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Planta Piloto de Fermentaciones

Departamento de Biotecnología

Reacciones enzimáticas

Sergio Huerta OchoaUAM-Iztapalapa



�aturaleza Industria química

Síntesis de compuestos orgánicos



La naturaleza de las enzimas

1) La reacción química se lleva a cabo

bajo condiciones suaves

2) Acción específica de acuerdo a la 2) Acción específica de acuerdo a la

clase de enzima

3) Tasas de reacción muy rápidas

4) Numerosas enzimas para diferentes

objetivosEnzymes at work (www.novozymes.com)



Clase Enzimas Industriales

1. Oxidoreductasas Peroxidasas, catalasas, glucosa

oxidasas, lacasas

2. Transferasas Fructosil-transferasas, glucosil-

Enzimas típicas usadas en procesos industriales

2. Transferasas Fructosil-transferasas, glucosil-

transferasas

3. Hidrolasas Amilasas, celulasas, lipasas,

pectinasas, proteasas, pululanasas

4. Liasas Pectato-liasas, αααα-acetolactato

decarboxilasas

5. Isomerasas Glucosa isomerasa

6. Ligasas �o son usadas actualmente

Enzymes at work (www.novozymes.com)



Algunos ejemplos de enzimas industriales y sus usos



Mercado mundial de enzimas industriales($1,500,000 USD en el año 2000)

(McCoy, 2000)

10 %

25 %

Enzimas técnicas (Industrias: Detergentes, almidón, textil, curtidos, pulpa y

papel, y cosméticos

Enzimas en la industria alimentaria: láctea, cerveza, vinos y jugos, grasas y

aceites, y panificación.

Enzimas en alimentación animal

65 %

25 %



Puntos principales de la aplicación comercial de

un catalizador enzimático

• Velocidad de reacción

(actividad catalítica)(actividad catalítica)

• Extensión de la reacción

(constante de equilibrio)

• Duración de la actividad

(estabilidad)



Energía de activación



Diseño de biorreactores

reactorroi VvSSF =− )(

Balance de materia

ννννr = velocidad de reacción

F, S0

F, Si

donde:



Leyes fundamentales de la cinética

• Velocidad de la reacción

v0

[P]

[A]0

• Orden de la reacción

---- = v = k

---- = v = k CA CB

Orden uno

Orden cero

Orden dos

t

d[P]

dt

---- = v = k CAd[P]

dt

d[P]

dt

A P

A P

A + B P



Consideraciones al definir el orden de una reacción

• No se puede decir que todas las

reacciones poseen un cierto ordenreacciones poseen un cierto orden

(Reacciones complejas)

• No se debe intentar deducir el orden de

una reacción de su ecuación

estequiométrica

(Depende del mecanismo de la reacción)



Sitio activo y formación del complejo: enzima-sustrato



Diferentes modelos de enlace enzima-sustrato

Efecto de proximidad y efecto de orientación



Modelo de ajuste inducido

Hexoquinasa



S P

Modelo llave-cerradura

ES

k 1

k -1

k cat

E E

E + S

k 1

k -1

ES

k cat

E + P

E



Los experimentos cinéticos revelan propiedades

enzimáticas

Cinética química

• Los experimentos examinan la cantidad de producto

(P) formado por unidad de tiempo (∆∆∆∆[P] / ∆∆∆∆t)

• Velocidad (v) – la tasa de una reacción

(varía con la concentración de reactante)

• Constante de la tasa (k) – indica la velocidad o

eficiencia de una reacción



Cinética enzimática

• Complejo enzima-substrato (ES) - complejo formado

cuando el substrato específico se enlaza al sitio activo de la

enzima

• Cuando [S] >> [E], cada enzima enlaza una molécula de

substrato (la enzima esta saturada con el substrato)

• Bajo estas condiciones la tasa depende solamente de [E],

y la reacción es pseudo-primer orden

E + S ES E + P



Velocidad inicial (vo)

• La velocidad al inicio de una reacción catalizada

enzimáticamente es

vo (velocidad inicial)

• k1 y k-1 representan una rápida asociación

/disociación no covalente de substrato del sitio

activo de la enzima

• kcat = constante de la tasa para formación de

producto de ES

E + S ES E + P k1

kcat

k-1



Curva de progreso para una reacción catalizada

enzimáticamente

• La velocidad inicial (vo) es la

pendiente de la porción lineal pendiente de la porción lineal

inicial de la curva

• La tasa de la reacción se duplica

cuando se usa el doble de

enzima



Leonor Michaelis

1875-1949

Maud Menten

1879-1960



Consideraciones de equilibrio rápido(Ecuación de Henri-Michaelis-Menten)

