorans; sin embargo, durante el crecimiento celular parte del polímero formado inicialmente se pierde debido a que se utiliza como sustrato en el mantenimiento del metabolismo celular. En el proceso en serie, primero las bacterias se cultivan con una fuente de carbono para obtener biomasa celular y luego se elimina un nutriente esencial en el medio, a la vez que se añade un sustrato para la formación del polímero. Este es convertido directamente en polímero y el crecimiento celular es mínimo. Este proceso se usa en la producción de PHAs a gran escala con C. necator.

Aunque la fermentación sumergida es la más generalizada para la producción de PHAs, la fermentación en estado sólido (FES) es una alternativa viable. Es un proceso caracterizado por la ausencia total de agua libre en el material sólido impregnado con el medio de crecimiento microbiano. En muchos casos el sustrato sirve también de soporte para el crecimiento de los microorganismos. El desarrollo de éstos puede ser tanto en la superficie del material sólido como en el caso de bacterias y levaduras así como en la parte interna, como los hongos filamentosos que atraviesan el material.

Una de las ventajas de la fermentación en estado sólido es la posibilidad de la utilización de fuentes de nutrientes de bajo costo como los subproductos o residuos agroindustriales. Asimismo, la purificación de los productos se facilita por estar más concentrados en medios sólidos. Los sustratos utilizados en FES pueden ser divididos en tres grupos, según el compuesto principal que constituye la fuente de carbono: los que presentan almidón (arroz, camote, yuca), los que presentan celulosa o lignocelulosa (maderas) y los que tienen azúcares solubles como fuente de carbono (forrajes, pulpa de frutas). Dantas (2005) investigó la producción de P(3HB) por fermentación en estado sólido de C. necator en residuos de extracto de aceite de soya y una solución de melaza, a 30 ºC durante 36 horas de fermentación, obteniendo 0,65 mg del polímero por gramo de sustrato.

Lee et al. (1995) realizaron un revisión de la producción de PHAs en diversas bacterias como C. necator, A. latus, A. vinelandii, metilótrofos, Pseudomonas sp.y el recombinante E. coli.

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11.1 Cupriavidus necatorEl copolímero P (3HB-co-3HV) sintetizado por C. necator es producido

industrialmente por Imperial Chemical Industries y comercializado bajo la marca registrada Biopol ®. El costo estimado basado en la producción de 500 000 kg de polímero al año es aproximadamente 15 dólares por kg. Los dos contribuyentes principales al costo de producción son la fuente de carbono asociada a la materia prima (sacarosa, glucosa, propionato) y la extracción del polímero de las bacterias

C. necator, anteriomente Hydrogenomonas eutropha, Alcaligenes eutrophus, Ralstonia eutropha y Wautersia eutropha produce PHB y polihidroxibutirato-valerato. La mayoría de trabajos de investigación utilizan cepas mutantes, capaces de crecer sobre glucosa; sin embargo, la cepa nativa crece en fructosa. Industrialmente una mutante de C. necator produce P(3HB) y P(3HB-co-3HV) a partir de glucosa y una mezcla de glucosa-ácido propiónico en cultivo alimentado respectivamente. Las bacterias se cultivan en medio con glucosa y determinada cantidad de fosfato hasta alcanzar la biomasa requerida y después de 60 horas de iniciada la fermentación se limita el fosfato con adición constante de glucosa para mantener una concentración entre 10 a 20 gL-1. En el cultivo alimentado, después de 50 horas se alcanzan 121 gL -1 de P(3HB), con un acumulación de 70 a 80 % y una productividad de 2,42 g/L.h. Las operaciones para la producción de P(3HB-co-3HV) son similares a las descritas anteriormente, pero la alimentación se realiza con glucosa y ácido propiónico. Normalmente el copolímero contiene 0-30 % de ácido 3 hidroxivalérico, valor que puede ser incrementado a más de 90 % con ácidos butírico y pentanoico.

El etanol también ha sido considerado como sustrato para la producción de P(3HB) por una mutante de C. necator. Asimismo el copolímero P(3HB-co-3HV) se obtiene alimentando propanol y etanol bajo limitaciones de nitrógeno. De igual manera, se ha reportado el uso de otras fuentes como ácido láctico con una producción de 59 gL-1 de PHA; ácido oleico con 32,5 g L-1, mezcla de dióxido de carbono e hidrógeno alcanzando 85 y 61,5 gL-1 de concentración celular y P(3HB) respectivamente después de 40 horas y otros sustratos como ácido acético, ésteres, glicerol (Cuadro 5).

En un ensayo con C. necator, se realizaron fermentaciones por lote alimentado en dos etapas, a escala (3 litros) usando tres concentraciones de fructosa (5,10 y 15 gL-1). Para el medio de cultivo se realizó el balance de materiales siguiendo la metodología propuesta por Duarte (1995), mencionada por Barbosa et al. (2005) y en la que se utiliza la siguiente reacción:

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C6H12O6 + 2,814 O2 + 0,75 NH3 = 3CH200,5 N0,25 + 4,14 H20 + 3 C02

Con base en esta ecuación se estableció la relación C:N en 6,85 gramos de carbono por gramo de nitrógeno y se mantuvo constante en la primera etapa para obtener una alta concentración celular. En la segunda etapa las células obtenidas se limitaron en la fuente de nitrógeno para permitir la acumulación del biopolímero. La mejor concentración para la producción de PHB fue 5 g. L-1, con la que se obtuvo un porcentaje de acumulación del 66,2 %, una velocidad especifica de crecimiento de 0,5171 h-1 y una productividad de 0,1245 g PHB.L-

1.h-1 (Barbosa et al., 2005).

