RESUMEN LEGENDARIO DE ACIDOS NUCLEICOS

PRIMERA PARTE: METABOLISMO DE NUCLEOTIDOS

Componentes del ADN, ARN, transportadores de intermediarios activado (UDP-glucosa, CDP-colina), componentes de coenzimas (CoA, FADH2, NADH, NADPH), segundos mensajeros (AMPc, GMPc) y compuestos regulatorios. ESTRUCTURA: Base nitrogenada + pentosa + fosfatos. 2 FAMILIAS: Purinas y pirimidinas. PURINAS: Adenina y Guanina, ambas en el ADN y ARN. PIRIMIDINAS: Citosina (ADN y ARN), timina (ADN) y uracilo (ARN). Adicion de una pentosa a la base mediante enlace glucosidico = NUCLEOSIDO. Azucar = ribosa => ribonucleotido: Adenosina, guanosina, citidina y uridina.

Azucar = 2-deoxirribosa => desoxirribonucleotidos: desoxiadenosina, desoxiguanina, desoxicitosina, desoxitimidina o timidina => se incorporan al ADN.

Adicion de un grupo fosfato a un nucleosido = NUCLEOTIDO. SINTESIS DE NUCLEOTIDOS – PURINAS

Anillo de purina = aa (aspartato, glicina, glutamina) + CO2 + N10-FormilTHF. En hígado mediante reacciones que agregan C a la ribosa 5-fosfato que proviene de la via de las pentosas fosfato. PRIMER PASO => Activacion de la pentosa:

ATP + Ribosa 5P => PRPP (5-fosforibosil-1-pirofosfato) Enzima = PRPP sintetasa. Activador = fosfato inorgánico, Inhibidor = Purinas.

SEGUNDO PASO => Sintesis de 5-fosforibosilamina PRPP + Glutamina => Glutamato + 5-fosforibosilamina Enzima = Glutamina:Fosforibosilpirofosfato amidotransferasa. Activador = PRPP, Inhibidor = AMP, GMP.

TERCER PASO => Sintesis de Ribotido de Glicinamida (GAR) 5-Fosforibosilamina + Glicina => GAR Enzima = GAR sintetasa.

CUARTO PASO => Sintesis de Ribotido de N-Formilglicinamida GAR + N10-FormilTHF => FGAR + THF Enzima = Formiltransferasa.

QUINTO PASO => Sintesis de Ribotido de N-formilgicinamidina FGAR + Glutamina => FGAM + glutamato Enzima = Sintetasa

SEXTO PASO => Sintesis de Ribotido de 5-aminoidazol FGAM + ATP => AIR Enzima = Sintetasa

SEPTIMO PASO => Sintesis de Ribotido de Carboxiaminoimidazol AIR + CO2 => CAIR Enzima = Carboxilasa.

OCTAVO PASO => Sintesis de SAICAR CAIR + Aspartato + ATP => SAICAR Enzima = Sintetasa

NOVENO PASO => Sintesis de AICAR SAICAR => Fumarato + AICAR Enzima = Adenilosuccinato liasa

DECIMO PASO => Sintesis de FAICAR AICAR + N10-FormilTHF => FAICAR + THF Enzima = Formiltransferasa

ONCEAVO PASO => Sintesis del IMP FAICAR => IMP (Monofosfato de inosina) + H2O Enzima = Ciclohidrolasa

SINTESIS DE ADINOSINA Y GUANINA MONOFOSFATO Conversion del IMP a AMP/GMP 2 pasos. Si es AMP requiere GTP, si es GMP requiere ATP.

La primera reacción de cada una es inhibida por el producto, si hay AMP y GMP en gran cantidad entonces la reacción se anula. AMP: PRIMER PASO => Sintesis del Adenilosuccinato. IMP (Inosina monofosfato) + Aspartato + GTP => Adenilosuccinato + GDP Enzima = Adenilosuccinato sintetasa. SEGUNDO PASO => Sintesis del AMP Adenilosuccinato => Fumatato + AMP Enzima = Adenilosuccinasa. GMP: PRIMER PASO => Sintesis de la Xantosina Monofosfato. IMP + H2O + NAD => Xantosina Monofosfato + NADH Enzima = IMP deshidrogenasa. SEGUNDO PASO => Sintesis del GMP Xantosina Monofosfato + Glutamina + ATP => GMP + Glutamato Enzima = GMP sintetasa.

CONVERSION DE NUCLEOSIDOS MONOFOSFATOS A NUCLEOSIDOS DI/TRIFOSFATOS Mediante kinasas con gasto de ATP. En el musculo e hígado => Adenilato kinasa.

Nucleosidos difosfados y trifosfatados se interconvierten mediante => Nucleosido difosfato kinasa.

RUTA DE RECUPERACION DE LAS PURINAS

Producto de reutilización de los acidos nucleicos celulares o del poco porcentaje que se obtiene de la dieta se pueden convertir a nucleosidos trifosfatos y usados en el cuerpo. 2 enzimas: ADENINA FOSFORIBOSILTRANSFERASA (APRT) Sustrato = Adenina. ADENINA + PRPP => AMP XANTINA-GUANINA FOSFORIBOSILTRANSFERASA (HGPRT) Sustato = Hypoxantina y guanina GUANINA + PRPP => GMP HIPOXANTINA + PRPP => IMP

APLICACIÓN CLINICA: SINDROME DE LESH-NYHAN Enfermedad recesiva ligada al X, deficiencia completa de la HGPRT => no se puede convertir guanina ni hipoxantina a GMP o IMP respectivamente = reducción de estas junto a un incremento en síntesis = incremento de ac urico => HIPERURICEMIA => Urolitiasis + Gota.

SINTESIS DE DESOXIRRIBONUCLEOTIDOS Durante la FASE S del ciclo celular (síntesis del ADN) se utilizan como materia prima a los desoxirribonucleotidos que se sintetizan de nucleótidos mediante la ribonucleotido reductasa. RIBONUCLEOTIDO REDUCTASA

Enzima con 2 subunidades: R1 y R2, especifica para la reducción de purinas difosfato (ADP y GDP) y pirimidinas difosfato (CDP y UDP) a sus formas desoxigenadas (dADP, dGDP, dCDP, dUDP). Donantes de hidrogeno son los 2 sulfhidro de la enzima => enlace disulfuro. Donador de equivalentes reductores = Tioredoxina (donan 2 hidrogenos a la enzima tras esta formar los enlaces disulfuro). Regenerada mediante gasto de NADPH + H. REGULACION Mantiene suministro balanceado de desoxirribonucleotidos para la síntesis del ADN, regulación.

Sitios activos: Union de dATP al sitio alosterico inhibe la actividad de enzima y reducción del nucleótidos difosfatos. Union del ATP a sitios alostericos potencia la actividad enzimática. Sitios sustrato: Union de trifosfatos a sitios alosterios adicionales regula la especifidad de enzima por un sustrato determinado. Ej: Deoxitimidina trifosfato => Reduccion de GDP a dGDP.

DEGRADACION DE NUCLEOTIDOS – PURINAS Ocurre en el intestino delgado => Enzimas pancreáticas hidrolizan acidos nucleicos a nucleótidos. En la mucosa intestinal las purinas se degradan secuencialmente => Ac urico. DEGRADACION DE ACIDOS NUCLEICOS DIETARIOS EN EL INTESTINO DELGADO

Secrecion pancreática: Ribonucleasas + Desoxirribonucleasas, ARN/ADN => Oligonucleotidos que se hidrolizan por las fosfodiesterasas a mononucleotidos, las nucleotidasas producen nucleosidos que se degradan por nucleosidasas a bases libres y desoxirribosa 1P.

PURINAS DIETARIAS NO SE USAN MUCHO PARA SINTESIS DE AC NUCLEICOS TISULARES, SE CONVIERTEN A AC URICO.

FORMACION DEL ACIDO URICO 1.- AMP => IMP ADENOSINA => INOSINA Enzima = AMP desaminasa Enzima = Adenosina desaminasa 2.- IMP/GMP => Inosina/Guanosina, enzima = 5`-nucleotidasa. 3.- Inosina/Guaninosina => Hipoxantina/Guanina, enzima = Purina nucleosido fosforilasa. 4/1.- Desaminacion de guanina = Xantina. 4/2.- Oxidacion (Oxidasa) de Hipoxantina = Xantina. 5.- Oxidacion de la xantina (oxidasa) => Ac urico. APLICACIÓN CLINICA: GOTA

Hiperuricemia causada por sobreproducción o poca excreción => depósitos de cristales de urato monosodico (MSU) en las articulaciones = artritis gotosa. Tofos = masas nodulares de MSU depositados en tejidos blandos => gota crónica tofacea. Calculos de ac urico en el riñon (Urolitiasis). Hiperuricemia por si sola es asintomática pero puede relacionarse a hipertensión.

