BENJAMÍN PAZ ALIAGA Profesor Principal de la UCSM

CURSO DE BIOTECNOLOGIA MEDICA- 2011

EL DESCUBRIMIENTO EL RNA INTERFERENTE

• Con la idea de producir comercialmente flores de colores exóticos, se introdujo a las plantas usando el Agrobacteriun un gen adicional que codificaba para la enzima chalcona sinteasa, pensando que esta permitiría una mayor síntesis de pigmento y las flores tendrían un color púrpura más intenso.

• Sorpresivamente las plantas transgénicas produjeron flores de color blanco, carentes de pigmento, no obstante que el gen endógeno y el transgénico estuvieron presentes

Napoli C y col.(1990) Plant Cell 2:279-289

Jorgensen R.A. (1995) Science 268: 686-691

COSUPRESION

UN TRANSGEN INYECTADO GATILLA EL SILENCIAMIENTO DEL GEN CELULAR HOMOLOGO

EL DESCUBRIMIENTO EL RNA INTERFERENTE

• Este experimento fue denominado como de COSUPRESION, ya que el transgen no solo silenció su propia expresión sino también el de la chalcona sinteasa endógena.

LA COSUPRESION SE DA A NIVEL POSTRANSCRIPCIONAL

• Se introdujo el gen de la RNA polimerasa RNA dependiente (RdRP)del virus de la papa en un vector y usando el Agrobacterio se infectó plantas de tabaco.

• Se aisló el RNA de las plantas transgénicas y se trató de hibridizar con RdRP del virus de la papa y no se pudo identificar en mRNA.

LA COSUPRESION SE DA A NIVEL POSTRANSCRIPCIONAL

• Aislando los núcleos de las plantas padres y de las transgénicas y usando nucleótidos radioactivos, se demostró que había transcripción.

• Se pudo concluir que tanto las líneas susceptibles como resistentes transcribían el transgen, pero el mRNA era eliminado en las líneas resistentes.

LA COSUPRESION OCURRE DESPUES DE LA TRANSCRIPCION

SE IDENTIFICA AL RNA DE DOBLE HEBRA COMO EL INDUCTOR DEL RNA INTERFERENTE

• En1998 Fire y col. Encontraron que la inyección de RNAs de doble hebra, constituidas de mixtura de cadenas sentido y antisentido del mRNA blanco determinaban el silenciamiento de la expresión génica y que lo mismo no era logrado con cadenas sentido o antisentido de una sola hebra.

• Estos experimentos se realizaron en Caenorhabditis. elegans

• Fire A ; Mello C. ( 1998)Nature 391: 806-811

C. elegans

EFECTO FENOTIPICO ESPUES DE LA INYECCION DE RNAs DE UNA HEBRA O DE DOBLE HEBRA

GEN SEGMENTO RNA INYECTADO

FENOTIPO

Unc 22 A Exones 21 y 22 Hebra sentido

No se altera

Unc 22 A Exones 21 y 22 Hebra antisentido

No se altera

Unc 22 A Exones 21 y 22 Sentido + antisentido

Alterado en un 100%

Unc 22 B Exón 27 Sentido + antisentido

Alterado en un 100%

EL RNA DE DOBLE HEBRA ES EL GATILLO PARA EL RNA i

El silenciamiento e C. elegans se daba al

alimentarlos con bacterias modificadas

• El descubrimiento que en C. elegans que el silenciamiento podía ser inducido simplemente por la alimentación de los nemátodes con bacterias que habían sido modificados para expresar el RNA homólogo al mRNA blanco, llevó rápidamente a la adopción del RNAi como una tecnología para la genética reversa a nivel del organismo.

¿COMO HACE EL ds RNA PARA SILENCIAR LOS GENES ?

• Habían evidencias que era a través de la interacción con el mRNA blanco.

1. La transcripción de los genes silenciados era normal.

2. Los niveles de mRNA decrecen en los organismos en silenciamiento.

3. Los dsRNAs solo causaban silenciamiento cuando tenían secuencias complementarias al mRNA blanco.

4. El efecto del RNAi declinaba con el tiempo

Una nucleasa destruye los RNA homólogos para silenciarlos

• Incubando dsRNAs en extractos de Drosophila, al momento de añadir los RNA homólogos , estos fueron rápidamente degradados.

• El añadido de RNAs no homólogos, no los afectó en absoluto.

• El complejo proteico necesario para esta acción nucleásica, secuencia-específica fue denominado RISC (RNA-induced silencing complex)

RISC

RISCDEGRADA mRNA HOMOLOGOS

Ds RNAs

( Activado)

SE DETECTAN RNA PEQUEÑOS EN ORGANISMOS SILENCIADOS• Se tenía que pensar que RISC contenía RNA

antisentido para reconocer y degradar el mRNA homólogo.