Cuadro 5. Producción de P(3HB) por Cupriavidus necator utilizando diferentes fuentes de carbono. X= biomasa, P=concentración de P(3HB), acúmulo teórico de P(3HB) en la biomasa, Qp = productividad

Sustrato Estrategia de fermentación

X(g/L)

P(g/L)

Acúmulo(% m/m)

Qp(g/L.H)

L-láctico+ acético

Alimentada 75,0 54,8 73,1 1,30

C02 Alimentada 91,3 61,9 67,8 1,55

EtanolAlimentada 63,5 47,0 74,0 0,94

GlucosaAlimentada 164,0 121,0 76,0 2,42

GlucosaContinua 67,1 47,6 72,1 1,23

Hidrolizado de tapioca

Alimentada 106,0 61,9 57,5 1,03

Aceite de soya

Alimentada 126,0 94,8 76,0 0,99

11.2 Alcaligenes latusEl grupo Polymer Group Petrochemic Danubia (PCD) utiliza A. latus para

producir PHB con sucrosa como fuente de carbono. La síntesis de PHB está asociada al crecimiento y la limitación de algún nutriente no se utiliza para inducir la acumulación del polímero. El proceso de fermentación se realiza con A. latus aislado de suelo en California y que produce hasta un 80 % del peso celular durante un crecimiento ilimitado. En un proceso fed batch más de 1 tonelada de PHB puede ser obtenido en menos de 1 semana. Las fermentaciones se realizan en tanques con agitación pero también se utilizan columnas de burbujas. La fermentación se realiza en medio sales minerales

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con sucrosa o glucosa como fuente de carbono. Si se añade ácido propiónico como precursor se producen copolímeros de PHB/HV, así como también se producen copolímeros 3HB/4HV (3 hidroxibutirato-co-4 hidroxivalerato) si se añade 1,4 butanodiol como precursor. Después de la fermentación se cosechan las células y se mantienen en suspensiones acuosas de 200 gL-1

para el proceso de extracción. La suspensión celular es tratada con solvente cloruro de metileno, luego se centrifuga y el PHB disuelto y precipitado en el agua se recupera como un polvo blanco y seco, con 99 % de pureza. La biomasa es recuperada luego del proceso de extracción y se puede utilizar como mejorador del suelo.

La ventaja de utilizar A. latus frente a C. necator es su crecimiento más rápido, capacidad para utilizar fuentes de sucrosa baratas (residuos de remolacha y caña) y la acumulación de P(3HB) durante el crecimiento alcanzando más de 60 g L-1 de P(3HB) en cultivos alimentados con una productividad de hasta 2,6 g.L-1.h-1 .

11.3 Azotobacter vinelandiiEn la década del 60, se observó la acumulación de PHAs en A.

beijerinckii principalmente con limitación de oxígeno antes que nitrógeno. El mutante de A. vinelandii acumula más de 75 % de P(3HB) durante la fase exponencial de crecimiento. La acumulación no depende de la limitación de oxígeno, pero si se observa un mejora de la eficiencia para convertir la glucosa a P(3HB). Se alcanza un rendimiento de 0,33 g P(3HB) por gramo de glucosa que es superior a 0,05 obtenido por la cepa salvaje. La adición de 0,05 a 0,2 % de peptona de pescado, proteosa- peptona o extracto de levadura permite hasta un 25 % de incremento en el rendimiento, sobre todo en cultivos bien aireados, sin observarse mejora del crecimiento celular (Cuadro 6). El copolímero P(3HB-co-3HV) puede ser sintetizado por A. vinelandii alimentando con ácido valérico u heptanoico durante la síntesis del polímero en residuos de remolacha. Variando la concentración de ácido valérico se obtienen copolímeros con 23 % de unidades de ácido hidroxivalérico

Las células del mutante A. vinelandii cultivadas en el medio con peptona de pescado son frágiles y el P(3HB) puede ser extraído de manera fácil con amoniaco acuoso 1 N (pH 11,4), a 45 °C, por 10 minutos. La mezcla del polímero obtenido tiene 94 % de P(3HB), 2 % de proteína y 4 % de materiales celulares residuales. Según los resultados, el mutante A. vinelandii es un buen candidato para la producción de PHAs por su capacidad para utilizar sustratos baratos y un eficiente proceso de purificación; sin embargo, la productividad debe ser incrementada mejorando la estrategia de fermentación para alcanzar a C. necator o A. latus.

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Cuadro 6. Producción de P(3HB) por Azotobacter vinelandii cultivado con diferentes fuentes de nitrógeno

Fuente de nitrógeno

P (3HB)(gL-1)

Biomasa residual(gL-1)

P(3HB)(%)

Ninguna 0,3 1,6 16Peptona de pescado 7,5 2,6 74Extracto de levadura 6,8 2,5 73Triptona 5,5 2,1 72Casaminoácidos 4,7 2,2 68Bactopeptona 4,7 2,2 68Extracto de carne 3,8 1,9 67

11.4 MetilótrofosEl metanol es una de los sustratos carbonados más baratos que se

puede emplear en la producción de PHAs. En un inicio la ICI patentó el proceso con Methylobacterium organophilum; sin embargo, el bajo porcentaje de polímero acumulado hacía difícil el proceso de recuperación, por cuanto se debía procesar una mayor cantidad de biomasa. No obstante, el bajo precio del metanol ha sido atractivo para diversas investigaciones. De esta manera se obtuvieron 136 gL-1 de P (3HB) en un cultivo alimentado con Methylobacterium extorquens (antes Protomonas extorquens) usando 0,5 gL-1 de metanol como fuente de carbono, a 30°C y 2,5 ppm de oxígeno disuelto. Se determinó que el nitrógeno era requerido aún en la fase de acumulación a diferencia de C. necator. Controlando la tasa C:N durante el cultivo alimentado la concentración celular final y P(3HB) fue 233 y 149 gL-1 respectivamente, en 170 horas, con un rendimiento de 0,2 g de P(3HB) por gramo de metanol; sin embargo, la productividad fue de 0,88 g P(3HB) L-1h-1, inferior a la de C. necator o A. latus.

