A.C.C.A

A.C.C.A2014

B

(Anlisis, control de calidad alimentaria) A.M.J

Empresa: //////No. De identificacin de laboratorio: 5333No. De control: 158PRESENTE:Identificacin: identificacin de salmonellaInformacin de la muestra: Muestra tomada por personal del laboratorio de un quesillo artesanalFecha de muestreo: 01 de julio del 2014 Hora de muestreo: 01:00 Hrs.Fecha de obtencin resultados: 04 de julio 2014 Hora de muestreo: 15:00Hrs.Temperatura de muestreo: Ambiente

Aislamiento de Salmonella spp. a partir de alimentos.MxDeterminacin TcnicaRX

Quesillo artesanalDe Salmonella spp. Aislamiento de Salmonella spp. a partir de alimentos (extensin en superficie).Negativo

NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-114-SSA1-1994, BIENES Y SERVICIOS. MTODO PARA LA DETERMINACIN DE SALMONELLA EN ALIMENTOS.

Observaciones: la muestra analizada, est dentro de la NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-114-SSA1-1994 puesto que no se encontr la presencia de Salmonella.

Responsables:

Antony Rosales Martnez Mayra Mora Snchez

Jos Abdn Lpez godos

SalmonellaLos miembros del gnero Salmonella han sido muy estudiados como patgenos cuando se encuentran presentes en los alimentos. El control de este microorganismo, tanto por parte de las autoridades sanitarias, como en las plantas procesadoras de alimentos, depende en cierta medida del mtodo analtico utilizado para su deteccin.Este microorganismo fue inicialmente identificado en muestras clnicas y los mtodos empleados para estos casos se adaptaron posteriormente para su deteccin en alimentos. Las modificaciones a los mtodos consideraron dos aspectos principales, el primero es el debilitamiento o dao a las clulas bacterianas presentes en un alimento, debido al proceso a que est sujeto (por ejemplo: tratamiento trmico, secado, etc.) y segundo, la variabilidad inherente a la naturaleza del producto bajo estudio.Para diversos alimentos existen diferentes protocolos para el aislamiento de Salmonella, todos ellos son esencialmente similares en principio y emplean las etapas de preenriquecimiento, enriquecimiento selectivo, aislamiento en medios de cultivo selectivo y diferencial, identificacin bioqumica y confirmacin serolgica de los microorganismos. FundamentoCaldo lactosado (medio de preenriquecimiento)Es un medio rico en nutrientes, y no contiene inhibidores del crecimiento bacteriano. El extracto de carne y la peptona, son la fuente de carbono y nitrgeno, mientras que la lactosa es el hidrato de carbono. Por la fermentacin de la lactosa, se produce cido y gas, y ste ltimo se demuestra al usar las campanas Durham.Se lo usa tambin como medio de preenriquecimiento, porque permite recuperar clulas injuriadas, diluye sustancias txicas o inhibitorias y favorece el desarrollo de Salmonella con respecto a otras bacterias.Frmula (en gramos por litro)Instrucciones

Extracto de carne3.0Suspender 13 g por litro de agua destilada. Mezclar bien y distribuir en tubos con campanitas de Durham. Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121C.

Peptona5.0

Lactosa5.0

pH final: 6.9 0.2

Caldo tetriationato (medio de enriquecimiento)El medio de cultivo contiene peptona que provee los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano, y carbonato de sodio que neutraliza y absorbe metabolitos toxicos. La selectividad est dada por la presencia de tiosulfato de sodio, tetrationato (generado en el medio por el agregado de la solucin iodo-iodurada) y sales biliares, los cuales permiten el desarrollo de bacterias que contienen la enzima tetrationato reductasa, como ser la Salmonella spp. e inhiben el desarrollo de la flora acompaanteFrmula (en gramos por litro)Instrucciones

Peptona5.0Suspender 46 g del polvo en 1 litro de agua destilada. Mezclar vigorosamente y llevar a ebullicin. Enfriar a 45C o menos. Agregar 20 ml de solucin iodurada. Mezclar y distribuir 10 ml por tubo, en tubos estriles. No debe calentarse luego de agregar la solucin iodada. El medio base puede mantenerse a 4C , dura varios meses, pero una vez agregada la solucin iodada debe usarse en el mismo da.