POCA EXCRECION 90% de casos de hiperuricemia. Primaria = Defectos excretorios. Secundaria = Procesos infecciosos que afectan como el riñon maneja el urato o también factores como drogas o diuréticos. SOBREPRODUCCION Idiopatica, probablemente asociada a mutaciones en la PRPP sintetasa => excreso de producción de purinas = altos niveles de acido urico => HIPERURICEMIA. Secundaria = alta disponibilidad de purinas. TRATAMIENTO Colchicina previene formación de microtubulos = reducción en la respuesta inflamatoria (evita migración de linfocitos). AINES => tratamiento de dolor. REDUCIR NIVELES DE ACIDO URICO => Agentes uricosuricos = Probenecid, sulfinpyrazona. ALOPURINOL => análogo estructural de la hipoxantina, inhibe la síntesis de acido urico y en el organismo se convierte a OXIPURINOL que inhibe la XANTINO OXIDASA = acumulación de hipoxantina y xantina.

APLICACIÓN CLINICA: DEFICIENCIA DE ADENOSINA DESAMINASA

ADA => gran actividad en linfocitos, deficiencia = acumulación de adenosina que se convierte a dATP que inhibe a la ribonucleotido reductasa previniendo formación de nucleótidos => inmunodificiencia por perdida de linfocitos.

SINTESIS Y DEGRADACION DE PIRIMIDINAS Anillo de pirimidina = Glutamina + CO2 + Aspartato. PRIMER PASO: Sintesis del carbamoil fosfato Glutamina + CO2 => Carbamoil fosfato Enzima = Carbamoil fosfato sintetasa II (CPS II). Activador = PRPP, inhibidor = uridina trifosfato. SEGUNDO PASO: Sintesis del carbamoil aspartato. Carbamoil fosfato + Aspartato => Carbamoil Aspartato

Enzima = Aspartato transcarbamoilasa. TERCER PASO: Cierre del anilo. Carbamoil aspartato => Dihidrooratato + H2O Enzima = dihidooratasa CUARTO PASO: Sintesis de oratato Dihidrooratato + FMN => Oratato Enzima = dihidrooratato deshidrogenasa. QUINTO PASO: Sintesis de OMP Oratato + PRPP (Dona la Ribosa-5P) => OMP Enzima = oratato fosforibosiltransferasa. SEXTO PASO: Sintesis del UMP OMP => UMP + CO2 Enzima = OMP descarboxilasa. UMP se fosforila hacia UDP y UTP. SINTESIS DEL CITIDIN TRIFOSFATO UTP + Glutamina + ATP => CTP + Glutamato + ADP Enzima = CTP sintetasa SINTESIS DE DEOXITIMIDINA MONOFOSFATO dUMP se convierte a dTMP por accion de TIAMIDILATO SINTASA que usa N5,N10 metilenoTHF. Inhibidores de la enzima (5-fluorouracil) se usan como agentes antitumorales. DEGRADACION Y REUTILIZACION DE PIRIMIDINAS

Anillo de las pirimidinas se abre y degrada a compuestos solubles => B-alanina (de CMP y UMP) + B-aminoisobutirato (de TMP) + NH3 + CO2, además también pueden convertirse en nucleosidos que se fosforilan a nucleótidos.

PREGUNTAS DEL LIBRO (Pag. 306) 1)La azaserina es una droga con aplicaciones de investigación que inhibe las enzimas dependientes de glutamina. ¿La incorporacion de que nitrógeno en la estructura de una purina afectara la azaserina? 2) Paciente varon de 42 años que se expone a radioterapia para cáncer de próstata desarrolla dolor severo en la articulación metatarsofalangica en su pulgar derecho, se detectan cristales de urato monosodico. La causa del dolor del paciente se relaciona directamente a la sobreproducción del producto terminal mediante cual de las siguientes vias metabólicas. Recordar las causas, para la gota hay 2 opciones: Poca excreción (defectos en el riñon) o Sobreproduccion (problemas en la enzima o exceso de purinas). 3)Inhibidores farmacológicos: Alopurinol y Febuxostat inhiben la síntesis de Ac urico inhibiendo la xantino oxidasa. 5-flurorouracil inhibe la formación de dTMP desde dUMP. Metotrexato inhibe a la dihidrofolato reductasa. 4)Paciente de un año esta letárgica, débil y anémica. Peso y talla por debajo de lo normal. Alto contenido de acido orotico en orina junto a actividad de uridina monofosfato sintasa reducida. ¿Qué le administra? Alta excreción de acido orotico es por poca actividad de UMP sintasa, por la edad la causa es genética por deficiencias en los dominios catalíticos de UMP sintasa, se administra uridina ya que hace un bypass a la UMP sintasa. 5)Prueba de laboratorio para distiguir aciduria orotica de deficiencia de ornitina transcarbamilasa por deficiencia en uridina monofosfato sintetasa => Niveles de amoniaco elevados en deficiencia de ornitina transcarbamoilsas pero no en deficiencia de uridina monofosfato sintasa.

SEGUNDA PARTE: ESTRUCTURA, REPLICACION Y REPARACION DEL ADN Acidos nucleicos => Almacenamiento + expresión de información genética => ADN + ARN. ADN => cromosomas en el nucleo, mitocondrias y cloroplastos. Replicacion y transmisión a células hijas. Procariontes => 1 solo cromosoma + ADN no cromosómico como plasmidos. Cada celula especializada, expresa solamente lo que necesita para ejercer su función = expresión selectiva. DOGMA CENTRAL => Flujo del ADN ARN Proteinas. ESTRUCTURA DEL ADN ADN = polímero de monofosfatos unidos por enlace fosfodiester 3´->5´, como doble cadena que se enrolla formando doble hélice, asociado con proteínas. ENLACE FOSFODIESTER 3´->5´

Grupo 3´-Hidroxilo + grupo 5´-Hidroxilo mediante un fosfato => cadena polar, el 5´=fosfato libre y 3´=hidroxilo libre. LAS BASES DE ESCRIBEN DESDE 5´->3´. Rotos hidroliticamente por enzimas: Desoxirribonucleasas => ADN Ribonucleasas => ARN DOBLE HELICE 2 cadenas alrededor de un eje de simetría emparejadas antiparalelamente (3´ de una con 5´ de otra), parte hidrófila externamente y bases hidrófobas internamente. “Escalera de caracol”. 2 surcos: Mayor y menor => acceso + unión de proteínas reguladoras. EMPAREJAMIENTO DE BASES

A=T, G≡C. Una cadena es el complemento de la otra => REGLA DE CHARGAFF, cantidad de una purina = cantidad de pirimidinas. SEPARACION DE LAS DOS HEBRAS Ruptura de puentes de hidrogeno: pH, temperatura (al tener solo 2 enlaces A y T se rompen mas rápidamente). En condiciones adecuadas el ADN se renaturaliza a diferencia de otras proteínas. FORMAS ESTRUCTURALES

Forma A => deshidratación moderada de la forma B, hélice dextrógira con 11 pares de bases por vuelta, angulo de 20° respecto a perpendicular. Forma B (“CLASICA”)=> destrogira de 10 pares de bases por vuela, angulo perpendicular. Forma Z => levógira con 12 pares de bases por vuelta.

ADN LINEAL Y CIRCULAR Cada cromosoma contiene una molecula lineal de ADN, el ADN circular cerrado esta en las mitocondrias y procariontes. En los procariontes y las bacterias => Plasmidos llevan genes y facilitan transferencia de información genética.

ETAPAS EN SINTESIS DE ADN EN PROCARIONTES Replicacion de ADN, cada una de las hebras = plantilla para replicación de una nueva => REPLICACION SEMICONSERVADORA. Una vez que la celula inicia la replicación no se detiene hasta completar la división celular. SEPARACION DE HEBRAS DE ADN

Fusion de 2 hebras en un punto = ORIGEN DE REPLICACION, en las eucariotas es en varios sitios para agilizar la replicación, el ORIGEN DE REPLICACION presenta abundantes bases A=T.

FORMACION DE HORQUILLA DE REPLICACION 2 hebras al desenrollarse y separarse forman una V en la que se produce la síntesis, esta región se desplaza por todo el ADN bidireccionalmente = BURBUJA DE REPLICACION. Proteinas necesarias: Complejo cebador (reconocimiento del origen de replicación).

