SEMINARIO 1

SEMINARIO 12015

INTEGRANTES: ORTIZ LUJAN MARIO OTOYA LAVADO STHEFANY PAREDES LLICO LESDY PAREDES MONZON WALTER PAREDES PUERTA ALEXANDRA PELAEZ RAMOS GIANNINA PEREA ALVA PERCY PESANTES CHAVEZ GIULIANAPROFESOR: Dra. MIRIAM GUTIRREZ RAMOS

CICLO: VII: dos.

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PRUEBAS MICROBIOLOGICAS PARA MANEJO Y ESTUDIO DE LA INFECCION FUNGICA INVASORA

1.- Espiroquetas:Bacilos flexuosos en forma de espiral con movilidad debida a un filamento axial y semejante a un sacacorchos. Son Gram-negativos. Comprende los rdenes y familias siguientes1:

Orden Spirochaetales1 Familia Spirochaetaceae Gnero Treponema: T. pallidum Gnero Borrelia: B. recurrentis

Familia Leptospiraceae: Gnero Leptospira: L. interrogansESPIROQUETAS Treponema pallidum Es la causante de la sfilis. Se trata de un microorganismo de pequeo tamao que no es observable al microscopio ptico con los sistemas de tincin normales. No ha podido ser cultivado en el laboratorio. El nico reservorio es el humano1. La sfilis es una enfermedad de transmisin sexual y de declaracin obligatoria. La enfermedad pasa por diferentes estados (periodo de incubacin, sfilis primaria, secundaria y terciaria) y puede atravesar la barrera placentaria y causar la sfilis congnita1.El sntoma caracterstico de la sfilis es la aparicin de una lcera plana no dolorosa, principalmente en el rea genital, que se conoce con el nombre de chancro de inoculacin1. El tratamiento de la sfilis se basa en la inyeccin de altas concentraciones de penicilina de accin retardada o doxiciclina en el caso de pacientes alrgicos a los -lactmicos, y la prevencin del contagio se basa en las medidas de proteccin frente a las enfermedades de transmisin sexual1. El patgeno escapa del sistema inmune y es difcil de tratar en pacientes con SIDA.

2.- Micoplasmas:Carecen de pared celular. Son los menores microorganismos cultivables en medios sintticos. Familia Mycoplasmataceae. Gnero Mycoplasma. Especies: M. pneumoniae, M. hominis Gnero Ureaplasma. Especie: U. urealyticumMICOPLASMAS Mycoplasma pneumoniae:Es el microorganismo causante de la neumona atpica primaria. Los microplasmas no tienen pared celular de peptidoglicano y, por consiguiente, son insensibles a los - lactmicos y son muy pleomrficos Su cultivo en el laboratorio es muy complicado2.Hay especies que son parte de la flora normal; pero M. pneumoniae es intrnsecamente patgeno2.La infeccin se presenta en adultos jvenes y el contagio es persona-persona por medio de contacto directo y siendo necesario un contacto estrecho. La enfermedad se presenta como faringitis, bronquitis o neumona siendo por lo general leve, con fiebre y tos no productiva2.El tratamiento normalmente no es necesario porque la infeccin se autolimita. En caso de ser necesario el uso de antibiticos, la eleccin es un antibitico macrlido, tetraciclina o eritromicina2.

3.- RICKETTSIASEl gneroRickettsiaest constituido por especies de pequeos cocobacilos gramnegativos pleomrficos, inmviles y aerobios que se comportan como patgenos intracelulares obligados y estn relacionados serolgicamente. Se tien razonablemente bien con los mtodos de Giemsa, Castaeda y Gimnez y dbilmente con la tincin de Gram3.Las rickettsiosis constituyen un grupo de enfermedades zoonticas de distribucin geogrfica heterognea cuya gravedad vara desde formas benignas y autolimitadas a infecciones fulminantes de elevada mortalidad. La mayora de los casos se adquieren por picadura de garrapatas, piojos o pulgas que estn infectados por el microorganismo. El hombre es un husped accidental en el ciclo biolgico de lasrickettsias. Diversos mamferos, fundamentalmente pequeos roedores, ganado y perros, contribuyen a perpetuar la infeccin y cerrar el ciclo biolgico de la bacteria. Un hecho de especial inters con relacin a la epidemiologa de las rickettsiosis reside en que la distribucin de una especie determinada, en general, coincide con la distribucin de la garrapata vector. Hasta el ao 1991 slo se conocan cinco enfermedades rickettsiales. Desde entonces, gracias al desarrollo de los mtodos de cultivo y de las tcnicas de biologa molecular, se han descrito otras muchas . Las rickettsias se clasifican en dos grupos atendiendo a las bases clnicas y a los agentes etiolgicos responsables: el grupo de las fiebres manchadas (GFM) y el de las fiebres tficas (GFT). Las rickettsias pertenecientes al GFM muestran una distribucin global. La mayora se transmite por garrapatas y estn muy relacionadas serolgicamente. Los representantes del GFT son dos:R. prowazekii, responsable del tifus exantemtico epidmico, yR. typhi, que produce el llamado tifus murino o endmico3.

Los principales sntomas de una rickettsiosis aparecen a los 6-10 das despus de la picadura y se caracterizan por cefalea, erupciones maculopapulares, dolores musculares, linfadenopata local y una o varias escaras en el punto de inoculacin. A partir del sitio de entrada del agente, la infeccin se extiende por la circulacin venosa invadiendo el endotelio de capilares, venas y arterias, donde se multiplica y produce una vasculitis ms o menos generalizada. En los casos ms graves, las rickettsiosis suelen ir acompaadas de edema pulmonar, neumona intersticial y erupcin hemorrgica. Las alteraciones del sistema nervioso central suelen ser relativamente frecuentes y pueden provocar distintos cuadros clnicos. Algunas de ellas derivan en importantes secuelas como sordera, prdida de visin y parapleja, entre otros defectos neurolgicos3.Tcnicas diagnsticasEl diagnstico microbiolgico se basa en tcnicas serolgicas, de PCR y el cultivo.

