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Análisis de micotoxinas en alimentación animal y humana

•En el siglo XV se presentó en Europa un brote de los que se llamó, “Fuego de San Antonio”, intoxicación masiva con alcaloides ergot (micotoxinas producidas por el hongo Claviceps purpurea). •Las aflatoxinas son conocidas desde 1960, cuando en Inglaterra se presentó una epidemia que mató alrededor de 100.000 pavos alimentados con maní infectado con estas toxinas producidas por Aspergillus flavus proveniente del Brasil. •Su exposición causan daño hepático y renal, mutagénesis, teratogénesis, carcinogénesis, inmunosupresión y citotoxicidad. •Desde 1965 se detectó en África y Asia una alta incidencia de cánceres por consumo de granos contaminados con aflatoxina B1 (la más tóxica).

Introducción

•Son metabolitos secundarios tóxicos producidos por

ciertos hongos,

Introducción

•Pueden contaminar los alimentos del

hombre y los animales, produciendo

enfermedades denominadas

micotoxicosis,

•La presencia de hongos en un

producto no implica necesariamente

la presencia de micotoxinas,

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Introducción

•El crecimiento de este hongo se ve afectado por la termohigrotropía. La formación de aflatoxinas en el maní tiene lugar si éste se almacena entre 20 ºC y 40 ºC con un 10-20 % de humedad y con un 70 – 90 % de humedad relativa en el aire. •El crecimiento del hongo se ve favorecido si los granos están dañados por insectos o roedores. •Tipos de aflatoxinas:

•Aflatoxina B1 (AFB1), metabolizada a Aflatoxina M1 (AFM1) • Aflatoxina B2 (AFB2) •Aflatoxina G1 (AFG1) •Aflatoxina G2 (AFG2)

AFLATOXINAS

Cereales, frutos secos,

leche y especias

Mutagénicas, Carcinogénicos

(CIRC1)

Aspergillus spp

OCRATOXINAS

Café, vino, cerveza

y especias

Teratogénicas, Carcinogénicos

en animales (CIRC2A)

Aspergillus spp

FUMONISINAS

Maíz y derivados

Carcinogénicos en ratas y

otras enfermedades

Fusarium spp

ZEARALENONA

Trigo, Maíz y Sorgo

Estrogénica en animales

Fusarium graminearum

TRICOTECENOS

Cereales y derivados

Pasta seca

Intoxicación aguda

Fusarium spp

PATULINA

Manzana y derivados

Otras frutas

Intoxicación aguda

Aspergillus y Penicillium

Legislación Europea

Reglamento 401/2006/CE. Se hace obligatorio el análisis en cereales de micotoxinas a partir de julio 2006 Recomendación 576/2006/CE Sobre el contenido máximo de micotoxinas en piensos y otros productos para alimentación animal Reglamento 1881/2006/CE Se fija el contenido máximo de determinados contaminantes, entre ellos las micotoxinas, en productos alimenticios

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Legislación Europea

Reglamento 1126/2007/CE. Se modifica el reglamento 1881/2006/CE se fija el contenido máximo de toxinas de Fusarium en el maíz y productos del maíz Recomendación 853/2006/CE Sobre la prevención y la reducción de las toxinas de Fusarium en los cereales y los productos a base de los cereales Reglamento 105/2010/CE Se fija el contenido máximo de Ocratoxina A en productos alimenticios Reglamento 165/2010/CE Se fija el contenido máximo de Aflatoxina en productos alimenticios

Contenidos máximos de micotoxinas en cereales y derivados destinados a

consumo humano

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Cornezuelo del Centeno

(Esclerocio)

• Aunque puede afectar muchas gramíneas

(trigo, tiritare, cebada, mijo, avena). El centeno

es el huésped favorito.

•El esclerocio es la parte activa con elevada

cantidad de alcaloides.

•ergometrina

•ergotamina

•ergosina

•ergocristina

•ergocriptina

•ergocomina

•y los correspondientes epímeros,

terminados (-inina).

• EFSA por Panel CONTAM estableció un ARfD: 1 g/kg bw; y ADI: 0.6 g/kg bw/d

•El Reglamento EU 2015/1940 establece contenidos máximos específicos para la

suma de los 12 alcaloides, antes del 1 de julio de 2017.

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LEGISLACION DE LA UNIÓN EUROPEA SOBRE CONTENIDOS MAXIMOS DE

MICOTOXINAS EN PRODUCTOS ALIMENTICIOS

AFLATOXINAS

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OCRATOXINA A

PATULINA

Contenidos máximos de micotoxinas en alimentación animal

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REGLAMENTO (CE) No 401/2006 DE LA COMISIÓN por el que se establecen los métodos de muestreo y de análisis para el

control oficial del contenido de micotoxinas en los productos alimenticios

B. MÉTODO DE MUESTREO PARA LOS CEREALES Y PRODUCTOS A BASE DE CEREALES. Este método de muestreo es aplicable al control oficial de los contenidos máximos establecidos para la aflatoxina B1, las aflatoxinas totales, la ocratoxina A y las toxinas de Fusarium en los cereales y los productos a base de cereales.

