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UNIVERSIDAD CENTRAL DEL ECUADOR
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
CARRERA DE QUÍMICA DE ALIMENTOS
Determinación de carotenoides totales en cuatro variedades de mashua (Tropaeolum
tuberosum), deshidratada.
Trabajo de titulación, modalidad proyecto de investigación para la obtención del título
de Química de Alimentos
Autora: Julissa Cristina Alemán Reyes
Tutora: MSc.Tamara Fukalova Fukalova
Quito, 2019
ii
DERECHOS DE AUTOR
Yo, Julissa Cristina Alemán Reyes en calidad de autora y titular de los derechos morales
y patrimoniales del trabajo de titulación: “Determinación de carotenoides totales en
cuatro variedades de mashua (Tropaeolum tuberosum), deshidratada.” modalidad
proyecto de investigación, de conformidad con el Art. 114 del CÓDIGO ORGÁNICO
DE LA ECONOMÍA SOCIAL DE LOS CONOCIMIENTOS, CREATIVIDAD E
INNOVACIÓN, concedo a favor de la Universidad Central del Ecuador una licencia
gratuita, intransferible y no exclusiva para el uso no comercial de la obra, con fines
estrictamente académicos. Conservo a mi favor todos los derechos del autor sobre la obra,
establecidos en la normativa citada.
Así mismo, autorizo a la Universidad Central de Ecuador para que se realice la
digitalización y publicación de este trabajo de investigación en el repositorio virtual, de
conformidad con lo dispuesto en el Art. 144 de la Ley Orgánica de Educación Superior.
La autora declara que la obra objeto de la presente au7torizacion es original en su forma
de expresión y no infringe el derecho de autor de terceros, asumiendo la responsabilidad
por cualquier reclamación que pudiera presentarse por esta causa y liberando a la
Universidad de toda responsabilidad.
Julissa Cristina Alemán Reyes
C.I:1723581458
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CONSTANCIA DE APROBACIÓN DEL TUTOR
Yo, Dr. Tamara Fukalova Fukalova, MSc, en calidad de tutor del trabajo de investigación
titulado “Determinación de carotenoides totales en cuatro variedades de mashua
(Tropaeolum tuberosum), deshidratada.”, elaborado por la señorita Julissa Cristina
Alemán Reyes, estudiante de la Carrera de Química de Alimentos de la Facultad de
Ciencias Químicas de la Universidad Central del Ecuador, considero que el trabajo reúne
los requisitos y méritos necesarios en el campo metodológico y en el campo
epistemológico, por lo que APRUEBO, a fin de que sea sometido a la evaluación por
parte del tribunal calificador que se designe.
En la ciudad de Quito, al sexto día del mes de agosto de 2019.
Dra.Tamara Fukalova Fukalova
C.I 1711908150
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CONSTANCIA DE APROBACIÓN DEL TRABAJO DE TITULACIÓN POR EL
TRIBUNAL
El tribunal constituido por: Dr. Klever Parreño y Dra. Guadalupe Jibaja, luego de revisar
el trabajo de investigación titulado: “Determinación de carotenoides totales en cuatro
variedades de mashua (Tropaeolum tuberosum), deshidratada.”, previo a la obtención del
Título Profesional de Química de Alimentos presentado por la señorita Julissa Cristina
Alemán Reyes, APRUEBA el trabajo presentado.
Para constancia de lo actuado firman:
Dra. Tamara Fukalova Fukalova
TUTORA
C.I. 1711908150
Dr. Klever Parreño Dra.Guadalupe Jibaja
C.I. 0601619984 C.I. 1705412342
v
LUGAR DONDE SE REALIZÓ LA INVESTIGACIÓN
El proyecto de investigación ”Determinación de carotenoides totales en cuatro
variedades de mashua (Tropaeolum tuberosum), deshidratada”, se realizó en el
laboratorio de Nutrición y Calidad del Instituto Nacional de Investigaciones
Agropecuarias (INIAP) y en los Laboratorios OSP de la Facultad de Ciencias Químicas
de la Universidad Central del Ecuador.
vi
DEDICATORIA
A mi Dios, dueño y artífice de mi vida, su bondad y misericordia han permitido que los
anhelos de mi corazón sean cumplidos; a mis padres Fernando y Ximena su ejemplo de
amor y dedicación han permitido que mis metas sean consolidadas; a mis hermanos Elías
y Laura por su amor, complicidad y compañía.
Salmos 37:4-5
Deléitate asimismo en Jehová,
Y él te concederá las peticiones de tu corazón.
Encomienda a Jehová tu camino,
Y confía en él; y él hará.
vii
AGRADECIMIENTOS
A Dios por guiar mi camino, corregir mis pasos y ser el pilar fundamental de mi vida, su
amor y su gracia sobre mi han permitido que pueda reflejar su amor.
A mis padres Fernando y Ximena por su paciencia, amor real y sin condiciones, sus
sabios consejos y apoyo para lograr llegar a la meta.
A mis hermanos Elías y Laura, su amor y compañía han sido motivación de todos los
días para ser mejor y darles lo mejor. Les amo.
A mi alma mater la Universidad Central del Ecuador en especial a la Facultad de Ciencias
Químicas por abrirme las puertas, formarme y demostrar que soy una excelente
profesional.
A mi tutora Dra. Tamara Fukalova por su ayuda, su paciencia y dirección del trabajo de
investigación, así mismo a mis lectores Dr. Klever Parreño y Dra. Guadalupe Jibaja por
el aporte en el desarrollo del trabajo de investigación.
Al Instituto Nacional de Investigaciones Agropecuarias en especial al Departamento de
Nutrición y Calidad por permitirme desarrollar mi trabajo investigativo en sus
instalaciones.
A la Ingeniera Elena Villacrés por su predisposición de guiar, apoyar y ayudar en la
elaboración del trabajo investigativo.
Al personal de los laboratorios OSP de la Facultad de Ciencias Químicas, al Dr. Yandri
Infante e Ingeniera Vanessa Mena por su ayuda y enseñanzas para el desarrollo
experimental y estadística del trabajo.
A mis amigas Mónica, Tania, Anita, Diana y Katty por su cariño y apoyo durante toda la
carrera universitaria, gracias por todos los momentos compartidos y por ser un reflejo
perfecto del amor de Dios.
A todas las personas que en su momento estuvieron en el trayecto de este hermoso viaje
y apoyaron de alguna manera.