Tincin de GimnezLas muestras de tejidos pueden examinarse microscpicamente mediante esta tincin, que permite visualizar las rickettsias, pero no diferencia en cuanto a especie ni tampoco otros microorganismos, por lo que su deteccin suele ser dudosa3.SerologaLa serologa est limitada por las reacciones cruzadas entre el GFM y el GFT. La IFI es una de las tcnicas ms sensibles y la ms ampliamente utilizada en la actualidad para el diagnstico de las rickettsiosis exantemticas. Los antgenos estn comercializados, estandarizados y prefijados en los portaobjetos sobre los que se aaden diluciones seriadas del suero del paciente. La confirmacin del diagnstico requiere detectar una seroconversin, que se produce en la fase de convalecencia, entre la tercera y cuarta semanas. Para una correcta interpretacin de los resultados de serologa, se deben tener en cuenta los datos de reactividad ba-sal de la poblacin en zonas endmicas. Como tcnicas experimentales, para evitar la reactividad cruzada, en algunos casos se utilizan ensayos deinmunoblotingcon sueros sometidos a absorciones con antgenos heterlogos. Este mtodo da como resultado un considerable aumento de la especificidad, si bien tiene una baja sensibilidad3.CultivoPara el cultivo de las rickettsias del GFM se requiere Minimum Esencial Medium (medio MEM) sin antibitico suplementado con suero bovino fetal (SBF) al 10% (concentracin final [CF]), 2 mM de glutamina CF y el 0,2% (CF) de aminocidos no esenciales. La incubacin de los cultivos se lleva a cabo a 33-35 C en ausencia de CO2. ParaR. typhise requiere el mismo medio suplementado con SBF al 2% (CF). El diagnstico definitivo de las rickettsiosis requiere el aislamiento e identificacin de la especie a partir del cultivo. El cultivo se lleva a cabo en clulas VERO E6 o fibroblastos L92. El efecto citoptico producido no es muy caracterstico ni especfico de especie y, aunque puede aparecer a las 24-48 h postinoculacin, generalmente se necesitan 5-7 das para su desarrollo. El cultivo se puede acelerar si se inocula la muestra sobre una monocapa de las clulas susceptibles previamente crecidas sobre un portaobjetos circular (shell vial,SV), seguida de una centrifugacin. Despus de 5-7 das de incubacin se procede a detectar la presencia de la bacteria mediante tincin de Gimnez, IFI con anticuerpos especficos o PCR. Este procedimiento resulta muy laborioso, requiere personal especializado e instalaciones con nivel de seguridad 3. Su principal limitacin es su baja sensibilidad, por lo que se no se recomienda en el caso de que el paciente haya comenzado con la antibioterapia. Sin embargo, es la tcnica diagnstica ms especfica, fundamental para la obtencin de antgenos, para el estudio de la sensibilidad a antibiticos y la determinacin de las especies deRickettsiapresentes en un rea3.Deteccin molecularLas tcnicas moleculares, como la PCR, permiten un diagnstico rpido y especfico al detectar ADN de rickettsia en tejidos infectados, cultivos y garrapatas. Por el momento, la mayor parte de las tcnicas descritas son de desarrollo propio (in house),y no estn comercializadas. Los genes ms comnmente analizados son los que codifican dos protenas de la membrana externa:rOmpA(presente en todas las especies exceptoR. helvetica, R. australis, R. belliiyR. canadensis) yrOmp B(presente en todas las especies exceptoR. helvetica, R. bellii y R. massiliae). Tambin se utiliza el gengltA, que codifica la citrato sintetasa (vlido para todas la rickettsias), el gen que codifica la protena de 17-kDa (vlido para todas las rickettsias del GFM) y el gen D (vlido para la mayora de las especies). Recientemente, se ha desarrollado una PCR-RLB(reverse line blotting)que utiliza como diana el espacio intergnico 23S-5S ARNr que, junto con una hibridacin en fase reversa utilizando sondas espe-cie-especficas, permite la identificacin de la especie implicada sin necesidad de secuenciacin. Este mtodo es altamente sensible y especfico, tanto para muestras clnicas como ambientales. Cuando se busque una mayor sensibilidad, hay que recurrir a PCR anidadas y posterior hibridacin en fase reversa. La PCR a tiempo real permite obtener resultados en muy poco tiempo (menos de 1 h). Todas estas ventajas hacen que la PCR se presente como la prueba ideal para el diagnstico de estas infecciones, aunque existen algunas desventajas, como son la limitacin para realizar pruebas de sensibilidad a los antibiticos y la imposibilidad de coleccionar los aislados para futuras investigaciones3.Las rickettsiosis se previenen evitando la picadura de los artrpodos vectores. El tratamiento de las rickettsiosis debe iniciarse sobre la base proporcionada por datos clnico-epidemiolgicos. El tratamiento de eleccin para la infeccin por rickettsias es la doxiciclina. En nios puede utilizarse en algunos casos la azitromicina3.4.-CLAMIDIAS

La familia Chlamydiaceae consiste de un gnero, Chlamydia con tres espcies que causan enferemedad en humanos4: C. trachomatis, la cual puede causar infecciones urogenitales, tracoma, conjuntivitis, neumona y linfogranuloma venreo (LGV) C. pneumoniae, la cual puede causar bronquitis, sinusitis, neumona y posiblemente aterosclerosis C. psittaci, la cual puede causar pneumona (psitacosis).

