rna
TRANSCRIPT
- 1
-
CAPITULO 15. ESTRUCTURA DEL RNA 15.1 Estructura primaria 15.2 Estructura secundaria 15.3 Duplexes híbridos ADN-ARN 15.4 ARN de transferencia (estructura secundaria y terciaria) 15.5 Interacciones aparareamiento codón-anticodón
- 2
-
15.1 ESTRUCTURA PRIMARIA DEL ARN
El RNA es una cadena nucleotídica formada por enlaces fosfodiester 5’->3’.
Esto es, algo identico a lo que se tenía en el ARN. La diferencia fundamental, a parte de
la existencia de uridina en lugar de timidina, es la existencia de ribosa, en lugar de 2’-
deoxyribosa. La existencia de un grupo OH en 2’ abre una posibilidad nueva. Esto es,
porque no es el enlace fosfodiester 5’->2’, en lugar de 5’->3’?. La primera respuesta
que se nos puede ocurrir es que el enlace fosfodiester es más estable en 3’ que no en 2’.
Esto es falso, se ha visto experimental, y teóricamente que la unión 5’->2’ es incluso
más estable que la 5’->3’ y que puede formar hélices como las uniones 5’->3’. Por que
entonces es el enlace 5’->3’ el que existe in vivo?. La verdad no se sabe muy bien, pero
se especula que pueda ser un efecto evolutivo ligado al hecho de que las uniones 5’->2’
tienen una tendencia superior a formar hélices de orden superior (p.ej triples hélices)
que las que tienen los enlaces 5’->3’ standard.
Señalar que recientemente se han encontrado polímeros de RNA con unión 5’-
>2’. Un ejemplo es el 5’->2’ polyA RNA (3 a 8 A) que se da catalizado por la proteína
interferón. El interferón sabéis que es una molécula proteica que se da como respuesta a
la infección vírica, y que es responsable de la defensa antiviral del organismo. La
síntesis del fragmento poliA (5’->2’) induce una “interferón-induced ribonuclease” que
es la que rompe y degrada el RNAm vírico. Es decir, que el enlace 5’->2’ no es el más
abundante, pero es teóricamente posible, y biológicamente relevante.
La similitud estructural a nivel de estructura primaria del RNA y el RNA es muy
elevada, y los cambios de propiedades debido al cambio ribosa->deoxyribosa y T->U
son pequeños. De hecho las diferencias de secuencia más relevantes entre RNA y DNA
es que la presencia de bases anómalas (no codificantes) en el ARN es mucho más
abundante que no en el DNA, especialmente en lo que hace referencia al RNA(t).
- 3
-
15.2 ESTRUCTURA SECUNDARIA DEL ARN
La presencia del grupo 2’-OH introduce pequeñas modificaciones en la
preferencia conformacional del azúcar, pero suficiente para que prevalezca la
conformación C3’-endo (zona Norte), como ya se discutió en el capítulo anterior. De
hecho, el puckering de la ribosa en el RNA es más rígido que el correspondiente de la
2’deoxy-ribosa en el RNA y prácticamente el 100% de la población está en regiones
Norte, sin población apreciable de regiones E y menos aún W. Los enlaces glycosidicos
están en conformación anti.
La conformación global del RNA se adapta muy bien a lo que conocemos como
conformación A. De hecho, la estructura del A-RNA es muy parecida a la del A-DNA,
con forma de doble hélice y apareamientos del tipo Watson-Crick. Disposición general
de la hélice, surcos,..., son idénticos a los que se tenían en el A-DNA. En condiciones de
alta fuerza iónica la forma A cambia a una formar denominada A’, esta es un hélice aún
más compacta que la hélice A, ya que tiene 12 pares de bases por vuelta de hélice.
El RNA aparece in vivo como una cadena sencilla, por lo que para adoptar
estructuras de doble cadena debe replegarse sobre el mismo y seleccionar el trozo
complementario que le de máxima estabilidad. Es por ello que en la estructura del RNA
encontramos hairpins, regiones hairpins alternados, bulges, internal loops y todo tipo de
estructuras anómalas comentadas más adelante. De hecho, predecir la estructura
secundaria del RNA es difícil, porque para un fragmento largo como es el RNA(m) hay
muchos posible marcos de formación de duplexes y no es trivial determinar cual es el
que ha usado el RNA(m). El RNA tiene además tendencia a formar estructuras 3-D muy
fijas, lo que le permite tener una serie de funcionalidades propias de proteínas (p.ej el
RNA ribosomal, RNA de transferencia o los ribozimas). En este tipo de estructuras
complejas juegan un papel clave los pseudoknots que son los que en muchos caos nos
delimitan los giros y empaquetamientos de las estructuras (véase capítulo anterior).