M. extorquens y Paracoccus denitrificans han sido utilizados para la producción del copolímero P(3HB-co-3HV) con metanol y n-alcohol amílico como fuentes de carbono en un medio con limitación de nitrógeno. Asimismo Pseudomonas sp. acumuló más de 55 % de P(3HB) en un cultivo alimentado con limitación de nitrógeno. Por lo expuesto, el uso de los metilótrofos para la producción de PHA parece atractivo por la elevada concentración de PHAs que se puede obtener a partir de un sustrato barato como el metanol, no obstante el contenido de PHAs así como el peso molecular (10 5) es más bajo que el de Alcaligenes sp. o Azotobacter sp.

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11.5 Pseudomonas spp.Algunas especies de Pseudomonas como P. oleovorans y en general

todas las Pseudomonas fluorescentes sintetizan PHAs de cadena media (6 a 14 carbonos) cuando se les cultiva en ácidos alcanoicos de 6 a 10 carbonos alcanzando 30 % de contenido de PHAs. En un cultivo alimentado de P.oleovorans, con octano como fuente de carbono y un sistema eficiente de transferencia de oxígeno, con alimentación de magnesio y limitación de amonio se alcanzó una concentración celular y de PHAs de 37,1 y 12.1 gL -1, respectivamente después de 38 horas. Así mismo, el contenido de PHA fue de 33 % y la productividad de 0,32 gL-1h-1. Por su parte, utilizando ácido octanoico como fuente de carbono y añadiendo intermitentemente sulfato de amonio y de magnesio se obtuvieron 41,8 gL-1 de concentración celular; 15,5 gL-1 de PHAs y 37,1 % de contenido, después de 45 horas. A su vez, con octanol que es mucho más barato que el ácido octanoico se alcanzó una concentración de 14 gL-1 en 40 horas de fermentación; sin embargo, el proceso de separación fue muy difícil y una gran cantidad de células quedaron atrapadas en la capa de octanol después de la centrifugación.

Marsudi et al. (2007) cultivaron Pseudomonas putida en ácido oleico para producir PHAs de cadena media, alimentando con nitrógeno y carbono y observaron que la acumulación de PHAs se dio también durante la fase de crecimiento. Después de horas se alcanzó una concentración celular de 30,2 gL-1, un contenido de PHA de 44,8 % y una productividad de 0,188 g/L/h.

11.6 Escherichia coli recombinanteLos genes de C. necator fueron clonados en E. coli en 1988, alcanzando

un rendimiento de hasta 90 % de acumulación de PHAs. La producción de P(3HB) por E. coli recombinante tiene ventajas como su rápido crecimiento, uso de varios sustratos carbonados, gran acumulación del polímero y la pérdida de las depolimerasas. Además las purificación del P(3HB) parece ser más fácil porque las células acumulan grandes porcentajes de P(3HB) en gránulos con paredes frágiles que facilitan la extracción; sin embargo, uno de los problemas de emplear este recombinante es el uso de oxígeno puro para obtener una elevada densidad celular.

11.7 Otros microorganismosDong et al. (2006) realizaron una fermentación fed batch con Haloferax

mediterranei (aqueobacteria extremadamente halófila, aerobia, quimiorganótrofa) utilizando glucosa y extracto de levadura como fuente de carbono y nitrógeno respectivamente para la producción de PHB. Después de 117 horas, la concentración celular fue de 85,8 gL-1 y 48,6 % de PHA, caracterizado como poli (3-hidroxibutirato-co-3 hidroxivalerato) P (3HB-co-3HV copolimero). Por su parte Lee et al. (1995) informaron que con 2 % de

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almidón como fuente de carbono se alcanzaron 6 gL-1 de P(3HB), 60 % de contenido y 0,33 gramos de P(3HB) por gramo de sustrato. Así mismo, debido a la dificultad para la contaminación el cultivo continuo se pudo realizar durante 3 meses.

12. Producción de PHAs y relación costo-beneficioAún cuando las ventajas ecológicas de los PHAs son notables, una

serie de factores limitan su adopción plena como sustitutos de poliésteres sintéticos. Los costos de producción de PHAs son, hasta el momento mayores que los de la producción de poliésteres sintéticos. Para reducir los costos se deben aislar cepas con mayor rendimiento y se debe optimizar el proceso en cada operación unitaria: selección de sustratos económicos, optimización del proceso de fermentación y optimización de la extracción y purificación del producto (Rivera y Nevárez, 2009; Arcos y Vargas, 2006).

La selección de los microorganismos para producir PHA se basa en factores como la capacidad de la célula para utilizar fuentes de carbono baratas, tasa de crecimiento, tasa de síntesis del polímero y cantidad máxima de polímero que puede ser acumulada. Los últimos tres afectan directamente la productividad. La clonación de los genes responsables de la biosíntesis de PHA en E. coli ha permitido obtener una cepa recombinante que alcanza 80 a 90 % de su peso celular seco con una concentración del polímero superior a 80 gL-1 y una productividad mayor de 2 gL-1.h-1 en un proceso alimentado (Dalcanton, 2006).

La productividad es definida como la cantidad de PHA producido por unidad de volumen en una unidad de tiempo. Para una producción de una misma cantidad de PHAs por año, un proceso con menor productividad requiere mayor equipamiento. El efecto de la productividad sobre los costos de producción fue determinado comparando dos procesos de producción de P(3HB) por E. coli recombinante con cepas de diferente productividad. Para una capacidad de producción estimada en 100 000 t año se observó que cuando la productividad se incrementó de 1,98 g.L-1.h-1 a 3,2 g.L-1.h-1, los costos de producción disminuyeron de $5,37 a $ 4,491 Kg-1 P(3HB).

