resuelva los agregados y los productos de degradaciÓn de ... · monómeros, dímeros, agregados y...

Columnas para cromatografía de exclusión por tamaño BioHPLC Agilent

RESUELVA LOS AGREGADOS Y LOS PRODUCTOS DE DEGRADACIÓN DE PROTEÍNAS CON RAPIDEZ Y SEGURIDAD

La cromatografía por exclusión de tamaño (SEC) es una herramienta crítica para cuantificar monómeros, dímeros, agregados y potenciales degradantes. Estos tipos de separaciones de proteínas requieren unos niveles máximos de precisión y velocidad.

Las columnas BioHPLC Agilent para cromatografía por exclusión de tamaño (SEC) ofrecen resultados rápidos, precisos y fiables para sus análisis biofarmacéuticos. Son fáciles de integrar en su flujo de trabajo y están disponibles en una amplia gama de dimensiones y tamaños de poro, para garantizar la separación perfecta de forma sistemática.

Como fabricante líder de instrumentos y columnas SEC durante más de 30 años, Agilent desarrolla continuamente nuevos productos que ofrecen la resolución más alta y las separaciones más rápidas del sector. Así puede ofrecer productos que pueden cambiar la vida de las personas que los necesitan de forma rápida y asequible.

La incorporación más reciente a la familia de columnas Agilent SEC es la AdvanceBio SEC, una nueva tecnología con nuevas partículas y fases estacionarias diseñadas y concebidas para una cuantificación precisa y exacta de agregados de anticuerpos monoclonales y proteínas.

COLUMNAS PARA CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN POR TAMAÑO BioHPLC AGILENT

CONSIGA SEPARACIONES RÁPIDAS Y DE ALTA RESOLUCIÓN PARA DEGRADACIÓN Y AGREGACIÓN DE PROTEÍNAS

3

¿Qué columna SEC es la más adecuada para su aplicación?La amplia selección de columnas SEC de Agilent le ofrece todo lo que necesita para obtener separaciones perfectas en función de sus analitos y parámetros de método. Este gráfico le ofrece una visión general de las gamas de tamaños de poros que proporcionan los mejores resultados para los tipos de moléculas más comunes.

Agilent Bio SEC 100 Å



100 D 1 kD 10 kD 100 kD 1.000 kD 10.000 kD

InsulinaMioglobina

Ovoalbúmina

BSA IgG Tiroglobulina

ProSEC 300S

ZORBAX GF-250

ZORBAX GF-450


Péptidos Proteínas globulares Proteínas conjugadas y biomoléculas grandes



100.000 kD

COLUMNAS IDÓNEAS PARA EL ANÁLISIS DE PROTEÍNAS Y ANTICUERPOS MONOCLONALES

Agilent AdvanceBio SEC 300 Å

Agilent AdvanceBio SEC 130 Å NUEVO

Nueva tecnología diseñada para separaciones de anticuerpos monoclonales Columnas Agilent AdvanceBio SEC ..............................................4

Análisis de proteínas utilizando la espectrometría de masas Columnas para HPLC Agilent Bio SEC-3 ......................................9

Biomoléculas grandes Columnas HPLC Agilent Bio SEC-5 ............................................11

Proteínas globulares con una única columna Columnas Agilent ProSEC 300S .................................................12

Para protocolos SEC que requieran la nomenclatura USP L35 Columnas Agilent ZORBAX GF-250 y ZORBAX GF-450 ..........13

Investigación, QC/QA y fabricación Flexibilidad con una sola columna ..............................................14 Purificación ...................................................................................23 Detectores avanzados .................................................................24

Sistemas LC para identificación de proteínas y determinación del perfil de impurezas ................................25

Información sobre pedidos ..........................................................28

CONTENIDO: Catálogo completo de columnas SEC BioHPLC para las aplicaciones biomoleculares de vanguardia

Para obtener más información sobre cómo obtener separaciones rápidas y de alta resolución para degradación y agregación de proteínas, visite www.agilent.com/chem/BioHPLC

4

2 4 6 8 10 12 140

25

50

75

100

125

150

175

2 4 6 8 10 12 140

100

200

300

400

5001

2 3 4

5

mAU

mAU

min

min

1 2

3

4

5

COLUMNAS AGILENT ADVANCEBIO SEC

Las columnas AdvanceBio SEC consiguen una cuantificación precisa y exacta para análisis SEC de agregados de anticuerpos monoclonales y proteínas. Esta nueva tecnología SEC está diseñada y concebida para:

• Alta resolución para una cuantificación más precisa

• Mayores velocidades de análisis para cumplir los plazos

• Sin modificaciones en la integridad de la muestra

• Cuantificación sensible de agregados, incluso con niveles de concentración bajos

Además, las columnas AdvanceBio SEC mejoran la productividad del laboratorio proporcionando métodos robustos y fiables que eliminan la necesidad de repetir análisis de muestras. También es posible transferir con facilidad los métodos a otras ubicaciones como control y garantía de calidad, reduciendo el riesgo de fallos de lotes y candidatos en la última fase.

Óptima resolución para una cuantificación precisa

Los cromatogramas de la derecha comparan la separación de la filtración con gel BioRad conseguida con columnas AdvanceBio SEC 300 Å y 130 Å.

Cromatograma superior: La columna AdvanceBio SEC 300 Å proporciona resolución para cuantificar proteínas de gran tamaño, incluidos anticuerpos monoclonales.

Cromatogramas inferiores: La columna AdvanceBio SEC 130 Å proporciona resolución para cuantificar fragmentos de proteínas, proteínas pequeñas y péptidos.

Estándar de filtración con gel BioRad (ref. 1511901)

2 4 6 8 10 12 14 min

0

10

20

30

40

50

60

70

mAU

1

23

45

Separación de la mezcla de filtración con gel BioRad mediante AdvanceBio SEC 300 Å y 130 Å. La columna 300 Å proporciona mayor resolución.

Separación en AdvanceBio SEC 130 Å de una mezcla de proteínas y péptidos; muestra la resolución de pequeños péptidos y proteínas.

Columna: AdvanceBio SEC, 7,8 x 300 mm

1. Ovoalbúmina (pollo)2. Mioglobina (equina)3. Aprotinina (bovina)4. Neurotensina5. Angiotensina II

1. Tiroglobulina 2. g-globulina bovina 3. Ovoalbúmina (pollo) 4. Mioglobina (equina) 5. Vitamina B12

1. Tiroglobulina 2. g-globulina bovina 3. Ovoalbúmina (pollo) 4. Mioglobina (equina) 5. Vitamina B12

Fase móvil: fosfato sódico 150 mM, pH 7,0

130 Å

130 Å

300 Å

5

0,80

0,90

1,00

1,10

1,20

1,30

1,40

1,50

1,60

1,70

0 50 100 150 200 250 300 350 400

Fact

or d

e re

solu

ción

(mon

ómer

o /

dímer

o)

Resolución tras cuatrocientas inyecciones Superposición de los cromatogramas 1 y 400

Resultados a tiempo. Aumente el número de muestras analizadas

Al reducir la longitud de la columna AdvanceBio SEC de 300 mm a 150 mm, y al aumentar la velocidad de flujo de 1,0 ml/min a 2,0 ml/min, el tiempo de análisis se ha reducido de doce a tres minutos. Además, la resolución del monómero y del dímero de IgG resultó suficiente para la cuantificación, y fue homogénea durante más de cuatrocientas inyecciones.

Columna: Agilent AdvanceBio SEC 300 Å, 7,8 x 150 mm

Fase móvil: fosfato sódico 150 mM, pH 7,00,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5

0

10

20

30

40

50

60mAU

min

Patrones de proteínas para AdvanceBio SEC 130 Å de AgilentMezcla de proteínas que consta de 5 proteínas cuidadosamente seleccionadas (ovoalbúmina, mioglobina, aprotinina, neurotensina y angiotensina II) diseñada para calibrar las columnas de exclusión por tamaño AdvanceBio 130 Å de Agilent. Este patrón se puede usar periódicamente para calibrar la columna y asegurar el rendimiento ideal del sistema en diversas aplicaciones que implican la purificación y el análisis de proteínas.