El gnero Clamidia son parsitos pequeos intracelulares obligados y alguna vez fueron considerados virus. Sin embargo, contienen DNA, RNA y ribosomas por lo tanto sintetizan sus propias protenas y cidos nucleicos por lo cual ahora se consideran bacterias verdaderas. Poseen membrana interna y externa de manera similar a las bacterias gram-negativas y presentan lipopolisacrido pero no tienen lmina de peptidoglicano. Aunque sintetizan la mayora de sus intermediarios metablicos, son incapaces de sintetizar su propio ATP y por lo tanto son parsitos de energa4.Diagnstico de LaboratorioExisten varias pruebas de laboratorio para diagnosticar C. trachomatis pero la sensibilidad de ellas depende de la naturaleza de la enfermedad, el sitio de coleccin de la muestra, la calidad de la misma. Dado que las Clamidia son parsitos intracelulares, para el anlisis deben enviarse hisopos de los lugares afectados mejor que los exudados. Se estima hasta el 30% de los especmenes enviados para su anlisis son inapropiados4.1.CitologaEl examen por tincin de raspados celulares para bsqueda de la presencia de cuerpos de inclusin (Figuras 2 y 3) ha sido usado para el diagnstico pero ste mtodo no es tan sensible como algunos otros4.2.CultivoEl cultivo es el mtodo mas especfico para el diagnstico de las infecciones de C. trachomatis. Los especmenes se agregan a clulas susceptibles en cultivo y las clulas infectadas se examinan por la presencia de cuerpos de inclusin teidos con yodo. El yodo tie el glucgeno de los cuerpos de inclusin. La presencia de cuerpos de inclusin teidos con yodo es especfica para la determinacin de C. trachomatis ya que los cuerpos de inclusin de otras espcies de clamidia no contienen glucgeno ni se tien con yodo4.3.Deteccin de AntgenoInmunofluorescencia Directa y ELISA (kits) que detectan el LPS-grupo especfico o protenas de membrana externa (omp) especficas de cepa estn disponibles para el diagnstico. Esta prueba tampoco es tan buena como el cultivo, particularmente con muestras conteniendo pocos microorganismos (ej. pacientes asintomticos) 4.4.SerologaLas pruebas serolgicas para el diagnstico son de valor limitado en los adultos, ya que las pruebas no distinguen entre infecciones actuales o infecciones previas (pasadas). La deteccin de altos ttulos de anticuerpos IgM es indicativa de una infeccin reciente. La deteccin de anticuerpos IgM, es til en la infeccin neonatal4.5. Sondas de cidos nuclicosEstn disponibles tres nuevas pruebas basadas en sondas de cidos nucleicos. Estas pruebas son sensibles y especficas y pueden reemplazar al cultivo como mtodo de eleccin4.DIAGNSTICO POR EL LABORATORIO DE LAS INFECCIONES MICTICAS:

Objetivo principal del laboratorio:

Detectar rpida y eficazmente la presencia de los hongos en muestras clnicas y determinar si es el agente etiolgico o es un contaminante. Para lograr este objetivo se requiere realizar adecuadamente la recogida de la muestra, su transporte y procesamiento, adems de contar con los detalles sobre el cuadro clnico y los antecedentes epidemiolgicos. Es importante disponer de la siguiente informacin5:

1) Historia clnica del paciente.2) Tratamientos antimicrobianos, citotxicos o frmacos inmunosupresores.3) Ocupacin del paciente.4) Historia de residencia o viajes al exterior.5) Contacto con animales.6) Tipo de muestra a analizar.7) En qu condiciones fue recolectada la muestra.

Es muy importante que las muestras sean enviadas al laboratorio una vez recolectadas, y en forma adecuada para su rpido procesamiento; de esta forma se minimiza la prdida de viabilidad de los hongos, reduce el desarrollo de bacterias y asegura la obtencin por cultivo del agente etiolgico5.Segn los tejidos comprometidos, las micosis se clasifican en: Superficiales, que afectan piel y fanreos. Profundas, que comprometen tejido subcutneo, osteoarticular y visceral. Estas ltimas pueden ser producidas por hongos patgenos (Histoplasma capsulatum, Coccidioides immitis, etctera) o por hongos oportunistas, que son inofensivos en el husped inmunocompetente, pero que actan como patgenos en el inmunocomprometido5. En los ltimos aos se ha observado un aumento importante de micosis oportunistas debido a la expansin de la poblacin de pacientes inmunocomprometidos. Adems de las infecciones fngicas oportunista clsicas, como candidiasis, criptococosis, aspergilosis y mucormicosis, han emergido micosis por otros hongos que hasta hace poco tiempo se consideraban simples contaminantes, como por ejemplo Fusarium, Trichosporon, Malassezia, etctera. Esto ha obligado a los microbilogos a familiarizarse con la morfologa macro y microscpica de estos agentes, ya que el diagnstico micolgico es eminentemente morfolgico, especialmente en hongos filamentosos5. Las tcnicas bsicas de Bacteriologa (aislamiento, identificacin morfolgica y bioqumica) son, en general aplicables a las levaduras de importancia mdica (gneros: Candida, Cryptococcus, Trichosporon, Rhodotorula.Pityrosporum y Torolopsis). No obstante, hay diferencias con respecto a las bacterias que es necesario destacar. El perodo de generacin es ms largo, por lo tanto debe mantenerse en incubacin durante un tiempo prolongado. Los demartofitos, por ejemplo, pueden demorar hasta 4 semanas. Los hongos oportunistas, en cambio, son de desarrollo ms o menos rpido, como por ejemplo Mcorales 24-48 horas, Apergillus 48-72 horas; Crytococcus 48-72 horas5. El diagnstico de laboratorio de las infecciones fngicas requiere: Presuncin diagnstica por parte de los clnicos. Apropiada recoleccin de muestras. Procedimientos especiales de Laboratorio. El estudio micolgico consta de5:1. Observacin directa al fresco con lquidos clarificantes (KOH 10-20%, lactofenol) para pesquisa de levaduras e hifas. 2. Cultivos de hongos en agar Sabouraud glucosado, con sin antibiticos, con y sin ciclohexamida, en que se consideran tiempo de desarrollo, caractersticas macroscpicas y microscpicas (hifas y esporas), estudios de fermentacin (zimograma) y utilizacin de carbono (auxonograma). 3. Estudio histolgico: biopsias con tinciones especiales, como Gomori Grocott (impregnacin argntica). 4. Inmunodiagnstico. Deteccin de antgenos capsulares, de pared fngica, etctera; son pruebas sensibles y una buena alternativa frente a cultivos que requieren perodos de incubacin prolongados . Deteccin de anticuerpos: IgG, IgM con tcnicas de inmunodifusin o con tcnicas de anticuerpos marcados: ELISA e inmunofluorescencia. 5. Tcnicas de biologa molecular: hibridacin de ADN, PCR,, etctera. Las micosis que se observan con mayor frecuencia en nuestro medio son, entre las micosis superficiales, pitiriasis versicolor y dermatofitosis y, entre las profundas oportunistas, candidiasis, criptococosis, aspergilosis y mucormicosis. A continuacin se revisar el diagnstico micolgico de stas5.RECOGIDA Y PROCESAMIENTO DE MUESTRAAl igual sucede en los restantes de procesos infecciosos, e l diagnstico de laboratorio de la infeccin causada por hongos. Estos ltimos es especialmente cierto cuando el microorganismo aislado en los cultivos forma parte de la microflora normal o se encuentra con frecuencia en el ambiente6.La microscopia directa tiene una clara utilidad en el diagnstico de las micosis, aunque puede obtener resultado falsos negativos o falsos positivos. La microscopa dispone de una sensibilidad menor que los cultivos, y la obtencin de resultados negativos no descarta la existencia de una micosis. Se emplea diversas tinciones y tcnicas microscpicas para detectar y caracterizar directamente los hongos en muestras clnicas. Lo abordajes utilizados ms a menudo en el laboratorio de micologa clnica son el reactivo fluorescente blanco calcoflor o la tincin de frotis y la preparaciones con tinciones de gram o giensa. El blanco calcoflor tie las paredes celulares de los hongos haciendo que emitan florescencia, lo que hace posible su deteccin de forma ms fcil y rpida. La tincin de gran resulta de utilidad en deteccin de levaduras de gnero como cndida y cryotococcus, aunque tambin tie las hifas de hongos filamentosos, como las inclusiones de aspergillus. Generalmente, los hongos son grampositivos, aunque pueden adoptar un aspectomoteado o gramnegativo. La tincin de giensa es especialmente til para detectar las formas levaduriformes intracelulares de H. capsulatum en frotis de sangre perifrica, medula sea o preparaciones touch de tejidos6.