El contenido de PHA acumulado afecta la eficiencia del proceso de extracción. Para que el proceso sea rentable es necesario que la cepa bacteriana productora sea capaz de acumular por lo menos 60 % de su masa celular en PHAs. Este criterio elimina a las Gram positivas o aquellas no capaces de acumular porcentajes elevados del polímero. El rendimiento y la pureza del proceso de extracción son dependientes del contenido de PHA. Una menor cantidad de producto para la digestión puede ser utilizada para separar los gránulos de PHAs de células con un mayor contenido de polímero. Así mismo, un bajo contenido de PHA lleva a grandes cantidades de sustrato

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desperdiciado en otros fines metabólicos. Comparando un cultivo alimentado de A. latus con 50 % de contenido de P(3HB) y un rendimiento de 0,17 g P(3HB) / g de sacarosa con un proceso en donde se alcanzó 88 % del polímero con 0,42 g de P (3HB) / g de sacarosa, se demostró que en el primer caso el costo de extracción fue de $ 4,48 kg -1 P (3HB) frente a $ 0,92 kg-1

P(3HB) en el segundo caso (Dalcanton, 2006).

13. Sustratos para la producción de polihidroxialcanoatosSe conoce que en la mayoría de las bacterias, la producción de PHAs

está ligada a la escasez de nitrógeno o algún otro nutriente en relación a una abundante fuente de carbono, generalmente mono y disacáridos o ácidos grasos. Los PHAs pueden ser producidos utilizando como fuente de carbono materias primas como acetato, amidas, ácido hidroxibutírico, ácido propiónico, celulosa, glicerol, lactato, lignina, melaza, metano, aceite mineral, sacarosa, suero de queso, triglicéridos (Dantas, 2005). Una de las áreas de oportunidad para mejorar el proceso de producción se centra en encontrar fuentes de carbono económicas, provenientes muchas veces de material considerado como desecho o como subproducto abundante que ofrece por si mismo poco valor (Rivera y Nevárez, 2009).

Los aceites de origen vegetal son una buena opción para obtención de PHAs, puesto que son una fuente de carbono renovable y económica y muchos de los ácidos grasos constituyentes de los aceites vegetales son insaturados, por lo que pueden funcionar como precursores de monómeros insaturados que son incorporados al polímero, lo que es esencial para algunos modificaciones químicas. Asimismo, el rendimiento teórico de conversión de aceites vegetales a PHAs está en el orden de 1,00 gg -1, comparado con el valor de conversión de sacarosa de 0,33 gg-1 obtenido en la práctica industrial. La producción de PHAs en P. aeruginosa y P. putida fue evaluada utilizando 11 aceites vegetales (girasol, tungue, mamona, linaza, palma, arroz, canola, maíz, soya, algodón y coco)y 10 combinaciones de éstos. Los valores de PHAs acumulados por el linaje IPT046 fueron significativamente superiores a aquellos observados para el linaje IPT171 y alcanzó hasta 60 % de la masa seca celular. El hidroxioctanoato (3HO) y 3-hidroxidecanoato (3HD) representaron un porcentaje mayor que 65 % de los monómeros detectados en el PHA producido por los dos linajes bacterianos, utilizando cualquiera de los aceites (Avila, 2007).

También se ha propuesto la producción de PHAs en aceite comestible post utilizado. Pseudomonas sp. DR2 acumuló hasta un 23,52 % (peso-peso) de PHAs de cadena mediana utilizando este sustrato como fuente de carbono. Asimismo Grados et al. (2008) investigaron la producción de PHAs por un consorcio bacteriano cultivado en ácidos grasos volátiles provenientes de la digestión anaerobia de desechos agrícolas como rastrojos de Hordeum vulgare

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“cebada”, Chenopodium quinoa “quinua”, Glycine max “soya”, Avena sativa “avena”, Triticum sativum “trigo”, Medicago sativa “alfalfa” y cascarilla de Oryza sativa “arroz”, observando una mayor cantidad de células con gránulos de PHA (hasta 9 %, p/V) en la paja de cebada.

En una revisión de trabajos de investigación realizada por Rivera y Nevárez (2009) se demostró el uso de material de desecho para producir PHAs en varios trabajos como el de Cho et al. (2001), en el que utilizaron agua de desechos de la crianza de cerdos en la producción de PHA por A. vinelandii ATCC 53799. Este sustrato es rico en acetato, propionato y butirato y cuando fue diluido a la mitad, A. vinelandii logró producir y almacenar PHAs hasta un 34 % (peso-peso); sin embargo, la adición de 20 gL-1 de glucosa elevó el porcentaje hasta 63 %. Por su parte Van-Thuoc et al. (2007), utilizaron residuos agrícolas para producir PHB con Halomonas boliviensis. Los residuos consistían en salvado de trigo hidrolizado que resultó en una acumulación de PHAs de 33,8 % y al adicionar acetato de sodio y ácido butírico se elevó la acumulación hasta un 50 %.

Asimismo, se cultivó Haloferax mediterranei en hidrolizados de almidón de maíz, paja de arroz con almidón de maíz así como suero, obteniendo PHAs en las concentraciones de 20; 77,8 y 12,2 gL-1, correspondientes a porcentajes de acumulación en peso seco (Yp/x) de 50,8; 55,6 y 72,8 % respectivamente (Chen et al., 2006; Ting et al., 2006 y Koller et al., 2007). Estos investigadores sugieren la hidrólisis de los residuos agrícolas lo que acarrea un costo extra en el proceso. Como una forma de superar este inconveniente se propone utilizar un extracto enzimático crudo de origen microbiano en lugar del uso de enzimas purificadas (Rivera y Nevárez, 2009). Por su parte, Ramírez et al. (2005) realizaron una fermentación con Pseudomonas fluorescens en biorreactor air lift con caldo melaza (10 gL-1), obteniendo 3,39 g L-1 de biomasa después de 150 horas así como 3,34 gL-1 de PHAs, correspondientes a 98,5 %.

Otra forma de abordar la problemática búsqueda de sustratos económicos consiste en aprovechar la materia prima abundante en una región. Lezza et al. (2007) mencionados por Rivera y Nevárez (2009) eligieron Alcaligenes latus para producir PHB, usando como fuente de carbono savia de maple que contiene 10-30 g L-1 de sacarosa, es abundante en países del hemisferio norte como Canadá y puede representar una fuente renovable de carbono para la producción de PHB. Se acumuló hasta 77 % (peso-peso) de PHB bajo concentraciones limitadas de nitrógeno.