B.1. Peso de la muestra elemental -El peso de la muestra elemental será de aproximadamente 100 g

B.2. Resumen general del método de muestreo para los cereales y productos a base de cereales

B.3. Método de muestreo para los cereales y productos a base de cereales en lotes superiores o iguales a 50 toneladas. — Número de muestras elementales: 100. Peso de la muestra global=10 kg.

B.4. Método de muestreo para los cereales y productos a base de cereales en lotes inferiores a 50 toneladas

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C. MÉTODO DE MUESTREO PARA LOS FRUTOS SECOS, INCLUIDAS LAS UVAS PASAS Y LOS PRODUCTOS DERIVADOS, CON EXCEPCIÓN DE LOS HIGOS SECOS Este método de muestreo es aplicable al control oficial de los contenidos máximos establecidos para: — la aflatoxina B1 y las aflatoxinas totales en los frutos secos, con excepción de los higos secos, — la ocratoxina A en las uvas pasas (pasas de Corinto, sultanas y otras variedades de pasas).

C.1. Peso de la muestra elemental, - El peso de la muestra elemental será de aproximadamente 100 g,

C.2. Resumen general del método de muestreo para frutos secos, con excepción de higos,

C.3. Método de muestreo para frutos secos en lotes superiores o iguales a 15 toneladas. — Número de muestras elementales: 100. Peso de la muestra global=10 kg.

C.4. Método de muestreo para frutos secos en lotes inferiores a 50 toneladas

D. MÉTODO DE MUESTREO PARA LOS HIGOS SECOS, CACAHUETES Y LOS FRUTOS DE CÁSCARA Este método de muestreo es aplicable al control oficial de los contenidos máximos establecidos para la aflatoxina B1 y las aflatoxinas totales en los higos secos, los cacahuetes y otros frutos de cáscara.

D.1. Peso de la muestra elemental, - El peso de la muestra elemental será de aproximadamente 300 g,

D.2. Resumen general del método de muestreo para higos secos, cacahuetes y otros frutos de cáscara,

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D.3. Método de muestreo para higos secos, cacahuetes y otros frutos de cáscara, en lotes superiores o iguales a 15 toneladas. — Número de muestras elementales: 100. Peso de la muestra global=30 kg.

D.4. Método de muestreo para higos secos en lotes inferiores a 50 toneladas

E. MÉTODO DE MUESTREO PARA LAS ESPECIAS Este método de muestreo es aplicable al control oficial de los contenidos máximos establecidos para la aflatoxina B1 y las aflatoxinas totales en especias.

F. MÉTODO DE MUESTREO PARA LA LECHE Y PRODUCTOS LÁCTEOS Este método de muestreo es aplicable al control oficial de los contenidos máximos establecidos para la aflatoxina M1 en leche, productos lácteos y los preparados para lactantes.

G. MÉTODO DE MUESTREO PARA EL CAFÉ Y LOS PRODUCTOS DEL CAFÉ Este método de muestreo es aplicable al control oficial de los contenidos máximos establecidos para la ocratoxina A en café tostado en grano, el café tostado molido y el café soluble.

H. MÉTODO DE MUESTREO PARA LOS ZUMOS DE FRUTA, INCLUIDO EL ZUMO Y EL MOSTO DE UVA, LA SIDRA Y EL VINO Este método de muestreo es aplicable al control oficial de los contenidos máximos establecidos para: — la ocratoxina A en el vino, zumo y mosto de uva, — la patulina en los zumos de fruta, el néctar de fruta, las bebidas espirituosas, la sidra y otras bebidas fermentadas producidas a partir de manzana o que contienen zumo de manzana.

I. MÉTODO DE MUESTREO PARA LOS PRODUCTOS SÓLIDOS A BASE DE MANZANA, INCLUIDOS LOS DESTINADOS A LACTANTES Y NIÑOS DE CORTA EDAD, Y EL ZUMO DE MANZANA Este método de muestreo es aplicable al control oficial de los contenidos máximos establecidos para la patulina en los productos sólidos a base de manzana, incluidos los destinados a lactantes y niños de corta edad, y el zumo de manzana.

J. MÉTODO DE MUESTREO PARA ALIMENTOS INFANTILES Y ALIMENTOS ELABORADOS A BASE DE CEREALES PARA LACTANTES Y NIÑOS DE CORTA EDAD Este método de muestreo es aplicable al control oficial de los contenidos máximos establecidos para: — las aflatoxinas, la ocratoxina A y las toxinas de Fusarium en alimentos infantiles y alimentos elaborados a base de cereales para lactantes y niños de corta edad, — las aflatoxinas y la ocratoxina A en alimentos dietéticos destinados a usos médicos especiales (distintos de la leche y los productos lácteos) dirigidos específicamente a los lactantes, — la patulina en alimentos infantiles distintos de los productos alimenticios transformados a base de cereales para lactantes y niños de corta edad.

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REGLAMENTO (CE) No 669/2009 DE LA COMISIÓN por respecto a la intensificación de los controles oficiales de las

importaciones de determinados piensos y alimentos de origen no animal.