Mil gracias, que Dios les recompense y permita seguir ayudando a cumplir metas.
viii
ÍNDICE
ÍNDICE......................................................................................................................... viii
Resumen ......................................................................................................................... xv
Abstract.......................................................................................................................... xvi
Introducción ...................................................................................................................... 1
Capítulo I .......................................................................................................................... 3
El problema ...................................................................................................................... 3
1.1 Planteamiento del problema............................................................................... 3
1.2 Formulación del problema ................................................................................. 4
1.3 Preguntas Directrices ......................................................................................... 4
1.4 Objetivos de la Investigación ............................................................................. 5
1.4.1 Objetivo General ........................................................................................ 5
1.4.2 Objetivos Específicos ................................................................................. 5
1.5 Justificación e Importancia ................................................................................ 5
Capítulo II ......................................................................................................................... 8
Marco teórico.................................................................................................................... 8
2.1 Antecedentes ...................................................................................................... 8
2.2 Fundamentación Teórica.................................................................................... 9
2.2.1 La Mashua (Tropaeolum tuberosum) ......................................................... 9
2.2.2 Taxonomía de la Mashua............................................................................ 9
2.2.3 Morfología ................................................................................................ 10
2.2.4 Variedades ................................................................................................ 11
2.2.5 Valor Nutricional ...................................................................................... 11
2.2.6 Propiedades del tubérculo Mashua ........................................................... 12
2.2.7 Formas de consumo de Mashua ............................................................... 12
2.2.8 Carotenoides ............................................................................................. 13
2.2.9 Clasificación de Carotenoides .................................................................. 14
2.2.10 Propiedades físicas y químicas de carotenoides ....................................... 16
2.2.11 Estabilidad de los carotenoides ................................................................ 17
2.2.12 Identificación de los carotenoides ............................................................ 18
2.2.13 Espectrofotometría ................................................................................... 18
2.2.15 Cromatografía Liquida de Alta Eficiencia HPLC .................................... 19
2.2.16 Beta Caroteno ........................................................................................... 20
2.2.17 Ruta Biosintética de Betacaroteno ............................................................ 20
ix
2.2.18 Beneficios del Beta caroteno .................................................................... 22
2.2.19 Requerimientos de Beta Caroteno ............................................................ 23
2.2.20 Métodos de Deshidratación ...................................................................... 23
2.2.21 Secado en Bandeja .................................................................................... 23
2.2.22 Liofilización ............................................................................................. 24
2.3 Fundamentación Legal ..................................................................................... 25
2.4 Hipótesis .......................................................................................................... 25
2.4.1 Hipótesis Alterna.(Hi) .............................................................................. 25
2.4.2 Hipótesis Nula.(Ho) .................................................................................. 25
2.5 Sistema de Variables ........................................................................................ 25
2.5.1 Variable Dependiente o respuesta ............................................................ 25
2.5.2 Variables Independientes.......................................................................... 26
Capítulo III ..................................................................................................................... 27
Metodología .................................................................................................................... 27
3.1 Diseño de Investigación ................................................................................... 27
3.2 Población y Muestra ........................................................................................ 27
3.2.1 Población .................................................................................................. 27
3.2.2 Muestra ..................................................................................................... 27
3.3 Métodos de Ensayo .......................................................................................... 28
3.3.1 Método CIP para determinación de Carotenoides. ................................... 29
3.3.2 Método de cuantificación de Carotenoides Totales .................................. 29
3.3.3 Método de determinación de Beta Caroteno ............................................ 31
3.3.4 Verificación del Método de Ensayo de Beta Caroteno ............................ 33
3.3 Materiales, reactivos y equipos ........................................................................ 37
3.5 Diseño Experimental ........................................................................................... 39
3.6 Matriz de Operacionalización de variables ...................................................... 40
3.7 Técnicas e Instrumentos de Recolección de Datos (IRD) ............................... 40
3.8 Técnicas de procesamiento y Análisis de Datos .............................................. 40
Capítulo IV ..................................................................................................................... 41
Análisis e Interpretación de Resultados ......................................................................... 41
4.1 Verificación del Método de Ensayo................................................................. 41
4.2 Cuantificación de Carotenoides Totales y Beta Caroteno por método de
deshidratación y variedad ........................................................................................... 43
4.3 Análisis de varianza factorial para Carotenoides Totales y Beta Caroteno ..... 44
x
4.4 Cuantificación de Carotenoides Totales y Beta Caroteno ............................... 50
4.5 Análisis Estadístico para la estimación del mejor método de deshidratación
para la concentración de Carotenoides Totales y β-caroteno ..................................... 52
Capítulo V ...................................................................................................................... 55
Conclusiones y Recomendaciones ................................................................................. 55
5.1 Conclusiones........................................................................................................ 55
5.2 Recomendaciones ................................................................................................ 56
Bibliografía ..................................................................................................................... 57
ANEXOS ........................................................................................................................ 61
xi
ÍNDICE DE ANEXOS
Anexo A.Esquema de diagnóstico ................................................................................. 61
Anexo B.Categorización de variables ........................................................................... 62
Anexo C.Situación geográfica de la comunidad Aláquez ............................................. 63
Anexo D. Procedimientos para la determinación de Carotenoides Totales y Beta
Caroteno ......................................................................................................................... 64
Anexo E.Reporte de datos Carotenoides Totales .......................................................... 70
Anexo F.Reporte de datos de Betacaroteno .................................................................. 71
Anexo G.Certificado de Análisis del Estándar de β caroteno ....................................... 72
xii
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Taxonomía de Mashua ..................................................................................... 10
Tabla 2. Composición Nutricional de Mashua ............................................................... 12
Tabla 3. Fuentes y contenido de carotenoides en alimentos .......................................... 13
Tabla 4. Clasificación de los carotenoides ..................................................................... 15