En un estudio realizado en los consultorios de dermatologa y el laboratorio del Hospital Nacional de Clnicas Pedro Vella de la Facultad de Ciencias Mdicas en la Universidad Nacional de Crdoba, Argentina, se analizaron 88 muestras clnicas de pacientes con diagnstico presuntivo de micosis superficiales, las muestras se recolectaron en dos etapas6.

1. Extraccin de material sin preparacin previa 6.

2. Extraccin post-preparacin6:

a) Se suspendi todo medicamento sistmico o tpico con accin antifngica 10 a 15 das antes de la extraccin.

b) Tres a cinco das antes de la toma de muestra no se aplicaron pomadas, cremas o polvos sobre la piel, as como esmalte de uas.

c) La zona debi ser higienizada con agua y jabn de tocador, as mismo se aconsej realizar por lo menos tres lavados con infusin de manzanilla o agua hervida y sal tres das antes de acudir al laboratorio.

d) En el caso de extraccin de material de uas, se recomend no cortarlas en la semana anterior a la obtencin y adems de los lavados fue necesario el cepillado de las mismas.

e) Si la zona afectada eran los pies, se recomend usar calzado cerrado y medias despus del ltimo bao, cuidando que los zapatos no tuvieran restos de talco.

Recoleccin de las muestras6:

Raspado con bistur para las lesiones de piel y uas. Extraccin de pelos con pinzas. Hisopos o bistur para las lesiones mucosas y semimucosas. Todos los materiales fueron recogidos en materiales estriles.

TRANSPORTE DE LAS MUESTRAS:

Las muestras deben ser transportadas en un recipiente estril, humidificado y a prueba de vertidos; sin embargo, las muestras dermatolgicas pueden transportarse en un recipiente seco (placa de petri, papel de fotografa negro, frascos recolectores) o de forma ideal, sembrarla directamente sobre el medio de cultivo; no deben introducirse en medios de transporte, a no ser que sea fcil retirar la muestra del medio. Los raspados corneales y hemocultivos deben sembrarse directamente en el medio de cultivo adecuado. Las muestras cuyo transporte se prolongue ms de 2 horas deben almacenarse a 4C, excepto la sangre y los lquidos estriles (30-37C) y las muestras dermatolgicas (15-30C) 6.

CULTIVOPor lo general se considera que el mtodo diagnostico dotado de la mayor sensibilidad frente a las micosis es el aislamiento del hongo en un cultivo. Adems, el cultivo suele ser necesario para identificar a los agentes etiolgicos en la mayora de los casos. La recuperacin ptima del material clnico depende de la obtencin de muestra clnica adecuada y la posterior utilizacin de los mtodos de cultivo que garanticen la recuperacin de los microorganismos que suelen estar presentes en pequeas cantidades y crecen muy despacio7Ningn medio de cultivo es suficiente por s mismo para aislar todos los hongos con importancia mdica y normalmente se acepta la utilizacin de dos tipos de medio: selectivos y no selectivos7.El medio no selectivo permite el desarrollo de levaduras y formas filamentosas de crecimiento rpido, as como los hongos exigentes desde el punto de vista nutricional y de crecimiento ms lento. Los hongos son capaces de proliferar en casi todos los medios de cultivo usados para las bacterias; no obstante, su crecimiento puede ser lento y se recomienda la inoculacin de un medio de ms enriquecido como agar de extracto de corazn y cerebro o agar SABHI (dextrosa de Sabouraud y BHI). En general la recuperacin optima de los hongos exigentes desde el punto de vista nutricional como, H. capsulatum,B.dermatitidis, a partir del material del material clnico suele requerir de un medio con sangre. A menudo se aade cicloheximida con el propsito de inhibir levaduras y las formas miceliales de crecimiento ms rpido que estn presentes en la muestra como contaminantes. Aunque este compuesto no afecta a los patgenos dimorficos endmicos, inhibe la proliferacin de un gran nmero de patgenos oportunistas (Candida o Aspergillus) que tambin podran ser responsables de la infeccin7.Por ello se debe combinar siempre un medio con ciclohiximida con otros medios complementarios carentes de esta molcula. Las muestras que podran presentar contaminacin bacteriana deben inocularse en medios selectivos como SaBHI y BHI complementarios con antibiticos (a menudo se emplea penicilina asociada a estreptomicina). Ciertos hongos pueden precisar de medios de especializados. Por ejemplo la recuperacin optima de Malassezia furfur, un patgeno que produce infecciones cutneas superficiales y en catteres vasculares exige la utilizacin de un medio que contenga aceite de oliva u otra fuente de acidos grasos de cadena larga7La deteccin de una fungemia es un importante componente del diagnostico de una micosis invasiva. Aunque es posible la contaminacin de los hemocultivos por un hongo, la obtencin de resultados positivos para hongos en la mayora de estos cultivos se utilizan se considera significativa. Por desgracia los hemocultivos arrojan con frecuencia resultados negativos a pesar de la presencia de la enfermedad diseminada en especial cuando el microorganismo que a causado una infeccin es una forma micelial. La deteccin de las fungemias ha mejorado como consecuencia de desarrollo de instrumentos de monitorizacin continua de los hemocultivos con medios de cultivo mejorados que tienen en cuenta las necesidades de crecimiento de los hongos y bacterias. Junto a estos sistemas basados en caldos de cultivo, el mtodo de lisis-centrifugacin constituye una herramienta flexible y sensible de deteccin de la fungemia provocada por levaduras y patgenos dimorficos7.Tras su inoculacin los cultivos fngicos han de incubarse en una atmosfera aerobia a una temperatura adecuada y durante un periodo de suficiente para permitir la recuperacin del hongo a partir de las muestras clnicas6.

