metabolismo de rna
TRANSCRIPT
METABOLISMO DEL RNA
Introducción.-
•Expresión de la información genética:
DNA (templado) transcripción RNA.
•RNA ~ DNA; OH 2´ y U x T, hebra simple.
•RNA hebra simple se pliega sobre si misma con más diversidad estructural que el DNA
•Interviene en almacenamiento, transmisión de la información y catálisis.
•Excepto algunos genomas virales, todos los RNAs derivan de la información permanentemente almacenada en DNAs.
•En la transcripción, un sistema de enzimas transfiere la información contenida en la doble hebra del DNA a una hebra de RNA con secuencia complementaria a una de las hebras.
•Tres RNAs:
mRNA codifica la secuencia de AA de uno ó más polipéptidos especificado por uno ó un set de genes. tRNA lee la información codificada en el mRNA y transfiere el AA indicado
rRNA constituyente de los ribosomas.
Otros RNAs tienen funciones catalíticas o regulatorias o son precursores de otros RNAs.
•La transcripción es más selectiva (en la replicación se copia todo el cromosoma), genes particulares o grupos de genes en un determinado tiempo,
Regulación
Algunas porciones del genoma, nunca son transcritas.
La célula restringe la expresión genética a la formación de productos necesarios en un momento particular.
•Secuencias regulatorias específicas marcan el inicio y el final del segmento de DNA que se transcribe y designan que hebra de DNA va a ser usada como templado.
Revisaremos:
•Síntesis de RNA de un DNA templado
•Procesamiento post-sintético y turnover de RNA
•RNA como templado de DNA
Síntesis de RNA dependiente de DNA.-
Transcripción Vs. Replicación:
Similitudes : mecanismo químico, polaridad, uso de templado, fases de: iniciación elongación y terminación.
Diferencias: no requiere primer, limitada a segmentos de una molécula de DNA.
El RNA es síntetizado por la RNA polimerasa.-
Se le descubre por el 1960, la RNA polimerasa dependiente de DNA. Requiere de un DNA templado, 4 Nu (A,T,G,U) y Mg++, une Zn ++.
El mecanismo ~ DNApol, RNA pol elonga una hebra de RNA por adición de Nu a un extremo OH 3´, en sentido 5´-3´.El nucleófilo OH 3´, ataca el Pα, del NuTP que se va a incorporar, liberandose PPi
(NMP)n + NTP RNA polimerasa (NMP)n+1 + PPi
La transcripción ocurre por apareamiento de bases en una burbuja de de DNA abierto
La RNA pol require DNA y es más activa cuando se une a DNA de doble hebra,Solo una hebra sirve como templado que es copiado en sentido 3´- 5´, ( antiparalela a la nueva hebra de RNA).
C/Nu es incorporado según la regla de apareamiento de W yC. Se inserta U, que se aparea con A del templado, la geometría del apareamiento de bases determina la selección de bases.
La RNA pol no requiere primer, se une al promotor, El grupo tri-P de primer Nu no es hidrólizado y se mantiene durante la transcripción.
Durante la elongación el extremo en crecimiento del RNA en formación se Mantiene forma temporal como un hibrido DNA -RNA de doble helix (8 bp )
Para permitir la acción de la RNA pol, el DNA duplex debe desenrrollarse sobre una corta distancia formando una burbuja de transcripción (en E. coli 17 bp, un corto hibrido DNA-RNA en la región desenrrollada, la v = 50 a 90 Nu/seg.
Como el DNA es una doble helix, el movimiento de la burbuja de transcripción, requiere de la rotación de la molécula, la rotación esta restricta por la unión de proteínas al DNA, como resultado el movimiento de la RNA pol genera ondas de superenrrollamiento positivo al lado de la burbuja de transcripción y superenrrollamientos negativos por detrás. Los problemas topológicos son aliviados por acción de las topoisomerasas.
Las dos hebras complementarias en el DNA cumplen diferentes roles en la Transcripción, la hebra que sirve como templado se llama hebra templado,La hebra complementaria al templado es la hebra no templado o codante que es idéntica en secuencia al RNA con U en lugar de T.