- 4
-
Figura 1. Estructura tipo A característica de un RNA.
También señalar que se ha detectado la presencia de RNA en triples hélices, se
han descrito sobre todo en motivos pirimidina y parecen tener una estructura similar a
las de DNA, aunque aún no hay ninguna descripción a alta resolución de las mismas.
Una característica interesante que diferencia a nivel de estructura secundaria a
DNA y RNA es su flexibilidad. El DNA en la forma B es mucho más flexible que el
RNA o el DNA en la forma B. Por ejemplo, lo que tenéis en la Figura 1 es un
histograma de las poblaciones de diversas conformaciones de propeller twist en
estructuras de A-DNA (izq), B-DNA (centro) y RNA. Los pefiles se han ajustado a
Gaussianas normalizadas y podéis ver como es mucho más ancho el perfil para el B-
DNA que para el A-DNA o el RNA.
- 5
-
Figura 1. Representación en histograma de la población de propeller twist en estructuras
de A-DNA, B-DNA y RNA resueltas por rayos X y depositadas en PDB.
Lo mismo se ve cuando se realizan dinámicas moleculares de DNA y en RNA.
Esto lo podéis ver por ejemplo en las Figura 2 y 3 donde se han representado las
poblaciones de “inclination” y “twist” que eran visitadas por B-DNA y RNA en una
dinámica de 10 ns de d(GCGCAATTGCGC)2 y r(GCGCAAUUGCGC)2.
Figura 2. Perfil de inclination visitado durante MD para RNA (gráfica de la
izquierda) y DNA (derecha).
- 6
-
Figura 3. Perfil de twist visitado durante MD para RNA (gráfica de la izquierda)
y DNA (derecha).
15.3 DUPLEX DNA-RNA
El DNA y el RNA pueden formar duplexes (una hélice DNA, otra de RNA).
Estas estructuras tienen una enorme importancia en la vida de la célula.
i) Se forman cuando la transcriptasa reversa forma DNA a partir de RNA.
ii) Cuando la RNA polimerasa forma RNAm a partir de DNA.
iii) Se forman durante la replicación de los primers en los fragmentos de Okazaki.
La estructura del híbrido DNA-RNA es la de una doble hélice con las
características generales de un A-RNA, o del A’-RNA. Típicamente se detectan 11-12
pares de bases por vuelta de hélice. Parece que no todos los azucares se encuentran en
conformación N, sino que al menos una parte de las deoxyribosas de la cadena de DNA
se encuentran en conformación S o E. Los complejos DNA-RNA son muy estables, de
hecho más estables incluso que los DNA-RNA Esta gran estabilidad también se intenta
- 7
-
aprovechar con fines terapeúticos en estrategías de RNA-antisense (Figura 3). La idea
es similar a la comentada más arriba para los antigene, pero ahora atacando
directamente el RNAm. De hecho, la estrategia antisense saca ventaja de la existencia
de un enzima la H-RNAase que degrada los híbridos DNA·RNA, rompiendo la cadena
de RNA, pero no la de DNA. Este enzima protege a la célula de la formación de
complejos no productivos de RNA y resulta muy útil en terapia antisense porque
degradaría el RNAm diana manteniendo el DNA foráneo que hemos añadido, lo que
produciría que este DNA actuara como catalizador de la degradación.
Figura 4. Esquema de la terapia antigene y antisense.