Patrones de proteínas para AdvanceBio SEC 300 Å de AgilentMezcla de proteínas que consta de 5 proteínas cuidadosamente seleccionadas (tiroglobulina, g-globulina, ovoalbúmina, mioglobina y angiotensina II) diseñada para calibrar las columnas de exclusión por tamaño AdvanceBio 300 Å de Agilent. Este patrón se puede usar periódicamente para calibrar la columna y asegurar el rendimiento ideal del sistema en diversas aplicaciones que implican la purificación y el análisis de proteínas.

Superposición de cromatogramas de IgG: Inyección 1,100, 200, 300, 400

6

Sin modificaciones en la integridad de la muestra

Como parte del protocolo de instalación, las generaciones anteriores de las columnas SEC de proteínas debían acondicionarse con BSA para bloquear los sitios responsables de interacciones no específicas. La nueva fase estacionaria de enlace usada en las columnas Agilent AdvanceBio SEC elimina este problema al proporcionar una superficie inerte que reduce las interacciones no específicas y mantiene la integridad de la muestra.

2 4 6 8 10 12 14010203040

2 4 6 8 10 12 14010203040

Análisis 1

Análisis 1300

min

min

mAU

mAU

Gráfico que muestra la resolución entre el monómero y el dímero de IgG tras una secuencia de 1.300 inyecciones.

2 4 6 8 10 12 14

-2-101234567

mAU

min

Inyecciones Área de pico de monómero

1 50,52 49,63 50,64 50,05 50,2

No se observaron problemas para la recuperación de proteínas. Se conservó la integridad de la muestra

Columna: AdvanceBio SEC, 300 Å, 7,8 x 300 mm


Cinco inyecciones de réplica de BSA 0,1 mg/ml, 1 µl equivalente a 0,1 µg de BSA en columna. El área de pico de BSA también es uniforme, incluso con cargas en columna de 0,1 μg.



Muestra: IgG

1,70 1,80 1,90 2,00 2,10 2,20 2,30 2,40 2,50 2,60

0 200 400 600 800 1000 1200 1400

Fact

or d

e re

solu

ción

(mon

ómer

o /

dímer

o)

Injection Number

El perfil de una muestra de IgG no cambió, ni siquiera después de 1.300 inyecciones (parte superior izquierda). Los factores de resolución y la cuantificación del monómero y el dímero de IgG también se mantuvieron dentro del rango de trabajo durante toda la vida útil de la columna.

7

Realice la cuantificación de agregados, incluso a bajos niveles

Se consiguieron resolución y estabilidad de línea de base con una columna AdvanceBio SEC-3, 300 Å, 7,8 x 300 mm, 2,7 μm. Ello permitió la cuantificación de bajo nivel de dímeros y agregados en una muestra con anticuerpos monoclonales y conjugados anticuerpo-fármaco (ADC).

Menores límites de detección (LOD) y límites de cuantificación (LOQ)

Los valores LOD y LOQ fueron de 15 µg/ml y 31 µg/ml respectivamente para trastuzumab y el conjugado anticuerpo-fármaco, lo que demuestra que el método es sensible.

min5 6 7 8 9 10 11 12

mAU

0

0,5

1

1,5

2

2,5DAD1 B, Sig = 280 (LOQ)

DAD1 B, Sig = 280 (blanco)DAD1 B, Sig = 280 (LOD)

LOD

LOQ

Blanco

Trastuzumab

min5 6 7 8 9 10 11 12

mAU

0

0,5

1

1,5

2

2,5

DAD1 B, Sig = 280 (blanco)

DAD1 B, Sig = 280 (LOQ)DAD1 B, Sig = 280 (LOD)

Conjugado anticuerpo-fármaco

LOD

LOQ

Blanco

Cromatogramas de los valores LOD y LOQ del trastuzumab y del conjugado anticuerpo-fármaco, superpuestos con el del blanco.

min2 4 6 8 10 12 14

mAU

0

20

40

60

80

100

120

140

160DAD1 B, Sig = 280

7,125

8,107

min7 7,5 8 8,5 9

mAU

0

5

10

15

20

25

7,125

8,107

Monómero ADC

Agregado ADC

Columna: AdvanceBio SEC-3 300 Å, 7,8 x 300 mm

Fase móvil: (PBS), fosfato sódico 50 mM, cloruro sódico 150 mM, pH 7,4

Velocidad de flujo: 0,8 ml/min

Instrumento: LC cuaternaria bioinerte Agilent 1260 Infinity

Muestra: Trastuzumab y conjugado anticuerpo-fármaco (T-DM1)

Perfil SEC de T-DM1 (ADC) intacto.

8

AGILENT 1260 INFINITY BIO-SEC MULTI DETECTOR SUITE (MDS)

ANÁLISIS BIOMOLÉCULAR INFINITAMENTE SUPERIOR

La SEC ha sido un caballo de batalla en el análisis de biopolímeros durante décadas, especialmente para detectar y cuantificar la agregación de proteínas. La utilización de detectores avanzados puede aumentar la sensibilidad a estos parámetros críticos y facilitar información adicional para el analista, lo que resulta especialmente importante con el progresivo aumento de normativas. El sistema Agilent 1260 Infinity Bio-SEC MDS es una solución destinada al análisis de biomoléculas grandes.

Los detectores avanzados determinan de forma muy precisa los pesos moleculares, el tamaño y la forma de la biomolécula.

September 30, 2015

Confidentiality Label

Técnicas de detección avanzadas

El diseño de los componentes exentos de metal en la ruta de flujo de muestras y la ausencia de hierro y acero en el sistema de bombeo garantizan la integridad de la biomolécula, minimizando las interacciones de superficie indeseadas y proporcionando confianza en la calidad de los datos. Este sistema de alto rendimiento, combinado con un software intuitivo y fácil de usar, permite obtener estos datos avanzados y reproducirlos fácilmente.

· Pesos moleculares precisos: determine la masa molar real, no la relativa.

· Agregación sensible: descubra la presencia de agregación en cantidades mucho más pequeñas.

· Estudio del tamaño molecular: determine el radio de hidratación de la biomolécula.

· Acceso a todo: obtenga los resultados que necesita, independientemente de su nivel de experiencia.

· Reproducible: aumente la reproducibilidad de la detección avanzada.

· Mantenimiento de la integridad de la muestra: superficie de contacto de la muestra libre de metales.

· Sencillez: información avanzada a través de una interfaz de usuario sencilla.

La columna AdvanceBio SEC presenta el menor desprendimiento de partículas y, en consecuencia, el menor ruido de línea base.

Agilent: AdvanceBio SEC 300 Å Competidor ACompetidor B

9

COLUMNAS PARA HPLC AGILENT BIO SEC-3

COMPATIBILIDAD DE LA ESPECTROMETRÍA DE MASAS PARA LA IDENTIFICACIÓN DE PICOS

La tecnología de partículas de Bio SEC-3 es estable frente a los eluyentes usados en MS, gracias a lo cual las columnas Agilent Bio SEC-3 son totalmente compatibles con la espectrometría de masas. Las partículas robustas también garantizan la estabilidad de línea de base y la baja supresión de la señal de MS. Otras ventajas:

• Compatibilidad con las fases móviles orgánicas/acuosas desnaturalizantes usadas para SEC-MS.

• Estabilidad excelente en condiciones de alto y bajo contenido de sal.

• Escalabilidad desde las preparaciones analíticas a las de laboratorio.

Las columnas Agilent Bio SEC-3 utilizan la misma tecnología de partículas que la columna Agilent SEC-5 y, de este modo, proporcionan una opción de mayor eficiencia cuando se requiere más resolución para las biomoléculas más pequeñas.