E + Sk 1

k -1ES

k cat E + P

[ ] [ ] [ ]ESEE t +=

[ ]ESkv cat=

1. Reacciones involucradas

2. Balance de masa

3. Velocidad limitante

[ ][ ]

[ ] [ ]ESE

ESk

E

v cat

t +=

[ ][ ][ ]

[ ] [ ] [ ]EK

SES

ES

SEK

S

S =∴= ,

[ ]

[ ] [ ]

[ ] [ ] [ ]EK

SE

EK

Sk

E

v

S

S

cat

t +=

[ ][ ]SK

S

V

v

Smax +=

4. Dividir por [E]t

5. Expresión de equilibrio

6. Sustituir en términos de [E]

7. Donde Vmax = kcat

[E]t



JBS HaldaneBriggs



Consideraciones de estado estacionario(Ecuación de Briggs-Haldane)

E + S

k 1

k -1ES

k catE + P

[ ] [ ] [ ] ( ) [ ]ESkkSEkdt

ESdcat ⋅+−⋅= −11

[ ]0=

dt

ESd


2. Balance de masa

3. En estado estacionariodt

[ ] [ ][ ] M

cat Kk

kk

ES

SE=

+=

⋅ −

1

1

[ ]ESkv cat=

[ ][ ]

[ ] [ ]ESE

ESk

E

v cat

t +=

[ ][ ]SK

S

V

v

M +=

max

4. Constante de Michaelis

6. Dividir por [E]t

8. Donde Vmax = kcat [E]t


[ ]

[ ] [ ]

[ ] [ ] [ ]EK

SE

EK

S

Ek

v

M

M

tcat +=

7. Sustituyendo [ES]



ννννVmax

Cinética de Michaelis-Menten

[S]KM

Vmax

2

νννν = Vmax [S]

KM + [S]



La ecuación de Michaelis-Menten

• La Velocidad máxima (Vmax) se alcanza cuando una enzima está

saturada con el substrato (alta [S])

• A altas [S] la tasa de reacción es independiente de [S] (orden • A altas [S] la tasa de reacción es independiente de [S] (orden

cero con respecto a S)

• A bajas [S] la reacción es de primer orden con respecto a S

• La forma de una curva vo versus [S] es una hipérbola

rectangular, indicando saturación del sitio activo de la enzima

conforme [S] se incrementa



Gráficas de velocidad inicial (vo) versus [S]

(a) Cada punto vo vs [S] se obtiene

de un experimento cinético

(b) La constante de Michaelis (KM)

iguala la concentración de

substrato necesario para

alcanzar ½ de la velocidad

máxima



El significado de KM

• KM = [S] cuando vo = 1/2 Vmax

• K ≅ k / k = K (es la constante de disociación • KM ≅ k-1 / k1 = Ks (es la constante de disociación enzima-substrato ) cuando kcat << k1 or k-1

• Entre más bajo sea el valor de KM, más ajustado

será el enlace del substrato

• KM puede ser una medida de la afinidad de E for S



KM y concentraciones de substrato fisiológicas

• Los valores de KM para las • Los valores de KM para las

enzimas son típicamente

arriba de [S], tal que las

tasas enzimáticas son

sensibles a pequeños

cambios en [S]



• La constante catalítica (kcat) – constante de la tasa de orden uno

para la conversión de complejo ES a E + P

Las constantes cinéticas indican la actividad

enzimática y la especificidad

para la conversión de complejo ES a E + P

• kcat es más fácilmente medible cuando la enzima esta saturada con

S

• La relación kcat /KM , llamada también coeficiente de

especificidad, es una constante de segundo orden para

E + S E + P

a bajas concentraciones de [S]



Significados de kcat y kcat/KM



Ejemplos de constantes catalíticas

Enzyme kcat(s-1)



Valores of kcat/KM

• kcat/KM puede aproximar la tasa de

encuentro de dos moléculas no cargadas

en solución (108 to 109 M-1s-1)en solución (108 to 109 M-1s-1)