Proteina DnaA => unión a secuencias nucleotidicas especificas = región corta rica en AT en serie, requieren ATP para separar las hebras y formar regiones localizadas de ADN. Helicasas => unión al ADN cercano a la horquilla y van hacia la doble hélice vecina forzando su separación, utilizan ATP. Proteinas de unión al ADN (SSB) => unión a una de las hebras en forma cooperativa, alteran el equilibrio del ADN para mantener las hebras separadas mediante la replicación además de protección contra nucleasas.

SUPERENROLLAMIENTO Al separarse las hélices => superenrollamientos + (supergiros) que interfieren en la escisión del ADN. Resuelto mediante las topoisomerasas:

Topoisomerasas tipo I => cortan reversiblemente una hebra, son nucleasas y a la vez ligasas, forman una mella transitoria por la que pasa la hebra intacta y luego sellan la hebra nuevamente = eliminación del superenrollamiento. Topoisomerasas tipo II => unión a la doble hélice, generación de roturas transitorias por la que se estira y pasa el ADN, utilizan ATP. Ej: ADN girasa introduce superenrollamientos – en ADN circular relajado en Procariotas para estimular la división.

DIRECCION DE REPLICACION Polimerasas leen las secuencias 3´->5´ y sintetizan las hebras de 5´->3´, por tanto desde un mismo origen y al ser las hebras antiparalelas una se dirige hacia la orquilla y otra se aleja de esta. Hebra adelantada => Copiada en dirección de orquilla de replicación, síntesis continua.

Hebra retrasada => Copiada alejándose de la horquilla, se copian fragmentos de ADN cerca de la horquilla (discontinuos = FRAGMENTOS DE OKAZAKI) que luego se unen.

ADN CEBADOR

ADN polimerasas no inician síntesis de una hebra sin un cebador de ARN que presente un hidroxilo libre, que sirve como aceptor de un desoxinucleotido.

PRIMASA => ARN polimerasa especifica que sintetiza los fragmentos de ARN => U=A, estos ARN se sintetizan en la horquilla constantemente para la hebra retrasada, en la hebra adelantada solo se necesita 1 y la replicación continua por si sola. Sustrato = trifosfato de 5´-ribonucleosido, liberación de pirofosfato. PRIMOSOMA => Complejo precebador + primasa.

ELONGACION DE CADENA ADN polimerasas alargan la hebra nueva del ADN añadiendo DESOXIRRIBONUCLEOTIDOS dirección 5´->3´, siguen la hebra.

ADN POLIMERASA III: Cataliza elongación del ADN, usa hidroxilo 3´ del ARN cebador como aceptor del 1er desoxirribonucleotido y a partir de ahí añade continuamente las bases, permanece unida a la hebra (procesividad = pinza deslizante), dirección = 5´->3´. Sustrato = 5´-desoxirribonucleosidos, al añadir un monofosfato de desoxirribonucleosido se libera PPi. Para elongar el ADN se requiere dATP, dTTP, dCTP, dGTP => escasez = x síntesis de ADN. CORRECCION DEL ADN SINTETIZADO: La ADN polimerasa III presenta también actividad correctora añadiendo nucleótidos y comprobando luego que el nucleótido este correctamente emparejada, esta actividad correctora requiere una exonucleasa 3´->5´ OJO.

ESCISION DE ARN CEBADORES Y SU SUSTITUCION POR ADN ADN polimerasa III continua síntesis de ADN en hebra retrasada hasta que se bloquea por el ARN cebador. ACTIVIDAD EXONUCLEASA 5´->3´

Actividad polimerasa 5´->3´, actividad exonucleasa 3´->5´. La ADN polimerasa I presenta también actividad exonucleasa 5´->3´ que elimina el ARN cebador.

ADN polimerasa I localiza espacio en extremo 3´ de la hebra recién sintetizada y extremo 5´ del ARN, luego la ADN polimerasa I sustituye el ARN dirección 5´->3´ y de paso corrigiendo la cadena por accion exonucleasa 3´->5´. DIFERENCIAS EXONUCLEASA 3´->5´ Y 5´->3´

ADN polimerasa I = 5´->3´ actividad exonucleasa que elimina el ARN cebador, 3´->5´ actividad exonucleasa que corrige el ARN. ADN polimerasa III = 3´->5´ actividad exonucleasa. Las exonucleasas 5´->3´=> eliminan nucleótidos cada vez que una región ADN se empareja correctamente. Las exonucleasas 3´->5´=> elimina nucleótidos alterados por grupos.

ADN LIGASA

ADN polimerasa III + 3´ hidroxilo de la cadena que forma la ADN polimerasa I se unen por enlace fosfodiester por accion de ADN LIGASA con gasto de ATP.

REPLICACION DEL ADN EN EUCARIOTAS Proceso similar al de las procariotas. CICLO CELULAR Replicacion del ADN ocurre en la fase S del ciclo celular. ADN POLIMERASAS DE EUCARIOTAS

Pol α => multiples subunidades una de las cuales actividad primasa que inicia síntesis de hebras, sintetiza ARN cebador corto que luego se elonga y genera un fragmento corto de ADN. Pol ε + Pol δ => Epsilon para completar síntesis de hebra adelantada, delta para alargar fragmentos de Okasaki en hebra retrasada. Pol β + Pol ϒ => Beta para rellenar huecos al reparar el ADN y la Gamma para replicar ADN mitoc.

TELOMEROS Complejos ADN no ccodificante que mantienen integridad cromosomatica, repeticiones multiples AGGGTT emparejada con región complementaria C y A. La hebra GT mas larga que la CA, los nucleótidos “sobrantes” se pliegan y forman una estructura en asa. ACORTAMIENTO

Tras eliminación del ARN no se puede rellenar el hueco restante por tanto en cada división el telomero se va acortando, llegado a cierto punto la celula no se divide. En células germinales + cancerosas telomeros no acortados => TELOMERASA. TELOMERASA = TRANSCRIPTASA INVERSA Usa una plantilla de ARN rica en CA que se une al extremo 3´ rico GT, la transcriptasa inversa usa plantilla de ARN para sintetizar ADN en dirección 5´->3´, al alargar la hebra la primasa la utiliza como plantilla para alargar la otra hebra y cerrar el telomero.

TRANSCRIPTASA INVERSA ADN polimerasas que usan ARN como plantilla => RETROVIRUS (VIH) convierte su genoma (ARN) a ADN vírico que se integra al cromosoma de la celula hospedera y actua como un “gen” que fabrica continuamente partículas víricas. Transposones => Tambien presentan actividad telomerasa, para que un segmento de ADN “salte” primero se traduce a ARN que una vez en el lugar que se requiera se traduce nuevamente a ADN y se reincorpora.

INHIBICION DE SINTESIS DE ADN POR ANALOGOS DE NUCLEOSIDOS Eliminacion de hidroxilo del C3 en la desoxirribosa o conversión de desoxirribosa a arabinosa = inhibición de replicación. Ej: Arabinosido de citosina = quimioterapia anticancerosa, Arabinosido de adenina = antiviral.

ORGANIZACIÓN DEL ADN EUCARIOTA 46 Cromosomas = 1m de ADN, empaquetado mediante proteínas = HISTONAS. HISTONAS Y NUCLEOSOMAS H1, H2A, H2B, H3 Y H4 => enlace ionico con el ADN.

NUCLEOSOMAS => 2 moleculas de cada histona forman un nucleo estructural alrededor del cual se enrolla el ADN formando una superhelice (-), los nucleosomas se conectan entre si mediante un ADN CONECTOR (50 pares de bases) luego la histona H1 se une al ADN conector entre los nucleosomas facilitando el empaquetamiento.

NIVELES SUPERIORES Empaquetamiento de nucleosomas = POLINUCLEOSOMA/NUCLEOFILAMENTO en espiral que si se sigue enrrollando forma la estructura cromosomatica.

EN REPLICACION Los nucleosomas se disocia de una hebra pero permacen unido a la otra hebra, a la hebra que no presenta nucleosomas se le van sintetizando según progresa la replicación.

REPARACION DEL ADN Emparejamiento erróneo o inserción incorrecta además de agentes ambientales => daño que debe reparase sino = mutacion. Se requiere reconocer el daño en el ADN y luego reemplazarlo con secuencia correcta. REPARACION DIRIGIDA POR METILO Principalmente ante errores de replicación.