La hebra que codifica para un gen particular, puede estar localizada en cualquiera de las dos hebras de un cromosoma dado.
Las secuencias regulatorias que controlan la transcripción están por convención designadas en la hebra no templada. Genoma de adenovirus
La RNA pol de E. coli, es un complejo enzimático grande con un core de 5 subunidades (α2ββ´ω; Mr 390,000) y una subunidad σ.
σ se une al core y dirige la enzima a sitios específicos en el DNA, las 6subunidades constituyen la holoenzima de la RNA pol.
La holoenzima de E. coli existe en varias formas dependiendo del tipo de σ, la más común es σ70 (Mr 70,000).
RNA pol carece de actividad proofreading exonuclesa 3´ - 5´ pudiendose generar un error por cada 104 – 105 Nu.
Generalmente se producen muchas copias de RNA de un simple gen y son degradadas y remplazadas por lo que un error en el RNA no tiene tanta consecuencia como un error en el DNA.
Holoenzima de la bacteria Thermus aquaticus
La síntesis de RNA se inicia en los promotores.-
La RNA pol se une a una secuencia específica en el DNA llamada promotor, que dirige la transcripción de segmentos de DNA (genes) adyacentes.
Las secuencias de los promotores son poco variables.
En E. coli la región del promotor se extiende de -70 a +30.del sitio de inicio
Secuencias de promotores reconocidos por σ70 tienen similitudes en dos secuencias cortas ubicadas en las posiciones -10 y -35, estas secuencias son sitios de interacción importantes para la subunidad σ70, aunque las secuencias no son idénticas en todos los promotores bacteriales, ciertos Nu mantienen una posición formando una secuencia de consenso, (recordar en E. coli secuencias de consenso ori C ).
La secuencia de consenso en -10 es 5´ TATAAT 3´ y en -35 es 5´ TTGACA 3´
Un tercer elemento de reconocimiento rico en AT es llamado elemento UP (up stream promotor) se presenta en promotores de ciertos genes que son muy expresados, ubicado entre las posiciones – 40 y – 60, se le une la subunidad σ70 .
La eficiencia de la unión RNA pol con un promotor para iniciar la transcripción esta determinada por estas secuencias, el espaciamiento entre ellas y su distancia del sitio de inicio de la transcripción.
Mutaciones que afectan la función de un promotor a menudo involucran un bp de las regiones -30 ó -10, variaciones en la regiones de consenso afectan la Unión de la RNA pol y la iniciación de la transcripción. El cambio en un solo bp, disminuye el grado de unión en varios ordenes de magnitud.
La secuencia del promotor establece el nivel basal de expresión para genes particulares en E. coli, que pueden variar grandemente de un gen al siguiente.
El inicio de la transcripción consiste de dos etapas principales (con múltiples pasos).
1º RNA pol se une al promotor formando sucesivamente un complejo cerrado(el DNA unido está intacto) y un complejo abierto ( en el cual el DNA se desenrrolla).
2º Se inicia la transcripción en el complejo que conduce a un cambio conformacional que convierte el complejo a la forma de elongación, seguido por el movimiento del complejo de transcripción fuera del promotor (promotor clearence), todos estos pasos pueden ser afectados por la secuencias específica de las secuencias del promotor.
E. coli tiene otros promotores que se unen con la holoenzima de la RNA pol, a través de diferentes factores σ. Ejm. Heat shock proteínas. Los productos de este set genes se producen a elevados niveles cuando las células son agredidas, tal como un incremento de Tº. La RNA pol se une a los promotores de estos genes cuando σ70 es reemplazado con σ32 (Mr 32,000),Que es específica para promotores heat shock proteins.
A través del uso de diferentes factores σ, la célula puede coordinar la expresión de genes que permitan mayores cambios en Función a su estado fisiológico.
La transcripción es regulada.-
El requerimiento del producto de un gen varía con la condición celular o el estado de desarrollo, y la transcripción es regulada para dar productossolo en proporciones necesarias.