Sales biliares1.0

Carbonato de calcio10.0

Tiosulfato de sodio30.0

pH final: 8.4 0.2

Solucin iodo iodurada

Iodo6.0

Ioduro de potasio5.0

Agua20.0

Agar TSI (identificacin bioqumica)En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, aportan los nutrientes adecuados para el desarrollo bacteriano. La lactosa, sacarosa y glucosa son los hidratos de carbono fermentables. El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la produccin de cido sulfhdrico, el sulfato de hierro y amonio, es la fuente de iones Fe3+, los cuales se combinan con el cido sulfhdrico y producen sulfuro de hierro, de color negro. El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el balance osmtico. Por fermentacin de azcares, se producen cidos, que se detectan por medio del indicador rojo de fenol, el cual vira al color amarillo en medio cido. El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrgeno el que reacciona luego con una sal de hierro proporcionando el tpico sulfuro de hierro de color negro.Frmula (en gramos por litro)Instrucciones

Extracto de carne3.0Suspender 62,5 g del polvo por litro de agua destilada. Mezclar bien y calentar con agitacin frecuente, hervir 1 o 2 minutos hasta disolucin total. Llenar hasta la tercera parte de los tubos de ensayo. Esterilizar a 121C por 15 minutos. Enfriar en pico de flauta profundo.

Pluripeptona20.0

Cloruro de sodio5.0

Lactosa10.0

Sacarosa10.0

Glucosa1.0

Sulfato de hierro y amonio0.2

Tiosulfato de sodio0.2

Rojo de fenol0.025

Agar13.0

pH final: 7.3 0.2

Agar verde brillante (aislamiento de salmonella)En el medio de cultivo, la pluripeptona y el extracto de levadura, constituyen la fuente de nitrgeno, vitaminas y minerales. La lactosa y la sacarosa son los hidratos de carbono fermentables, el rojo fenol es el indicador de pH, que vira al amarillo cuando hay produccin de cido a partir de la fermentacin de azcares, el cloruro de sodio mantiene el balance osmtico, y el verde brillante acta como agente selectivo.Frmula (en gramos por litro)Instrucciones

Pluripeptona10.0Suspender 58 g de polvo por litro de agua destilada. Reposar 5 minutos y mezclar calentando a ebullicin durante 2 o 3 minutos. Distribuir y esterilizar en autoclave a 118-121C durante 15 minutos. Secar la superficie del medio por unos minutos en la estufa.

Extracto de levadura3.0

Cloruro de sodio5.0

Lactosa10.0

Sacarosa10.0

Rojo fenol0.08

Verde brillante0.0125

Agar20.0

pH final: 6.9 0.2

Agar LIA En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura aportan los nutrientes para el desarrollo bacteriano. La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, y la lisina es el sustrato utilizado para detectar la presencia de las enzimas decarboxilasa y deaminasa. El citrato de hierro y amonio, y el tiosulfato de sodio, son los indicadores de la produccin de cido sulfhdrico. Por decarboxilacin de la lisina, se produce la amina cadaverina, que alcaliniza el medio y esto produce el viraje del indicador al color violeta. La decarboxilacin de la lisina, tiene lugar en medio cido, por lo que es necesario que la glucosa sea previamente fermentada.Las cepas de los gneros Proteus, Providencia y algunas cepas de Morganella, desaminan la lisina, esto produce un cido alfa-ceto-carbnico, el cual, con la sal de hierro y bajo la influencia del oxgeno forma un color rojizo en la superficie del medio.LIAFrmula (en gramos por litro)Instrucciones

Peptona de gelatina5.0Suspender 35 g del medio deshidratado en un litro de agua destilada. Dejar embeber unos 15 minutos. Calentar cuidadosamente, agitando con frecuencia y hervir durante un minuto hasta la disolucin completa. Distribuir y esterilizar a 121C durante 15 minutos. Enfriar en pico de flauta dejando un fondo vertical apto para la puncin.

Extracto de levadura3.0

Glucosa1.0

Lisina10.0

Citrato de hierro y amonio0.5

Tiosulfato de sodio0.04

Prpura de bromocresol0.02

Agar15.0

pH final: 6.7 0.2

MEDIO MIOPor su composicin, es posible detectar 3 reacciones en un mismo tubo: movilidad, presencia de ornitina dexcarbocilasa e indol. La movilidad se demuestra por un enturbiamiento del medio o por crecimiento que difunde mas all de la lnea de inoculacin.La reaccin positiva a la ornitina est dada por un color prpura del medio. Debido a la fermentacin de la glucosa se reduce el pH produciendo una condicin cida y originando que el indicador de pH prpura de bromocresol vire al amarillo. La presencia de acidez, otorga condiciones ptimas para la actividad de la enzima ornitina decarboxilasa, la cual decarboxila la ornitina presente. Por decarboxilacin, se alcaliniza el medio, con el consecuente viraje del indicador hacia el color prpura.El indol, es producido a partir del triptofano por los microorganismos que contienen la enzima triptofanasa. El desarrollo de un color rojo luego de agregar unas gotas de reactivo de Kovacs o de Erlich, indica un resultado positivo.Frmula (en gramos por litro)Instrucciones

Dextrosa1.0Suspender 31 g del polvo en un litro de agua destilada. Calentar a ebullicin hasta completa disolucin. Distribuir en tubos y esterilizar 15 minutos a 121C.