Identificacion: Proteinas Mut identifican el nucleótido mal emparejado, según su grado de metilación (las hebras mas recientes no presentan metilación en GATC). Reparacion: Endonucleasa produce mellas en hebras y se eliminan los nucleótidos tomando como plantilla la hebra original, la ADN polimerasa reemplaza los nucleótidos.

REPARACION DEL DAÑO POR UV UV => unión covalente de pirimidinas adyacentes = dimerización => no duplicación.

Identificacion: Endonucleasa especifica de UV (uvrABC escinucleasa) que reconoce el dimero y lo escinde dejando un hueco para rellenar.

CORRELACION CLINICA = XERODERMA PIGMENTOSO No reparación del ADN dañado = acumulación de mutaciones + canceres tempranos de piel. CORRECCION DE ALTERACIONES DE BASES (POR ESCISION) Bases alteradas espontáneamente (citosina) o compuestos desaminantes (ac nitroso).

Eliminacion de bases anómalas: Uracilo = desaminacion de Citosina => reconocimiento por glucosilasas que escinden el semento = sitio apirimidinico o apurico = sitios AP Reconocimiento y reparación del sitio AP => AP endonucleasas reconocen el “hueco” y lo rellenan.

REPARACION DE ROTURAS EN DOBLE HEBRA Radiacion ionizante o radicales libres = rotura, reparación 2 sistemas: Union de extremos no homologos (con perdidad de ADN = altamente mutageno). Reparacion por recombinación homologa (uso de enzimas de recombinación similares a meiosis).

DIRIGIDA POR METILO RADIACION UV ESCISION DE BASES

PREGUNTAS DEL LIBRO (Pag. 416) 1) Padres de niña de 10 años la llevan al dermatologo por exceso de pecas y alta sensibilidad a luz, identifica 2 carcinomas de celulas basales, ¿Cuál es el defecto? RESPUESTA: Indicativo de xenoderma pigmentoso, la palabra clave es sensibilidad a UV. 2) Telomeros son complejos de ADN y proteina que protegen los extremos de cromosomas. En la mayoria de celulas humanas se acortan con cada division pero en celulas totipotenciales y cancerosas se mantiene. Diga usted lo correcto. RESPUESTA: Telomerasa y una ribonucleoproteina proporcionan el ARN junto a polimerasa para sintetizar y mantener al telomero recordar tambien a la transcriptasa inversa que convierte a ese ARN en ADN que se incorpora al telomero y asi lo mantiene. 3) Durante el estudio de estructura de un pequeño gen recientemente secuenciado un investigador noto que una hebra contiene 20 A, 25 G, 30 C y 22 T. Diga usted la cantidad de bases en la doble helice completa. RESPUESTA: Aplicar la REGLA DE CHARGAFF que dice que # purinas = # pirimidinas, esto es si hay 3 adenosina deben haber 3 timinas para esas 3 adenosinas. 20 A y 22 T, aplicando la REGLA DE CHARGAFF: Hay 22 timinas en esta hebra en la otra habran 22 adenosina, y si en esta hay 20 adenosinas en la otra habra 20 timinas => TOTAL: 42 Adenosinas y 42 Timinas. 25 G y 30 C, aplicando la REGLA DE CHARGAFF: Hay 25 guaninas en esta hebra en la otra habran 25 citocinas, y si en esta hay 30 citosinas en la otra habran 30 guaninas => TOTAL: 55 guaninas y 55 Citocinas. 4)La magnitud de sintesis de ADN se determina midiendo la incorporacion de: A. leucina => aa no se incorporan al ADN. B. fosfato => no exclusivo del ADN. C. ribosa => tanto en ARN como ARN. D. timidina = RESPUESTA => Incorporada al ADN. E. uracilo => solo en ARN.

TERCERA PARTE: BOCIO Tambien llamada tiromegalia, en cualquier edad y generalmente no es tumoral. Presenta diversas causas como autoinmunidad, deficiencia de yodo, medicamentos, etc. BOCIO ENDEMICO Defecto nuctricional de yodo. Necesidad diaria = 150 a 300 ug, si es menor a 50ug = bocio. En carencia de yodo la tiroides: Aumento en depuracion de yodo inorganico. Secrecion de T3. Mas conversion de T4 a T3. Aumento de THS => aumento volumen tiroideo como mecanismo compensatorio. Prevencion = aporte de yodo como sal yodada o administracion parenteral. BOCIO NO TOXICO MULTINODULAR => Crecimiento irregular. 12% de adultos, mas en damas y vejez. Nodulos policlonales = respuesta hiperplasica a factores locales. Asintomaticos y eutiroideos. Sintomas compresivos si aumento tamaño => Disfagia, disnea o pletora (congestion venosa). No predispone a carcinoma de tiroides. TRATAMIENTO Levotiroxina (50ug) => suprime TSH. Iodo radiactivo => reduccion del bocio. Cirugia si hay sintomas compresivos. DIFUSO => Crecimiento generalizado. Aumento del tamaño total sin nodulos e hipertiroidismo, blanda y simetrica. Tmbn llamado Simple (no nodulos) y Coloide (foliculos llenos de coloide). Relacionado a deficit de yodo. Mas en damas. TSH normal o ligeramenta aumentados => + sensibilidad TSH u otras causas. Asintomatico. BOCIO RETROESTERNAL => Obstruccion del estrecho toraxico superior. Signo de Pemberton = obstruccion del flujo venoso yugular. T4 baja y T3/TSH normal. TRATAMIENTO YODO. Terapia de sustitucion. Tiroxina (100 ug) => supresion de TSH. Cirugia unicamente si sintomas compresivos. TOXICO MULTINODULAR Similar al no toxico pero funcional autonomamente => Hipertiroidismo/tirotoxicosis leve. Relacionada a enfermedad de Graves y adenoma funcionante de tiroides. Bocio multinodular de larga evolucion. TSH bajo, T4 normal o algo aumentada, T3 elevada

GAMMAGRAFIA => Normal = captacion uniforme, en la multinodular = captacion heterogenea.

TRATAMIENTO Antitiroideos + B-bloqueador. Yodo radioactivo.

Titoidectomia => eliminacion del lobulo hiperfuncionante, se trata de no eliminar toda la tiroides ya que el paciente dependeria de sustitucion hormonal.

CUARTA PARTE: REGULACION DE LA EXPRESION GENICA Y BIOTECNOLOGIA Porceso que origina producto funcional de un gen, ADN->ARN => regulacion mediante procesos postranscripcionales y postraduccionales. NO TODOS GENES REGULADOS => genes constitutivos (codificacion de productos para funcion celular normal), genes regulados solo en ciertas condiciones (hepatocito, celulas de zona glomerular, etc).

SECUENCIAS Y MOLECULAS REGULADORAS Regulacion de transcripcion por secuencias reguladoras de ADN que permiten o inhiben la transcripcion, actuan en “cis” => influyen en expresion de un gen en mismo cromosona, actor “trans” difunden desde un cromosoma hacia otro para regularlo. REGULACION DE EXPRESION GENICA EN PROCARIOTAS Regulacion en transcripcion mediada por proteinas “trans” a elementos reguladores “cis” en su unico cromosoma. TRANSCRIPCION DEL ARNm DE OPERONES Genes estructurales agrupados junto a elementos de regulacion cis => producto = ARNm, genes controlados como unidad (activos e inactivos) = operon. FUNCION DE LOS OPERADORES Operones contienen operador (ADN q regula la actividad de genes del operon), sin molecula represora => transcripcion, molecula represora = bloqueo de transcripsion, molecula inductora + represora = cambio conformacional => transcripcion.

OPERON DE LA LACTOSA (lac) Gen lacZ = B-galactosidasa Gen lacY = prermeasas GenlacA = tiogalactosido transacetilasa Porcion reguladora posicion 5` => Region promotora (P) de union a ARN polimerasa, sitio operador (O) y el sitio CAP de union para prots reguladoras. Expresion de todos los genes solo cuando el sitio O vacio y CAP unido a AMPc (activador de gen), el gen lacl se une al sitio O y por tanto evita la transcripcion. GLUCOSA UNICO DISPONIBLE

Desactivacion del operon lac (solo lactosa) mediante la union de proteina represora al sitio O en direccion 3` al operador = no transcripcion.

SOLO LACTOSA Induccion del operon lac => alactosa inductor de proteina represora = cambio conformacional que junto al AMPc que se une a la region CAP => Expresion de genes y transcripcion.

GLUCOSA Y LACTOSA Transcripcion del operon lac insignificante, la adenilato ciclasa se inhibe en presencia de glucosa por tanto no AMPc y no actividad de transcripcion.

