INFORMACION PARA COORDINADORES DE SERVICIOS DE SALUD Y MEDICOS

En los hallazgos de auditoria externa se encontr Falta de concordancia entre los examenes registrados en el manual y la tcnica utilizada en el laboratorio Como plan de mejoramiento del Sistema de gestin de Calidad, se determino realizar la divulgacin de los factores que diferencian las tcnicas y que se registran en los manuales de tarifas como (CUPS) clasificacin nica de procedimientos en salud, para que desde la solicitud del anlisis se especifique ya sea como cdigo numrico o haciendo la descripcin de la tcnica y en la revisin de cuentas se manejen los homlogos.

Para que la informacin sea ms didctica la enfocamos en la modalidad de preguntas.

1. Que tcnicas se utilizan en los anlisis bioqumicos?

Como respuesta al avance tecnolgico que cada da garantiza resultados mas confiables por permitir mayor objetividad en su medida, las tcnicas van depurndose prevaleciendo aquellas que cumplan con caractersticas de precisin, exactitud, sensibilidad y especificidad, criterios que se deben utilizar en la adquisicin de equipos y reactivos ofertados. Bajo estos parmetros las tcnicas mas utilizadas en el laboratorio clnico son: Espectrofotometra, luminiscencia, fluorescencia, fosforescencia, turbidimetra y nefelometra.

MTODOS ESPECTROSCPICOS: Son aquellos en los que existe intercambio de energa entre la radiacin electromagntica y la materia. En estos mtodos se miden espectros, debidos a transiciones entre distintos niveles energticos. Tcnicas basadas en la absorcin de radiacin: -niveles moleculares: UV-visible, microondas -niveles atmicos: absorcin atmica, rayos x Tcnicas basadas en la emisin de radiacin: -niveles moleculares: luminiscencia, fluorescencia y fosforescencia. -niveles atmicos: espectrometra de emisin, fluorescencia de rayos x, fluorescencia atmica

MTODOS NO ESPECTROSCPICOS: Son aquellos en los que no hay intercambio de energa sino cambios en la direccin o en las propiedades fsicas de la radiacin electromagntica Tcnicas basadas en la dispersin de radiacin: turbidimetra, nefelometra Tcnicas basadas en la refraccin de radiacin: refractometra, interferometra Tcnicas basadas en la difraccin de radiacin: rayos x o electrones Tcnicas basadas en la rotacin ptica: polarimetra, dicrosmo circular.

2. Que diferencia hay en tcnicas qumicas e inmunoqumicas?

Mediante las tcnicas qumicas se analizan componentes de bajo peso molecular o de alta concentracin en la muestra, los analitos presentes en sangre, orina y otros lquidos biolgicos son analizados principalmente por tcnicas espectrofotometrcas, que garanticen exactitud y precisin, bajo la estandarizacin de variables como temperatura, agitacin, tiempo, volumen, estabilidad de reactivos y correcta calibracin de equipos.

Gran parte del progreso alcanzado por la biologa moderna se debe al perfeccionamiento de los mtodos analticos de medida. La introduccin de los procedimientos basados en las reacciones inmunolgicas ha representado un importante avance en el anlisis de sustancias de inters en el laboratorio clnico. Dentro de los procedimientos inmunolgicos, los ms tiles y prcticos son aquellos que se basan en la especificidad de la unin Ag-Ac. La propiedad que tienen las Inmunoglobulinas de unirse a un Ag, la especificidad de esta unin y el hecho de que pueda ser visualizable por los fenmenos de precipitacin, aglutinacin, marcaje con fluorescena, radioistopos o enzimas, hacen que estos mtodos se empleen ampliamente y que cada da sean mas confiables. Estas tcnicas son utilizadas para medir molculas de estructura compleja o de concentraciones muy bajas, siendo importante garantizar la especificidad y sensibilidad del analito que se analiza. Para asegurar el resultado exacto se hacen ligaciones con otros cofactores que aseguran mayor estabilidad en la reaccin o la utilizacin de mltiples lugares de enlace, esto determina la generacin del reactivo contando actualmente con reactivos hasta de quinta generacin.