La industria tequilera en México genera como residuo el bagazo de agave que es la fibra residual que queda después de cocinar, moler y extraer el jugo fermentable de la piña de Agave tequilana Weber variedad azul. Se considera que el 40 % del peso total del agave consumido corresponde al

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bagazo residual por lo que se generan grandes volúmenes de este desecho y su disposición constituye un problema ambiental; sin embargo, bacterias degradadoras de celulosa como Microbulbifer degradans y de la lignina como Sagittula stellata producen PHA y pueden ser la alternativa para reducir los costos en la obtención de estos polímeros (Gonzáles et al., 2005).

En las plantas de tratamiento de aguas la disposición final efectiva de lodo producido en exceso constituye un problema ambiental. La producción de PHAs usando el lodo podría ser una solución. Se ha demostrado que el lodo desarrollado en proceso anaerobios-.aerobios para la remoción de fósforo produce PHAs y bajo condiciones óptimas es posible obtener más del 30 % de peso seco del lodo (Arcos y Vargas, 2006).

14. Influencia de los parámetros de cultivo en la producción de PHBLa viabilidad económica de un metabolito microbiano está determinada

de manera principal por la eficiencia del proceso, velocidad de crecimiento, formación del producto y el contenido intracelular del polímero por lo que se debe maximizar la conversión de la fuente de carbono y finalmente la productividad (Ackermann,1998, mencionado por Cholula, 2005).

La fuente de carbono y nitrógeno en el medio tienen gran efecto en la síntesis de PHB. En el género Azospirillum la capacidad de acumular PHB bajo condiciones microaerofílicas con o sin nitrógeno se regula principalmente de dos modos diferentes o complementarias, uno definido por la presión de oxígeno disuelto (P02) el cual se ha optimizado al 30 % y otro es la relación C:N con un valor máximo de 70, aunque se sabe que en las raíces de cereales la relación es de alrededor 30:1 Se ha observado que cuando Azospirillum brasilense sp7es cultivado en un medio con alta presión parcial de oxígeno y con cloruro de amonio como fuente de nitrógeno, el contenido de PHB es menor al 1 %. En ausencia de cloruro de amonio y bajo condiciones de fijación de nitrógeno (microaerofílicas) en cultivo en lote, A. brasilense acumula cerca del 75 % de su peso seco en PHB. Adicionando cloruro de amonio, el contenido de PHB disminuye (Cholula, 2005).

Como material base para la fermentación se utilizan carbohidratos como glucosa, sacarosa y fructosa, así como aceites vegetales y glicerina derivada de la producción de biodiesel. Se ha determinado que para una eficiente producción de PHAs se debe mantener un valor óptimo de carbono. Para la monitorización en una fermentación con C. necator mutante se utilizaron dos métodos: estimación de la tasa de evolución del dióxido de carbono (CER) medida por espectrometría de gases y monitoreo automático de la concentración de glucosa en el medio. La concentración se mantuvo en 10-20 gL-1 y se utilizó una solución de amoniaco para controlar el pH y suministrar una fuente de nitrógeno durante la fase de crecimiento celular. Cuando éste

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alcanzó la concentración deseada, se reemplazó la solución de amonio por NaOH / KOH para limitar el nitrógeno. Se encontró que la concentración final de P(3HB) y la productividad se incrementaron cuando la limitación de nitrógeno se inició en concentraciones celulares superiores a 70 gL-1, alcanzando 2,42 g.L-1.h-1, 164 gL-1, 121 gL-1 y 76 % de productividad, concentración celular, P(3HB) y contenido de PHB respectivamente después de 50 horas de fermentación. Por el contrario, con 90 gL-1 la concentración del polímero disminuyó. Otro aspecto a considerar es el nivel de fósforo o de nitrógeno en el medio de cultivo, pues al reducirlo casi se duplican los rendimientos producto/biomasa.

Las fuentes nitrogenadas contribuyen fundamentalmente al crecimiento microbiano ya que en la mayoría de los casos contienen aminoácidos libres que pueden ser transportados a la célula sin necesidad de ser metabolizados, lo cual sugiere un ahorro de energía y de tiempo para la multiplicación celular. Este aspecto ha sido estudiado en la síntesis de PHAs, concluyéndose que en general la adición al medio de cultivo, de determinados aminoácidos como la metionina genera una mayor cantidad de polímero pues en su síntesis se requieren ocho moléculas de NADPH; sin embargo, Lasala et al. (2004) informaron que M. plurifarium desarrolló muy poco en medios con caseina, soya, hidrolizado de levadura y peptona (una absorbancia no mayor de 1,13 = 0,45 g.L-1). Asimismo la adición de glicina y asparagina no incrementó la biomasa y por lo tanto no justifica su uso en el medio de cultivo porque encarecería la producción del polímero.

Respecto a la fuente de carbono, Mesorhizobium plurifarium en melaza y glucosa alcanzó un crecimiento abundante (1,152 y 1,169 gL-1), con una acumulación de PHAs de 146,03 y 192,05 gL-1. Por su parte, en sacarosa y manitol se observó un crecimiento moderado (0,971 y 0,967 gL-1) que condujo a mayores contenidos de polímero (361,90 y 336,51 mgL-1) en las células, probablemente debido a que velocidades de crecimiento menores siempre conducen a acumulaciones mayores de PHA. En este caso hasta 11,05 % con glucosa y 37,27 % con sacarosa (Lasala et al.,2009).