OPERON DEL TRIPTOFANO (trp)

Proteinas apra sintesis de triptofano, al igual que en el operon lac presenta regulacion + y -. Control - = union del represor a la porcion O, pero tambien control de atenuacion = inicio de transcripcion pero no se completa. Abundante trp inicia la transcripcion pero se detiene por formacion en el extremo 5` de un bucle => producto peptidico incompleto no funcional que se degrada.

COORDINACION TRANSCRIPCION Y TRADUCCION Regunlacion a nivel del ARNm y del ARNr (ribosomico) para respuesta y adaptacion al ambiente. RESPUESTA RESTRICTIVA

7 operones => ARNr para montar los ribosomas, cada uno regulado según ambiente. Regulacion en respuesta a carencia = respuesta restrictiva. PROTEINAS RIBOSOMICAS REGULADORAS Operones para prots ribosomicas (proteinas-r) inhibidos por exceso de productos proteicos, represion de traduccion de ARNm policistronico cada operon actua una prot-r especifica que se une a la secuencia Shine-Dalgarno (SD) en el ARNm continuo al condon AUG (iniciacion) impidiendo la union del ribosoma a SD inhibiendo la sintesis de proteinas del operon.

REGULACION DE EXPRESION GENICA EN EUCARIOTAS Necesidad de procesos reguladoras en mayor cantidad debido a complejidad del propio genoma, sitio principal de regulacion = transcripcion. En las eucariotas NO OPERONES, regulacion a multiples niveles. MOLECULAS DE ACCION TRANS

Proteinas de union al ADN con 2 dominios de union: Union al ADN y activacion de transcripcion (para union de coactivadores como HAT), regulacion mediante complejos multiproteicos con interaccion prot-prot o prot-ADN => efecto especifico depende de composicion del complejo.

ELEMENTOS REGULADORES CIS Regulacion coordinada de grupo de genes importante, prot unida a elemento regulador de un gen => adecta coordinadamente la expresion de estos genes (incluso si estan en cromosomas separados). ERH (elementos de respuesta a hormonas) actuan en cis y se unen a factores proteicos trans para regula la expresion genetica en respuesta a hormonas.

SEÑALES REGULADORAS MEDIADAS POR RECEPTORES INTRACELULARES Influencia directa en factores de transcricion alterando la afinidad de union al ADN de cada factor. Ej: Hormonas esteroideas como el cortisol => complejo ligando-receptor que ingresa al nucleo, se dimeriza y une al ADN nuclear por un dedo de zinc a un elemento de respuesta a glucocorticoides (ERG) que esta presente en cada gen “diana” de la hormona => expresion coordinada a pesar de estar en cromosomas fistintos, funcionan a grandes distancias.

SEÑALES REGULADORAS MEDIADAS POR RECEPTORES DE SUPERFICIE Glucagon e Insulina, receptor de proteina G que produce AMPc que fosforila y activa un factor de accion en trans que responde al AMPc (CREB) que se une a un elemento cis (elemento de respuesta AMPc = ERC) mediante cremallera de leucina => transcripcion de genes diana.

REGULACION POR PROCESOS COTRANSCRIPCIONALES Y POSTRANSCRIPCIONALES AFECTAN ARNm

ARNm se modifica antes de llegar al citoplasma, se añade caperuza en 5` y se poliadenila en 3` => adecta la estabilidad del mensajero y la expresion genica. ELECCION DEL SITIO CORTE Y EMPALME

Del pre-ARNm se sintetizan productos proteicos especificos de tejido mediante corte-empalme alternativo que generan isoformas de dichos productos para un tejido en especial.

CORRECION DEL ARNm Modificacion postranscripcional. Ej: apoB, su ARNm producido en higado e intestino delgado pero en el intestino el residuo C del codon CAA para glutamina se desamina a U = codon de parada (UAA) => produccion de apo B48 que es mas pequeña que la apoB del higado. ESTABILIDAD DEL ARNm Tiempo en el citosol influye en cantidad de producto que se produce.

METABOLISMO DEL HIERRO Transferrina = transporte de hierro, receptor = TfR, el ARNm para TfR presenta en extremo 3´ elementos de respuesta al Fe que actuan en cis y una estructura en bucle que se une a prots reguladoras trans (IRP). [Fe] baja => IRP se une a elementos de respuesta a Fe = estabilidad del ARNm para TfR = sintesis de TfR pero si [Fe] alta => IRP union al Fe en vez de elementos de respuesta = reduccion de sintesis de TfR por menos estabilidad del ARNm.

ARN DE INTERFERENCIA (ARNi) Silenciamiento genico que reduce la expresion de ARNm reprimiendo la traduccion o aumentando su degradacion, clave en prolifaracion-diferenciacion-apoptosis celular, mediado por microARN generada por endonucleasa (Dicer). El microARN se une al complejo silenciador inducido ARN (CSIA) que da represion de traduccion de ARNm o degradasion por actividad endonucleasa del CSIA. ARNi iniciado por ARN de interferencia cortos de dh (ARNic) que proviene de fuentes exogenas. TERAPIA CON ARNi Modulacion de expresion genica con aporte de ARNi exogeno.

TRADUCCION DEL ARNm Regulacion a nivel de traduccion mediante la fosforilacion del IF-2 (factor de iniciacion de traduccion) inhibiendolo, catalizada por cinasas en respuesta a factores ambientales.

REGULACION POR MODIFICACIONES EN ADN Según disponibilidad de ADN para transcripcion, cantidad y organización. ACCESO AL ADN

ADN con histonas = cromatina, la descondensada = eucromatina = transcripcionalmente activa mientras que la heterocromatina es la forma condensasa e inactiva. En la activa las histonas se acetilan o fosforila en extremo amino-terminal que disminuyen su asociacion al ADN relajando el nucleosoma y permitiendo el acceso de factores de transcripcion. Grado de metilacion en regiones ricas CG (islas CpG) en region promotora de genes mediante metiltransferasas que usan SAM, hipometilacion = actividad e hipermetiacion = inactivacion = silenciamiento de expresion genica. CANTIDAD ADN Cambio en numero de copias de un gen afecta la cantidad de producto, mecanismo de adaptacion. Ej: Metotrexato => inhibidor de dihidrofolato reductasa (sintesis de ADN), en celulas cancerosas aumenta el numero de genes de la dihidrofolato reductasa (amplificacion) lo que causa resistencia al farmaco. ORGANIZACIÓN DEL ADN Linfocitos B para producir las inmunoglobulinas deben reorganizar su ADN, la region variable es por combinacion somatica de segmentos en genes => genes unico (V), diverso (D) y union (J) que forman una region variablle unica => 10^9-10^11 posibles combinaciones (Ig) de un solo gen = diversidad alta para reconocimiento de antigenos.

ELEMENTOS MOVILES Transposones (Tn) => segmentos de ADN que se movilizan en 1 mismo cromosoma o a otros mediado por la transposasa (codificada por el Tn) mediante 2 formas: Directo (corte e insercion) o replicacitivo (copiado e insercion), esta mediado por un ARN que se denomina retrotansposon. Altera la expresion genica y potencialmente causar enfermedades => Hemofilia A y distrofia muscular de Duchenne.

BIOTECNOLOGIA Y ENFERMEDAD HUMANA ADN con 3000 millones de pares de bases que codifican 20000 a 30000 genes en 23 pares de cromosomas => PROYECTO GENOMA HUMANO gracias a descubrimiento de endonucleasas de restriccion, tecnicas de clonacion para framentos de especificos y sintesis de sondas que identifican secuencias de interes. ENDONUCLEASAS DE RESTRICCION Digieren ADN en fragmentos pequeños y manejables, ruptura de ADN en secuencias especificas. ESPECIFIDAD

Segmentos cortos de ADN (4 a 8 pares de bases) con secuencias especificas palindromica (simetria rotacional doble) = lectura igual para las 2 hebras si se leen en direccion 5´->3´. NOMENCLATURA Según el organismo aislado, primera letra del genero de bacteria y 2 letras del nombre de especie junto con una letra del tipo de cepa y numero final (orden) => HaeIII = 3ra endonucleasa aislada en Haemophilus aegyptius.