PRINCIPALES TECNICAS BASADAS EN LA UNION Ag-Ac

1. Tcnicas de aglutinacin. Cuando el antgenos se encuentra unido o formando parte de clulas, bacterias o partculas, la reaccin Ag-Ac se puede detectar y cuantificar por el aglutinado celular o bacteriano formado. 2. Tcnicas de fluorescencia y citometra de flujo. Para la realizacin de estas tcnicas el anticuerpo se marca con un fluoro cromo detectndose la formacin del complejo Ag-Ac por la fluorescencia emitida. 3. Tcnicas de radioinmunoensayo. En estas tcnicas al anticuerpo se une a un istopo Radiactivo siendo posible la cuantificacin del complejo Ag-Ac a travs de la radiactividad emitida. 4. Cromatografa de afinidad. La especificidad de la unin Ag-Ac puede utilizarse para obtener Anticuerpos y Anfgenos puros. 5. Inmunoprecipitacin e inmunoblotting. Permite detectar la presencia y cantidad de antgenos y anticuerpos especficos que difunden en geles 6. Enzimoinmunoensayo. Estas tcnicas son conocidas tambin como Enzimoinmunoanalisis (EIA). La identificacin de los complejos Ag-Ac, se hace mediante el empleo de enzimas, bien unidas al antgeno o al anticuerpo. Esta tcnica, tambin se conoce como test de ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) 7. Inmunonefelomtricas o Inmunoturbidimtricas. Estas tcnicas se basan en la deteccin de los complejos Ag-Ac, por la dispersin que dichos complejos producen sobre rayos de luz que se hacen pasar por el tubo con el complejo inmune correspondiente. Habitualmente se utilizan rayos lser y se establece una relacin entre la cantidad de luz que llega y la cantidad de complejos formados. Este procedimiento es rpido y sensible y se est utilizando en la actualidad, sobre todo, para la cuantificacin de protenas en suero y en otros lquidos biolgicos.

Las graficas siguientes permiten visualizar mejor este tipo de reacciones.

Grafica 1. Corresponde a reacciones de aglutinacin o precipitacin. Es muy importante el equilibrio entre el Ag y el Ac, para que no se presenten fenmenos zonales, que son los responsables de fasos positivos o falsos negativos. Corresponden a tcnicas cualitativas y muy sujetivas mientras no se cuente con un sistema de medida calibrado. Los resultados se reportan como positivos, negativos o en diluciones, en precipitacin sobre geles se puede hacer curvas con controles, obteniendo resultados semicuantitativos. Pertenecen a este grupo entre otras: Ltex, Inmunodifucin radial (IDR), Inmunoelectroforesis, cromatografas de afinidad.

Grafica 2. Se representa una placa donde se ha realizado la tcnica de inmunodifusin radial. Se siembran controles de diferentes se miden los halos correspondientes que determinan los puntos de una curva sobre la cual se ubican las muestras de los pacientes. Como es tan manual no cuenta con la exactitud y precisin que ofrecen las automatizadas.

Figura 3. El fundamento de todas las tcnicas denominadas Emzimo Inmuno Anlisis EIA. Si el sustrato se acopla a una reaccin coloreada se denomina ELISA, si la reaccin emite luz LIA, si emite fluorescencia FIA, si emite radiacin RIA. Cada una de ellas presenta diferente sensibilidad y especificidad dependiendo de la automatizacin y generacin del reactivo utilizado.

Figura 4. Las tcnicas nefelomtrica y turbidimtrica estn basadas en la dispersin de la luz de las partculas formadas por el complejo inmune el cual se encuentra en

suspensin en el seno de una disolucin. La diferencia entre estas dos tcnicas est en la forma de medir la luz dispersa.

3. Que diferencia hay entre un examen realizado correctamente y un resultado confiable?

El Bacteriologo sigue las indicaciones del desarrollo de una tcnica, por tanto el anlisis cumple con el procedimiento, se espera un resultado correcto, pero si no se compara con segundas opiniones no conoceremos su confiabilidad. La confiabilidad esta sujeta a la verificacin de la exactitud y precisin del ensayo, mediante el uso de controles. Si la comparacin se realiza con un grupo de otros laboratorios a travs de una muestra ciega, se mide la exactitud de su reporte. Si cuenta con equipos susceptibles a prevenir la descalibracion y reactivos con manejo ptimo de condiciones ambientales puede asegurar la precisin utilizando muestras de concentracin conocida. Las medidas de biomleculas en el orden de micro, nano o fentogramos, requieren un estricto control de variables como volumen, lavados y agitacin que se logran a travs de la automatizacin.