IDENTIFICACION DE HONGOS FILAMENTOSOS

El crecimiento de hongos puede producir en sus habitantes determinadas patologas entre las que cabe destacar asma y alveolitis alrgicas. La contaminacin ambiental por hongos en el interior de edificios, es debida bsicamente a hongos filamentosos y levaduras8.

Muchas especies de hongos se pueden diferenciar, identificar y clasificar segn su morfologa, estructura, mecanismo de formacin y elementos formadores de las esporas. El conocimiento de estas caractersticas puede ser suficiente para identificar especies que pertenecen al grupo de los hongos filamentosos; sin embargo, cuando se trata de identificar especies pertenecientes al grupo de las levaduras es imprescindible la aplicacin de pruebas bioqumicas8.

La mayora de los hongos, sin embargo, son pluricelulares o filamentosos y se caracterizan por estar constituidos por filamentos ramificados o hifas que se desarrollan y entrelazan formando el micelio8.

Existe un micelio vegetativo adosado a la superficie del sustrato (suelo, plantas, alimentos) y un micelio areo o reproductor, donde se forman las esporas (asexuales y sexuales) (9).Los hongos filamentosos y levaduras son en su mayora saprfitos, hallndose libres en la naturaleza, especialmente en la materia orgnica en descomposicin8.

Principales Mtodos De Identificacin De Hongos Filamentosos

La identificacin de los hongos filamentosos se basa en el examen macroscpico de la colonia y en sus caractersticas microscpicas. Semejanzas macroscpicas como la forma de la colonia, el color de la superficie, la textura y la produccin de pigmentos son muy tiles para la identificacin8.

En general, la morfologa microscpica de los hongos es estable y presenta pocas variaciones. La identificacin definitiva se basa en la forma caracterstica, mtodo de produccin y ordenamiento de las esporas, siendo tambin importante conocer el tamao y la disposicin de las hifas8.

La preparacin del material para la observacin microscpica puede realizarse en fresco, con cinta de celofn adhesiva o mediante cultivo sobre portaobjetos8.

Preparacin en fresco

Se realiza empleando el procedimiento descrito a continuacin8:

1. Seleccionar una colonia aislada.

2. Calentar a la llama el alambre de un asa de siembra, y doblar de forma que se convierta en un objeto cortante.

3. Con la ayuda del asa, extraer un fragmento triangular de la colonia que contenga adems un poco de agar en la parte inferior.

4. Depositar el fragmento extrado sobre un portaobjetos en el cual, previamente, se ha depositado una gota de azul de lactofenol.

5. Cubrir con un portaobjetos y presionar suavemente para dispersar la colonia y el agar; de esta forma, la muestra est disponible para su observacin al microscopio.

Este procedimiento es el que utilizan la mayora de los laboratorios, ya que las muestras se preparan con facilidad y rapidez y adems permite identificar muchas de las especies de hongos ms habituales. El mayor inconveniente de la observacin en fresco es que se puede alterar el ordenamiento caracterstico de las esporas al presionar con el cubreobjetos, por lo que este procedimiento no es vlido en los casos en que es necesario conocer la disposicin de las esporas8.

Preparacin con cinta de celofn adhesiva

El procedimiento se lleva a cabo como sigue8:

1. Apoyar el lado engomado de un trozo de cinta adhesiva transparente sobre la superficie de una colonia.2. Colocar la cinta bien extendida sobre una gota de azul de lactofenol o azul de anilina colocada, a su vez, sobre un portaobjetos.3. Observar al microscopio para conocer la forma y ordenamiento caracterstico de las esporas.

Este mtodo puede considerarse como el ms simple, econmico y adecuado para la identificacin de hongos, recomendable para los laboratorios microbiolgicos de cualquier nivel.

La preparacin de la cinta transparente permite observar al microscopio como se desarrolla el microorganismo en el cultivo. Generalmente las esporas se mantienen intactas y la identificacin se realiza con facilidad8.

Una de las desventajas de este mtodo es que si la cinta transparente no se presiona con suficiente firmeza sobre la superficie de la colonia, la muestra no es adecuada, ya que al no quedar bien adherida la cinta, las esporas o las hifas no se pueden identificar8.

En los casos en que mediante este mtodo no se observen esporas deber realizarse la preparacin en fresco8. Cultivo sobre portaobjetos

Se realiza empleando el procedimiento descrito a continuacin8:

1. Cortar un bloque pequeo de un medio slido adecuado (agar), que ha sido vertido en una cpsula de Petri, hasta una altura de 2 cm. El bloque puede cortarse con la ayuda de un bistur estril o con un tubo de ensayo estril sin reborde (lo que permite obtener un taco redondo) .