Fase ligada

Tamaño de poro (Å)

Tamaño de partícula (μm)

Gama PM de proteína (Da)

Rango de pH

Velocidad de flujo (ml/min)

Presión operativa típica (bar)

Bio SEC-3 100 3 100 a 100.000 2 a 8,5 0,1 a 1,25 (7,8 mm DI); 0,1 a 0,4 (4,6 mm DI)

103 (1.500 psi)

Bio SEC-3 150 3 500 a 150.000 2 a 8,5 0,1 a 1,25 (7,8 mm DI); 0,1 a 0,4 (4,6 mm DI)

103 (1.500 psi)

Bio SEC-3 300 3 5.000 a 1.250.000

2 a 8,5 0,1 a 1,25 (7,8 mm DI); 0,1 a 0,4 (4,6 mm DI)

103 (1.500 psi)

Especificaciones de la columna Bio SEC-3

Curvas de calibración de proteínas de Bio SEC-3

Columna: Bio SEC-3 7,8 x 300 mm, 3 µm

Fase móvil: fosfato de sodio 150 mM, pH 7,0

Velocidad de flujo: 1,0 ml/min

Detector: UV

Volumen de retención

Proteínas PM/Dalton 300 Å 150 Å 100 Å

Tiroglobulina 670.000 6,34 5,50 5,63

g-globulina 150.000 8,03 6,24 5,74

BSA 67.000 8,90 7,00 6,03

Ovoalbúmina 45.000 9,57 7,70 6,41

Mioglobina 17.000 10,12 8,50 7,10

Ribonucleasa A 12.700 10,40 8,80 7,46

Vitamina B12 1.350 11,90 11,40 10,20

1.000.000

100.000

10.000

1.000

1004 5 6 7 8 9 10 11 12 13

300 Å

150 Å

100 Å

Volumen de retención (ml)

Peso

mol

ecul

ar

10

3x10

00,250,5

0,751

1,251,5

1,752

2,252,5

2,753

3,253,5

3,754

4,25 46.877,1

45.800 46.000 46.200 46.400 46.600 46.800 47.000 47.200 47.400 47.600 47.800 48.000

4x10

00,10,20,30,40,50,60,70,80,9

11,11,2

23.558,7

23.744,2

22.700 2.2800 22.900 23.000 23.100 23.200 23.300 23.400 23.500 23.600 23.700 23.800 23.900 24.000 24.100 24.200 24.300 24.400 24.500 24.600 24.700

G0F/G0F

G0F/G1F

G1F/G1F

G1F/G2F G0/G0F

4x10

00,10,20,30,40,50,60,70,80,9

11,11,21,31,41,51,61,71,8 148.225,8

148.066,4 148.387,2

147.918,9

Cuentas frente a espectro de masas deconvolucionado (amu)

146.600 146.800 147.000 147.200 147.400 147.600 147.800 148.000 148.200 148.400 148.600 148.800 149.000 149.200 149.400 149.600 149.800

G0

G0F

G1F

G2F

N-acetilglucosamina ManosaGalactosa Fucosa

Cuentas frente a espectro de masas deconvolucionado (amu) Cuentas frente a espectro de masas deconvolucionado (amu)

Cuentas frente a espectro de masas deconvolucionado (amu)

HSNH2

OH

O

3x10

00,20,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2 2,2 2,4 2,6 2,8 3 3,2 3,4 74.030,8

74.193,1

74.353,1 73.879,3

73.000 73.200 73.400 73.600 73.800 74.000 74.200 74.400 74.600 74.800 75.000 75.200 75.400

G0F

G0

G1F

G2F

La espectrometría de masas es una excelente técnica para la determinación de la estructura e identidad de los picos.

La interconexión de SEC con MS puede proporcionar información adicional no disponible cuando se usa DAD o UV. Sin embargo, las fases móviles típicas usadas para SEC contienen tampones y sales, por lo que son incompatibles con MS. Al cambiar a una fase móvil desnaturalizante (como el acetonitrilo con agua mezclada con ácidos fórmico y trifluoroacético), la columna SEC se puede conectar directamente con el sistema MS.

Análisis SEC-MS (mAB inalterado)


LC: Sistema LC cuaternario bioinerte Agilent 1290 Infinity

MS: Sistema Q-TOF Agilent 6540

MS

UV (214 nm )

a

b

c d

a

b

c d

Ampliación

Herceptin 6

x10

1,5 1,75

2 2,25 2,5

2,75 3

3,25 3,5

3,75

2x10

0 0,2 0,4 0,6 0,8

1 1,2

1 2 3 4 5 6

7 8 9 10 11 12 13 14 15

Responsive vs, Acquisition Time (min)Fase móvil: Acetonitrilo al 20%, ácido fórmico al

0,1%, ácido trifluoroacético al 0,1%

Velocidad de flujo: 1 ml/min

Temperatura: 24 °C

Pico b

Pico c

Pico a

Pico d

El pico a representa el pico del monómero de mAB inalterado con diferentes formas glico. Los picos b, c y d son fragmentos.

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COLUMNAS PARA HPLC AGILENT BIO SEC-5

RENDIMIENTO EXCELENTE PARA BIOMOLÉCULAS GRANDES

Para biomoléculas grandes y muestras con componentes de distintos pesos moleculares, las columnas Agilent Bio SEC-5 son la elección perfecta. Tienen partículas de sílice de 5 µm recubiertas con una capa hidrofílica, neutra y patentada para ofrecer niveles insuperables de eficiencia y estabilidad, con seis tamaños de poro distintos para proporcionar una resolución óptima en todo el rango de pesos moleculares.

• Resolución excepcional para moléculas grandes.

• Altos niveles de estabilidad y eficiencia gracias a la capa hidrofílica neutra y patentada.

• Mejora de la resolución y la capacidad de picos gracias al empaquetado diseñado específicamente que aumenta el volumen del poro.

• Rendimiento robusto: Reproducibilidad extraordinaria y larga vida útil de la columna.

• Estabilidad excelente en niveles de pH alto, sal alta y sal baja.

• Desarrollo de métodos flexible: Compatible con la mayoría de tampones acuosos.

• Amplia aplicabilidad: Tamaño de poro de hasta 2.000 Å para vacunas y biomoléculas de alto peso molecular.

Fase ligada




Rango de pH



Bio SEC-5 100 5 100 a 100.000

2 a 8,5 0,1 a 1,25 (7,8 mm DI); 0,1 a 0,4 (4,6 mm DI)

103 (1.500 psi)

Bio SEC-5 150 5 500 a 150.000

2 a 8,5 0,1 a 1,25 (7,8 mm DI); 0,1 a 0,4 (4,6 mm DI)

103 (1.500 psi)

Bio SEC-5 300 5 5.000 a 1.250.000

2 a 8,5 0,1 a 1,25 (7,8 mm DI); 0,1 a 0,4 (4,6 mm DI)

103 (1.500 psi)

Bio SEC-5 500 5 15.000 a 2.000.000

2 a 8,5 0,1 a 1,25 (7,8 mm DI); 0,1 a 0,4 (4,6 mm DI)

103 (1.500 psi)

Bio SEC-5 1.000 5 50.000 a 7.500.000

2 a 8,5 0,1 a 1,25 (7,8 mm DI); 0,1 a 0,4 (4,6 mm DI)

103 (1.500 psi)

Bio SEC-5 2.000 5 >10.000.000 2 a 8,5 0,1 a 1,25 (7,8 mm DI); 0,1 a 0,4 (4,6 mm DI)

103 (1.500 psi)

Especificaciones de la columna Bio SEC-5

Curvas de calibración de proteínas de Bio SEC-5

Disponibilidad de varios tamaños de poro para una resolución óptima en todo el rango de pesos moleculares.

Volumen de retención

Proteínas PM/Dalton 1000 Å 500 Å 300 Å 150 Å 100 Å

Tiroglobulina 670.000 10,07 8,23 7,03 5,82 5,77g-globulina 158.000 10,88 9,80 8,57 6,55 5,79BSA 67.000 11,13 10,44 9,44 7,29 6,00Ovoalbúmina 45.000 11,28 10,83 9,89 7,90 6,40Mioglobina 17.000 11,44 11,28 10,42 8,66 7,05Ribonucleasa A 12.700 11,52 11,41 10,58 8,93 7,32Vitamina B-12 1.350 12,00 12,59 11,78 11,49 10,30Uracilo (marcador de penetración total) 112 12,08 12,68 12,21 12,13 11,41

4100

1.000

10.000

100.000

1.000.000

Peso

mol

ecul

ar

Volumen de retención (ml)5 6 7 8 9 10 11 12 13

1000 Å500 Å300 Å150 Å100 Å


Fase móvil: 150 mM de fosfato sódico, pH 7,0

Velocidad de flujo: 1,0 ml/minDetector UV

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COLUMNAS AGILENT PROSEC 300S

ANALICE LAS PROTEÍNAS GLOBULARES CON UNA ÚNICA COLUMNA

Las columnas ProSEC 300S se han diseñado como una solución de columna única para análisis de proteínas globulares. La optimización y selección del tamaño de poro proporciona un rango de resolución lineal ampliado para que esta única columna pueda utilizarse en análisis en toda la gama completa de proteínas globulares. Su partícula robusta no se fragmenta durante el uso, lo que impide la disolución de partículas y le ofrece una línea de base excepcionalmente estable.