Factores que afectan la sensibilidad y especificidad de los inmunoanlisis:

- La potencia del anticuerpo y la relacin de los pKa.

- La concentracin molar del anticuerpo, del analito, del trazador y del conjugado.

- La pureza de anfgenos o anticuerpos de los reactivos.

- La temperatura a la que se realizan los ensayos (Temperatura ambiental, del bao o estufas de incubacin en tcnicas manuales).

- El pH y la fuerza inica del medio donde transcurre la inmunorreaccin.

- El tiempo en que transcurre la inmunorreaccin y si la reaccin llega o no, al equilibrio. Exceso o defecto del tiempo de reaccin o incubacin establecida por el fabricante de los reactivos.

- Conservacin de la cadena de fro de los reactivos estipulada por el fabricante y la estabilidad de los reactivos durante el tiempo que el fabricante estima, previo al vencimiento.

- Adicionar un paso de lavado en una etapa intermedia fuera del protocolo del fabricante.

- La deshidratacin de los geles con los ensayos de difusin como en las tcnicas de inmunodifusin radial IDR.

- Ensayos inmunoanalticos basados en un punto de corte o cut-off.

- Precisin de dispensado de reactivos o muestras en los equipos automticos o la precisin de las micro pipetas automticas en tcnicas manuales.

- Calidad del agua de dilucin de reactivos en equipos automticos.

- Deterioro del agua de dilucin de reactivos en equipos automticos.

- Contaminacin bacteriana o fngica en el conjunto de tubos y mangueras de los equipos automticos.

- Contaminacin bacteriana o fngica de los reactivos o controles de calidad.

- Almacenamiento de los reactivos o muestras.

- Estado de funcionamiento (temperatura y su estabilidad) de las heladeras, freezers o congeladoras, lugar y posicin de almacenamiento de los reactivos y muestras dentro de las mismas. (Especial atencin en la posicin y el tiempo de almacenamiento de las placas de IDR).

- Estructura y estabilidad de la molcula que se va a determinar. Protena globular, anticuerpo, hormona asteroidea o tiroidea.

- Sistema de separacin (eficiencia de la separacin de la fraccin libre de la unida en el caso de los sistemas inmunoanalticos heterogneos), ej., aspirado o volcado, centrifugacin, lavado, separacin magntica, etctera.

- Tipo de seal que se va a medir (radiactividad, fluorescencia, color, turbidez, banda de precipitacin, quimioluminiscencia, electroquimioluminiscencia, etctera).

- Estado de la lmpara de los microscopios de fluorescencia, lmpara y filtros del espectrofotmetro, cristal de centelleo y foto multiplicador (PMT), en el caso del contador de pozo (Gamma Counter) para la medicin de radioistopos y el PMT de los instrumentos de quimioluminiscencia y electroquimioluminiscencia.

- Prdida de eficiencia de la capacidad de separacin a causa de la platina magntica en los ensayos de separacin magntica.

- Iluminacin ambiental en el lugar de trabajo con tcnicas de EIA, ELISA e IF.

- Entrenamiento y experiencia del operario.

4. Como se evidencia que el Laboratorio entrega resultados confiables?

Las consecuencias de un resultado equivocado repercuten no solo en el tratamiento del paciente sino tambin en los costos de malos procedimientos que asumen los proveedor de salud, actualmente se encuentra personal capacitado en los procesos de verificacin de la calidad y la competencia tcnica en los laboratorios clnicos, que pueden realizar auditorias.

Mediante la existencia de certificados de entidades como el Organismo Nacional de Acreditacin de Colombia (ONAC), que cuentan con auditores expertos que garantizan el cumplimiento de la normatividad relacionada con requisitos especficos para laboratorio clnico como la ISO 15189. La acreditacin de pruebas mediante esta norma, conlleva a evidenciar indicadores internacionales de ndice de confiabilidad de cada una de las pruebas que se acreditan.