REGLAMENTO (CE) No 401/2006 DE LA COMISIÓN por el que se establecen los métodos de muestreo y de análisis para el

control oficial del contenido de micotoxinas en los productos alimenticios

ANEXO II CRITERIOS APLICABLES A LOS MÉTODOS DE ANÁLISIS PARA EL CONTROL OFICIAL DEL CONTENIDO DE MICOTOXINAS EN LOS PRODUCTOS ALIMENTICIOS En tanto la legislación comunitaria no exija ningún método específico los laboratorios podrán aplicar cualquier método de su elección, siempre que se ajuste a los siguientes criterios:

a) criterios para la determinación de aflatoxinas:

a) criterios para la determinación de ocratoxina A:

b) criterios para la determinación de patulina:

c) criterios para la determinación de deoxinivalenol:

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d) criterios para la determinación de zearalenona:

e) criterios para la determinación de fumonisinas B1o B2:

e) criterios para la determinación de las toxinas T-2 y HT-2:

A liquid chromatography/tandem mass spectrometric multi-mycotoxin method Anal Bioanal Chem (2007) 389:1505–1523

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Total 87 Micotoxinas

Método de Análisis

Muestras sólidas alimentación humana

Pesar 5.0 +/- 0.1 g de muestra de ensayohomogeneizada en un tubo de centrífuga

de 50 mL.

Filtrar mediante filtros de 0,22 m a vialHPLC

Tomar 2 mL, evaporar a 40ºC y redisolvercon mezcla ACN/H2O 75/25 v/v a 1 mL

Añadir 5 mL de H2O MilliQ, agitando enVortex durante al menos 30 seg, seguidode agitación mecánica durante 30 min.

Añadir 15 mL ACN con 1% de ácidofórmico, agitando en Vortex durante almenos 30 seg, seguido de agitación

mecánica durante 60 min.

Centrifugar durante 5 min a 4000 r.p.m.

Muestras líquidas. Ocratoxina A

Filtrara a vial HPLC, mediante filtros de

0,22 m

Redisolver 2 mL, con mezcla ACN/H2O 1:175/25 v/v

Añadir 5 mL de acetato de etilo, agitandomecánica durante 10 min. Pasar a tubo de

centrifuga de 50mL

Pasar la fase orgánica a un tubo de ensayograduado y tomar 4mL

Centrifugar durante 5 min a 4000 r.p.m.

Evaporar a sequedad a 35ºC

Pesar 25.0 +/- 0.1 g de muestra de ensayohomogeneizada en un embudo dedecantación. Añadir 1g de NaCl

Mosto concentrado: dilución1:2,5 p/v

Pesar 40g de mostoconcentrado y diluirlo a

100ml con agua

Condiciones Instrumentales

• Agilent Technologies. HPLC 1200 Series. • ABSciex MS/MS API3200 Q-Trap. • Columna: Atlantis T3 2.1 x 150 mm, 3 m •Tª Columna: 40ºC •Fase móvil A: Formico/Formiato amónico 2mM •Fase móvil B: MeOH •Gradiente: min %A

0 95 2 70 14 0 16 0 16.2 95 21 95

•Flujo: 0.3 ml/min •Volumen inyección: 10 l

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Transiciones

Rt (min) Compound Q1 Q38.0 Dioxinivalenol 297.0

297.0203.3249.5

12.6 Aflatoxina B1 313.0313.0

241.4285.3

13.2 Fumonisina B1 722.5722.5

352.3334.4

13.9 HT-2 441.9441.9

263.2215.3

14.7 Fumonisina B2 706.4706.4

336.3318.0

14.9 T-2 484.3484.3

305.2245.2

15.7 Zearalenona 319.2319.2

187.1185.4

16.0 Ocratoxina A 404.0404.0

239.1385.1

DON 30 ppb AFB1 0.3 ppb

FumB1 45 ppb

HT-2 30 ppb

FumB2 14 ppb

T-2 30 ppb

ZEN 6 ppb

OTA 3 ppb

Curva de calibrado DON 0-630 ppb

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Fig 1. Muestra de maiz 298 g/kg de DON Fig 2. Muestra de maiz 540 g/kg de DON

Fig 3. Muestra de maiz 808 g/kg de FB1 Fig 4. Muestra de maiz 1520 g/kg de FB1

Fig 5. Muestra de maiz 216 g/kg de FB2 Fig 6. Muestra de maiz 440 g/kg de FB2

AFB1

AFB2

AFG1

AFG2

AFLATOXINAS 1.0 g/l

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RASFF

for safer food

The Rapid Alert System for Food and Feed 2014 annual report

Feed Out of the 3097 original notifications counted in RASFF in 2014, 309 concerned feed,

about 10% of the total. From the figure below it can be seen that 2014 feed notifications are ruled by

pathogenic micro-organisms. The second reason, although significantly less, is mycotoxins.

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Mycotoxins • All 26 notifications concerned the measured level of aflatoxins exceeding the

legal limit. 12 notifications concerned groundnuts with Sudan most frequently reported as country of origin.

• 10 notifications concerned maize from diverse origin but with India reported 5 times and once with a very high level of 881 ppb, about 40 times the legal limit.

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