EXTREMOS COHESIVOS Y ROMOS Digieren ADNdh produciendo 3´-hidroxilo en un lado y 5´-fosfato en otro extremo. Endonucleasa Taql forma corte escalonado = extremos cohesivos (fragmentos de ADN secuancias de una sola hebra que son complementarios. Endonucleasa HaeIII forma extremos romos que son de doble hebra y no forman puentes de H entre si, estos pueden unirse mediante ligasas. SITIOS DE RESTRICCION Secuencia reconocida y cortada por una enzima de restriccion = sitio de restriccion. Enzima que reconozca secuencia de 4 pares de bases = varios cortes de ADN. Enzima reconoce 6 pares de bases = menos cortes y fragmentos mas largos.

CLONACION DEL ADN ADN extraño en celula en division => amplificacion o clonacion, previamente se digere ese ADN formando fragmentos que se unen a un vector de ADN y forman una molecula recombinante que se lleva a una celula hospedera => clon de cada ADN vector y luego se libera el ADN vector mediante escision. VECTORES

ADN que se une al ADN para clonar, debe ser capaz de replicarse autonomamente en la hospedera, persenta una secuancia reconocida por endonucleasa de restriccion y debe llevar un gen que confiera capacidad de seleccionar el vector. Ej: Plasmidos y virus. PLASMIDOS PROCARIOTAS

ADN plasmidico replicado junto a la cromosomica, pueden llevar genes de resistencia a antibioticos o facilitan tranferencia de informacion genetica, ADN circular se puede escindir especificamente mediante endonucleasas e insertarse ADN que se introduce a una bacteria y genera copias del plasmido hibrido. OTROS VECTORES

Bacteriofagos, Retrovirus y estructuras artificiales como cosmidos y cromosomas artificiales bacterianos.

GENOTECAS

Fragmentos de ADN clonado de un organismo => Genotecas genomicas y genotecas de ADN complementario. Genotecas genomicas => copia de cada secuencia de nucleotidos de ADN del genoma producidos por endonucleasas de restriccion. Genotecas de ADNc => secuencias de ADN como ARNm procesadas que mediante una transcriptasa inversa se puede revertir a ADN de doble hebra que se amplifica y ademas puede usarse como sonda del ADN original que codifico el ARNm. SECUENCIACION DE FRAGMENTOS DE ADN Metodo didesoxi de Sanger => ADN polimerasa que usa ADN que se secuencia como molde, luego se añade un cebador radiactivo complementario junto a los 4 trifosfatos desoxirribonucleotidos (dNTP) y se divide la muestra en 4 tubos a cada uno se añade pequeña cantidad de fosfatos de didesoxirribonucleotido (ddNTP), la incorporacion de estos induce finalizacion => productos mezcla de hebras ADN con longitudes variables que terminan en bases especificas que se pueden separar mediante electroforesis y luego autorradiografia => patron de bandas (mas corto fragmento = mas lejos viaja).

SONDAS Fragmentos cortos de 1 hebra de ADN marcada radiactivamente o con biotina para identificar una secuencia diana. HIBRIDACION DE UNA SONDA A FRAGMENTOS DE ADN

Utilidad depende de la hibridacion => secuencia de ADN diana se une a la sonda que tenga la secuencia complementaria. SONDAS OLIGONUCLEOTIDICAS SINTETICAS Si conocemos la secuencia de todo o parte del ADN diana se pueden sintetizar sondas que identifiquen varios nucleotidos por vez. DETECCION DE MUTACION DE B5-GLOBINA

Usando una sonda de oligonucleotido especifico de alelo (OEA) podemos detectar la mutacion en el ADN aplificado obtenido de leucocitos, en la persona que tenga la enfermedad la secuencia complementaria se unira a la sonda => Deteccion con electroforesis.

SONDAS BIOTINILADAS Acoplamiento bioquimico a nucleotidos usados para sintetizar la sonda, la biotina se une a su vez a la avidia que se une a su vez a un colorante fluorescente detectable opticamente. ANTICUERPOS Identificacion clonando el ADNc en un vector de expresion y luego usando anticuerpo marcado para el producto de ese ADNc (para lo que se usan colonias bacterianas a las que se introdujo el ADNc como un plasmido) observando aglutinacion.

TRANSFERENCIA DE SOUTHERN Deteccion de mutaciones en ADN. Enzimas de restriccion + electroforesis + sondas. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Edward Southern, Pasos: Extraccion del ADN de celulas de estudio y luego se digere el ADN en fragmentos con enzimas de restriccion para luego separarlos mediante electroforesis que luego desnaturalizamos y transferimos a una membrana de nitrocelulosa. Si el ADN original = genoma del individuo => producto de digestion enzimatico 1 millon a mas fragmentos, para hallar el fragmento de interes se utiliza una sonda. DETECCION DE MUTACIONES Detecta inserciones, deleciones y mutaciones puntuales (sustitucion de nucleotidos) => diferencia en el patron de bandas causando perdida en sitios de restriccion = fragmentos mas largo o creando sitios de escision = fragmentos mas cortos.

POLIMORFISMO DE LA LONGITUD DE FRAGMENTOS DE RESTRICCION Variaciones del genoma = diferencias en secuencia del ADN, 1 de cada 1200 bases o 0.1% del genoma son diferencias entre personas => polimorfismos y mutaciones. Variacion en secuencia de un locus (alelos) en mas de 1% de poblacion.Polimorfismo de longitud de fragmentos de restriccion (PLFR) = variante genetica observable cortando el ADN en fragmentos mediante enzimas de restriccion => longitud alterada si la variante genetica altera el ADN => este polimorfismo se usa para detectar variaciones geneticas humanas (presuntos padres o tejido fetal).

REACCION EN CADENA DE POLIMERASA (PCR) Amplificacion en tubo de ensayo de una secuencia de ADN => sintesis de millones de copias en pocas horas. ETAPAS

PCR usa ADN polimerasa para amplificacion repetida de porciones de ADN, cada ciclo de amplificacion duplica la cantidad de ADN en muestra = aumento exponencial de ADN en ciclo de amplificacion => analisis mediante electroforesis o Southern. Se calienta a 94°C luego se infria a 55°C y el copiado del ADN se da a 72°C. CONSTRUCCION DEL CEBADOR

No se requiere conocer la secuencia de ADN pero si la secuencia de segmentos que estan cerca al ADN que se quiere = Secuencia flanqueante => oligonucleotidos de 20-35 nucleotidos con extremo 3` apuntando a la secuencia de interes. DESNATURALIZACION DEL ADN ADN se calienta y se separa el ADN en hebras sencillas. RENATURALIZACION DEL ADN Enfriamiento e hibridacion de las hebras con los cebadores (1 para cada hebra). EXTENSION DE LA CADENA Añadiendo ADN polimerasa con fosfatos de desoxirribonucleotidos para iniciar la sintesis de dos hebras complementarias a ADN original, la ADN polimerasa añade nucleotidos al extremo 3` del cebador y la hebra crece por el ADN de interes.

Al finalizar el ciclo se recalienta para separar las hebras y se repite el proceso hasta 20 – 30 ciclos = amplifica el ADN de 1 millon a 1000 millones. En los ultimos ciclos se agregan nucleotidos marcados = produccion de sondas. POLIMERASA Resistente a calor => Thermus aquaticus.

VENTAJAS Sensibilidad y velocidad. Amplificacion de secuencias minimas hasta convertilas en predominantes, es altamente sensible, mas rapido y menor dificultad que el ADN recombinante. APLICACIÓN COMPARACION DE UN GEN NORMAL CLONADO CON FORMA MUTANTE

Sintesis de ADN mutante => protocolo de secuenciacion sin necesidad de clonacion elaborada.

DETECCION DE SECUENCIAS POCO ABUNDANTES VIH => deteccion temprana del ADN viral incorporado a cromosoma humano antes de sintomatologia. ANALISIS FORENSE DIAGNOSTICO PRENATAL Y DETECCION DE PORTADORES DE FIBROSIS QUISTICA Mutacion en gen para proteina RTFQ => delecion de 3 bases => alelo mutante mas corto que puede detectarse mediante PCR => distinguir de homocigotos sanos, heterocigotos portadores y homocigotos afectados.

TERAPIA GENICA Insercion de ADN normal clonado en celulas somaticas de de un paciente con gen alterado, el ADN debe incorporarse permenentemente al paciente. Ej: Inmunodeficiencia combinada grave (SCID) = mutacion de adenosina desaminasa o gen que codifica subunidad para receptor de IL, tratamiento con copias funcionales del gen apropiado. No carece de riesgos, se usan retrovirus corrigio la SCID en 9 de cada 10 pacientes pero llevo a desarrollo de leucemias por activacion de un oncogen => FALTAN PROGRESOS ADEMAS QUEDAN AREAS DE INCERTIDUMBRE.