• Rendimiento estable: partículas de sílice mecánicamente robustas que no disuelven durante el uso.

• Desarrollo de métodos sencillo: el rango de resolución lineal ampliado elimina la necesidad de selección del tamaño de poro. Una única columna para analizar la mayoría de proteínas globulares.

• Opciones para ayudarle a perfeccionar su separación: dos diámetros internos de columna para adaptarse a SEC de multidetector.

• Aumento de la sensibilidad cuando se utiliza con detectores de dispersión de luz para identificar dímeros, trímeros y agregados.

Fase ligada




Rango de pH



ProSEC 300S

300 5 1.500 a 800.000

2 a 7,5 <1,5 (7,5 mm DI); <0,5 (4,6 mm DI)

250 (3.700 psi)

Especificaciones de la columna ProSEC 300S

Calibración de la columna ProSEC 300S con proteínas globulares

Esta curva de calibración muestra una relación lineal entre el tiempo de retención y el logaritmo del peso molecular, demostrando que tiene lugar la separación pura por exclusión de tamaño.

Columna: ProSEC 300S 7,5 x 300 mm, 5 µm

Fase móvil: 50 mM KH2PO4-K2HPO4 (a pH 6,8) con 0,3 M NaCl

Velocidad de flujo: 1,0 ml/minDetección: UV 280 nmMuestra: Muestras de proteínas

5 7 9 10Tiempo de retención (min)

133

3,5

4

4,5

5

5,5

6

Log

M

PM/Dalton Proteína

670.000 Tiroglobulina155.000 g-globulina66.430 Albúmina de suero bovino44.287 Ovoalbúmina29.000 Anhidrasa carbónica16.700 Mioglobulina12.384 Citocromo c1.423 Bacitracina

Pesos moleculares de las proteínas

13

0

12

3 4

5 6

1

2

3 4

56

5 10 15

0 5 10 15

0

12

3 4

5 6

1

2

3 4

56

5 10 15

0 5 10 15

COLUMNAS AGILENT ZORBAX GF-250 Y GF-450

PARA MÉTODOS SEC QUE REQUIERAN LA NOMENCLATURA USP L35

Las columnas de exclusión por tamaño (filtración por gel) ZORBAX GF-250 y ZORBAX GF-450 cuentan con una fase ligada basada en diol hidrofílica para la alta recuperación de proteínas (normalmente >90 %), además de una modificación única de sílice de circonio para un rango operativo de pH más amplio.

• Análisis integral: variedad de dimensiones de columna semipreparativas o preparativas que pueden usarse a velocidades de flujo de hasta 3 ml/min.

• Alta recuperación: base ligada de diol hidrofílica que genera >90 % de recuperación.

• Robusto: microesferas de sílice porosas de tamaño preciso, con un tamaño de poro y una distribución de tamaños de partículas muy estrechos.

• Compatible con modificadores orgánicos (<25 %) y desnaturalizantes para minimizar las interacciones no específicas.

• Amplia aplicabilidad: amplio rango de valores de pH utilizables: 3 a 8.

Esta separación de proteínas muestra la relación complementaria entre las columnas preparativas GF-450 y GF-250. La columna GF-450 separó fidedignamente las biomoléculas de alto peso molecular, que se excluyeron del rango de separación lineal de la columna GF-250 (con un tamaño de poro más pequeño).

Fase ligada




Rango de pH



ZORBAX GF-250 150 4 4.000 a 400.000 3,0 a 8,0 <3,0 350 (5.104 psi)

ZORBAX GF-450 300 6 10.000 a 900.000 3,0 a 8,0 <3,0 350 (5.104 psi)

Especificaciones de las columnas ZORBAX GF-250 y ZORBAX GF-450

Separaciones de proteínas en columnas semipreparativas

Columna: ZORBAX GF-250 9,4 x 250 mm, 4 μm

Columna: Agilent ZORBAX GF-450 9,4 x 250 mm, 6 μm

Fase móvil: 0,2 M Na2HPO4, pH 7.0 Velocidad de flujo: 5,0 ml/minDetección: UV 280 nmMuestra: 200 µl

1. Tiroglobulina, 5,43 min2. Dímero BSA, 6,19 min3. Monómero BSA, 6,93 min4. Ribonucleasa A, 8,74 min5. Poli-DL-alanina (1-5 kDa), 9,90 min6. Uracilo, 12,13 min

ZORBAX GF-250

ZORBAX GF-450

14

INVESTIGACIÓN, QC/QA Y FABRICACIÓN

FLEXIBILIDAD PARA LAS MUESTRAS CON UNA SOLA COLUMNA ADVANCEBIO SEC

Una sola columna AdvanceBio SEC y un solo método usados para el análisis de varios compuestos bioterapéuticosVarios tipos de muestras, anticuerpos monoclonales bioterapéuticos, innovadores, biosimilares y ADC con la misma fase móvil acuosa.

Columna: AdvanceBio SEC-3 300 Å, 7,8 x 300 mm

Fase móvil: (PBS), fosfato sódico 50 mM, cloruro sódico 150 mM, pH 7,4

Velocidad de flujo: 0,8 ml/min Sistema LC cuaternario bioinerte Agilent 1260 Infinity

Muestra: Rituximab original, rituximab biosimilar, cetuximab original, herceptin original, ADC

min2 4 6 8 10 12 14

mAU

0200400600800

1.0001.2001.4001.600

DAD1 A, Sig = 220,Rituximab original

min2 4 6 8 10 12 14

mAU

0200400600800

1.0001.2001.4001.600

DAD1 A, Sig = 220,Rituximab biosimilar

min2 4 6 8 10 12 14

mAU

0100200300400500600700 DAD1 A, Sig = 220,

Cetuximab original

min2 4 6 8 10 12 14

mAU

0250500750

1.0001.2501.5001.750 DAD1 A, Sig = 220,

Herceptin original

A B

C D

Perfil SEC de mAB terapéuticos inalterados, A-rituximab original, B-rituximab biosimilar, C-cetuximab original y D-herceptin original.

Cromatograma obtenido con una columna AdvanceBio SEC del conjugado anticuerpo-fármaco en condiciones naturales (control; curva roja) superpuesto con el de una solución de 2 mg/ml de conjugado anticuerpo-fármaco en condiciones extremas de pH y temperatura.

min2 4 6 8 10 12 14

mAU

0

200

400

600

800

1.000

1.200

1.400

1.600

DAD1 A, Sig=220, ADC en condiciones extremas de temperatura/pH

6,654 7,1

41

8,067

11,58

6 12,73

7

DAD1 A, Sig=220, ADC inalterado

8,106

Conjugado anticuerpo-fármaco agregado

Conjugado anticuerpo-fármaco inalterado

Conjugado anticuerpo-fármaco degradado

Tiempo de retención Área de pico

Muestras Media (min) DER Media (mAU/min) DER

Rituximab original 8,28 0,04 99,33 1,21

Rituximab biosimilar 8,29 0 100 0

Cetuximab original 7,86 0 99,60 0,96

Herceptin original 8,034 0 100 0

Conjugado anticuerpo-fármaco 8,106 0,005 98,91 0,33

Precisión del tiempo de retención y del área de pico (n = 6)

15


REALICE SEPARACIONES POR TAMAÑO EFICIENTES CON UN AMPLIO RANGO DE FASES MÓVILES

Resolución y rendimiento robusto en diversas condiciones salinasLas columnas Agilent AdvanceBio SEC proporcionan un rendimiento robusto en diversas condiciones salinas y durante largos periodos de tiempo.

Su mecanismo de separación SEC debe basarse en el tamaño, sin interacciones secundarias con la fase estacionaria. La innovadora tecnología de partículas utilizada en las columnas AdvanceBio SEC elimina la necesidad de utilizar altas concentraciones salinas para conseguir separaciones por tamaño, reduciendo las interacciones iónicas no específicas.

Fosfato 100 mM, NaCl 50 mMFosfato 80 mM, NaCl 70 mMFosfato 60 mM, NaCl 90 mMFosfato 40 mM, NaCl 110 mMFosfato 20 mM, NaCl 130 mM


pH 7,5

pH 6,0

200

100

0

2 4 6 8 10

200

100

0

2 4 6 8 10



pH 7,5

pH 6,0

200

100

0

2 4 6 8 10

200

100

0

2 4 6 8 10

Aquí, las formas de pico son uniformes y no muestran la característica distorsión de las interacciones no específicas.