En cuanto a la OTR (velocidad de transferencia de oxígeno), un incremento se traduce en un aumento de la velocidad específica de crecimiento (u), debido a que los microorganismos aerobios en presencia de suficiente fuente carbonada, la utilizan para el metabolismo energético a través de la respiración y con ella los procesos de biosíntesis con lo cual queda NADH y Acetil-CoA libres. Para Mesorhizonium plurifarium, el punto de cambio parece estar en un valor de OTR cercano a 16 mM.L-1.h-1. En condiciones con mayor aireación (OTR =25,68 mM.L-1.h-1) se observó un crecimiento inestable, con ciclos de incremento y pérdida de biomasa así como en la producción de PHAs. Una oxigenación elevada desviaría el metabolismo hacia mayores

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cuotas de respiración, mayor oxidación del sustrato y por lo tanto menor disponibilidad de acetil-CoA para la producción del polímero; sin embargo con bajos niveles de oxigenación y exceso de fuente carbonada, el metabolismo energético genera elevadas concentraciones de NADH y acetil-CoA que deben ser convertidos en formas osmóticamente neutras y que no afecten el balance redox de las células, como sucede con los PHAs (Lasala et al., 2004).

Martínez et al.(2004) informaron de una cepa de Azospirillum brasilense aislada de raíces de Sorghum halepense y productora de 1,5 gL-1del elemento más pequeño de la familia de PHA, el polihidroxibutirato (PHB). Los cultivos realizados a pH inicial de 6,0; 6,8 y 7,4 mostraron rendimientos producto biomasa (Yp/x) entre 9,6 y 7,4 %, alcanzado el rendimiento máximo a pH 6,8 para una tasa de crecimiento de 1,67 gL-1 y 0,16 gL-1 de PHB en 36 horas de cultivo. Dicha producción estuvo influenciada negativamente por altos niveles de aireación. La velocidad de la formación del producto alcanzó su valor mayor equivalente a 0,06 mgL-1. h-1 para una OTR de 6,75 y mínimo de 0,035 mgL-1. h-

1 para 25,68. Para un OTR de 13,20 los valores máximos de Y p/x fueron los más altos tanto a 48 como a 72 horas con 300 y 420 mg L -1 respectivamente. Por su parte, Franco et al. (2009), optimizaron condiciones de fermentación y aireación para la acumulación de PHB por Rhizobium tropici 3, determinando que los valores máximos en el rendimiento se lograron con 472 r.minuto-1 y 1,55 vvm, mientras que para la producción de PHB estos valores correspondieron a 500 r. minuto-1 y 1 vvm.

Para la producción de PHAs, el biorreactor Air lift tiene múltiples ventajas respecto a la aireación, debido a que las burbujas de aire ascendente presentan mayores tiempos de residencia favoreciendo el proceso de oxigenación del medio de cultivo. Por el contrario, el biorreactor CSTR, provisto de un sistema de agitación mecánica, compuesto por un impeler unido a un motor eléctrico presenta un menor tiempo de residencia de las burbujas de aire por lo que se requieren mayores flujos volumétricos con el fin de mantener oxígeno disponible. Ramírez et al. (2005) estudiaron el desempeño de dos tipos de biorreactores en la producción de PHA con Pseudomonas fluorescens y determinaron que en el biorreactor Air Lift se alcanzó una concentración celular máxima de 3,39 gL-1 en 150 horas frente a 0,66 gL-1 después de 167 horas, tiempo después del cual se inició la fase estacionaria de crecimiento y la producción del polímero como un metabolito secundario.

En cuanto al inóculo, en su mayoría, las fermentaciones para la obtención de PHAs se han realizado con valores que oscilan entre 10 a 12%. Con 10 % de inóculo para Cupriavidus necator (Barbosa et al., 2005); Haloferax mediterranei (Chen at al., 2000; Trong et al., 2006), Mesorhizobium plurifarium (Lasala et al., 2004), Pseudomonas fluorescens (Ramírez et al., 2005) y 12 % para Haloferax mediterranei (Koller et al., 2007). Respecto a la

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temperatura, Dantas (2005) demostró que también influye en la producción de P(3HB), alcanzando el mayor rendimiento (0,65 mg del polímero por gramo de sustrato) a 30 ºC durante 36 horas de fermentación con C. necator. Por su parte Marangoni et al. (2001) cultivaron esta bacteria en lactosa hidrolizada (20 gL-1) y observaron similares valores en la tasa específica de crecimiento en la primera y segunda fase de la fermentación a 30 ºC (0,22 y 0,09 h-1) y 34 ºC (0,25 y 0,09 h-1), concluyendo que debido a que el proceso es exotérmico, la utilización de altas temperaturas (es este caso 34 ºC) es interesante porque requiere menos energía para el enfriamiento del fermentador.

15. Detección, extracción y cuantificación de PHAsLas metodologías para detectar PHAs pueden ser realizadas in vivo así

como in vitro, siendo las últimas más sensibles, capaces de detectar una cantidad de polímeros 100 veces menor. La detección in vivo se basa en la utilización de diferentes tipos de colorantes en las colonias productoras: Sudan Negro B para detectar en microscopio óptico común, Azul de Nilo A para detectar en microscopio con receptores de fluorescencia y Vermelho de Nilo para detectar a través de exposición a luz ultravioleta. Las metodologías in vitro además de detectar la presencia de PHAs, permiten caracterizar y cuantificar el polímero, inclusive sus monómeros. Ejemplo la espectrofotometría de infravermemelho, cromatografía para resonancia nuclear magnética, espectrometrìa de masas, cromatografía de permeaciòn en gel y colorimetrìa de barrido diferencial (Gonzáles et al., 2005). Una técnica más rápida para identificar microorganismos productores de PHAs consiste en encontrar los genes que codifican para las tres enzimas necesarias para la síntesis de PHAs: ketotiolasa, acetoacetil CoA reductasa y PHA sintetasa (Revelo et al., 2007).