Tabla 5. Especificaciones de cada variedad de las muestras .......................................... 28
Tabla 6. Condiciones de deshidratación por liofilización y las especificaciones de
muestra obtenida. ............................................................................................................ 28
Tabla 7. Condiciones de deshidratación en bandejas y las especificaciones de las
muestras obtenidas.......................................................................................................... 28
Tabla 8. Condiciones Cromatográficas para determinación de β caroteno .................... 32
Tabla 9. Resultados obtenidos para el estándar de β-caroteno ....................................... 33
Tabla 10. Evaluación de precisión en cuatro variedades de Mashua para determinar
Carotenoides Totales ...................................................................................................... 35
Tabla 11. Evaluación de precisión en cuatro variedades de mashua para determinar β-
caroteno .......................................................................................................................... 36
Tabla 12.Materiales para determinación de carotenoides totales y β-caroteno .............. 37
Tabla 13.Reactivos para determinación de carotenoides totales y β-caroteno ............... 38
Tabla 14.Equipos para determinación de carotenoides totales y β-caroteno.................. 39
Tabla 15. Operacionalización de variables para la determinación de carotenoides totales
y β caroteno .................................................................................................................... 40
Tabla 16. Corridas cromatográficas de concentración y área de pico del estándar de β-
caroteno .......................................................................................................................... 41
Tabla 17.Parámetros de precisión para concentración de Beta Caroteno ...................... 42
Tabla 18.Porcentaje de recuperación del estándar de β caroteno ................................... 43
Tabla 19. Concentración de Carotenoides Totales ......................................................... 44
Tabla 20.Concentración de Beta Caroteno .................................................................... 44
Tabla 21. Análisis de varianza para Carotenoides Totales ............................................. 46
Tabla 22.Análisis de varianza para Beta Caroteno ......................................................... 48
Tabla 23. Comparación de medias de Carotenoides Totales mediante DMS y TUKEY
para muestras secadas en bandeja ................................................................................... 50
Tabla 24. Comparación de medias de Carotenoides Totales mediante DMS y TUKEY
para muestras liofilizadas ............................................................................................... 50
Tabla 25. Comparación de medias de Beta Caroteno mediante DMS y TUKEY para
muestras secadas en bandeja .......................................................................................... 51
Tabla 26. Comparación de medias de Beta Caroteno mediante DMS y TUKEY para
muestras liofilizadas ....................................................................................................... 51
Tabla 27. Prueba t de student para dos grupos de muestras de Carotenoides Totales
considerando varianzas desiguales ................................................................................. 52
Tabla 28. Prueba t de student para dos grupos de muestras de β-caroteno considerando
varianzas desiguales ....................................................................................................... 53
xiii
ÍNDICE DE ILUSTRACIONES
Ilustración 1.Prevalencia del consumo inadecuado de Vitamina A a Escala Nacional .... 6
Ilustración 2.Flores y follaje de la Mashua .................................................................... 10
Ilustración 3.Tubérculo de Mashua ECU 1144 .............................................................. 11
Ilustración 4. Colada de Mashua .................................................................................... 13
Ilustración 5. Estructuras y características de carotenoides presentes en alimentos ...... 15
Ilustración 6. Espectro de absorción de los pigmentos fotosintéticos ............................ 17
Ilustración 7.Principales componentes de un equipo HPLC .......................................... 19
Ilustración 8. Estructura química del beta-caroteno ....................................................... 20
Ilustración 9.Biosíntesis de Carotenoides....................................................................... 22
Ilustración 10. Estufa de desecación por aire forzado .................................................... 24
Ilustración 11. Equipo de Liofilización .......................................................................... 24
Ilustración 12.Curva de calibración para el estándar de β-caroteno ............................... 42
Ilustración 13. Diagrama de barras para resultados de Carotenoides Totales en cuatro
variedades de Mashua..................................................................................................... 47
Ilustración 14.Diagrama de barra para resultados de Beta Caroteno en cuatro variedades
de Mashua ....................................................................................................................... 49
Ilustración 15. Diagrama de cajas métodos de deshidratación vs concentración de
carotenoides totales ........................................................................................................ 53
Ilustración 16. Diagrama de cajas para métodos de deshidratación vs concentración de
β-caroteno ....................................................................................................................... 54
xiv
ÍNDICE DE ECUACIONES
Ecuación 1. Cálculo de carotenoides totales .................................................................. 31
Ecuación 2. Cálculo de β-caroteno ................................................................................. 33
Ecuación 3.Límite de detección y límite de cuantificación ............................................ 34
Ecuación 4. Porcentaje de recuperación del estándar de β-caroteno .............................. 37
xv
TEMA: Determinación de carotenoides totales en cuatro variedades de mashua
(Tropaeolum tuberosum), deshidratada.
Autora: Julissa Cristina Alemán Reyes
Tutora: MSc.Tamara Fukalova Fukalova
Resumen
La investigación estuvo enfocada en determinar la concentración de Carotenoides
Totales y Beta Caroteno de las variedades ECU 8768; ECU 1144; ECU 8552; ECU 1107,
de mashua (Tropaeolum tuberosum) y evaluar el efecto de dos sistemas de
deshidratación: secado en bandeja con aire forzado a 50°C y liofilización a -40°C. Para
lo cual con las muestras deshidratadas se realizó una extracción sólido-líquido utilizando
acetona como solvente. El extracto lipídico se cuantificó mediante Espectrofotometría
UV-VIS a 450 nm, lo que permitió determinar la concentración de Carotenoides Totales
en cada una de las variedades de mashua (Tropaeolum tuberosum) deshidratada. Se
estableció que 40,89±0,24 mg /100 g de muestras seca es la mayor cantidad de
Carotenoides Totales procedente de la variedad ECU 8768 sometida a liofilización. Por
otro lado, la concentración de Beta Caroteno se determinó por Cromatografía Líquida de
Alta Eficacia (HPLC), haciendo uso del estándar de Beta Caroteno con pureza 94,9%. Se
cuantificó la cantidad de -caroteno en todas las variedades previamente deshidratadas,
estableciendo que la mayor cantidad fue 1906,83±129,38 µg /100 g de muestras seca que
corresponde a la variedad ECU 8768 liofilizada. Los datos obtenidos fueron procesados
con un análisis estadístico al 95% de confianza.
Palabras clave: CONCENTRACIÓN / CAROTENOIDES TOTALES / BETA
CAROTENO / DESHIDRATACIÓN /MASHUA
xvi
THILE: Determination of total carotenoids in four varieties of mashua (Tropaeolum
tuberosum), dehydrated.
Author: Julissa Cristina Alemán Reyes
Tutor: MSc.Tamara Fukalova Fukalova
Abstract
The research was focused on determining the concentration of Total Carotenoids and
Beta Carotene of the varieties ECU 8768, ECU 1144, ECU 8552, ECU 1107, mashua
(Tropaeolum tuberosum) and evaluate the effect of two dehydration systems: drying in
tray with air forced at 50 ° C and lyophilization at -40 ° C. For this, with the dehydrated
samples, a solid-liquid extraction was carried out using acetone as solvent. The fatty
extract was quantified by UV-VIS spectrophotometry at 450 nm, which allowed to
determine the concentration of total carotenoids in each of the varieties of dehydrated
mashua (Tropaeolum tuberosum). It was established that 40,89 ± 0,24 mg / 100 g of dry
samples is the highest amount of total carotenoids from the ECU 8768 variety subjected
to lyophilization.On the other hand, the concentration of Beta Carotene was determined
by High Efficiency Liquid Chromatography (HPLC), making use of the Beta Carotene
standard with 94,9% purity. the amount of -carotene was quantified in all the previously
dehydrated varieties, establishing that the highest quantity was 1906.83 ± 129,38 μg /
100 g of dry samples corresponding to the ECU 8768 freeze-drying variety.The data
obtained were processed with a statistical analysis at 95% confidence
Key words: CONCENTRATION / TOTAL CAROTENOIDS / BETA CAROTENE /
DEHYDRATION / MASHUA
1
Introducción
En la presente investigación se estudió el efecto del método de deshidratación sobre
la concentración de carotenoides totales y del -caroteno en variedades ECU 8768, ECU
1144, ECU 8552, ECU 1107 del tubérculo mashua (Tropaeolum tuberosum).
En la actualidad la soberanía alimentaria tiene como fin fomentar la producción y
consumo de los alimentos regionales que garanticen el derecho humano a la provisión
permanente de alimentos sanos, nutritivos, suficientes y culturalmente apropiados.