5. Que informacin ofrece la descripcin del cdigo CUPS referente a los examenes de Laboratorio?

El nombre del examen que se requiere, pero principalmente la tcnica con la cual quiere que se le realice la prueba, ejemplos

902207 HEMOGRAMA I [HEMOGLOBINA, HEMATOCRITO Y LEUCOGRAMA] METODO MANUAL +

902208 HEMOGRAMA II [HEMOGLOBINA, HEMATOCRITO, RECUENTO DE ERITROCITOS, NDICES ERITROCITARIOS, LEUCOGRAMA, RECUENTO DE PLAQUETAS E INDICES PLAQUETARIOS] METODO MANUAL Y SEMIAUTOMATICO +

902209 HEMOGRAMA III [HEMOGLOBINA, HEMATOCRITO, RECUENTO DE ERITROCITOS, NDICES ERITROCITARIOS, LEUCOGRAMA, RECUENTO DE PLAQUETAS, INDICES PLAQUETARIOS Y MORFOLOGA ELECTRONICA] METODO AUTOMATICO +

902210 HEMOGRAMA IV [HEMOGLOBINA, HEMATOCRITO, RECUENTO DE ERITROCITOS, NDICES ERITROCITARIOS, LEUCOGRAMA, RECUENTO DE PLAQUETAS, INDICES PLAQUETARIOS Y MORFOLOGA ELECTRONICA E HISTOGRAMA] METODO AUTOMATICO+

En estudios de comparacin de tcnicas se ha encontrado una variacin entre el mtodo manual y el automatizado en el contaje de clulas:

ARAMETRO %CV MANUAL %CV AUTOMATIZADO

Recuento de Leucocitos 11.8 25.2 < 2.0

Recuento de Plaquetas 22.0 60.0 < 4.0

En el mtodo manual no se cuenta con controles de calidad Confiables para verificar los resultados. En equipos automatizados se puede verificar el resultado mediante controles confiables que permiten acreditar la prueba

901001 ANTIBIOGRAMA (DISCO)

901002 ANTIBIOGRAMA (MIC) MTODO AUTOMTICO

901003 ANTIBIOGRAMA (MIC) MTODO MANUAL

Los discos son muestras de antibiticos, la lectura del halo no es confiable, son almacenados por largo tiempo incidiendo en la sensibilidad de la concentracin, no hay disponibilidad de un buen nmero de antibiticos ni ofrece diferentes concentraciones para el mismo antibitico, no se pueden aplicar ms de 8 sensidiscos en la placa. Puede presentar reaccin cruzada por acercamiento de los halos de reaccin. (MIC) Mnima Concentracin Inhibitoria, se utilizan galeras de antibiticos de concentraciones garantizadas, especficos tanto a cada cultivo como al grupo de microorganismos de metabolismo similar, se presentan diferentes diluciones para el mismo antibitico, con una buena variedad de opciones por familia de antibiticos que permiten ofrecer desde primera hasta ltima generacin. Cada antibitico corre separadamente y la reaccin es de turbidez.

903026 MICROALBUMINURIA POR EIA +

903027 MICROALBUMINURIA POR NEFELOMETRA +

903028 MICROALBUMINURIA POR RIA +

903029 MICROALBUMINURIA POR TURBIDIMETRIA +

906913 PROTENA C REACTIVA, CUANTITATIVO DE ALTA PRECISION

906914 PROTENA C REACTIVA, PRUEBA SEMICUANTITATIVA

Las protenas son molculas complejas y varias de ellas de baja concentracin, se requieren tcnicas que permitan la formacin de complejos inmunes, las que utilizan enzimas para revelar el sustrato pertenecen al grupo de las EIA. La tcnica Nefelomtrica o Turbidimtrica requiere conformar partculas de complejo inmune y son iguales. Cualquiera de las tcnicas anteriores garantizan un resultado confiable por ser Cuantitativas. Tcnicas como cromatografa de afinidad, ltex, inmunoprecipitacin, inmunodifusin radial IDR, son cualitativas y no garantizan medidas exactas.

Si en la orden de solicitud solo se nombra el examen este se asimila al cdigo menor o sea a la tcnica menos confiable, si se agrega la palabra Cuantitativo se asimila a los cdigos de EIA.

Mas informacin al respecto: www.laboratoriobolivar.com en: CONTACTENOS.

GRACIAS

Alix Bolivar Grimaldos

Gerente Laboratorio Clnico de Especialidades Bolivar.