La pega de todas estas estrategias “antisense” son varias, y muchas de ellas
comunes con las estrategias anti-sense. Primero, no es fácil que el fragmento de DNA
pase la membrana; segundo: el DNA se degrada con facilidad dentro de la célula;
tercero no es siempre fácil seleccionar el trozo de RNA(m) diana del híbrido; por último
no es simple hacer estable en sangre el RNA. Existe en la actualidad un enorme
esfuerzo tendente a generar RNA resistentes, y con mejor biodisponibilidad para ello se
modifican los extremos 5’ y 3’ (punto de ataque de muchas nucleasas), y también se
- 8
-
intenta crear RNA donde los fosfatos se sustituyen por otros grupos. Paralelamente se
está trabajando mucho en el desarrollo de métodos teóricos de predicción de estructura
secundaria del RNA que nos permitan determinar la mejor región para formación del
híbrido.
En los últimos 2 años ha surgido una nueva estrategia antisense que parece
tremedamente prometedora y con la que se consiguen bloquear todalmente la expresión
de genes (knock-out). Se denomina RNA de interferencia y se basa en inyectar en la
célula pequeños trozos de RNA de cadena doble complementaria una de ellas a un
fragmento del RNA que se quiere inhibir. El mecanismo de funcionamiento del RNA(i)
se desconoce cuando he redactado esto (2003), pero está claro que involucra un número
elevado de enzimas.
15.4 RNA DE TRANSFERENCIA
Es uno de los RNA in vivo de los que se conoce su estructura secundaria y
terciaria. Existen numerosos tRNA lógico si pensamos en los aminoácidos diferentes
que estos tienen que transportar. No obstante, todos ellos tienen una estructura general
común que es lo que explica que puedan integrarse en un proceso común: la síntesis de
proteínas.
Estructura Secundaria
En la actualidad se habla de familias de tRNA todas ellas son en general similares, con
pequeñas diferencias en algunas zonas. La forma general se ha asimilado a una hoja de
trébol. En él distinguimos:
• El aceptor stem (tallo). Tiene 7 pares de bases y termina en el sitio de unión
del aminoácido que es SIEMPRE el triplete 5’-CCA-3’ donde el extremo 3’
(A) esta con el 3OH’ sin fosforilar. Ese será el punto de unión del
aminoácido.
- 9
-
• El T-stem de 5 pares de bases que termina en el T-loop un lazo donde no se
forma la doble hélice.
• El “extra loop” o “variable loop” que es un fragmento muy variable de un
RNA(t) a otro, varia en longitud (de 3 a 21 nucleótidos) y composición.
• El “D-stem” tiene entre 3 y 5 pares de bases y termina en el “D-loop” que
tiene una longitud variable de 7 a 11 nucleótidos.
• Finalmente el “anticodon stem” tiene 5 pares de bases y acaba siempre en el
anticodon loop donde están las 3 bases del codón que reconocen al triplete
(codón) de bases del RNA(m).
Figura 5. Estructura del RNA(t)
- 10
-
Algunas características son comunes a los diferentes tRNA como es la estructura
secundaria común o la presencia de bases no codificantes como pseudouridina o
dihydrouridina. También el tamaño es relativamente constante (entre 74 y 95), lo que
contrasta con el resto de los ácidos nucleicos. Son comunes en los diferentes tRNA la
lóngitud del tallo aceptor y anticodón, y gran parte de la secuencia del loop T (también
llamando pseudoruidine loop). Otros detalles tales como el tamaño del D stem
(dihydrouridine stem), el tamaño del loop estra, y la composición concreta del
dehydrouridine loop varían de una familia a otra. La diferencia de tamaño entre
diferentes RNAs se debe a los nucleótidos extras en el D-loop y stem, así como en el
extra loop.
Todos los tRNA tienen una serie de nucleótidos comunes. Así, todos tienen en
el extremo 3’ la secuencia ----CCA sin fosfato en el extremo (3’). El hidroxilo no
esterificado del extremo 3’ será el que se une a un aminoácido. Destacar, que aparte de
estos existen otros nucleótidos constantes, sobre todo los vitales para mantener la
estructura terciaria del RNA que como se puede observar ya en la Figura 5 es muy
definida.
Por último comentar que el RNA(t), al igual que los RNA(m) se procesa
eliminándose fragmentos de cadena (splicing) y produciéndose otras modificaciones.
Por ejemplo, el extremo CCA solo se inserta después del procesado del RMA(t), antes
era UU. Es decir que los RNA(t) tal como hemos descritos son RNA(t) maduros, justo
los que hacen su función biológica.