La regulación puede producirse en cualquiera de los tres pasos, iniciación elongación o terminación, principalmente en los pasos de unión de la Polimerasa e iniciación de la transcripción.
Las diferencias en las secuencias de promotores son uno de los varios niveles de control.
La unión de proteínas a secuencias cerca o distantes del promotor pueden afectar los niveles de expresión del gen.
La unión de proteínas pueden activar la transcripción facilitando la unión de la RNA pol, o pasos posteriores a lo largo del proceso de iniciación.
También pueden reprimir la transcripción bloqueando la actividad de la Polimerasa.
En E. coli La proteína receptor cAMP (CRP) activa la transcripción, de genes que codifican enzimas que metabolizan azucares diferentes de la glucosa.
Represores son proteínas que bloquean la síntesis de RNA en genes Específicos . Represor Lac, la transcripción de genes para enzima que metabolizan lactosa, están bloqueados cuando no se dispone de lactosa.
La regulación de la síntesis de proteínas en bacterias y eucariotes, está dirigida por la transcripción sobre todo en sus primeros pasos.
Secuencias específicas señalan la terminación de la transcripción
La RNA pol tiene alta procesividad, si libera un transcrito prematuramente no puede reasumir su síntesis.
Al encontrarse con ciertas secuencias en el DNA detiene la síntesis y en algunas termina la transcripción.
En eucariotes el proceso de terminación no es muy conocido, en E coli , 2 tipos de señales:
a) Terminadores independientes de rho, en ellos el RNA transcrito tiene secuencias autocomplementarias que forman un hairpin entre 15 a 20 Nu antes del extremo. Además una corta secuencia de A en el templado que son transcritos como U en el extremo 3’, cuando la polimerasa llega a un sitio terminal con esta estructura, se detiene, el hairpin distorsiona las interacciones entre RNA y RNA pol, disociandose el transcrito.
b) Los terminadores dependientes de rho, carecen de los A repetidos, pero normalmente incluyen una secuencia rica en CA llamada elemento rut (utilización de rho) la proteína rho se asocia con el RNA en un sitio de unión específico y migra en dirección 5’-3’, hasta que el alcanza al complejo de transcripción que esta detenido en un sitio de terminación, aquí contribuye a la liberación del transcrito.
La proteína rho tiene una actividad helicasa dependiente de ATP, que promueve la translocación de la proteína a lo largo del RNA, el ATP es hidrolizado por rho durante el proceso de terminación.
Las células eucarioticas tienen tres clases de RNApol nucleares
La maquinaria eucariotica es más compleja que la bacterial.
Tres complejos distintos, con distinta función, que se unen a una secuencia promotor específico pero con algunas subunidades en común:
RNA pol I transcribe solo el RNA preribosomal que contiene los precursores para rRNAs 18S, 5.8S y 28S. Sus promotores varían mucho su secuencia de una especie a otra.
RNA pol II transcribe mRNAs y algunos RNAs especiales. Reconoce miles de promotores que varían mucho en sus secuencias. Muchos de sus promotores tienen pocas secuencias comunes caja TATA (con la secuencia de consenso TATAAA) cerca del par de bases -30 y una secuencia iniciador Inr cerca del sitio de inicio en +1
RNA pol III transcribe tRNAs, el rRNA 5S y algunos RNAs pequeños especiales. sus promotores están bien caracterizados, algunas de sus secuencias regulatorias del inicio están en el mismo gen, otras convencionalmente antes del sitio de inicio.
La RNApol II requiere de otros factores protéicos para su actividad
Cumple un rol central en eucariotes, ha sido muy estudiada y es mucho más compleja que la bacterial, muy conservada estructura , función y mecanismo.
Es una enzima muy grande con 12 subunidades, la subunidad mayor (RBP1) tiene alto grado de homología con β’ bacterial , otra subunidad RBP2 es similar a la subunidad β y otras dos RBP3 y RBP11 son homólogas a las estructuras de las 2 subunidades α bacteriales.
Funciona con genomas más complejos y con DNAs más empacados que los de bacteria.