Dentro de estos objetivos se encuentra el aprovechamiento de los tubérculos andinos
como mashua, zanahoria blanca, melloco, entre otros. La investigación se sustenta que
en el país hay un sector campesino que se dedica a los cultivos andinos y se puede
aprovechar íntegramente esta materia prima, que aporta proteínas, carbohidratos, fibra,
calorías, vitaminas y pigmentos naturales o carotenoides con el fin de fortalecer la
economía de los productores de mashua. Al mismo tiempo se considera que estos
compuestos naturales pueden actuar como antioxidantes y precursores de vitamina A que
aportan diversos benéficos en la salud humana.
Capítulo I. Describe el problema que motivó esta investigación, además de establecer
la importancia del tubérculo en estudio, siendo el tema más relevante las enfermedades
relacionadas con el déficit de los carotenoides, precursores de vitamina A, que se
encuentran principalmente en los alimentos. Tomando en cuenta lo mencionado, se
formularon objetivos, justificación e importancia de la investigación, que se centró en el
aporte de carotenoides provitaminas A cuyo déficit provoca deterioro en la salud humana.
Capítulo II. Sustenta bibliográficamente el fundamento teórico para ampliar el tema
de la investigación que está enfocado en el tubérculo de mashua y sus variedades; los
métodos de deshidratación utilizados, las características fisicoquímicas y cuantificación
de carotenoides totales y beta caroteno. Se formuló la hipótesis y se definieron las
variables.
Capítulo III. Establece el diseño y la metodología de investigación, en donde se detalla
el enfoque, nivel y el tipo de estudio. Además, se fija la población y la muestra, se
mencionan los materiales, métodos, equipos y reactivos utilizados durante la
investigación, sin olvidar el diseño experimental y las técnicas de procesamiento de
datos. Finalmente, se detallan cada uno de los procedimientos experimentales.
Capítulo IV. Presenta resultados experimentales obtenidos, correspondientes a
concentración de carotenoides totales y betacaroteno, tratamientos estadísticos y análisis
respectivos.
2
Capítulo V. La investigación concluye verificando si los resultados y aportes
obtenidos en relación con los objetivos planteados se han alcanzado, además se citan las
recomendaciones válidas para futuros trabajos de investigación.
3
Capítulo I
El problema
1.1 Planteamiento del problema
El tubérculo mashua (Tropaeolum tuberosum) originario de los Andes centrales con
mayor concentración en países como Colombia, Bolivia, Perú y Ecuador, es un tubérculo
andino no aprovechado al máximo. La producción de alimentos a base del mismo es
escasa debido a la falta de información en cuanto a sus propiedades nutricionales y como
una fuente promisoria de carotenoides precursores de vitamina A que son importantes en
el metabolismo y la salud de seres humanos.
Según lo citado en el documento “Normas, protocolos y consejería para la
suplementación con micronutrientes Ecuador”, la deficiencia de vitamina A es un
problema de salud pública que afecta fundamentalmente a los países en desarrollo. Se
estima que de cinco a diez millones de niños y niñas en el mundo presentan patología
ocular por esta causa, y otros diez millones no presentan signos clínicos pero tienen
alguna deficiencia (MSP, 2011).
Además, la Encuesta Nacional de Salud y Nutrición ENSANUT menciona que la
prevalencia de anemia debido a la deficiencia de vitamina A es mayor en los hombres
que en las mujeres (26,8% vs 24,6% respectivamente), y es más alta en los niños menores
de 36 meses, y particularmente en los menores de 1 año (62%) (Freire W.B et al., 2013).
Junto con lo anterior, el principal problema en la población ecuatoriana es la
deficiencia de nutrientes que cumplen una serie de funciones en el organismo. Es así el
caso de la capacidad antioxidante que puede atribuirse a ciertos carotenoides presentes
en frutas y verduras, y otros que son precursores de vitamina A.
Los carotenoides son pigmentos orgánicos naturales que aportan colores como
amarillo y rojo a la mayoría de frutas y hortalizas. Estos compuestos naturales son de
origen vegetal y actúan como antioxidantes para el organismo humano. De ahí es la
importancia de estudiarlos ya que además, cierto grupo de carotenoides son considerados
provitamina A, entre los cuales se encuentra el beta caroteno.
Las vitaminas son nutrientes que facilitan el metabolismo de otros micronutrientes y
mantienen diversos procesos fisiológicos vitales para todas las células activas, tanto
vegetales como animales (Badui, 2006).
La vitamina A es una vitamina liposoluble que se encuentra de forma natural en los
alimentos. La vitamina A es importante para mantener una visión normal, el sistema
inmunitario y la reproducción. Además la vitamina A influye en el correcto
funcionamiento del corazón, de los pulmones, de los riñones y otros órganos vitales.
Existen dos tipos diferentes de vitamina A. El primer tipo, la vitamina es decir que se
4
encuentra en productos de origen animal ya sea carne vacuna, carne de ave, pescado y
productos lácteos. El segundo tipo, son los compuestos provitaminas A que provienen de
las frutas, verduras y otros productos de origen vegetal. Las provitaminas A se encuentran
ampliamente distribuidos en los alimentos y una vez ingeridos, en el organismo se
convierten en vitamina A, resaltando el beta caroteno como principal precursor (NIH,
2015).
El tubérculo mashua (Tropaeolum tuberosum) es una fuente interesante de
provitaminas A con un contenido de 73,56 mg por cada 100 g de muestra seca,
expresados como equivalentes de retinol, que alcanza su máximo en el estado de madurez
fisiológica (INIAP, 1998).
Tomando en cuenta que en Ecuador se cultivan diferentes variedades de mashua
principalmente en las provincias de la sierra ecuatoriana como Chimborazo, Cotopaxi,
Tungurahua, Bolívar, Cañar, Azuay y tienen el aporte del INIAP. Por su alto valor
nutritivo, el bajo coste de producción y alta facilidad de ambientación puede ser una
buena fuente de ingresos invirtiendo y potencializando la soberanía alimentaria.
La disminución de la producción, acompañada de la falta de estudios relacionados a
evaluar el tubérculo de mashua como una fuente promisoria de carotenoides, hace viable
este estudio experimental de determinar la concentración de carotenoides totales y beta
caroteno en particular como precursores de vitamina A. Para esto se aplicaron dos
métodos de deshidratación sobre cuatro variedades del tubérculo con el fin de evaluar el
mejor método y la variedad con mayor concentración de los compuestos mencionados
anteriormente.
1.2 Formulación del problema
¿Los métodos de deshidratación (secado en bandeja/liofilización) y las variedades de
mashua influyen sobre la concentración de carotenoides?
1.3 Preguntas Directrices
¿Se puede considerar a mashua (Tropaeolum tuberosum) como una fuente de
carotenoides?
¿Es posible evaluar los efectos de los métodos de deshidratación sobre la concentración
de carotenoides en mashua (Tropaeolum tuberosum)?
¿Qué método de deshidratación permite obtener la mayor cantidad de carotenoides en
mashua (Tropaeolum tuberosum)?