Extracto de levadura3.0

Peptona10.0

Triptena10.0

Clorhidrato de L-ornitina5.0

Agar2.0

Prpura de bromocresol0.02

pH final: 6.5 0.2

Diagrama de proceso:Inicio

20g. de Quesillo 180ml. Caldo Lactosado (previamente preparado)

sdSDadsadasdasdsadassaasfaSerologaIncubar a 35C/24hrs. 3Realizar las pruebas bioqumicas TSI, LIA y MIOSNoFinIncubar a 35C/24hrs. 3Hubo presencia de salmonella?Del inculo, se debe estriar de forma cruzada en el Agar verde brillanteIncubar a 35C/24hrs. 3Incubar a 43C/24hrs. 3Poner 1ml. de la mezcla al Caldo TetrationatoPasar la mezcla al frasco (donde estaba el caldo)Colocar en una bolsa esterilizada la muestra y el caldo. Homogenizar en el stomacher (60seg,)

Fin

NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-114-SSA1-1994, BIENES Y SERVICIOS. MTODO PARA LA DETERMINACIN DE SALMONELLA EN ALIMENTOS.Objetivo y campo de aplicacin Esta Norma Oficial Mexicana establece un mtodo general para la determinacin de Salmonella en alimentos. Esta Norma Oficial Mexicana es de observancia obligatoria en el territorio nacional para las personas fsicas y morales que requieran efectuar este mtodo enproductos nacionalesy de importacin para fines oficiales.FundamentoLa presente tcnica para la deteccin de Salmonella en alimentos, describe un esquema general que consiste de 5 pasos bsicos: Preenriquecimiento, es el paso donde la muestra es enriquecida en un medio nutritivo no selectivo, que permite restaurar las clulas de Salmonella daadas a una condicin fisiolgica estable. Enriquecimiento selectivo, empleado con el propsito de incrementar las poblaciones de Salmonella e inhibir otros organismos presentes en la muestra. Seleccin en medios slidos, en este paso se utilizan medios selectivos que restringen el crecimiento de otros gneros diferentes a Salmonella y permite elreconocimiento visualde colonias sospechosas. Identificacin bioqumica, este paso permite la identificacin genrica de los cultivos de Salmonella y la eliminacin de cultivos sospechosos falsos. Serotipificacin, es una tcnica serolgica que permite la identificacin especfica de un cultivo.Esta norma se complementa con la siguiente Norma Oficial Mexicana:NOM-109-SSA1-1994 Procedimiento para la toma, manejo y transporte de muestras de alimentos para su anlisis microbiolgico.*DefinicionesPara fines de esta norma se entiende por: Deteccin de Salmonella: determinacin de la presencia o ausencia de estos microorganismos en una masa determinada de producto, cuando las pruebas se llevan a cabo de acuerdo con esta norma. Salmonella: microorganismo patgeno perteneciente al grupo de Enterobacterias. Bacilo gram negativo, aerobio, no esporulado que forman colonias tpicas en medios selectivos slidos y que presentan adems las caractersticas bioqumicas y serolgicas descritas cuando los procedimientos se efectan de acuerdo con esta norma.