La subunidad mayor (RBP1) tiene un largo tallo C-terminal con muchas secuencias de consenso repetidas de 7 AA (YSPTSPS), en enzimas de levaduras hay 27 repeticiones(18 componen el consenso) y en enzimas de ratones y humanos 52 (21 en consenso), este Dominio Carboxilo Terminal CTD esta separado del cuerpo principal de la enzima por una secuencia linker no estructurada, El CTD cumple roles muy importantes.
RNA pol II requiere de un arreglo de otras proteínas, factores de transcripción, para formar un complejo de transcripción activo.
Los factores de transcripción generales requeridos en cada promotor de la Pol II se designan como TFII con un identificador adicional, y son altamente conservados en todos los eucariotes
La transcripción por las Pol II, se describe en las fases de: ensamble, iniciación, elongación y terminación c/u asociado con proteínas características.
En la célula pueden estar en grandes complejos preensamblados simplificando las vías para el ensamble sobre los promotores.
12
3
4 (lleva a 5 a su blanco)
estabiliza
5
6
7Helicasa -kinasa
(TFIIH y CDK9 - pTEFb)
9
8TFIIF
10
Ensamble de la RNA pol y Factores de Transcripción al promotor
La formación de un complejo cerrado se inicia cuando la proteína de unión a TATA (TBP) se une a la caja TATA (1), TBP esta unido por TFIIB que también une a DNA por todos los lados de TBP (2).
La unión de TFIIA aunque no es esencial puede estabilizar el complejo TFIIB –TBP en el DNA y puede ser importante en promotores sin-consenso donde la unión de TBP es débil. (3)
Al complejo TFIIB-TBP se une a otro complejo de TFIIF y RNA pol II. TFIIF ayuda a llevar a la RNA pol a su blanco, esto es a sus promotores. Debido a que interactúa con TFIIB y por que reducen la unión de la RNA pol a sitios no específicos en el DNA. (4 y 5)
Finalmente TFIIE y TFIIH se unen para crear un complejo cerrado ( 6 y 7), TFIIH tiene una actividad de DNA helicasa desenrollado el DNA cerca del sitio de inicio (requiere Hidrólisis de ATP) creando un complejo abierto, se requieren más de 30 polipéptidos
Iniciación de la hebra de RNA y Clearence del promotor
TFIIH tiene otra función, una de sus subunidades tiene actividad de kinasa, que fosforila a la RNApol II en varios sitios del CTD. Otras proteín kinasas incluyendo a CDK9 (Kinasa dependiente de ciclina 9) que es parte del complejo pTEFb (factor de transcripción de elongación positiva b), también fosforila a CTD ; esto produce un cambio conformacional en el complejo total iniciándose la transcripción. (8)La fosforilación es importante en la elongación y afecta las interacciones entre el complejo de transcripción y otras enzimas del procesamiento del transcrito.
Durante la incorporación de los primeros 60 – 70 Nu, TFIIE y luego TFIIH son liberados comenzándose la fase de elongación.
Elongación, Terminación y Liberación
TFIIF permanece asociado con RNA pol II a través de la elongación, la actividad de la enzima se ve incrementada por factores de elongación, (9)Los factores de elongación suprimen las pausas durante la transcripción y coordinan las interacciones entre los complejos de proteínas involucrados en el procesamiento post transcrpcional de los mRNAs.
completado el transcrito, el proceso termina por mecanismos no conocidos, la RNA pol II es defosforilada y reciclada para iniciar otro transcrito. (10)
Regulación de la actividad de la RNA pol II
La regulación en los promotores, involucra la interacción de otras proteínas con el complejo de preiniciación, algunas proteínas regulatorias interactúan con los factores de transcripción otras con la misma Pol II, otras con TFIID, un complejo de 12 prot incluyen TBP y ciertos factores asociados a TBP o TAFs.
Diversas funciones de TFIIH
La reparación de DNA es más eficiente en genes que están siendo transcritos y la hebra templado se repara más eficiente que la no templada, algunas de las subunidades de TFIIH son componentes esenciales del complejo de reparación por excisión de Nu.