No se requiere sal: la retención de SEC está relacionada con el tamaño molecular en disolución. Los ligeros cambios en los tiempos de elución probablemente se deban a la influencia del pH y la concentración salina sobre el radio hidrodinámico de las proteínas.

Columna: Estándar de filtración con gel BioRad n.º 1511901 AdvanceBio SEC-3, 300 Å, 7,8 x 300 mm

16

Influencia de la concentración del tampón fosfato y del pH sobre la cuantificación de monómeros y dímeros

Ahorre tiempo y dinero en la preparación del tampón

F+

NaCl

G+

NaCl

H+

NaCl

I+

NaCl

J+

NaCl

F G H I J

Preparación manual de tampones

Mezcla dinámica, on-line y automatizada de tampones

El software Agilent Buffer Advisor le ayuda a automatizar la producción de tampones. La mezcla dinámica de solo cuatro soluciones madre elimina la necesidad de preparar y valorar varias disoluciones tampón. Potencie el rendimiento: desarrollo de métodos rápido a través de la preparación automatizada de tampones. Ahorre tiempo: la mezcla cuaternaria facilita la combinación de varios tampones de distintos pH o concentraciones salinas para una preparación más rápida. Reduzca costes: evalúe las condiciones para un eluyente óptimo antes de analizar muestras para reducir los desperdicios de muestras y los tiempos de análisis.


EL SOFTWARE PERMITE LA OPTIMIZACIÓN DEL MÉTODO EN MUCHO MENOS TIEMPO

Los organismos reguladores requieren que los diseños experimentales establezcan el método analítico óptimo, además de robustez y reproducibilidad del método. La realización manual de este proceso requiere la preparación de un elevado número de fases móviles y el equilibrado del sistema LC al cambiar cada fase móvil, un proceso muy laborioso.

El software Buffer Advisor de Agilent simplifica el protocolo permitiendo la preparación de tampones en el sistema a partir de tan solo cuatro componentes (dos tampones, además de agua y solución salina).

En el análisis de la derecha, se investigó la robustez de la cuantificación de monómeros y dímeros de BSA utilizando 20 fases móviles (pH 6,0 a 7,5) y concentraciones del tampón de entre 20 mM y 100 mM.

80 %

82 %

84 %

86 %

88 %

90 %

0 20 40 60 80 100 120Fosfato (mM)

Fosfato (mM)

Monómero (%)

pH 6,0

pH 6,5

pH 7,0

pH 7,5

pH 6,0

pH 6,5

pH 7,0

pH 7,5

Dímero (%)

0 20 40 60 80 100 12010 %

11 %

12 %

13 %

14 %

15 %

80 %

82 %

84 %

86 %

88 %

90 %

0 20 40 60 80 100 120Fosfato (mM)

Fosfato (mM)

Monómero (%)

pH 6,0

pH 6,5

pH 7,0

pH 7,5

pH 6,0

pH 6,5

pH 7,0

pH 7,5

Dímero (%)

0 20 40 60 80 100 12010 %

11 %

12 %

13 %

14 %

15 %


Muestra: BSA

17

Reproducibilidad entre lotes

Si trabaja en laboratorios regulados y tiene que entregar datos cumpliendo los plazos, contar con columnas y métodos robustos resulta esencial.

Con las columnas AdvanceBio SEC se consigue rendimiento y reproducibilidad durante toda la vida útil de la columna. Consulte las páginas 5 y 6 para conocer los datos y los resultados entre columnas y lotes.

Entre instrumentos

La transferencia de métodos a otros instrumentos de LC dentro del mismo departamento o de otros departamentos, ubicaciones o empresas es necesaria según avanzan los productos bioterapéuticos candidatos por el desarrollo hasta su aprobación. El tamaño de partícula de 2,7 µm de las columnas AdvanceBio SEC proporciona una buena resolución a presiones inferiores a 200 bar. El análisis puede realizarse mediante sistemas HPLC, sin necesidad de considerar la disponibilidad instrumental durante el desarrollo de métodos.

2 4 6 8 10 12 140

1020304050607080

2 4 6 8 10 12 140

1020304050607080

mAU

mAU min

min

213

4

5

213

4

5

Análisis de gammaglobulina (IgG) mediante columnas AdvanceBio SEC 300 Å 4,6 x 300 mm, 2,7 µm de dos lotes diferentes de medios. La resolución entre los picos 3 y 4, el dímero y el monómero, así como el porcentaje de las áreas de pico muestran una excelente reproducibilidad entre lotes.

Rs (monómero/dímero) 1,94

Rs (monómero/dímero) 1,98

min0 2 4 6 8 10 12 14

AU

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

Superposición de cuatro inyecciones consecutivas en sistemas HPLC Waters Alliance

Superposición de cuatro cromatogramas consecutivos de un IgG policlonal en una columna AdvanceBio SEC 300 Å, 7,8 x 300 mm, 2,7 µm realizados en un sistema HPLC Alliance de Waters.

Sistema HPLC Alliance

Número de pico Área (%) Área (%)1 2,6 2,92 2,0 2,13 12,8 12,94 78,9 78,45 3,7 3,7

Inyecciones Área (%) n.º 1

Área (%) n.º 2

Área (%) n.º 3

Área (%) n.º 4

1 1,7 1,8 1,7 1,72 10,6 10,5 10,3 10,23 86,5 86,1 86,3 86,64 1,3 1,6 1,7 1,6


CONFÍE EN ADVANCEBIO SEC PARA TERMINAR CON LA INCERTIDUMBRE

18

Sistema LC binario Agilent 1290 Infinity con detector de diodo array Agilent 1260 Infinity (G1315D) y celda de flujo bioinerte (1200 bar). Columna AdvanceBio SEC 4,6 x 300 mm y velocidad de flujo de 0,35 ml/min.

min2 4 6 8 10 12 14

Norm.

0

25

50

75

100

125

150

175

Métodos de cromatografía líquida de ultra alto rendimiento para aumentar la sensibilidadLos instrumentos de cromatografía líquida de ultra alto rendimiento proporcionan la mínima dispersión y alta precisión y son los sistemas LC de elección para las etapas iniciales de desarrollo. Para aplicaciones que requieren sensibilidad y/o pequeñas cantidades de muestra, se usa un DI menor para la columna. Para SEC, esto sería un DI de 4,6 mm. Las velocidades de flujo que suelen usarse con estas columnas son de 0,3 a 0,7 ml/min.

Sistema LC cuaternario bioinerte Agilent 1260 Infinity (600 bares). Columna AdvanceBio SEC 4,6 x 300 mm y velocidad de flujo de 0,35 ml/min.

min2 4 6 8 10 12 14

Norm.

0

25

50

75

100

125

150

175

200


VARIAS DIMENSIONES DE COLUMNA, EL MISMO RENDIMIENTO

Con el fin de comparar la prestación de la columna en diferentes instrumentos, se usaron el patrón de filtración con gel BioRad n.º 1511901 (picos azules) y un IgG policlonal disponible comercialmente. Se generaron datos en diferentes laboratorios, utilizando columnas diferentes y lotes de muestras de prueba diferentes.

19

min0 2 4 6 8 10 12 14

Norm.

0

25

50

75

100

125

150

175

200

Métodos HPLC para robustez Para métodos robustos capaces de proporcionar la precisión y reproducibilidad necesarias para los métodos de QC, los instrumentos de HPLC son con frecuencia el sistema de elección. Para los métodos HPLC robustos, suelen usarse las columnas más grandes de 7,8 mm DI con los sistemas HPLC. Las velocidades de flujo ideales para este tipo de sistema LC son 1,0 ml/min con las columnas de 300 mm de largo si se busca resolución y hasta 2 ml/min con las columnas de 150 mm de largo si se busca aumentar el número de muestras analizadas.

Instrumento de HPLC Agilent 1100 (400 bar). Columna AdvanceBio SEC 7,8 x 300 mm y velocidad de flujo de 1,0 ml/min.

Con las columnas AdvanceBio SEC, no es necesario cambiar de columna ni validar un nuevo método cuando un compuesto candidato pasa de investigación a desarrollo y a fabricación: solo es necesario cambiar las dimensiones de la columna AdvanceBio SEC.