QUINTA PARTE: SISTEMA ENDOCRINO Sistema nervioso como endocrino => comunicación intracelular. Hormona = sustancia que se sintetiza en un organo y es transportada via sangre para actuar sobre una celula diana. Accion autocrina = la misma celula que sintetiza en ella misma el efecto. Accion paracrina = accion sobre celulas adyacentes. CELULA BLANCO => Hormona actua sobre celulas que presenten el receptor. RECEPTOR HORMONAL ALTA CAPACIDAD DE DICRIMINACION

[hormonas] bajas, menor a demas sustancias en el plasma => alto grado de dicriminacion proporcionado por los receptores => inician y suspenden la respuesta, caracteristicas: Union especifica, saturable y debe producir respuesta. DOMINIOS 2 dominios como minimo: Reconocimiento (acopla el ligando) y otra de acoplamiento que genera la señal intracelular. Polipeptidos, proteinas y catecolaminas => receptor en membrana.

Esteroides, retinoides y hormonas tiroideas => receptor intracelular => complejo ligando redceptor que actua directamente en transcripcion, presentan varios dominios: Union al ligando, union a region ADN y uno que interactua con prots correguladoras.

TIPOS DE RECEPTORES Receptor de insulina = heteroteramero con 2 subunidades unidas por puente disulfuro, unidad alfa se une a insulina y la B transduce la señal. Receptor para IGF-1 + EGF (factor de crec epidermico) estructura similar a insulina. Receptor de GH y prolactina en la membrana => no actividad cinasa intrinseca pero activan via Jak-stat. Receptores de catecolaminas y polipeptidos => transduccion alterando la produccion AMPc por prot G. Receptores esteroideos => nucleares.

HORMONAS CLASIFICACION

GRUPO I: Lipofilicas asociadas a transportadores en plasma haciendolas solubles y prolongando su vida media, la hormona libre es la activa, sus receptores pueden estar en el citosol o nucleo y el complejo ligando-receptor = mensajero intracelular. GRUPO II: Hidrosolibles, receptores en membrana que usan segundos mensajeros.

Factor natriuretico auricular (ANF) => 2do mensajero = GMPc. Algunas pueden usar Ca o IP3 como 2dos mensajeros.

LUGAR DE PRODUCCION TIROIDES => T3 y T4. SUPRARRENAL => Glucocorticoides y mineralocorticoides. HIPOFISIS => TSH, FSH, LG, GH, prolactina, ACTH. GONADAS OTROS ORGANOS => Intestino delgado => peptido similar a glucagon, riñones => calcitonina, etc. PRECURSORES COLESTEROL => Glucocorticoides, mineralocorticoides, estrogenos, progestinas y 1.25DiOHD3. HORMONA ESTEROIDEA => Progesterona precursor de glucocorticoides, testosterona, etc. TIROSINA => T3 y T4, junto con el I.

POLIPEPTIDOS/GLUCOPROTEINAS => Tripeptidos (hormona lib de tirotropina TRH) hasta mas de 200 aa.

PRODUCCION DERIVADAS DEL COLESTEROL => Ni bien se producen se estan secretando.

CATECOLAMINAS => almacenamiento en forma final lista para secrecion. INSULINA => sintesis de precursores y luego secrecion con estimulo. T3 Y DHT => Conversion a moleculas activas en periferia => T4 Y TESTOSTERONA. DERIVADAS DEL COLESTEROL ESTEROIDOGENESIS SUPRARRENAL

Del colesterol que puede ser plasmatico (mayor %) y otro del acetil-CoA. Colesterol esterificado y almacenado en gotitas lipidicas y en estimulacion => esterasa que transporta el colesterol a la mitocondria y ahí el P450scc lo convierte en pregnenolona a la que luego se va dividiendo su cadena lateral hasta terner 21 C = nucleo esteroide.

PARA TRANSPORTAR EL COLESTEROL NECESITAMOS = StAR (prot dependiente de ACTH). PREGENENOLONA = Precursor comun de hormonas esteroideas, a la que se hidroxila o deshidrogena o isomerisa => enzimas especificas: 18-hidroxilasa y 19-hidroxiesteroide => SINTESIS DE ALDOSTERONA => Solo en ZONA GLOMERULOSA.

SINTESIS DE MINERALOCORTICOIDES (ALDOSTERONA)

1.Pregnenolona => Progesterona, accion de 3B-Hidroxiesteroide deshidrogenasa (3B-OHSD) y una isomerasa. 2.Hidroxilacion de Progesterona en C21 => 11-desoxicorticosterona (DOC), ya presenta actividad de retencion de Na. 3.Hidroxilacion del DOC en C11 => Corticosterona, glucocorticoide + mineralocorticoide leve. 4.La 18-hidroxilasa (aldosterona sintasa) actua sobre la corticosterona => 18-hidroxicorticosterona. 5.18-hidroxicorticosterona => aldosterona, intercambiando el Alcohol 18 en aldehido. SINTESIS DE GLUCOCORTICOIDES Sintesis de CORTISOL => 3 hidroxilasas que actuan en orden sobre el C17, C22 Y C11. Si se hidroxila primero el C11 se bloquea la 17-hidroxilasa => via mineralocorticoide. 1.Pregnenolona => 17a-hidroxiprogesterona por 17a-hidroxilasa (REL). 2.17a-hidroxiprogesterona => 11-desoxicortisol por 21-hidroxilasa (REL). 3.11-desoxicortisol => cortisol por 11-hidroxilasa (mitocondrial).

SINTESIS DE ANDROGENOS Principal precursor = DHEA. 1.17-hidroxipregnenolona una pequeña fraccion por accion de 17,20-liasa => produccion de androgenos, esta produccion se incrementa si la via de glucocorticoides esta bloqueada = sindrome adrenogenital. 2.DHEA => Androstenediona (por accion de 3B-OHSD y la isomerasa) que tiene gran actividad. 3.Androstenediona => Testosterona (reduccion en C17 de la androstenediona). ESTEROIDOGENESIS TESTICULAR Androgenos en Cel de LEYDIG. Precursor = pregnenolona. 2 vias => una que sintetiza directamente testosterona pero sintetizando primero progesterona y otra que sintetiza primero 17a-hidroxipregnenolona para llegar a delta5-androstenedio y luego por accion de 3B-OHSD transformarse en testosterona, esta ultima es mas usada en los testiculos. DIHIDROTESTOSTERONA Si se oxida en posicion 17 => cetoesteroides inactivos. En tejidos blanco => DHT (dihidrotestosterona) que es mas importante que la testosterona inclusive, mediante la 5a-reductasa. ESTEROIDOGENESIS OVARICA 17B-estradiol = estrogeno primario. En el embarazo se produce mas estriol (placentario). Estrogenos = aromatizacion de androgenos por aromatasa y P450 monooxigenasas, ESTRADIOL => sustrato = testosterona, ESTRONA => aromatizacion de androstenediona. Celulas de teca producen androstenediona y testosterona que son convertidas por las celulas de granulosa en estradiol y estrona. Progesterona secretada por el cuerpo luteo. Aromatasa en adipocitos, higado y piel.

DERIVADOS DE TIROSINA CATECOLAMINAS

3 aminas = dopamina, norepinefrina y epinefrina de la tirosina en celulas cromafines en medula suprarrenal. Epinefrina 80% en medula suprarrenal, gran % de norepinefrina produccion en nervios simpaticos.

1.Tirosina hidroxilasa actua como oxidorreductasa que usa THB como cofactor, Tirosina -> L-dopa. Regulacion: Las catecolaminas la inhiben. Deficit de dopamina = Parkinson, se administra el precursor (L-dopa). 2.Dopa descarboxilasa usa PLP como cofactor, L-dopa -> 3,4-hidroxifeniletilamina (dopamina). Inhibida por la a-metildopa.

3.Dopamina B-Hidroxilasa(DBH) es monooxigenasa y usa Ascorbato+Cu+Fumarato, Dopamina -> norepinefrina. 4.Feniletanolamina-N-metiltransferasa (PNMT) cataliza el paso de norepinefrina a epinefrina, sintesis inducida por hormonas adrenocorticotropas. HORMONAS TIROIDEAS T3 y T4 => Necesitan iodo para ser activas, estan almacenados en coloide y la T4 se transforma a T3 (+activo) en tejidos perifericos. Precursor = Tiroglobulina => proteina yodada de 660 kDa, presenta 2 subunidades y residuos tirosina alrededor de los cuales se inicia la yodacion (precursores inactivos = MIT y DIT) que se van yodando.