Cuando la RNApol se detiene en un sitio de una lesión TFIIH puede interactuar con la lesión y reclutar el complejo total de reparación por excisión de Nu , la perdida genetica de ciertas subunidades de TFIIH.. Xeroderma pigmentoso, retención de crecimiento, fotosensibilidad desordenes neurológicos.
La RNA polimerasa Dependiente de DNA puede sufrir Inhibición selectiva
La elongación de la transcripción en bacterias y eucariotes es inhibida por el antibiótico Actinomicina D. la porción planar de la molécula se intercala entre pares sucesivos G≡C deformando el DNA, evitando el movimiento de la polimerasa a lo largo del templado. Util en para identificar procesos celulares que dependen de la síntesis de RNA. Acrididina actúa similar.
Rifampicina inhibe la síntesis de RNA bacterial, se une a la subunidad β de la RNApol bacterial, evitando el clearence del promotor.
El hongo Amanita phalloides, produce α-amanitina bloquea la Pol II, y en altas concentraciones a Pol III. Ni Pol I, ni la Pol bacterial , ni la Pol II del hongo son sensibles.
Procesamiento de RNA
Muchos RNAs de bacterias y todos las de eucariotes son procesadas en algún grado después de su síntesis. Muchas de las enzimas son RNAs, Ribozimas.
El RNA recién sintetizado se denomina Transcripto primario, los procesamientos más extensivos se dan en mRNAs eucariotes y tRNAs de bacterias y eucariotes.
El trascripto primario de un mRNA eucariote contiene secuencias que comprenden todo el gen, aunque las secuencias que codifican el polipéptido no están contiguas, los fragmentos no codantes que interrumpen los segmentos codantes son llamados intrones mientras que los segmentos codantes son los exones.
Un proceso llamado splicing remueve los intrones y los exones se unen para formar una secuencia continua que especifica un poli péptido funcional
Los mRNAs eucarióticos son también modificados en los extremos. Se adiciona residuo modificado 5’cap. El extremo 3’es clivado y se adicionan 80 a 250 A cola poli A.
Los complejos de proteínas que llevan a cabo estos tres eventos muchas veces no actúan en forma independiente sino están organizadas entre ellas y con el CTD fosforilado de la Pool II, cada complejo afecta la acción de los otros.
Otras proteínas que transportan el mRNA al citoplasma, también están asociadas con el mRNA en el núcleo, asi, el procesamiento del transcripto está asociado con su transporte.
mRNA eucariote conforme es sintetizado, forma un complejo con una docena de proteínas, la composición del complejo cambia conforme el transcrito es procesado, transportado al citoplasma y conducido al ribosoma
Tres eventos del procesamiento
tRNAs de procariotes y eucariotes, se procesan por clivajes en cada extremo y en pocos casos por splicing, muchos azucares y bases también son modificados,
G – NH2
Finalmente, los RNA sufren una completa y regulada degradación,
la velocidad de recambio de RNAs, es determinante en su St St. Y en la velocidad en la cual “apagan” la expresión de un gen cuyo producto ya no se requiere.
Durante el desarrollo de organismos multicelulares, por ejemplo, ciertas proteínas deben ser expresadas únicamente en un estado, y el mRNA que es codificado para tal proteína debe ser producido y degradado en un tiempo apropiado.
Los mRNAs eucariotes, adicionan un ¨casco¨ en el extremo 5’.
El cap se forma por condensación de GTP con el extremo 3’trifosfato del transcripto,
Luego la guanina es metilada en N-7, grupos adicionales de metilos se adicionan en OH 2’ del primer y segundo Nu.
Los Metilos derivan del S-adenosilmetionina, todas estas reaciones se producen muy tempranamente en la transcripción, después que los primeros 20 - 30 Nu han sido adicionados.
Las 3 enzimas capping y a través de ellas el extremo 5’ del transcripto mismo están asociadas con la CTD de la RNA polimerasa II hasta que el cap es sintetizado. El extremo 5’ con su casquete, es liberado de las enzimas capping y unido a CTD por el complejo que une el cap (CBC).