Las columnas AdvanceBio SEC de Agilent con el tamaño de la partícula optimizado de 2,7 μm proporcionan un rendimiento excepcional con presiones típicas inferiores a 200 bar.

Se pueden transferir los métodos entre instrumentos y entre laboratorios.

Los datos de cromatografía líquida de ultra alto rendimiento se generaron en Europa en un laboratorio de I+D y los de HPLC, en un laboratorio de soporte técnico en EE.UU por parte de científicos diferentes, utilizando muestras y columnas diferentes.

20

Cromatografía de exclusión por tamaño de PEG GCSF en columna AdvanceBio SEC 130 Å, 7,8 x 300 mm, 2,7 µm. A. PEG GCSF inalterado, vista ampliada mostrando los agregados. B. PEG GCSF inalterado, superposición con muestra en condiciones extremas de calor mostrando el agregado.

Se conoce como PEGilación la unión covalente de polímeros del polietilenglicol (PEG) a proteínas o fármacos. Entre las ventajas de la PEGilación de una molécula se encuentran la mayor biodisponibilidad, el aumento de la vida media del plasma y la menor inmunogenicidad.

min2 4 6 8

mAU

0

200

400

600

800

1.000

1.200

1.400

1.600DAD1 A, Sig=214

4,132

4,739

5,125

min4 5 6

mAU

0

10

20

30

40

4,132

4,739

5,125

min2 4 6 8

mAU

0

200

400

600

800

1.000

1.200

1.400

1.600DAD1 A, Sig=214, PEG GCSF en condiciones extremas de temperatura

4,501

5,117

DAD1 A, Sig=214, PEG GCSF inalterado

Monómero PEG GCSFAgregadoPEG GCSF

Monómero PEG GCSF

A B

Columna AdvanceBio SEC 130 Å, 7,8 x 300 mm Instrumento: Sistema LC cuaternario bioinerte Agilent 1260 InfinityFase móvil Una mezcla de 6,8 ml de disolución al 85 % v/v de ácido ortofosfórico (según la monografía): en 800 volúmenes de agua, ajustar el pH a 2,5 con hidróxido sódico 10 N, 50 volúmenes de etanol y 150 volúmenes de agua.

Análisis de proteínas PEGiladas


MÉTODOS SEC DE MONOGRAFÍAS

Velocidad de flujo: 1 ml/minTemperatura: 25 °CMuestreador automático 4 °C termostatizado:Detector: 214 nm (1260 DAD VL+, celda de flujo bioinerte G5615-60022)Volumen de inyección: 3 µl

La cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) es el método de elección para identificar las impurezas de alto peso molecular en proteínas PEGiladas. Abajo, se usó un método SEC para identificar pegfilgrastim (PEG GCSF) según un borrador de monografía utilizando una columna Agilent AdvanceBio SEC 130 Å, 7,8 x 300 mm, 2,7 μm.

Los resultados confirman que el porcentaje de área del monómero y la desviación estándar del tiempo de retención estaban dentro de los criterios aceptables definidos en la monografía. Además, las columnas Agilent SEC separaron, detectaron y cuantificaron con éxito los agregados de PEG GCSF producidos por estudios en condiciones extremas.

mAU

DAD1 A, Sig=214

Monómero PEG GCSF

min

DAD1 A, Sig=214, PEG GCSF inalterado

DAD1 A, Sig=214, PEG GCSF en condiciones extremas de temperatura

Agregado PEG GCSF

Monómero PEG GCSF

21

min5 10 15 20 25

0

100

200

300

400

DAD1 A, Sig=276 16,29

0

24,22

1

26,79

7

13,56

9

27,89

5

mAU

min10 12 14 16 18 20 22

0,5

1

1,5

2

2,5

13,56

9

16,29

0

mAUMonómero

APM

Rs= 3,84

La insulina es una hormona polipeptídica pequeña que controla la homeostasis de la glucosa en sangre. Las empresas biofarmacéuticas utilizan técnicas de ingeniería genética para desarrollar diversos análogos de la insulina de larga duración.

Los siguientes datos se obtuvieronanalizando un análogo de insulina y sus agregados utilizando un método SEC de un borrador de monografía modificado. La columna Agilent AdvanceBio SEC 130 Å, 7,8 x 300 mm, 2,7 µm, de menor tamaño del poro, proporcionó una resolución superior entre monómeros y agregados.

Análisis de insulina

Columna: AdvanceBio SEC 130 Å, 7,8 x 300 mmInstrumento: Sistema LC binario Agilent 1290 InfinityFase móvil L-arginina (1,0 g/l)/ácido acético (99 %)/acetonitrilo;

65/15/20 (v/v/v) Velocidad de flujo: 0,4 ml/minTemperatura: AmbienteMuestreador automático 4 °C termostatizado:Detector: 276 nm (1260 DAD VL+, celda de flujo bioinerte G5615-60022) Volumen de inyección: 10 µl

Cadena B30 aminoácidos

Cadena A21 aminoácidos

22


CONTROLE LA ESTABILIDAD DE LAS PROTEÍNAS

La columna AdvanceBio SEC resolvió los agregados, además de la degradación del trastuzumab y el conjugado anticuerpo-fármaco. En ambos casos, la agregación aumentó cuando las muestras fueron sometidas a condiciones extremas.

Se usó la misma fase móvil acuosa tanto para el anticuerpo monoclonal como para el conjugado anticuerpo-fármaco, más hidrofóbico.

Cromatograma de trastuzumab en condiciones naturales (curva roja) superpuesto con el de una solución de 2 mg/ml de herceptin en condiciones extremas de pH y temperatura.

Cromatograma de conjugado anticuerpo-fármaco en condiciones naturales (curva roja) superpuesto con el de una solución de 2 mg/ml de conjugado anticuerpo-fármaco en condiciones extremas de pH y temperatura.

Columna: AdvanceBio SEC 300 Å, 7,8 x 300 mm

Fase móvil: Fosfato sódico 50 mM, cloruro sódico 150 mM, pH 7,4

Velocidad de flujo: 0,8 ml/minSistema: LC cuaternaria bioinerte Agilent

1260 Infinity Muestra: Trastuzumab y conjugado

anticuerpo-fármaco (T-DM1)Las muestras sometidas a condiciones extremas se prepararon ajustando el pH a 1,0, 10 y 6,0 y, a continuación, incubando a 60 ºC durante 60 min.

min2 4 6 8 10 12 14

Norm.

0

250

500

750

1.000

1.250

1.500

1.750

6,610

7,033

8,049

11,58

4

12,74

0

14,46

913,11

4

DAD1 A, Sig=220, trastuzumab inalteradoDAD1 A, Sig=220, trastuzumab en condiciones extremas de temperatura/pH

Fragmentos

Agregado

Trastuzumab inalterado

min2 4 6 8 10 12 14

mAU

0

200

400

600

800

1.000

1.200

1.400

1.600

DAD1 A, Sig=220, ADC en condiciones extremas de temperatura/pH

6,654 7,1

41

8,067

11,58

6 12,73

7

DAD1 A, Sig=220, ADC inalterado

8,106


Conjugado anticuerpo-fármaco inalterado

Conjugado anticuerpo-fármaco degradado

Trastuzumab


23


MEJORE LA PRECISIÓN PARA BIOPURIFICACIÓN Y TRABAJOS SEMIPREPARATIVOS

Las columnas BioHPLC Agilent están disponibles en tamaños adecuados para aplicaciones de biopurificación y trabajos semipreparativos. Junto con el sistema LC bioinerte Agilent 1260 Infinity y el colector de fracciones bioinertes 1260 Infinity, pueden aumentar la precisión de su recogida de fracciones basada en picos.