Para la detección ràpida de PHAs en las células, las bacterias son teñidas con Sudan Negro B, indicando la naturaleza lipídica de los gránulos. Asimismo, los gránulos también pueden teñirse con Azul de Nilo A, una oxazina que produce fluoresceína naranja con excitación a 460 nm (Avila, 2007). La técnica que usa azul de Nilo se basa en el principio que los gránulos de PHB muestran una fluorescencia fuerte naranja al ser teñidos. Las células de interés son expuestas al azul de Nilo al 10 % durante 10 minutos, Luego son observados en longitud de onda de excitación de 460 nm y son fotografiados para su registro. El glucógeno y los polifosfatos no se tiñen. El colorante azul de Nilo A es específico para el PHB y no detecta otros PHA existentes. Las placas de Petri con bacterias productoras de PHAs usando glucosa como fuente de carbono y suplementadas con azul de Nilo A se colocan en la cámara de luz ultravioleta en un ambiente oscuro y las colonias brillan (Arcos y Vargas, 2006).

La cuantificación de polímero tipo PHA, se lleva a cabo mediante cromatografía de gases, por espectrofotometría infrarroja con transformación

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de Fourier y por resonancia magnética nuclear (Lassala et al., 2004, Avila, 2007). En la mayoría de los estudios reportados se usa cromatografía de gases, empleando un patrón interno de ácido benzoico que establece los tiempos de retención mediante los que se informa el tipo de estructura y la cantidad de carbonos que pueden tener; sin embargo, para usar la cromatografía de gases, es necesario una despolimerización del PHA una vez extraído de la célula, formando metil-ésteres o propio-ésteres, dependiendo si el método aplicado es metanolisis o propionolisis, respectivamente. En el método espectrofotométrico, el PHB es despolimerizado y deshidratado por ácido sulfúrico hasta ácido crotónico; sin embargo, otros compuestos también pueden absorber a 200-235 nm.

También se ha empleado el análisis espectroscópico con Resonancia Magnética Nuclear (H NMR) con 13C (13 C-NMR) para el estudio de la estructura del PHA; sin embargo, para PHAs con monómeros saturados e insaturados de cadena larga la 13C-NMR es mucho más complicada por la equivalencia de los cambios químicos de los átomos de carbono y los patrones protónicos del espectro de NMR, lo que dificulta la determinación estructural (Chen et al., 2006 ; Avila , 2007).

Después del cultivo, las células con PHAs son separadas por procesos convencionales como centrifugación, filtración o floculación-centrifugación. Enseguida los procesos para la purificación de PHAs extraen el polímero de las células bacterianas con el uso de solventes orgánicos (hidrocarburos clorados) como cloruro de metilo, cloroformo, carbonato de propileno y dicloroetano. Estos solventes rompen las células solubilizando sus componentes, inclusive los PHAs. También se pueden usar compuestos orgánicos polares como la acetona y el alcohol. Estos rompen el material celular pero no el polímero, dejando los gránulos de PHAs intactos. Asimismo se puede utilizar una combinación de los dos procesos. Inicialmente se usa cloroformo, la solución resultante con el polímero solubilizado es filtrada para remover los restos. El polímero es precipitado con metanol o etanol, dejando los lípidos de bajo peso molecular en solución (Dantas, 2005).

La empresa Imperial Chemical Industries utiliza una alternativa a la extracción con solventes y consiste en un tratamiento térmico de la biomasa bacteriana para romper las células y desnaturalizar los ácidos nucleicos. A continuación se realiza un tratamiento enzimático y lavado con surfactantes aniónicos para solubilizar el material celular no deseado (restos celulares). Otro proceso que rompe el material celular utiliza soluciones alcalinas de hipoclorito de sodio. Los gránulos de PHA insolubles son separados de la fase acuosa por centrifugación. Este tipo de extracción puede dañar los gránulos. El pretratamiento de las células con surfactantes ayuda a mejorar las características del polímero extraído. El hipoclorito de sodio y cloroformo

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también se pueden utilizar garantizando en simultáneo una ruptura del material celular y la migración del polímero hacia la fase orgánica.

16. Importancia de los PHAs en la supervivencia bacterianaLos PHAs son polímeros acumulados por algunas bacterias en gránulos

intracelulares, en condiciones limitantes de nutrientes para el crecimiento y en exceso de fuente de carbono. Cuando ésta se agota, o si el nutriente limitante es suministrado nuevamente, el PHA es despolimerizado y posteriormente metabolizado. La utilización de los PHAs es considerada como una estrategia desarrollada por las bacterias para incrementar su supervivencia en ambientes cambiantes. Los PHAs son utilizados como fuente de carbono y energía en escasez de nutrientes, como fuente de carbono y energía para el enquistamiento y la esporulación y como fuente de poder reductor para la degradación de compuestos tóxicos.

Trabajos realizados en laboratorio con C. necator y B. megaterium salvajes y deficientes en la síntesis de PHB, demostraron que aquellas cepas capaces de sintetizar el polímero de reserva tenían mayor supervivencia en agua de río y mayor capacidad de competencia que sus correspondientes mutantes. Conclusiones similares se obtuvieron cuando se analizó la supervivencia de B. megaterium utilizando microcosmos de suelo. Estos experimentos sugirieron que la síntesis y utilización del polímero aumentaba la supervivencia y la capacidad de competencia bacteriana en ambientes naturales. Para analizar el efecto de la degradación de los PHAs en la supervivencia se comparó la supervivencia en agua de río de una cepa salvaje de Pseudomonas putida con una cepa mutante en la enzima PHA depolimerasa. Los resultados demostraron que la incapacidad de degradación de PHAs representa una desventaja para la supervivencia, tanto en agua de río estéril como en agua de río con la comunidad bacteriana normal. Además se comprobó que la deficiencia en la capacidad de degradación de PHAs tenía efectos negativos sobre el desarrollo de resistencia al estrés, observando una menor supervivencia a la exposición al etanol y al estrés térmico después de varios días de permanencia en agua de río en las mutantes (de Almeida, 2004).