¿En qué variedad de mashua (Tropaeolum tuberosum), se obtiene un mayor contenido
de carotenoides?
5
¿Cuáles son las condiciones analíticas e instrumentales óptimas para la aplicación de los
métodos espectrofotométrico y cromatográfico con el fin de determinar carotenoides
totales y -caroteno respectivamente?
1.4 Objetivos de la Investigación
1.4.1 Objetivo General
Determinar la concentración de carotenoides en cuatro variedades de mashua
(Tropaeolum tuberosum), deshidratada por dos métodos.
1.4.2 Objetivos Específicos
Realizar la deshidratación de las cuatro variedades de mashua y obtener los extractos de
carotenoides.
Establecer las condiciones óptimas para el análisis químico de los extractos obtenidos.
Verificar los métodos de análisis, espectrofotométrico y cromatográfico para cuantificar
los carotenoides.
Determinar el contenido de carotenoides totales y de beta caroteno en los extractos de
cada variedad de mashua por dos métodos: Espectrofotometría UV/Vis y HPLC.
Analizar la relación existente entre los métodos de deshidratación y las variedades sobre
la concentración de carotenoides obtenidos.
1.5 Justificación e Importancia
Los metabolitos secundarios como los carotenoides, provenientes de fuentes
vegetales actúan como provitaminas A o antioxidantes. Entre los más importantes es el
beta caroteno precursor de la vitamina A que se sintetiza en el organismo humano. Se
debe tomar en cuenta los requerimientos diarios de los mencionados fitonutrientes y
pigmentos naturales, para cubrir su déficit y generar beneficios para la salud humana.
De todos los antioxidantes naturales existentes el beta caroteno y licopeno son
pigmentos mayoritarios responsables de los colores amarillos, anaranjados o rojos de las
frutas, verduras y granos. Permiten neutralizar la oxidación celular, deteniendo el daño
en los tejidos y ayudan a prevenir las enfermedades que normalmente están relacionadas
con el estrés oxidativo. Los antioxidantes son sustancias que protegen las células del
organismo contra los efectos de los radicales libres, es decir, moléculas generadas cuando
6
el cuerpo metaboliza los alimentos o cuando se lo expone a los factores externos como
el humo de tabaco y la radiación (NIH, 2016).
El consumo diario de la dosis recomendada de la vitamina A genera beneficios para
la salud. Es un fitonutriente esencial para la vista, el crecimiento, la división celular, la
reproducción y la inmunidad. Además, tiene propiedades antioxidantes (NIH, 2016). Las
necesidades de Vitamina A para los seres humanos varían entre 400 y 900 microgramos
(µg) de retinol diarios (FAO, 2014).
Según la Encuesta Nacional de Nutrición y Salud, en Ecuador el 89,4% de la
población nacional presenta un consumo inadecuado en relación con las
recomendaciones diarias. Por ejemplo, las prevalencias de consumos inadecuados de
vitamina A son superiores al 50% para todos los grupos de diferentes edades, es mayor
en los hombres (90,5%) respecto a las mujeres (88,2%), y en indígenas (94,4%) en
comparación con el resto de grupos étnicos.
En la Ilustración 1, se reporta el índice de individuos que presentan consumo
inadecuado de vitamina A, a escala Nacional.
Fuente: ENSANUT (Freire W.B et al., 2013)
Ilustración 1.Prevalencia del consumo inadecuado de Vitamina A a Escala Nacional
El gráfico revela que la población con mayor consumo inadecuado de Vitamina A de
acuerdo al género son hombres con el 90,5%, tomando en cuenta las etnias la población
indígena presenta un 90,4% y por regiones la amazonia urbana se posiciona con un
porcentaje de 92,9% del consumo inadecuado de Vitamina A.
En Ecuador existen alimentos ancestrales originarios de la región andina que son
potenciales fuentes de los carotenoides que son precursores de vitamina A como es el
caso de mashua como una posible fuente de aporte nutricional y funcional.
7
En Ecuador el cultivo de mashua es significativamente importante por lo que el
aprovechamiento de este tubérculo beneficiaría tanto a la industria como a los
consumidores. El empleo de mashua en Ecuador es escaso debido a que es un tubérculo
poco conocido. Estudiar y recalcar sus propiedades nutricionales es un reto para toda la
cadena agroalimentaria que permite potencializar la producción de alimentos ancestrales.
Su composición química presenta el 9,17% de proteína, 5,86% de fibra, 75,40% de
carbohidratos totales, vitamina C 77,37 mg /100 g y 73,56 Equivalentes de Retinol
(vitamina A) en materia fresca (INIAP, 1998).
Por lo expuesto anteriormente, es muy importante evitar la extinción de estos
cultivos. La investigación pretendió estudiar la composición química e identificar la
presencia de los carotenoides provitaminas A. La obtención de resultados tuvo la
intención de generar información relevante que aportaría con la seguridad alimentaria de
pueblos ecuatorianos.
Al estudiar una fuente potencial de carotenoides en el ámbito regional se pretendió
generar información relevante que sirva como referencia a las nuevas investigaciones
enmarcadas en redescubrimiento de los productos autóctonos del país que son de fácil
acceso en el mercado nacional. Es considerable aprovechar esta condición que conlleva
a contribuir a solución del déficit de la vitamina A en el país.
8
Capítulo II
Marco teórico
2.1 Antecedentes
Nuestro cuerpo necesita cantidades relativamente pequeñas de vitaminas, si las
comparamos con los requerimientos de proteínas o de carbohidratos. No obstante,
muchas personas no reciben las vitaminas suficientes, bien porque no ingieren los
alimentos adecuados o por problemas de absorción. Estos compuestos son capaces de
estimular todos los procesos bioquímicos del cuerpo necesarios para la vida y salud, sin
embargo, este no es capaz de producirlas por lo que es importante ingerirlas a través de
alimentos o suplementos nutricionales (Brown Liz, 2007).
Según la FAO, el retinol es la forma principal de vitamina A en las dietas humanas.
En su forma cristalina pura, es una sustancia amarilla verdosa, pálida. Es soluble en
solventes apolares, pero insoluble en agua. Como retinol se encuentra únicamente en
productos animales. Existen otras formas de vitamina A como el retinal,13-cis-retinol y
deshidrorretinol con diferentes configuraciones moleculares, menos actividad biológica
que el retinol y no son importantes en las dietas humanas (FAO, 2002).
Los carotenos, que actúan como provitaminas o precursores de la vitamina A, son
sustancias de color amarillo que existen en muchos vegetales. En algunos alimentos su
color puede estar enmascarado por el pigmento vegetal verde clorofila, que con
frecuencia se encuentra en íntima asociación con los carotenos. Hay diversos tipos de
carotenos; uno de ellos, el beta-caroteno, es la fuente más importante de vitamina A en
las dietas de la mayoría de las personas que viven en países no industrializados (FAO,
2002).