Estructura terciaria del tRNA
El tRNA se repliega en el espacio dando una estructura terciaria en forma de L, que es
estabilizada por interacciones de stacking entre las bases, interacciones de van der
Waals, y puentes de hidrógeno, básicamente del tipo Hoogsteen. Nota: estos puentes de
hidrógeno son entre zonas alejadas de la cadena, no confundirlos con los A:U, o G:C
que son de tipo Watson-Crick, y que son los que forman la estructura secundaria. De
- 11
-
hecho, el RNA(t) tiene una enorme cantidad de pares no canónicos (véase Figura 6).
Señalar finalmente que interacciones de grupos fosfatos y de grupos 2-OH’ parecen
colaborar también a la estabilización, por ejemplo con interacciones del tipo 2-OH’---
N(Ade).
Figura 6. Esquemas de algunas de las interacciones existentes en RNA(t).
Como consecuencia de todo el conjunto de interacciones comentado el tRNA
adopta una estructura terciaria muy compacta y estable, pero con un grado de
flexibilidad y de variabilidad conformacional dependiente de la secuencia, que es la que
le posibilidad de ejercer las diversas funciones biológicas (recordar que cada Aa se
reconoce por un tRNA diferente).
- 12
-
15.5 INTERACCIONES CODON-ANTICODON
EL tRNA debe “cargar” un aminoácido que es el que se corresponde con su
codón. Existen 20 aminoácidos, y entre 60 y 70 tRNA, luego existirán varios tRNA que
llevan el mismo aminoácido. Esto es lo que se deriva de la degeneración del código
genético (Figura 7).
.
Figura 7. Esquema del código genético usual
La reacción de adición de un aminoácido a un tRNA se realiza por medio de la
acilación en el extremo 3’ (el CCA-OH). Esta reacción esta catalizada por la aminoacil
acil transferasas. Existen unas 20 diferentes amonoacil acil transferasas, tantas como
diferentes aminoácidos. Estos enzimas cuentan con al menos 2 dominios, uno “lee” el
- 13
-
anticodon y el otro el aminoácido. Tienen que ser muy específicos en cargar el Aa
porque sino el error puede ser muy grave y pensad que no es trivial distinguir un
aminoácido de otro (pensar por ejemplo en Leu, Ile, Val.,...). Por eso estos enzimas
tienen un mecanismo de doble lectura. Por ejemplo en la primera lectura miran que el
residuo no sea más grande de la cuenta, y en la segunda que no sea más pequeño. El
caso es que consiguen un nivel de fiabilidad muy elevada.
El mecanismo de acilación sugerido para el enzima se muestra en la Figura 8 y consta
de: i) reacción con ATP, ii) El aminoácido activado por el ATP interacciona con el OH
libre en el extremo 3’ de la adenosina final del tRNA.
Figura 8. Esquema de la unión de un aminoácido al RNA(t).
Una vez tenemos cargado el tRNA con el aminoácido que corresponde, el tRNA
debe ser capaz de reconocer el triplete de bases del RNam (codon). Como ya sabéis eso
se realiza dentro del complejo sistema del ribosoma y será un tema que os explicarán
- 14
-
con gran detalle en otra asignatura (véase Figura 9). Básicamente la idea es de ir
poniendo el nuevo RNA(t) cargado en contacto con el péptido que se esta sintetizando.
Eso facilitará la formación del enlace peptídico y la liberación del RNA descargado. El
proceso seguirá hasta que llegue un codon de finalización UAA, UAG y UGA que no
tiene RNA(t) cargado y eso producirá la liberación del péptido y la disociación del
polisoma.
Figura 9. Esquema de la síntesis de proteínas en un ribosoma.
- 15
-
El reconocimiento codón-anticodón (3 bases mRNA con 3 bases del tRNA) se
da por medio de puentes de hidrógeno:
Los 2 primeros nucleótidos forman interacciones muy específicas tipo Watson-
Crick. El apareamiento del tercer nucleótido es más flexible y no siempre es Watson-
Crick. Además es posible que el tercer nucleótido del codon llegue a aparearse con un
nucleótido que no es complementario. Esto es totalmente coherente con el caracter del
código genético, donde existen diversos codones que codifican para el mismo
aminoácido (véase Figura 7).