Es una forma de almacenamiento de T3 y T4 en el coloide, tras la estimulacion por TSH se endocita y por accion de proteasas se liberan T3, T4, DIT, MIT pero solo el T3 y T4 difunden mientras que el resto pasan al coloide nuevamente.

Para la Iodacion se requiere Iodo oxidado, 1 MIT + 1 DIT = T3, 1 DIT + 1 DIT = T4.

PRECURSORES DE GRAN TAMAÑO

INSULINA Primero se sintetiza como proinsuina, que es mucho mas grande que la insulina que por divisiones peptidicas lleva a formacion de cantidades equimolares de insulina y peptido C.

PTH Precursor = proPTH que difiere de la PTH por 84aa, que proviene de preproPTH de 115aa. La PTH regula la concentracion de Ca, las catepsinas dividen a PTH en 2 fragmentos: PTH1-36 y PTH37-84, la PTH1-36 se sigue degradando. ANGIOTENSINA Sistema renina-angiotensina => regula la PA y metabolismo de electrolitos. Angiotensinogeno por accion de renina = Angiotensina I que por accion de al ECA en capilar pulmonar = Angiotensina II que es la que ejerce el efecto biologico (aumenta el simpatico, reabsorcion tubular de solutos, secrecion de aldosterona, vasoconstriccion, etc).

PROOPIOMELANOCORTINA (POMC) Peptidos que actuan como hormonas = ACTH, LPH, MSH y otros que actuan como neurotransmisores. Produccion en lobulo anterio de la hipofisis.

SEXTA PARTE: MECANISMOS DE ACCION HORMONAL Y SEGUNDOS MENSAJEROS Grupo I => receptor intracelular. Grupo II => receptor en membrana.

MECANISMOS DE ACCION HORMONAL AMPc IP3 GRUPO I OTROS

ACTH LH y FSH TSH ADH (receptor V2) GCH MSH CRH Receptores B1 y B2 Calcitonina PTH Glucagon

GnRH TRH GHRH Angiotensina II ADH (receptor V1) Oxitocina Receptores alfa 1

Glucocorticoides Estrogenos Testosterona Progesterona Aldosterona Vitamina D T3 y T4

ACTIVIDAD DE TIROSIN KINASA Insulina IGF-1 GH Prolactina GMPc Peptido atrial natriuretico Oxido nitrico

MECANISMO DE HORMONAS ESTEROIDEAS Y TIROIDEAS (GRUPO I) 1. Difusion atravez de membraana hacia su receptor. 2. Complejo hormona receptor ingresa al nucleo y se dimeriza. 3. El dimero hormona receptor actua como factor de transcripcion y se une a un elemento de respuesta a hormona (HRE) en ADN y activa la transcripcion. HRE para el glucocorticoide = GRE. HRE para mineralocorticoides = MRE. 4. Producto de transcripcion = ARNm que se usa para sintetizar proteinas. MECANISMOS USADOS POR HORMONAS DEL GRUPO II PROTEINA G

Proteinas de union a GTP que acoplan receptores hormonales a moleculas efectoras adyacentes que pueden ser una adenilato ciclasa (para AMPc) o Fosfolipasa C (IP3). Presentan actividad GTPasa intrinseca. 3 subunidades: Alfa, Beta y Gamma. Alfa se une al GDP (proteina G inactiva) o GTP (proteina G activa). Pueden ser de varios tipos: Gs (estimuladora) o Gi (inhibitoria). MECANISMO DE ADENILATO CICLASA Por ejemplo al unirse la ACTH a su receptor causa que se libere el GDP de la proteina G y sea reemplazado por GTP = activacion de la prot G => activacion de adenilato ciclasa. Adenilato ciclasa activa => AMPc desde ATP. El AMPc activa a una protein kinasa A que fosforila proteinas las que ejercen la accion fisiologica. El AMPc se degrada por a 5´-AMP por una fosfodiesterasa que se inhibe por la cafeina (esta aumenta las acciones fisiologicas del AMPc). MECANISMO DEL INOSITOL TRIFOSFATO (IP3) Union de TRH a su receptor => proteina G que activa fosfolipasa C. Fosfolipasa C libera DAG + IP3 de lipidos de membrana. IP3 moviliza el Ca del reticulo endoplasmatico. Ca + DAG activan a protein kinasa C que fosforila proteinas y ejerce accion fisiologica. El DAG puede desviarse a formar acido araquidonico y prostaglandinas.

MECANISMOS DE RECEPTORES CATALITICOS Hormona se une a receptores que presentan o estan asociados con actividad enzimatica en el lado intracelular. GUANIL CICLASA

PAN => Receptor con actividad guanil ciclasa que convierte el GTP a GMPc que actua como segundo mensajero.

NO => Mediante un receptor guanil ciclasa intrinseco, GMPc = segundo mensajero. TIROSIN KINASAS

Hormona se une a receptores que son o estan asociados a tirosin kinasas que al activarse fosforila restos de tirosina en proteinas = accion biologica. RECEPTOR TIROSIN KINASA Receptor con actividad intrinseca de tirosin kinasa, 2 tipos:

Monomero: Union del ligando causa dimerizacion del receptor = activacion de tirosin kinasa intrinseca y fosforilacion de residuos de tirosina. Ej: Receptor de factor de crecimiento nervioso. Dimero: Union de la hormona activa a tirosin kinasa intrinseca = fosforilacion de residuos de tirosina. Ej: Insulina e IGF-1. RECEPTOR ASOCIADO A TIROSIN KINASA Mecanismo de la GH, el lado intracelular no presenta actividad tirosin kinasa pero esta asociado covalentemente a una tirosin kinasa => Familia Janus de receptor asociado a tirosin kinasa = JAK. Union de la GH causa dimerizacion del receptor y la activacion de la tirosin kinasa (JAK) que tiene como blancos transductores de señales y activadores de transcripcion (STA) que causan transcripcion de ARNm y sintesis de proteinas.

SEPTIMA PARTE: CELULAS MADRE Celula madre: Celula que puede dividirse ilimitadamente y puede diferenciarse en celula especializada. 2 CARACTERISTICAS: Autorenovacion: Varias mitosis sin diferenciarse. Potencia: Diferenciacion a celulas especializadas. Totipotentes => Tejidos embrionarios y extraembrionarios, pueden contruir un organismo. Pluripotentes => Capaces de transformarse en cualquier tejido corporal.

Multipotentes => Diferenciacion en celulas de familas cercanas. Ej: Celulas hematopoyeticas. Oligopotentes => Celulas se diferencian a pocos grupos celulares. Ej: Mieloides y linfoides. Unipotentes => Solo en una sola linea celular.

FUENTES Embrionarias => blastocisto. Cordon umbilical => sangre del cordon del RN. Derivadas de placenta. Adultas => Medula osea, piel, etc. CELULAS MADRE EMBRIONARIAS De la morula (totipotentes) o blastocisto (pluripotentes) => fertilizacion invitro, transferencia nuclear de embriones. Mayor potencia, facil aislamiento y cultivo. Pueden originar procesos tumorales, diferenciacion no deseada ademas de problemas eticos. CELULAS MADRE ADULTAS Indiferenciadas y poco numero en organos y tejidos diferenciados. Permanecen quiescentes y se activan en daño tisular, son MULTIPOTENTES. Fuentes: Mioblastos, condroblastos, osteoblastos, medula osea, cels hematopoyeticas, cordon umbilical, testiculos, endotelio corneal, endotelio vascular, SNC. No se requiere embriones y compatible con el donante. Dificil de aislar y cultivar, pueden tomar nuevos fenotipos al realizar fusion nuclear. APLICACIONES DIABETES

Celulas del islote de Langerhans se toman y se colocan en medula osea de ratones => produccion de insulina humana en animales => problema = cantidad pequeña de insulina que se obtiene.

ENFERMEDADES NEUROLOGICAS Parkinson, esclerosis lateral amiotrofica, Alzheimer => celulas embrionarias y adultas pueden diferenciarse en neuronas dopaminergicas pero no se sabe si forman nuevos circuitos. Al colocar neurosferas (celulas madre neurales) en ratones se promueve la remielinizacion y por tanto soluciona la esclerosis multiple. LESIONES MEDULARES Capacidad de formacion de neuronas motoras al inyectar celulas madre embrionarias, diferenciacion mediante factores de crecimiento locales. ENFERMEDADES CARDIOVASCULARES Aislamiento de celulas madre en el musculo cardiaco => usadas para reconstituir corazon dañado, se han realizado implantaciones pero no se demostro que transmitan impulsos electro mecanicos.

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