Este estándar de filtración con gel que contiene tiroglobulina, g-globulina, ovoalbúmina, mioglobina y vitamina B12 se ha separado utilizando SEC. Posteriormente, hemos recogido automáticamente las fracciones (utilizando el modo de disparo de fracción basado en picos) en pocillos determinados de una placa de pocillos. A continuación, las fracciones se reanalizaron utilizando la columna C8 de fase reversa.

min0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

mAU

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

γ-glo

bulin

a - 1

58.00

0 Da

Ovoa

lbúm

ina

- 44.0

00 D

a

Tiro

globu

lina

- 670

.000

Da

Mio

globin

a - 1

7.000

Da

Vita

mina

B12

- 1.3

50 D

a

Un reanálisis de las fracciones confirma el procedimiento de fraccionamiento exacto utilizando el modo de disparo de fracción basado en picos. La válvula de 2 posiciones y 6 puertos en el compartimento de la columna permitió el cambio automático de columna.

min2 3 4 5 6 7 8 9

mAU

4080

120

min2 3 4 5 6 7 8 9

mAU

4080

120

min2 3 4 5 6 7 8 9

mAU

200400600

min2 3 4 5 6 7 8 9

mAU

4080

120

1.200

SEC

C8

1.000800600400200

0

5 7,5 10 12,5 15 min

mAU P1-G-1

P1-G-2

P1-G-3

P1-G-4

P1-G-5

P1-G-6

P1-G-7

SEC y recogida de fraccionesColumna: Bio SEC-3, 300 Å,

7,8 × 300 mm, 3 μm Fase móvil: Tampón A: 50 mM de tampón

de fosfato de sodio + 150 M NaCl, pH 6,8

Velocidad de flujo: 1 ml/minGradiente: IsocráticasVolumen de inyección: 30 μlTermostato muestreadorautomático y FC: 8 °CTemperatura TCC: TRDAD: 280 nm/4 nm, Ref.: DesactivadoAnchura de pico: >0,05 minutos (tiempo de

respuesta de 1,0 segundos) (5 Hz)

Repetición del análisis – C8 de fase reversaColumna: ZORBAX 300SB-C8,

4,6 x 50 mm, 5 μm Fases móviles: Tampón B: ACN + 0,09 % TFA

Tampón C: H2O + 0,1 % TFAVelocidad de flujo: 1 ml/minGradiente: 0 min 5 % B, 95 % C

10 min 95 % B, 5 % C Tiempo de análisis: 10 min Tiempo de parada: 10 min

Volumen de inyección: 100, 50 y 10 μlTermostato muestreadorautomático y FC: 8 °CTemperatura TCC: 70 °CDAD: 280 nm/4 nm

Ref.: DesactivadoAnchura de pico: >0,05 minutos (tiempo de

respuesta de 1,0 segundos) (5 Hz)

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AUMENTE LA SENSIBILIDAD CON LA DETECCIÓN POR DISPERSIÓN DE LUZ

La combinación de un detector de dispersión de luz y un detector de concentración (como UV o RI) permite obtener datos sobre el peso molecular absoluto. La dispersión de luz ofrece una sensibilidad más alta de los agregados, comparado con los detectores de concentración como los de UV y RI.

Aquí podemos ver tres regiones del cromatograma (monómero, dímero y trímero) con la información sobre el peso molecular calculada por el software. Según lo esperado, la señal procedente del detector de dispersión de luz era bastante más sensible al material de peso molecular más alto, lo que mejoraba los límites de detección y la precisión de la cuantificación agregada.

Al estudiar los agregados más grandes de una proteína grande, es posible que haya que utilizar una columna con un tamaño del poro mayor para maximizar la información obtenida.

Aquí se ha utilizado una columna Agilent Bio SEC-5 500 Å para conseguir la separación en el rango de los agregados más grandes.

Mejora de los límites de detección a través de la dispersión de luz

Columnas: Bio SEC-5, 500 Å, 7,8 × 300 mm, acero inoxidable Fase móvil: 50 mM de fosfato de sodio, 250 mM NaCl, pH 7,0Volumen de inyección: 50 μlVelocidad de flujo: 1,0 ml/minTemperatura: 30 °CMuestra: g-globulina bovinaConcentración de la muestra: 1,0, 2,0 y 4,0 mg/mlDetección: UV 280 nm; LS 15° y 90°; RI Instrumento: Sistema LC cuaternario bioinerte Agilent 1260 Infinity con el multidetector

Agilent 1260 Infinity GPC/SEC

Señales del detector de monómero (región 3), dímero (región 2) y trímero (región 1) de IgG bovina. La duración del análisis fue de 20 minutos.

320300280260240220200180160140120100806040200

-20-40 1e0

1e1

1e2

1e3

1e4

1e5

Tiempo (min)

Resp

uest

a de

l det

ecto

r (m

V)

Logaritmo PM

(g/mol)

20181614121086420

Pico 1. PM 460.281 (trímero)Pico 2. PM 302.178 (dímero)Pico 3. PM 153.404 (monómero)

1 2 3

Naranja = UV 280 nmRojo = dispersión de luz 90° Azul = índice de refracción

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Desde el bombeo de disolvente exento de hierro y acero… a componentes de la ruta de paso de muestra exentos de metal... el sistema LC cuaternario bioinerte Agilent 1260 Infinity define nuevos estándares en términos de rendimiento y fiabilidad.Este sistema robusto lidia con las complejas condiciones de los disolventes que suelen utilizarse para analizar proteínas y bioterapéuticos, al tiempo que minimiza los problemas asociados a la unión no específica. Combinado con las columnas Agilent BioHPLC de intercambio iónico, podrá conseguir el tiempo de resolución más alto.

Ruta de flujo de muestras 100 % bioinerteTodos los capilares y todas las conexiones que pasan por el muestreador automático, el compartimento de la columna y los detectores no contienen metales, por lo que las biomoléculas solo entran en contacto con la cerámica o el PEEK. Esto le ayuda a evitar los riesgos de colas de los picos, baja recuperación y vida útil reducida de la columna minimizando la interacción secundaria de proteínas y péptidos con superficies metálicas.

Verdadero rendimiento de UHPLCRango de potencia de hasta 600 bares, que admite las altas presiones requeridas por las emergentes tecnologías de columna con partículas más pequeñas. Es la solución perfecta para todas las columnas SEC e IEX con tamaños de partícula de hasta 1,7 μm.

El software Agilent Buffer Advisor agiliza y simplifica la creación de gradientes salinos y de pH.

Para obtener más información sobre el sistema LC bioinerte Agilent 1260 Infinity, visite www.agilent.com/chem/1200BioLC

Tecnología de conexiones y capilares para un funcionamiento seguro y robusto; día tras díaCon el sistema LC bioinerte Infinity 1260, Agilent utiliza la tecnología de conexiones y capilares que proporciona la combinación única de condiciones bioinertes exenta de metales y funcionamiento a alta presión. Se han implantado tres tipos distintos de capilares:

• Capilares de titanio muy resistentes a la corrosión para las líneas de bombeo de disolvente. • Capilares PEEK chapados en el muestreador automático y el compartimento de la columna. • Capilares PEEK en las piezas de baja presión al final de la columna de separación.

Los capilares PEEK chapados cuentan con un sistema de conexión único para proporcionar unas condiciones bioinertes completas en todas las conexiones. La punta PEEK enclavada mecánicamente es muy resistente a la tensión lateral o rotacional, eliminando el par de torsión en el capilar y apretando la conexión.

Para obtener más información, visite www.agilent.com/chem/LCcapillaries


SISTEMA LC CUATERNARIO BIOINERTE AGILENT 1260 INFINITY: ANÁLISIS BIOMOLECULAR INFINITAMENTE SUPERIOR

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INSTRUMENTOS AGILENT PARA IDENTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS Y DETERMINACIÓN DEL PERFIL DE IMPUREZAS

El nuevo sistema 1290 Infinity II LC Agilent: La siguiente generación en UHPLC, aumenta la eficiencia en tres dimensiones

► Maximiza la eficiencia analítica: un rendimiento de separación y detección sin parangón que ofrece análisis de datos de la más alta calidad.

► Maximiza la eficiencia instrumental: la mayor capacidad de muestras y los ciclos de inyección más rápidos se combinan con nuevos niveles de uso.

► Maximiza la eficiencia del laboratorio: perfecta integración en la infraestructura actual y fácil transferencia de métodos desde equipos antiguos.

El sistema 1290 Infinity II LC está disponible con una bomba de alta velocidad o con una bomba flexible

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Sistema LC binario Agilent 1260 Infinity: Mejora de la HPLC analítica con el detector de alta velocidad de 80 Hz, 600 bares y una sensibilidad hasta 10 veces superior

100 % compatible con HPLC, características de UHPLC más:► Ruta de flujo resistente a la corrosión y biológicamente inerte► El rango de pH más amplio► Para bioanálisis y biopurificación

Uso adecuado para cualquier aplicación UHPLC estándar

Sistema Bio-SEC con detectores múltiples Agilent 1260 Infinity Una solución exclusiva para el análisis avanzado y reproducible de fármacos basados en proteínas.