Aislamiento de SalmonellaExaminar las placas para investigar la presencia de colonias tpicas de Salmonella, de acuerdo con las siguientes caractersticas:Agar XLD: colonias rosas o rojas que pueden ser transparentes con o sin centro negro. En algunos casos las colonias pueden aparecer completamente negras.Agar VB: colonias rojas o rosas que pueden ser transparentes rodeadas por medio enrojecido; las bacterias fermentadoras de la lactosa dan colonias amarillas.Agar entrico Hektoen: colonias verdes o azulverdes con o sin centro negro. En algunos casos las colonias pueden aparecer completamente negras.Agar Sulfito de Bismuto: las colonias tpicas de Salmonella pueden ser cafs, grises o negras; con o sin brillo metlico. Generalmente el medio circundante (halo) es caf, tornndose posteriormente negro. Algunas cepas producen colonias verdes sin la formacin del halo oscuro. Si las placas no muestran colonias tpicas o no se observa crecimiento, incubar 24 h adicionales.Agar SS: colonias translcidas, ocasionalmente opacas. Algunas colonias dan centro negro. Las colonias fermentadoras de la lactosa son rojas.Identificacin bioqumicaObservar el crecimiento en los tubos y considerar presuntivamente positivas para Salmonella las colonias que den las siguientes reacciones: Agar TSI, en el fondo del tubo se observa vire del indicador debido a la fermentacin de la glucosa; en la superficie del medio se observa un color rojo ms intenso que el medio original debido a la no fermentacin de la lactosa ni de la sacarosa. En la mayora de los casos se observa coloracin negra a lo largo de la puncin debido a la produccin de cido sulfihdrico. Agar LIA, se observa intensificacin del color prpura en todo el tubo por la descarboxilacin de la lisina. Considerar negativos aquellos cultivos que produzcan claramente color amarillo en el fondo del agar. La mayora de las cepas de Salmonella producen cido sulfihdrico en este medio con ennegrecimiento a lo largo de la puncin. Retener todos los cultivos que muestren las reacciones caractersticas de Salmonella en los medios TSI y LIA para las pruebas adicionales.Los cultivos con TSI que no parecen de Salmonella pero que presentan reacciones en LIA tpicos, deben trabajarse como cultivos presuntivos positivos, ya que en estos casos, el medio LIA permitir detectar S. arizonae y cepas atpicas de Salmonella que utilicen lactosa o sacarosa. Descartar solamente los cultivos que muestren reacciones atpicas en ambos medios.Continuar el anlisis a partir de los tubos de TSI con reacciones tpicas. Si el cultivo presenta reacciones atpicas en este medio, tomar colonias adicionales de las placas de donde se obtuvo el cultivo atpico anterior y sembrar las pruebas bioqumicas nuevamente.Continuar la identificacin bioqumica y serolgica a partir de los cultivos recuperados de TSI. Se recomienda trabajar seis cultivos por cada 25 g de unidad analtica seleccionando colonias procedentes de ambos medios de enriquecimiento. Prueba de ureasaPrueba de ureasa (convencional). Con una asa estril, tomar crecimiento del cultivo presumiblemente positivo de cada tubo de medio TSI e inocular tubos de caldo urea. Utilizar un control de medio para comparar el vire prpura de las reacciones positivas con el color del medio original. Incubar 24 2 h a 35C. Prueba de ureasa (rpida). Tomar dos asadas de crecimiento del cultivo presumiblemente positivo de cada tubo de medio TSI e inocular tubos de caldo urea (rpida). Incubar 2 h a 37 0,5C en bao de agua.Descartar todos los cultivos que den ureasa positiva. Retener los cultivos que den la prueba negativa (sin cambio de color del medio).Identificacin serolgicaLa prueba positiva resulta cuando se presenta aglutinacin en la gota con el cultivo y el antisuero y no aglutinacin en la gota que contiene el cultivo y la solucin salina.Si se observa aglutinacin en ambas gotas, la prueba no es definitiva y se debe continuar con las pruebas bioqumicas complementarias. Cuando la aglutinacin es positiva con el suero polivalente O, puede determinarse el subgrupo empleando antisueros para los diferentes subgrupos (los grupos B, C, D y E, suelen ser los ms frecuentes). Si se requiere, practicar el ensayo de los antgenos flagelares de Salmonella (Antisuero polivalente H). Pruebas bioqumicas complementarias

Resultados:

Quesillo artesalCon el analisis obtenido se concluye: a buena calidad sanitaria del queso Las buenas condiciones higinicas de las materias prima. Una buena manipulacin durante el proceso del queso analizado. Por lo tanto local quesillo artesanal cumple con la norma establecida. En el agar verde brillante se determin ausencia de salmonella en la placa estriada. ausencia de salmonella en 20gr de muestra de quesillo artesanal.

ConclusionesCon esta prctica pudimos verificar si hubo presencia de salmonella en el quesillo por lo cual no la hubo (Prueba NEGATIVA) eso nos indica que el quesillo est libre de esta bacteria y lo podemos consumir sin preocuparnos de que se presenten los sntomas de la bacteria de salmonella.

BIBLIOGRAFIAYabar Villanueva Emilio Fredy. 2005. Microbiologa de alimentos. Criterios microbiolgicos de calidad sanitaria e inocuidad para los alimentos y bebidas de consumo humano. Facultad de Ingeniera en Industrias Alimentarias. Universidad Nacional del Centro del Per Viana Cmara Snia Aparecida. S.f. Curso de Farmcia. Microbiologia de alimentos. Microorganismos indicadores. INAL (Instituto Nacional de Alimentos).2004. Gua de Interpretacin de Resultados Microbiolgicos de Alimentos ANMAT. Administracin Nacional de Medicamentos, Alimentos y Tecnologa Mdica. Disponible en www.analizacalidad.com/ arm2004-4.pdf