• kcat/KM es también una medida de la

especificidad de la enzima por diferentes

substratos (constante de especificidad)

• Aceleración de la tasa = kcat/KM



Cálculo de KM y Vmax

La gráfica doble-

recíproca

Lineweaver-Burk es Lineweaver-Burk es

una transformación

lineal de la gráfica de

Michaelis-Menten

(1/vo versus 1/[S])



[ ] [ ]PS−

Consideración de estado estacionario

Reacciones reversibles

E + S ES E + P

k1

k -1

k2

k -2

[ ] [ ]

[ ] [ ]ps

p

r

s

mm

m

max

m

dmax

neta

K

P

K

S

K

PV

K

SV

v

++

−

=1

[ ]tmax EkVd 2= [ ]tmax EkV

r 1−=

1

12

k

kkK

sm−+

=2

12

−

−+=

k

kkK

pm

Donde:



Inhibición por substrato(Consideración de equilibrio rápido)

E + S ESk cat

E + P

[ ] [ ] [ ]+[ΕS2]ESEEt

+=

[ ]


2. Balance de masa

+S

ES2

KS

KI

[ ]ESkv cat=

[ ][ ]

[ ] [ ]ESE

ESk

E

v cat

t +=

[ ][ ][ ]ES

SEKS= ,

[ ]

[ ][ ]

[ ] [ ]E

EK

Sk

E

v

[ ]EK

S

S

S

cat

t +=

[ ]SK

[ ]SV

v

Smax +=


4. Dividir por [E]t

5. Expresiones de equilibrio

6. Sustituir en términos de [E]

7. Donde Vmax = kcat [E]t

+ [ES2]

[ ][ ][ ]ES2

SESKI=

[ ]EK

S

S

+ [ ]2

[ ]2S+KI

KI



Inhibición por substrato

10.0000

15.0000

20.0000

25.0000

V n

mol/l*m

in

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

1/v

[ ] [ ]SKVVSV

K

v I

M

maxmaxmax

1111++=

[ ]

[ ] [ ]i

MK

SSK

SVv

2

max

++

=

0.0000

5.0000

0.00E+00 2.00E+06 4.00E+06 6.00E+06

[S] nM

V n

mol/l*m

in

0

0.05

0.00E+00 5.00E-06 1.00E-05 1.50E-05

1/[S]

-1/KM

1/Vmax

KM/Vmax

1/V

1/[S]

[ ] iM KKS =max

[ ] maxmax

111

VSV

K

v

M +=

KI se calcula de:

[S]max



Los inhibidores de enzimas son importantes por varias

razones

Inhibición enzimática

razones

1) Pueden ser usados para obtener información acerca de la forma del sitio

activo de la enzima y los residuos de amino ácidos en el sitio activo

2) Pueden ser usados para obtener información acerca del mecanismo químico

3) Pueden ser usados para obtener información acerca de la regulación o control

de una vía metabólica

4) Pueden ser muy importantes en el diseño de medicamentos



Sistemas de inhibición simple

• Inhibición competitiva

• inhibición no competitiva

• Inhibición acompetitiva



ES

KS k p

E

S

E

PI

Modelo de inhibición competitiva

EE E

EI

KiE + S

KS

ES

k p

E + P

+

I

Ki

EI

[ ][ ] [ ]SK

IK

S

V

v

i

S

max +

+

=

1

Consideración de equilibrio rápido

E



1/v0 Incremento de

[I]

Inhibición competitiva

1/[S]-1/KM

1/Vmax

[I]-KI

Pend.

KM aumenta

Vmax no cambia



Ki

I

S

E+PES

Ki

KSE

Modelo de inhibición no competitiva

Ki Ki

KSESIEI

E + S ES E+P

KS

EI + S ESI

KS

+

IKi Ki

+

I[ ]

[ ][ ]SK

S

K

I

V

v

S

i

max +=

+1




1/v0

Inhibición no competitiva

Incremento de

[I]

1/[S]-1/KM

1/Vmax

[I]-KI

Inter.

KM no cambia

Vmax disminuye



Modelo de inhibición acompetitiva

K

E + P

E S ES+

I+

KS

kcat

E + S

Ki

ESI

I+

KS

ES E + P

ESI

Ki

kcat

[ ]

[ ]

[ ][ ]S

K

I

K

S

K

I

V

v

i

m

i

max +

+

=

+ 11




1/v0

Incremento de

[I]

Inhibición acompetitiva

KM disminuye

V disminuye

1/[S]-1/KM

1/Vmax

[I]-KI

Inter.