Si la cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) se combina con detectores de dispersión de luz avanzados, permite a los bioquímicos determinar pesos moleculares precisos y el tamaño en disolución, al tiempo que proporciona una detección de agregación más sensible para el análisis de biomoléculas grandes.

► Obtención de datos de peso molecular y tamaño reproducibles y precisos

► Detección sensible de agregados con la detección de dispersión de luz de bajo volumen muerto líder del mercado

► Precisión para tamaño y peso molecular gracias a la detección avanzada

Uso adecuado para aplicaciones que precisen mayor sensibilidad para biomoléculas grandes

Para analizar con más detalle estos sistemas avanzados, visite www.agilent.com/chem/BioHPLC

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INFORMACIÓN PARA PEDIDOS

Columnas para HPLC Agilent AdvanceBio SEC La tecnología más reciente para el análisis SEC de anticuerpos monoclonales, proteínas y péptidos

Descripción 130 Å 300 Å

Columnas analíticas4,6 x 300 mm, 2,7 µm PL1580-5350 PL1580-5301

4,6 x 150 mm, 2,7 µm PL1580-3350 PL1580-3301

7,8 x 300 mm, 2,7 µm PL1180-5350 PL1180-5301

7,8 x 150 mm, 2,7 µm PL1180-3350 PL1180-3301

Guarda columnas analíticas

4,6 x 50 mm, 2,7 µm PL1580-1350 PL1580-1301

7,8 x 50 mm, 2,7 µm PL1180-1350 PL1180-1301

Patrones de proteínas para Agilent AdvanceBio SEC

Descripción Tamaño Referencia

130 Å Vial de 1,5 ml 5190-9416

300 Å Vial de 1,5 ml 5190-9417

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Columnas para HPLC Agilent Bio SEC-5 para biomoléculas grandes y muestras con componentes de distintos pesos moleculares

Descripción 100 Å 150 Å 300 Å 500 Å 1000 Å 2000 Å

Columnas analíticas4,6 x 300 mm, 5 µm 5190-2518 5190-2523 5190-2528 5190-2533 5190-2538 5190-2543

4,6 x 150 mm, 5 µm 5190-2519 5190-2524 5190-2529 5190-2534 5190-2539 5190-2544

7,8 x 300 mm, 5 µm 5190-2516 5190-2521 5190-2526 5190-2531 5190-2536 5190-2541

7,8 x 150 mm, 5 µm 5190-2517 5190-2522 5190-2527 5190-2532 5190-2537 5190-2542


4,6 x 50 mm, 5 µm 5190-6857 5190-6858 5190-6859 5190-6860 5190-6861 5190-6862

7,8 x 50 mm, 5 µm 5190-2520 5190-2525 5190-2530 5190-2535 5190-2540 5190-2545

Columnas preparativas21,2 x 300 mm, 5 µm 5190-6863 5190-6864 5190-6865 5190-6866 5190-6867 5190-6868

Guarda columnas preparativas

21,2 x 50 mm, 5 µm 5190-6869 5190-6870 5190-6871 5190-6872 5190-6873 5190-6874

Columnas Agilent Bio SEC-3 HPLC para análisis de proteínas con detección por MS

Descripción 100 Å 150 Å 300 Å

Columnas analíticas4,6 x 300 mm, 3 µm 5190-2503 5190-2508 5190-2513

4,6 x 150 mm, 3 µm 5190-2504 5190-2509 5190-2514

7,8 x 300 mm, 3 µm 5190-2501 5190-2506 5190-2511

7,8 x 150 mm, 3 µm 5190-2502 5190-2507 5190-2512


4,6 x 50 mm, 3 µm 5190-6846 5190-6847 5190-6848

7,8 x 50 mm, 3 µm 5190-2505 5190-2510 5190-2515

Columnas preparativas21,2 x 300 mm, 3 µm 5190-6850 5190-6851 5190-6852

Guarda columnas preparativas

21,2 x 50 mm, 3 µm 5190-6854 5190-6855 5190-6856

30

Columnas Agilent ProSEC 300S para proteínas globulares (USP L33)

Descripción 300 Å

Columnas analíticas4,6 x 250 mm, 5 µm PL1547-5501

7,5 x 300 mm, 5 µm PL1147-6501

7,5 x 600 mm, 5 µm PL1147-8501

Guarda columnas analíticas4,6 x 50 mm, 5 µm PL1547-1501

7,5 x 50 mm, 5 µm PL1147-1501

Columnas de filtración por gel ZORBAX GF-250 y GF-450 para protocolos de análisis que requieren el uso de la nomenclatura USP L35

Descripción Tamaño Referencia

Columnas analíticasGF-250, 150 Å 4,6 x 250 mm, 4 µm 884973-701

GF-250, 150 Å 9,4 x 250 mm, 4 µm 884973-901

GF-450, 300 Å 9,4 x 250 mm, 6 µm 884973-902

Guarda columnas analíticas y kits

Cartucho precolumna de diol ZORBAX, 4/paquete 4,6 x 12,5 mm, 6 µm 820950-911

Cartucho precolumna de diol ZORBAX, 2/paquete 9,4 x 15 mm, 6 µm 820675-111

Kit de hardware para guarda columnas para DI 4,6 mm 820999-901

Kit de hardware para guarda columnas para DI 9,4 mm 840140-901

Columnas PrepHTPrepHT GF-250, 150 Å 21,2 x 250 mm, 6 µm 877974-901

PrepHT GF-450, 300 Å 21,2 x 250 mm, 6 µm 877974-910

Guarda columnas y kits PrepHT

Cartucho precolumna ZORBAX Diol PrepHT, 2/paquete 17 x 7,5 mm, 5 µm 820212-911

Kit de piezas de cartucho precolumna para DI 21,2 mm 820444-901

Terminales de conexión PrepHT, 2/paq. 820400-901

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LA TRADICIÓN DE AGILENT POR LA INNOVACIÓN

Agilent continúa innovando con la familia de columnas AdvanceBio, con el fin de satisfacer las necesidades en la caracterización de anticuerpos monoclonales y proteínas. Las columnas Agilent AdvanceBio se han diseñado para avanzar en la precisión y velocidad en caracterización, agregación con SEC, variantes cargadas con IEX, masa intacta, estructura primaria y perfiles de impurezas mediante fase reversa, glicanos escindidos mediante interacción hidrófila y la titulación de anticuerpos monoclonales mediante cromatografía de afinidad.

Columnas BioHPLC Agilent

AfinidadDeterminación de títulos

y purificación

Protein A Bio-Monolith AdvanceBio RP-mAb Mapeo de glicanos AdvanceBio AdvanceBio SEC, 2,7 μm

Protein G Bio-Monolith Mapeo de péptidos AdvanceBio Zorbax RRHD 300-HILIC 1,8 µm Bio SEC-3

ZORBAX RRHD 300 Å, 1,8 µm Bio SEC-5

Poroshell 300 ProSEC 300S

PLRP-S ZORBAX GF-450 ZORBAX GF-250

ZORBAX 300SB

ZORBAX para análisis de aminoácidos

Fase reversaIdentificación de proteínas

y perfil de impurezas

HILICAnálisis de glicanos

Exclusión por tamañoAnálisis de agregación

Bio-Monolith (QA, DEAE, SO3)

Bio mAb

Bio IEX (SAX, SCX, WAX, WCX)

PL-SAX

PL-SCX

Intercambio iónicoAnálisis de variantes cargadas

Elimine los obstáculos para la caracterización de anticuerpos monoclonales y proteínas con éxito. Visite www.agilent.com/chem/BioHPLC

Los productos Agilent están destinados solamente a la investigación. Prohibido su uso en procedimientos diagnósticos.La información, descripciones y lespecificaciones incluidas en esta publicación están sujetas a cambio sin previo aviso.

© Agilent Technologies, Inc. 2015 Impreso en EE.UU., 16 de diciembre de 2015 5991-2898ES

Para obtener más información sobre las biocolumnas Agilent para SEC, www.agilent.com/chem/BioHPLC

Búsqueda del centro de atención al cliente de Agilent en su país www.agilent.com/chem/contactus

EE. UU. y Canadá 1-800-227-9770 [email protected]

Europa [email protected]

Asia Pacífico [email protected]

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