Cuando A. brasilense forma agregados, las células acumulan altas cantidades de PHB en forma de gránulos y la envoltura celular presenta una capa de electrones bien definida cerca de la membrana externa. En células no agregadas no se observan los gránulos de PHB pero después de 24 horas la envoltura celular parece difusa y menos definida, observándose el inicio de la acumulación de PHB y la formación de una capa delgada de exopolisacárido durante la floculación y enquistamiento de A. brasilense Sp7.La formación de PHB involucra una deshidrogenasa dependiente de NADH que compite por los intermediarios del ciclo del ácido tricarboxílico del sistema de transporte de electrones (NADH, NADPH, ATP y acetil-CoA). Cuando la acumulación de PHB

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es interrumpida, hay más intermediarios accesibles al ciclo de Krebs; sin embargo, una mutante PHB negativa mostró más agregación que la cepa silvestre en un medio con un relación alta de C:N lo que demostró que la producción de exopolisacárido también compite por el poder reductor. Esta mutante con un incremento en la capacidad para adherirse a la raíz pero un decremento en la supervivencia, demostró el papel del PHB como compuesto de almacén de carbono y energía que promueve la supervivencia de la bacteria cuando las fuentes exógenas son limitadas.

Razzaq et al. (2010) detectaron PHAs en cepas de Pseudomonas, Citrobacter, Klebsiella, Escherichia y Enterobacter, a través de la tinción lipofílica de Sudan Negro B y encontraron una mayor cantidad de gránulos en las bacterias provenientes de lugares contaminados, sugiriendo la necesidad de estos gránulos para sobrevivir donde los requerimientos básicos de carbono pueden estar cubiertos pero no así los de nitrógeno

17. Degradación de PHAsLos PHAs pueden ser totalmente degradados por las bacterias que los

producen y por otras bacterias, hongos y algas (De Almeida et al., 2004). Los microorganismos que degradan los PHAs poseen enzimas extracelulares como las depolimerasas e hidrolasas que catalizan la ruptura del polímero en compuestos solubles en agua que pueden ser procesados por las bacterias y los hongos. También pueden ser degradados por un mecanismo no biótico de hidrólisis química especialmente en altos valores de pH.

La tasa de biodegradación varía en función de la población microbiana presente en el ambiente, temperatura, pH, nutrientes presentes en el medio, cristalinidad, aditivos y área superficial de los polímeros. Los PHAs son sólidos insolubles en agua mientras que las depolimerasas son enzimas solubles, por eso la degradación acontece en una reacción heterogénea de dos etapas: la primera es la adsorción de la enzima a la superficie del polímero y la segunda es la hidrólisis de las cadenas poliméricas en el sitio activo de la enzima. La hidrólisis siempre ocurre en una superficie entre las enzimas absorbidas y los sitios de absorción libres. Para un copolímero formado por P (3HB-co-4HB) se ha observado una degradación en 2 a 25 semanas, mientras que para una película de P (3HB) el tiempo varía de 0,5 a 50 semanas (Dantas, 2005).

La degradación de los PHAs es dependiente de la estructura del polímero debido a que las depolimerasas son enzimas altamente específicas en cuanto al sustrato y también presentan estereoselectividad para unidades de configuración S. El tamaño de la cadena también influencia disminuyendo la tasa de degradación y dificultando el crecimiento microbiano debido a un aumento en la hidrofobicidad.

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En C. necator la degradación de P(3HB) se inicia por acción de la PHA depolimerasa que forma ácido (R)-3-hidroxibutírico que luego es oxidado por una deshidrogenasa NAD específica, originando acetoacetato. Posteriormente éste es convertido en acetoacetil-CoA (Figura 14), el cual es un intermediario común de la síntesis y degradación del P(3HB) (Saito, et al., 1993). Así mismo en Azospirillum spp. bajo condiciones de inanición, la síntesis de PHAs cesa y comienza su degradación. Una depolimerasa unida a la membrana probablemente degrada el PHB a su monómero D (-) B-hidroxibutirato, el cual es oxidado hasta acetoacetato por la deshidrogenasa hidroxibutirato (BOHB-DH) con la reducción de NAD. La acetoacetato succinato CoA transferasa cataliza la transferencia de CoA desde succinil CoA hasta acetoacetato para producir acetoacetil CoA (Cholula, 2005).

Figura 14. Biosíntesis y degradación de P(3HB) en C. necator (1) 3-cetotiolasa, (2)acetil-CoA reductasa dependiente de NADPH, (3) acetoacetil-CoA reductasa dependiente de NADH,(4) PHA polimerasa,(5) PHA depolimerasa, 6) ®-3-hidroxibutirato deshidrogenasa, (7) acetoacetil-CoA sintetasa (Saito, et al., 1993).

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18. Aplicaciones de los PHAsLos PHAs son termoplásticos y pueden ser procesados por los equipos

tradicionales, utilizándose mayormente en películas, inyección y extrusión. Así mismo tienen aplicaciones en el ámbito medicinal y farmaceútico, debido a su biodegradabilidad y solubilidad en el cuerpo humano.

- Aplicaciones industriales: Transportadores biodegradables para la liberación controlada de fertilizantes, fungicidas, herbicidas e insecticidas, redes de pesca, embalajes para alimentos, frascos, recipientes, emulsificantes, materia prima para la producción de tintes, adhesivos.

- Aplicaciones médicas: Grapas, jeringas, suturas, materiales osteosintéticos como placas óseas, trasportadores biodegradables para la liberación controlada de drogas y medicamentos.

- Precursores para la síntesis química de sustancias ópticamente activas

Una de las más importantes aplicaciones del PHB es como material para aplicaciones biomédicas en filamentos de suturas, portadores de drogas y generación de constructos para el crecimiento celular, debido a que resulta biocompatible. Es particularmente importante el hecho que el producto de la degradación del PHB, es decir D(-)-3-hidroxibutirato es un metabolito intermediario común presente en las células animales y se ha detectado también en grandes cantidades en el plasma sanguíneo humano, lo cual reafirma su biocompatilidad.

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19. Referencias bibliográficasArcos, M. & Vargas, A. (2006). Degradación de aguas residuales y

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