2. Colocar un portaobjetos estril sobre una capa de agar al 2% contenida en una cpsula de Petri.

3. Colocar el bloque de agar sobre el portaobjetos.

4. Con un asa de siembra cuyo alambre ha sido doblado en ngulo recto, inocular los cuatro cuadrantes del taco con el microorganismo a identificar.

5. Colocar un cubreobjetos estril sobre la superficie del bloque de agar.

6. Tapar la cpsula de Petri que contiene el cultivo e incubar a 30o C.

7. Finalizado el perodo de incubacin, retirar el cubreobjetos (este proceso debe realizarse en una cabina de seguridad biolgica), y colocarlo en un portaobjetos que contenga azul de lactofenol o azul de anilina.

8. La observacin al microscopio permite distinguir la forma y disposicin de las esporas.

9. Si con este proceso no ha sido posible la identificacin, el resto del cultivo puede ser usado ms adelante si se contina incubando. Entonces se retira el bloque de agar y se agrega una gota de azul de lactofenol o azul de anilina sobre la zona del cultivo y se coloca un cubreobjetos sobre ella. Es recomendable realizar dos cultivos sobre el mismo portaobjetos de modo que si en uno no se pueden observar las caractersticas microscpicas puede disponerse del segundo despus de un perodo adicional de incubacin.

Este mtodo permite la observacin microscpica del hongo mientras se desarrolla directamente debajo del cubreobjetos, de forma que las caractersticas microscpicas se distinguen con facilidad, las estructuras se mantienen intactas y puede observarse un gran nmero de reas representativas8.

No deben realizarse cultivos en portaobjetos de hongos de crecimiento lento que pueden ser patgenos dimorfos, como : Histoplasma capsulatum, Blastomyces derma titidis, Coccidioides immitis, Paracoccidioides brasilien sis o Sporothrix schenckii8.

Identificacin de levaduras de importancia clnicaEl trmino levadura se refiere bsicamente a un grupo de hongos unicelulares, donde las hifas y/o pseudohifas pueden o no estar presentes y tienenuna fase sexual perfecta o teleomorfa. Sin embargo, las levaduras a las que no se le ha descrito an la fase sexual, y slo se le conoce la fase anamorfa, son denominadas como formas parecidas a levaduras o yeastlike; estas se reproducen por gemacin.

Levaduras de Importancia Mdica Levaduras del gnero Candida Levaduras del gnero Cryptococcus Levaduras del gnero Malassezia Levaduras del gnero Trychosporon Levaduras del gnero Rhodotorula Levaduras del gnero Saccharomyces

GneroCandidaEn cuanto a hongos patgenos en humanos, existen cerca de 200 especies que han sido reconocidas; de estas, alrededor de 30 son levaduras de inters mdico. Entre ellas, desde el punto de vista clnico, han sido y siguen siendo relevantes las del gneroCandida, las cuales forman parte de la flora normal de nuestro organismo. Son los agentes causales de la candidiasis o candidosis, micosis oportunista, aguda, subaguda o crnica, de alta incidencia en nuestro medio y a nivel mundial; pueden afectar a individuos de cualquier edad, raza o sexo, siendo los factores predisponentes del husped en combinacin con los del microorganismo, los que favorecen el desarrollo de la infeccin.

En cuanto a la incidencia, en los ltimos 20 a 30 aos se ha elevado el nmero de casos de candidiasis, siendo hasta el presenteCandida albicansel principal agente causal, encontrndose entre un 60-70% de los aislamientos clnicos, en individuos infectados por VIH, se ha observado tambin, que un 90% puede sufrir un episodio de candidiasis orofaringea. En mujeres VIH positivo, la vulvovaginitis porCandidaesta muy relacionada, as como los casos de recidivas. En estas pacientes se ha aisladoC. albicansde secrecin vaginal en un 20,75% yCandidaspp.en 5,66%.

La identificacin de levaduras del gnero Candida, Pruebas biolgicas,Produccin de clamidosporos: Se utilizan medios pobres AHM-Tween 80 Estructuras de resistencia Se utilizan repiques de 24 hs. Se observan a las 72 hs. hasta los 7 das. Personal experimentado 5-7% de las cepas de C. albicans no los producen Son de bajo costo

Pruebas bioqumicas Asimilacin de hidratos de carbono Auxanograma convencional Zimograma convencional Sistemas comerciales de identificacin Mtodos enzimticos Fluorognicos Cromognicos Auxanograma

Mtodo de estudio bioqumico para identificacin de levaduras del gnero Candida. Asimilacin de carbohidratos en aerobiosis. Repiques de 24 hs de la cepa a estudiar. Lectura luego de 24 hs a 48 hs previo pasaje por estufa a 37 C. Halo de crecimiento alrededor del disco, evidencia asimilacin del carbohidrato.

GneroCryptococcusEn orden de importancia siguiendo aC. albicans,se encuentrala levadura capsuladaCryptococcus neoformans, agente causal de la criptococosis, micosis sistmica de evolucin subaguda o crnica, que ocupa el cuarto lugar entre las enfermedades oportunistas en pacientes con SIDA. En Venezuela, en este tipo de pacientes, constituye la tercera causa de muerte, despus de la histoplasmosis y candidiasis. A nivel mundial, esta micosis tiene una prevalencia del 3% en Amrica y Europa, y de 20-35 % en frica, afecta ambos sexos, siendo ms frecuente en individuos entre los 30 y 60 aos de edad, principalmente debilitados e inmunosuprimidos. Las formas clnicas ms frecuentes son la meningitis y la meningoencefalitis; en algunos casos puede suceder con diseminacin a otros rganos.Del estado anamorfo de esta levadura se han descrito tres variedades:C. neoformansvar.grubii(serotipo A),C. neoformansvar.neoformans(Serotipo D), ambas de distribucin mundial yC. neoformansvar.gattii(Serotipo B y C), limitada a regiones tropicales y subtropicales.