Además es importante mencionar que los carotenoides son compuestos que pueden
inhibir o retardar la oxidación de otras moléculas inhibiendo la iniciación y propagación
de las reacciones en cadena de los radicales libres, por lo que se les atribuye la capacidad
antioxidante, siendo así una alternativa barata para el tratamiento de enfermedades
relacionadas con el estrés oxidativo pues ya se ha demostrado la efectividad del efecto
antioxidante de productos naturales provenientes de las plantas, es por eso que las dietas
ricas en frutas y hortalizas están asociadas con un menor riesgo de padecer diversas
enfermedades (Juárez & GutiérreZOUz, 2008).
Los carotenoides están incluidos en la lista de importantes antioxidantes naturales, y
algunos, incluidos el -caroteno, el licopeno y la criptoxantina, se asocian con una menor
incidencia de cáncer, enfermedades coronarias y otras afecciones degenerativas (A. J.
Meléndez-Martínez, 2017).
Tomando en cuenta al beta caroteno como el más importante entre los carotenos, se
menciona que la concentración beta caroteno depende de la variedad de la fruta, verdura
o tubérculo, estado de maduración, clima, composición del suelo, duración de la post
9
cosecha, procesamiento y almacenamiento. Normalmente son extraídos con solventes
orgánicos miscibles en agua como acetona, metanol o etanol; su análisis generalmente
consiste en la extracción, partición con éter de petróleo o hexano, saponificación,
concentración y separación cromatográfica para su respectiva identificación y
cuantificación (Minguez, Pérez, & Hornero, 2008).
Los precursores de vitamina A se encuentra presente en una variedad de alimentos
entre ellos, las verduras de color verde, anaranjado y amarillo con cantidades
significativas de carotenoides que algunos son precursores de vitamina A (como brócoli,
zanahorias, zapallo, mashua etc.). Sin embargo, el escaso estudio de esta vitamina y sus
precursores en los tubérculos como mashua, no han permitido que éstos sean totalmente
aprovechados. Tampoco existen estudios sobre los métodos de deshidratación aplicados
al tubérculo que podrían prolongar su vida útil y aportar nuevos conocimientos para el
desarrollo de recetas y productos propios del Ecuador.
2.2 Fundamentación Teórica
2.2.1 La Mashua (Tropaeolum tuberosum)
Se trata de una planta originaria de los Andes centrales, posiblemente de zonas en
donde se originó la papa y también es considerado un tubérculo. En Ecuador se siembra
en diferentes provincias de la sierra ecuatoriana como Chimborazo, Cotopaxi,
Tungurahua, Bolívar, Cañar, Azuay. Además, su producción se realiza en parcelas
pequeñas de indígenas y campesinos, que también se dedican a cultivar melloco, oca y
papas nativas. Debido a esto es un tanto difícil de manera certera delimitar su área de
extensión (Suquilanda, 2007). La mashua es un tubérculo que crece de forma silvestre en
altitudes que van desde 2500 m hasta 4000m sobre el nivel del mar; además, desde el
punto de vista agronómico la mashua es muy rústica porque se cultiva en suelos pobres,
sin uso de fertilizantes y pesticidas químico-sintéticos; y aun en estas condiciones, su
rendimiento puede duplicar el de la papa (Pacco, 2015).
2.2.2 Taxonomía de la Mashua
Según lo mencionado en (Pacco, 2015) la ubicación taxonómica de la mashua es la
siguiente:
10
Tabla 1. Taxonomía de Mashua
Reino Vegetal
Clase Angioespermas
Sub clase Dicotiledoneas
Orden Geraniales
Familia Tropaelaceae
Género tropaeolum
Especie tuberosum
Nombre Científico tropaeolum tuberosum
Nombres Comunes "mashua","añu","cubios", "navios"
Adaptado por: Alemán Julissa
2.2.3 Morfología
Tallos: La mashua es una planta herbácea erecta o semi postrada, de tallos cilíndricos
y hábitos rastreros.
Hojas: Esta planta posee un follaje compacto, con hojas de color verde oscuro en el
haz y más claras en el envés. Las hojas tienen lámina redondeada y el peciolo inserto en
el centro.
Flores: La mashua posee flores solitarias de distintos colores que van desde el
anaranjado hasta el rojo oscuro. El número de estambres varía de 8 a 13 y el tiempo que
permanece abierta oscila entre 9 y 15 días.
Fuente:(Ebay, 2017)
Ilustración 2.Flores y follaje de la Mashua
11
Tubérculos: Los tubérculos de mashua miden de 5 a 15 cm de largo, tienen forma
cónica alargada, yemas profundas, y variados colores como el amarillo, blanco, rojizo,
morado, gris y negro, con jaspes oscuros en la piel. El tubérculo posee una textura arenosa
y contiene 15% de proteínas, con alto porcentaje de carbohidratos y 80% de agua. Debido
a la presencia de isotiocianatos, que también se encuentran en la mostaza y los rabanitos,
la mashua tiene un sabor acre y picante, pero que se transforman con la cocción
volviéndose dulce (Ecológico, 1995).
Adaptado por: Alemán Julissa
Ilustración 3.Tubérculo de Mashua ECU 1144
2.2.4 Variedades
Tapia y colaboradores mencionan que según su coloración la mashua puede
clasificarse en: tubérculos de color uniforme generalmente blanco, amarillo o anaranjado;
tubérculos con yemas pigmentadas que contienen antocianinas que también se
manifiestan con franjas longitudinales rojas o moradas (Tapia, Fries, Mazar, & Rosell,
2007).
2.2.5 Valor Nutricional
Según la revista Patrimonio Alimentario (Ministerio de Cultura del Ecuador, 2013),
la mashua aporta nutrientes esenciales como vitaminas y minerales que fortalecen el
organismo humano y estimulan el crecimiento. Por su alto contenido en carbohidratos,
la mashua tiene un importante valor calórico. Además, es rica en ácido ascórbico
(vitamina C), el cual contribuye al mantenimiento de los cartílagos, ayuda a la absorción
del hierro que previene la anemia y estimula el sistema inmune para la prevención de las
infecciones. Presenta un alto contenido de fibra, por ende, estimula la motilidad
intestinal. El fósforo, el calcio y carotenoides precursores de vitamina A también están
presentes. Cabe recalcar que sus colores amarillos y anaranjados indican un considerable
contenido de carotenoides. Estos compuestos tienen además, la actividad antioxidante
12
que es atribuida a las propiedades de las moléculas que son capaces prevenir o retrasar
algunos tipos de daños a las células causado por radicales libres (Rodriguez-amaya,
1997).