Vmax disminuye



Equilibrio rápido en sistemas bi y tri-reactantes

E + A + B EAB E + P

donde:

1. La aproximación de equilibrio rápido es útil y válida

para los sistemas de enlace aleatorio

2. La mayoría de las enzimas que catalizan secuencias de reacciones

ordenadas se prefiere la aproximación de estado estacionario

B = Sustrato

A = Cosustrato, coenzima o coactivador

�otas:

E = Enzima



Sistemas bi-reactantes aleatorios

E + B EB

+

A+

A

KB

αααα K

[ ] [ ]

[ ] [ ] [ ] [ ]BABA

BA

max

KK

BA

K

B

K

A

KK

BA

V

v

⋅⋅

+++

⋅⋅

=

α

α

1

EA + B EAB E + P

KA

αααα KB

αααα KA

kp




Sistemas bi-reactantes ordenados

E + A EA + B EAB E + P

[ ] [ ]

[ ] [ ] [ ]BAA

BA

max

KK

BA

K

A

KK

BA

V

v

⋅++

⋅

=1




Sistemas tri-reactantes aleatorios

EABEABC

EAEAC

E + P + Q + R

+ C

ββββ KC

+ C

αααα ββββ KC

[ ] [ ] [ ]

[ ] [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] [ ]CBACBCABACBA

CBA

max

KKK

CBA

KK

CB

KK

CA

KK

BA

K

C

K

B

K

A

KKK

CBA

V

v

⋅⋅⋅⋅⋅

+⋅⋅

+⋅⋅

+⋅⋅

++++

⋅⋅⋅⋅⋅

=

γβααβγ

γβα

1


EB

E EC

+ C

KC

EBC+ C

αααα KC



Sistemas tri-reactantes ordenados

kp

KA KB KC

E EA EAB

KP KQ KR

EQR ER E

Sistema Ter Ter ordenado

[ ] [ ] [ ]

[ ] [ ] [ ] [ ] [ ] [ ]CBABAA

CBA

max

KKK

CBA

KK

BA

K

A

KKK

CBA

V

v

⋅⋅+

⋅++

⋅⋅

=1

(EABC EPQR)kpE EA EAB EQR ER E




Multisitios de enlace de sustrato

Sitios de enlace no cooperativos

[ ] [ ]

[ ] n

n

SS

max S

K

S

K

S

V

v

+

+

=

−

1

1

[ ]S

max

K

SV

+1

[ ][ ]SK

S

V

v

Smax +=

Si todos los sitios de enlace son equivalentes, n moléculas de enzina de un

sitio sencillo de enlace, producen la misma curva de velocidad de una

molécula de n sitios de enlace



0.7

0.8

0.9

1.0

Enzimas alostéricas

(a)

[S]

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

v

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

Comparación de curvas de velocidad.

(a) Respuesta hiperbólica, (b) respuesta sigmoidal

(b)

Enzima alostérica




Sitios de enlace cooperativos(Modelo de interacción simple: Adair Pauling)

E + S ES E + PKS kp

Ejemplo: Enzima con dos sitios de enlace

E + S ES E + P

+

S

+

S

SE + S SES SE + P

ES + P

P + Eαααα KS

KS

kpkp

αααα KS



Ejemplo: Enzima con cuatro sitios de enlace


Sitios de enlace cooperativos(Modelo de interacción simple: Adair Pauling)

[ ] [ ] [ ] [ ]

[ ] [ ] [ ] [ ]423

4

32

3

2

2

423

4

32

3

2

2

4641

33

SSSS

SSSS

max

cKba

S

bKa

S

aK

S

K

S

cKba

S

bKa

S

aK

S

K

S

V

v

++++

+++

=


Vmax = 4 kp [E]tdonde:

Ejemplo: Enzima con cuatro sitios de enlace




Si la cooperatividad de los sitios en el enlace del sustrato

es muy marcada

Ecuación simplificada para enzimas alostéricas

(Ecuación de Hill)

[ ][ ]nn

max SK

S

V

v

+=

'

es muy marcada

n = número de sitios de enlace de sustrato por molécula de enzima

K’ = Constante que involucra los factores de interacción y a la constante

de disociación intínseca

Donde:

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