Dentro de las 19 especies deCryptococcusque han sido reconocidas, 6 han sido recuperadas ocasionalmente como agentes infecciosos:C. albidusvar.albidus, C. albidusvar.diffluens, C. luteolus, C. laurentii, C. terreusy C. Gastricus .Entre los otros grupos de levaduras de inters mdico, se pueden mencionar las ocho especies del gneroMalassezia,Geotrichum candidum, Trichosporonspp., Rhodotorula mucilaginosa, Sporobolomycesspp.,Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha, Pneumocystis jiroveci(especie queinfecta al humano, antiguamente considerado como un protozoario y denominadoP. carinii), y otras.

La causa principal de patogenicidad de estas levaduras est relacionada con alteraciones del sistema inmunolgico del husped, as como con otros factores predisponentes, que puedan interferir en el equilibrio del nicho biolgico que mantienen a estas levaduras en estado de comensal. Entre los factores desencadenantes podemos mencionar: embarazo, edades extremas (infancia y vejez), uso prolongado de antibiticos, antineoplsicos, glucocorticoides, drogas, uso de prtesis dentales, etc.

Estudio micolgico Examen directo (ED) o microscpico de la muestra clnica: es un mtodo rpido para la visualizacin de las estructuras fngicas. En una lmina portaobjeto se aade a la muestra clnica una gota de un aclarante (KOH 10-40%, Clorazol Black E), para favorecer la ruptura de los enlaces intercelulares y liberar la clula fngica; se coloca el cubre objeto y se examina directamente al microscopio de luz (o en microscopio de fluorescencia en el caso de usar Calcoflor), observndose estructuras tales como: blastoconidias redondas u ovales, con o sin gemacin, pseudohifas, (posiblemente Candida spp.); artroconidias y blastoconidias, (Trichosporon spp.); slo artroconidias (Geotrichum spp.), etc. La presencia de blastoconidias y pseudohifas est asociada con la forma patgena de C. albicans. En todo caso es importante sealar que el ED slo refiere que se est en presencia de estructuras compatibles con, siendo necesario el cultivo para aislar e identificar el microorganismo.Cultivo: Se efecta por siembra del material clnico en medios de cultivo como Sabouraud-Dextrosa-Agar, micosel, lactritmel, etc. La mayora de estas levaduras presentan un crecimiento entre 3-5 das. El crecimiento del cultivo nos puede mostrar colonias pastosas compactas o rugosas de color blanco a crema (sugestivas deCandida, Saccharomyces, Prototheca),colonias anaranjadas o coral(Rhodotorula), mucoides(Cryptococcus), de consistencia dura, superficie rugosa y seca(Geotrichum, Trichosporon),etc.

Como se ha sealado, una vez aislado el agente, slo se puede sugerir el gnero al cual pertenece, poco se puede referir respecto a la especie. Para tal fin, se hace necesario recurrir a los diversos mtodos de identificacin, pero, Es importante llevar a cabo ese tipo de estudio?En respuesta a esto, McGinnis en 1980, describe que las levaduras son un grupo de hongos heterogneos que superficialmente parecen homogneos, lo cual ya sugera la necesidad de llevar a cabo mtodos, que en lo posible, permitieran la identificacin en cuanto a gnero y especie. Sin embargo, en la actualidad la importancia de identificar estos microorganismos conlleva an otra serie de razones como:La orientacin para el tratamiento antifngico:existen mltiples reportes en la literatura, sobre la resistencia innata y adquirida de algunas de estas levaduras de inters mdico a los tratamientos antifngicos de primera y segunda generacin, como el caso ya mencionado deC. krusei, C. glabrata y C. albicans, las cuales con frecuencia pueden presentar resistencia al fluconazol.Caracterizacin epidemiolgica:Hoy en da, se refleja en muchas casusticas y publicaciones cientficas,la importanciaque ha tenido el valorar e introducir en los laboratorios de rutina de micologa las pruebas de identificacin de levaduras, las cuales han permitido ampliar cada vez ms el conocimiento de estos microorganismos, desde el punto de vista clnico, micolgico y epidemiolgico.

Estudio biolgico y molecular:No cabe duda que la descripcin de la nueva especieCandida dubliniensisen 1995, fue debida al sustento que proporcionaron las tcnicas de biologa molecular, una vez que los mtodos convencionales de identificacin, no fueron suficientes para lograr la discriminacin entre esta especie yC. albicans. Cada da, los estudios de biologa molecular constituyen el asiento de toda investigacin en el campo taxonmico y biolgico, tanto de hongos como de cualquier otro microorganismo. Sin embargo, se considera que an estas tcnicas moleculares no deben ser abordadas en forma nica, sino en conjunto con ensayos complementarios, que puedan permitir tener un conocimiento mas integral con respecto a los caracteres morfolgicos, fisiolgicos y genotpicos de las levaduras.

Identificacin de las Levaduras

Las tcnicas de identificacin pueden ser agrupadas en: Estudio morfolgico. Evaluacin macroscpica: examinar en un determinado medio de cultivo caractersticas de la colonia tales como: color, textura, topografa de la superficie y bordes de la colonia. Se ha referido que estos caracteres pueden variar de acuerdo a la fuente de carbono. Evaluacin microscpica:presencia o ausencia de hifas, pseudohifas, cpsula, blastoconidias, artroconidias, ballistoconidias, etc.

Produccin tubo germinativo:Es una de las pruebascortas que nos orienta principalmente hacia la identificacin deC. albicans. Se debe recordar que la especie descubierta mas reciente,C. dubliniensis, tambin produce tubo germinal en un corto periodo de tiempo. El ensayo se aplica colocando un pequeo inculo de la levadura en suero humano, de conejo o ratn, clara de huevo o en solucin protica, por el lapso de 2-4 h a 37 C.Se induce el desarrollo de una estructura tubular a partir del blastoconidio, sin constriccin en su base, caracterstica que lo diferencia de una pseudohifaProduccin de clamidosporas:conforma otra de las pruebas rpidas que se utilizan para diferenciarC. albicansde las otras especies, teniendo en cuenta queC. dubliniensis,tambin forma clamidosporas en un lapso de 48 horas de incubacin a temperatura ambiente. Se requiere la aplicacin de otros ensayos (fisiolgicos, bioqumicos, moleculares) para diferenciar estas especies.