Tabla 2. Composición Nutricional de Mashua
Composición Nutricional de
Mashua
Humedad (%) 88,70
Cenizas (%) 4,81
Proteína (%) 9,17
Fibra (%) 5,86
Grasa (%) 4,61
Carbohidratos Totales (%) 75,40
Azúcares totales (%) 42,81
Vitamina C (mg/100 g mf) 77,37
Eq. Retinol /100 g mf 73,56
mf=muestra fresca
Fuente:(Espín, Villacrés, & Brito, 2004) Adaptado por: Alemán Julissa
2.2.6 Propiedades del tubérculo Mashua
Según el Centro Internacional de la papa, el tubérculo de mashua tiene propiedades
medicinales e insecticidas. Por sus altos niveles de isotiocianatos (glucosinolatos), se
considera que es un diurético tradicional y un remedio para dolencias renales. Estudios
realizados en la Universidad Complutense de Madrid han mostrado que puede prevenir
el desarrollo de células cancerosas en el estómago, colon, piel y próstata (CIP, 2015).
2.2.7 Formas de consumo de Mashua
Tradicionalmente los tubérculos de mashua, en las comunidades y pueblos del
callejón interandino, se consumen cocidos de manera directa sin pelar como parte de
mazamorras (coladas) o locros. Los brotes tiernos y las flores de la planta también se
consumen cocidos como verduras (Ministerio de Cultura del Ecuador, 2013).
Este tubérculo puede ser aprovechado en la gastronomía ecuatoriana por su
versatilidad para la elaboración de exquisitos platos, sin olvidar su valioso aporte
nutricional.
13
Formas de consumo de Mashua
Fuente:(Ministerio de Cultura del Ecuador, 2013)
Ilustración 4. Colada de Mashua
2.2.8 Carotenoides
Los carotenoides son pigmentos naturales que se encuentran en plantas, hongos y
bacterias. Los mamíferos obtienen carotenoides predominantemente a través de
alimentos de origen vegetal que los acumulan en los plastos dando colores amarillo
brillante, rojo y naranja, característicos de las frutas y verduras (Shete & Quadro, 2013).
En la Tabla 3 se resume las fuentes alimenticias y los tipos de carotenoides que aportan.
Presentan numerosas aplicaciones en el campo de la industria alimentaria y de piensos,
así como en nutracéutica y cosmética. El β-caroteno se utiliza como colorante y
antioxidante en muchos alimentos, como las margarinas o mayonesas, así como en la
industria cosmética y farmacéutica. Algunos cetocarotenoides como astaxantina y
cantaxantina se usan como aditivos alimentarios esenciales para la adecuada
pigmentación de salmones, truchas o mariscos en acuicultura.(Zotal, 2016)
Tabla 3. Fuentes y contenido de carotenoides en alimentos
Carotenoide µg/100 g
Fuente alfa
caroteno
beta
caroteno
beta
criptoxantina
luteína o
zeaxantina licopeno
Lechuga - 1,27 - 2,64 -
Espinaca - 5,60 - 11,94 -
14
Col de
Bruselas 6,00 4,50 - 1,59 -
Fréjol 1,47 4,08 - - -
Brócoli 1,00 7,79 - 2,00 -
Pimiento 5,90 2,38 2,21 - -
Calabaza 4,80 6,94 - - -
Papa - 6,00 - - -
Tomate 1,12 3,93 - 1,30 3,03
Zanahoria 4,65 8,84 - - -
Plátano 5,00 2,10 - - -
Mango 1,70 4,45 1,10 - -
Naranja 1,60 5,10 - - -
Melón 2,70 1,60 - 4,00 -
Fuente: (Minguez, M. I., Pérez, A., 2008) Adaptado por: Alemán Julissa
2.2.9 Clasificación de Carotenoides
Según su estructura química, los carotenoides pueden clasificarse como carotenos y
xantofilas. Los carotenos (como β-caroteno, α-caroteno, γ-caroteno, licopeno, fitoeno y
fitotolueno) son carotenoides no oxigenados que pueden ser lineales o poseer
hidrocarburos cíclicos en uno o ambos extremos de la molécula. Las xantofilas (como la
luteína, la zeaxantina, la meso-zeaxantina, astaxantina, cantaxantina y β-criptoxantina)
son derivados oxigenados de los carotenos (Wassef et al., 2014). Su clasificación se
expone en la Tabla 4 y sus estructuras químicas están reflejadas en la Tabla 5.
15
Tabla 4. Clasificación de los carotenoides
CAROTENOIDES
CAROTENOS XANTOFILAS
Provitaminicos No Provitaminicos Provitaminicos No Provitaminicos
Alfa caroteno Licopeno
Beta criptoxantina
Luteína
Beta caroteno Fitoeno Zeaxantina
Gama caroteno Fitoflueno Cantaxantina
Fuente: (Wassef et al., 2014) Adaptado por : Alemán Julissa
Fuente:(A. J. Meléndez-Martínez, 2017)
Ilustración 5. Estructuras y características de carotenoides presentes en alimentos
16
Algunos de los carotenoides también actúan como precursores de la vitamina A, lo que
permite su clasificación en grupo provitamina A y grupo de carotenoides no provitamina
A. Se estima que aproximadamente el 60% de la vitamina A de la dieta diaria proviene
del grupo de las provitaminas A (Shete & Quadro, 2013).
2.2.10 Propiedades físicas y químicas de carotenoides
Solubilidad
La gran mayoría de los carotenoides son insolubles en agua debido a su carácter
lipofílico y solubles en disolventes apolares, como acetona, metanol, hexano éter
dietílico, entre muchos otros. Por otra parte, los carotenoides ácidos pueden formar sales
sódicas o potásicas solubles en agua por tratamiento con álcali como el caso de bixina,
astaceno, mitiloxantina (Britton, Liaaen-Jensen, & Pfander, 2009).
Los puntos de fusión son elevados, generalmente comprendidos en el rango 130-
220°C y la solubilidad de los cristales generalmente pequeña, siendo mejor en disolventes
orgánicos clorados y en benceno (Meléndez-Martínez, Antonio J, Vicario, Isabel M, &
Heredia, 2007).
Absorción de Luz
Debido a la presencia de los grupos cromóforos de dobles enlaces conjugados, los
carotenoides absorben luz UV-visible. Las longitudes de onda a las que aparecen los
carotenoides (λ máx.) dependen del número de dobles enlaces conjugados y del
disolvente empleado para medir el espectro (Britton et al., 2009).
La propiedad de absorber la luz se deriva de la presencia de 7 o más enlaces dobles
conjugados que absorben en el espectro visible, y presentan colores que van del amarillo
al rojo. Cuando los carotenoides están en disolución, obedecen la ley de Lambert-Beer,
de ahí que pueden cuantificarse espectrofotométricamente (Meléndez-Martínez, Antonio
J, Vicario, Isabel M, & Heredia, 2007).
Además, el sistema de dobles enlaces conjugados no solo afecta a sus propiedades de
absorción de la luz y por tanto a su color, sino también a su reactividad frente a los
radicales libres, responsables del estrés oxidativo en el organismo.
Color
Los carotenoides absorben también la luz azul y violeta (aprox. 400-500 nm), de
forma que exhiben coloraciones de tonos amarillentos, anaranjados o rojizos. (A. J.