• Usando geles de agarosa no se pudo demostrar la idea,pero con geles de poliacrilamida que detectan mejor secuencias cortas de RNA, se identificaron poblaciones de RNA pequeños(21-22nt), homólogas al gen silenciado

( Hamilton A.J. and Baulcombe D.D. (1999)Science 286: 950-952)

SE DESCUBRE EL MECANISMO QUE CORTA EL dsRNA PARA PRODUCIR LOS RNA PEQUEÑOS

• Resultaba urgente identificar la RNAasa que cortaba el dsRNA para dar los RNAs pequeños.

• Mediante inmunoprecipitación fue posible aislar una proteína con la función esperada. Sus productos eran del tamaño de los RNAs pequeños antes vistos.

• Esta proteína fue denominada como DICER por su habilidad de trozar el dsRNA en fragmentos de tamaño igual.

LOS PRODUCTOS DE LA NUCLEASA DICER SON SUFICIENTES PARA INDUCIR EL RNA i

• Con el clonaje y secuenciación de los RNAs pequeños, se pudo sintetizar oligonucleótidos sintéticos que semejaban a los productos de la RNAasa DICER.

• Al añadir estos oligonucleótidos a los extractos de embriones de Drosophila, se determinó que trabajaban igual que os productos de DICER, degradando mensajeros homólogos

A LOS RNAs PEQUEÑOS SE LES DIO EL NOMBRE DE RNA INTERFERENTE CORTO( siRNA)

• Los RNAs pequeños, producto de la acción de DICER fueron denominados como RNAs interferentes cortos ( siRNAs).

• Se abrieron grandes expectativas sobre la posibilidad de estudiar la función del gen usando sus correspondientes siRNAs

• También en su aplicación en el tratamiento y prevención de enfermedades .

Se descubren otros RNAs pequeños, los microRNAs

• Se identifican un distinto pero relacionado grupo de RNAs pequeños que también eran procesados por DICER y que jugaban un papel importante silenciando genes para regular el desarrollo embrionario, la apoptosis, la oncogénesis, etc.

• Juegan un rol importante en regular la función de un 30% de genes de mamífero

RNA interference (2)

• dsRNAs are cleaved into 21-23 nt segments (“small interfering RNAs”, or siRNAs) by an enzyme called Dicer

RNA interference (3)

• siRNAs are incorporated into RNA-induced silencing complex (RISC)

RNA interference (4)

• Guided by base complementarity of the siRNA, the RISC targets mRNA for degradation

EL MECANISMO DEL ARN INTERFERENTE ( RNA i )

Eventos en el procesamiento del RNA i (2)

1. Introducción del dsRNA a la célula

2. La proteína citosólica DICER captura al dsRNA y lo fragmenta para dar siRNA de 21-25 nt

3. Los siRNA endógenos o introducidos artificialmente son incorporados en el sistema RISC

4. Las 2 hebras del siRNA se separan y la hebra antisentido (Guía) queda unida a RISC

Eventos en el procesamiento del RNA i (1)

4.- Las hebras del siRNA se separan y la cadena antisentido queda unida a RISC

5.- Esta hebra guiará a RISC a la búsqueda de la secuencia homóloga en el mensajero blanco

6.- Se produce la degradación del mRNA y con ello queda silenciado el gen

IMPORTANCIA DE LOS ESTUDIOS DEL RNA i

• El RNA i protege contra las infecciones virales

• El RNA i garantiza la estabilidad del genoma al mantener silenciosos muchos elementos móviles

• El RNA i ( miRNA) regula el desarrollo de los organismos

• El RNA i mantiene la cromatina condensada y regula la transcripción

IMPORTANCIA DE LOS ESTUDIOS DEL RNA i

• El RNA i se constituye en una herramienta muy practica para silenciar genes específicos

• Se vislumbran sus grandes aplicación en la prevención y cura de muchas enfermedades

Andrew Z. FireThe Nobel Prize in Physiology or

Medicine 2006

Craig C. MelloThe Nobel Prize in Physiology

or Medicine 2006

PREMIO NOBEL EN FISIOLOGIA O MEDICINA POR SUS INVESTIGACIONES RESPECTO AL RNAi

En resumen, el descubrimiento del ARNi ha expandido enormemente el conocimiento científico sobre los mecanismos implicados en la regulación génica. Además el desarrollo de tecnologías basadas en ARNi ha proporcionado a la comunidad científica una poderosa herramienta experimental para el estudio de la funcionalidad génica. La adaptación de esta tecnología a la biomedicina, aunque aún en desarrollo, ha abierto expectativas terapéuticas sin precedentes

.

El descubrimiento del RNA interferente ha tenido un gran impacto en la investigación biomédica y con seguridad esperamos sus grandes aplicaciones en medicina, en un futuro próximo.