Estudio fisiolgico y bioqumicoDe este tipo de estudio se han derivado los ensayos de asimilacin (auxonograma-degradacin aerbica) y fermentacin (zimograma-degradacin anaerbica) de carbohidratos para la identificacin de levaduras. En el auxanograma, la asimilacin del azcar se detecta por el crecimiento visible y cambio del indicador de color en el medio de cultivo, mientras que en el zimograma, su producto se detecta a travs de la produccin de gas (hidrgeno y anhdrido carbnico).

Deteccin de enzimasPrueba de ureasa: mide la capacidad de la levadura de hidrolizar la molcula de rea en dos molculas de amonio por la accin de la enzima ureasa; esto genera un incremento del pH del medio y en consecuencia el cambio de color de naranja a fucsia. Esta enzima por lo general esta ausente en el grupo de los Ascomycetes, pero est siempre presente en los Basidiomycetes. Es as como permite diferenciar los gnerosCryptococcus,Trichosporony Rhodotorula,los cuales son ureasa positivos, deCandida y Geotrichumque son negativos a este ensayo, salvo algunas excepciones, comoC. krusei,la cual puede o no presentarla.Actividad de fenol-oxidasa: se produce en presencia de sustratos orto-fenlicos como cido cafico o bilis esculina, los cuales son hidrolizados; los productos reaccionan con las sales de Fe+3dando como resultado un pigmento oscuro o negro, indicativo de la positividad de la prueba.C. neoformans,la especie ms patgena de este gnero, tiene la capacidad de producir esta enzima, sin embargo, esta puede ser variable en las otras especies del gnero. La asimilacin del carbohidrato inositol es comn a todas.Otras pruebas enzimticas como la deteccin de -galactosidasa, gelatinazas y -glucosidasa, son de gran utilidad en la identificacin de levaduras. Por ejemplo, el ensayo de -glucosidasa: positiva paraC. albicansy negativa paraC. dubliniensis. Sin embargo, reportes ms recientes han demostrado la ausencia de esta enzima en algunos aislados deC. albicans.

Mtodos automatizados Son mtodos de identificacin rpida basados en ensayos de asimilacin de carbohidratos y otras pruebas bioqumicas, los cuales se encuentran estandarizados y simplificados en forma de sustratos liofilizados. A diferencia de las pruebas convencionales, que pueden tomar entre 2-20 das, el sistema automatizado permite la identificacin de la levadura en un lapso de 24-48 horas y los resultados pueden ser ledos en forma manual o automtica a travs de un Software. Entre estos sistemas podemos mencionar el APICandida, API-ATB, ID 32C, API 20C, Vitek Systems, Baxter MicroScan System y otros.

Medios diferenciales o deidentificacin directaComprende una serie de medios de cultivo a los cuales se les ha adicionado sustratos cromognicos o fluorognicos, que ponen de manifiesto la presencia o no de un grupo de enzimas del hongo: L-prolina-aminopeptidasa, N-acetil--D-galactosaminidasa, -D-glucosidasa, pirofosfato-diesterasa y fosfatasa cida. En presencia de sustratos fluorognicos, la reaccin enzimtica da lugar a compuestos fluorescentes, que pueden ser ledos con luz UV, mientras que un sustrato cromognico da lugar a una colonia pigmentada. Por ejemplo,C. albicanses L-prolina y -galactosaminidasa positiva,mientras que enC. tropicalisla segunda enzima es negativa, lo cual hace que en presencia de lamezcla cromognica,C. albicans,desarrolle una colonia color verdeyC. tropicalisazul.Estos medios de cultivo diferenciales, a pesar de arrojar una identificacin presuntiva, tienen la gran ventaja de no requerir mucha experiencia tcnica, son rpidos y especficos, permiten identificar el agente a partir del cultivo primario y discriminan entre mezclas de levaduras de una misma muestra, sin embargo, slo pueden identificar unas pocas especies.El medio CHROMAgarCandida(Biomedics) descrito por Odds y Barnaerts en 1994, uno de los primeros en salir al mercado, ha mostrado un 100% de sensibilidad y especificidad en la identificacin deC. albicans y C. tropicalis;tambin ha sido referido la identificacin deC. glabratayC. krusei. Entre otra de sus ventajas resalta su utilidad en la diferenciacin entreC. albicansyC. dubliniensis, las cuales desarrollan un color verde claro y verde oscuro respectivamente; similares resultados se han observado en el medioCandidaID.

Mtodos inmunolgicosLas tcnicas serolgicas siguen siendo una herramienta de gran valor en el diagnstico de las micosis profundas, para la deteccin de antgenos o anticuerpos.Estos ensayos, hansido aplicados en el diagnostico e identificacin rpida de hongos con el uso de anticuerpos monoclonales o monoespecificos por ensayos de Inmunodifusin Doble, inmunofluorescencia, aglutinacin, ELISA e inmunoperoxidasa. Hoy en da disponemos de pruebas comerciales rpidas y de fcil ejecucin como Bicholatex Albicans y Krusei color (Francia), consistentes en partculas de latex sensibilizadas con anticuerpos monoclonales que reaccionan en forma especifica con antgenos de superficie de lalevadura. Otras tcnicas tambin estn disponibles en el mercado para diagnstico e identificacin rpida del agente causal.

Biologa molecular, y otros como son estudios quimiotaxonmicos.Son herramientas de alto potencial tanto para el diagnstico como para la identificacin y clasificacin taxonmica de microorganismos. Estos ensayos estn basados en el anlisis de secuencias de ADN genmico, con el uso de secuencias cortas especficas de oligonucletidos con tcnicas de PCR y PCR-EIA. Mtodos ms avanzados estn siendo realizados en formatos miniaturizados, donde se ensayan en una sola reaccin secuencias de ADN o de pptidos para diagnstico, identificacin y evaluacin de otros aspectos biolgicos del microorganismo.

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