Meléndez-Martínez, 2017)
17
Espectro de absorción
Fuente:(UPV, 2019)
Ilustración 6. Espectro de absorción de los pigmentos fotosintéticos
De todos los carotenoides identificados en la naturaleza, solo unos pocos que forman
grupo de provitaminas A, son ingeridos con la dieta humana y fueron detectados en la
sangre y los tejidos humanos. Estos son α-caroteno, β-caroteno y β-criptoxantina. El
grupo de licopeno, luteína, zeaxantina y meso-zeaxantina no son carotenoides
provitaminas A (Krinsky & Johnson, 2005).
2.2.11 Estabilidad de los carotenoides
Los carotenoides son pigmentos estables en su ambiente natural, pero cuando los
alimentos se calientan o cuando son extraídos en disolución, en aceites o en disolventes
orgánicos se vuelven mucho más inestables. La destrucción de estos pigmentos reduce el
valor nutritivo de los alimentos e induce una decoloración y una pérdida de sus
características organolépticas y funcionales (Antonio J Meléndez-Martínez, Vicario,
Heredia, & Heredia Are, 2004).
El grado de decoloración depende de la presencia de agentes oxidantes en el medio.
La oxidación de carotenoides al igual que los lípidos es acelerada por la temperatura, la
luz, la presencia de metales y enzimas. La estructura química, la actividad de agua, la
exposición a la luz y presencia de sulfitos son factores que influyen en la degradación de
carotenoides (Meléndez-Martínez et al., 2004).
18
2.2.12 Identificación de los carotenoides
La identificación de carotenoides generalmente requiere su separación de otros
compuestos con posterior identificación por métodos analíticos previa extracción y
saponificación de las muestras. Tomando en cuenta que los carotenoides son compuestos
coloreados con proporciones altas de dobles enlaces conjugados su identificación como
carotenoides totales es factible utilizando los métodos de espectrofotometría UV/VIS.
Sin embargo, para la determinación de carotenoides específicos como el beta caroteno,
es conveniente aplicar métodos cromatográficos como HPLC.
2.2.13 Espectrofotometría
La espectrofotometría es uno de los métodos ampliamente aplicado en los análisis.
Se basa en la relación que existe entre la absorción de luz por parte de un compuesto y
su concentración. Cuando se hace incidir una luz monocromática (de una sola longitud
de onda) sobre un medio homogéneo, una parte de esta luz es absorbida por el medio y
otra es transmitida. Como consecuencia la intensidad del rayo de luz es atenuada desde
Po a P, siendo Po la intensidad de la luz incidente y P la intensidad de luz transmitida
(Harris, 2006).
Dependiendo del compuesto y de la longitud de onda a medir, la muestra puede estar
en fase líquida, sólida o gaseosa. Para las regiones visibles y ultravioleta del espectro
electromagnético, la muestra es generalmente disuelta para formar una solución. Cada
sustancia tiene su propio espectro de absorción, que se visualiza como una curva. La
cantidad de energía radiante que se absorbe a una determinada longitud de onda, para
una determinada sustancia es distinta a la que absorbe otro compuesto (Harris, 2006).
Siendo así la espectrofotometría UV-visible es una de las técnicas analíticas que
permite determinar la concentración de un compuesto especifico, para lo que es necesario
valerse de un equipo de espectrofotometría en el que se puede seleccionar la longitud de
onda adecuada para que un haz de luz atraviese el compuesto de interés dando como
respuesta la absorbancia del compuesto misma que es utilizada para determinar la
concentración del compuesto de interés (Díaz et al., 2006).
2.2.14 Cromatografía
La cromatografía es un método físico en el que los componentes a separar se
distribuyen entre la fase estacionaria y la fase móvil, en donde la fase estacionaria permite
el paso lento de fluidos a través de los materiales porosos que la componen. Este proceso
(elución) se da como resultado de repetidos procesos de sorción y desorción durante el
movimiento de los componentes de la mezcla que son arrastrados por la fase móvil a lo
largo de la fase estacionaria (columna). Con esto se produce la separación debido a las
19
diferencias en las constantes de distribución de los componentes de la mezcla entre la
fase estacionaria y la móvil (Tobergte & Curtis, 2013).
2.2.15 Cromatografía Liquida de Alta Eficiencia HPLC
La cromatografía de líquidos de alta eficacia es la técnica analítica de separación más
ampliamente utilizada para el análisis de muestras líquidas.(Metropolitana, 2007), pues
es útil para la separación de sustancias con grandes pesos moleculares que presentan una
volatilidad muy baja y no pueden separarse mediante cromatografía de gases. Se usa
principalmente en la biotecnología, en ciencias y la industria farmacéutica.
En este tipo de cromatografía la fase móvil es un disolvente o mezcla de disolventes
y la fase estacionaria un sólido que interactúa con las sustancias que se desea separar
(cromatografía líquido-sólido), o bien un líquido inmiscible con la fase móvil, depositado
en la superficie de un sólido (cromatografía líquido-líquido). Esta forma de cromatografía
puede realizarse utilizando una columna en donde la fase estacionaria es su relleno
(Metropolitana, 2007).
Fuente:(Gasca & Torres Salas, 1931)
Ilustración 7.Principales componentes de un equipo HPLC
Como se muestra en la Ilustración 7 los equipos de cromatografía líquida de alta eficacia
deben disponer de al menos los siguientes componentes.
Reservorios o botellas para la fase móvil.
Sistema de bombeo (bomba peristáltica).
Inyector (manual o automático).
Columna.
20
Uno o varios detectores en serie.
Sistema de tratamiento de resultados.
Botella para residuos.
2.2.16 Beta Caroteno
El beta caroteno es un integrante de la familia de los carotenoides que tiene carácter
hidrofóbico y se relaciona con los colores rojos, anaranjados o amarillos presentes de
forma natural en muchas frutas, cereales, aceites y verduras. El β-caroteno es el precursor
de mayor actividad de provitamina A (100%) que los otros carotenoides de su grupo. Una
de las ventajas del beta caroteno en la dieta es que el cuerpo solo convierte tanta cantidad
como es requerido por el organismo, cubriendo con esto el requerimiento diario de este
fitonutriente (Nordqvist, 2017).
También tiene propiedades antioxidantes que ayudan a neutralizar los radicales libres
que son unas moléculas reactivas y altamente energizadas. Se forman a través de ciertas
reacciones bioquímicas durante los procesos metabólicos (por ejemplo, la respuesta
inmunitaria, la síntesis de prostaglandina) o a través de fuentes externos tales como la
polución atmosférica o el humo del cigarro (Gonzales, 2011).
Es un componente del grupo de los carotenos, que pertenece estructuralmente a los
tetraterpenos, que se sintetizan bioquímicamente a partir de ocho unidades de isopreno y
tienen 40 carbonos. Entre esta clase de carotenos, el β-caroteno se distingue por tener
anillos beta en ambos extremos de la molécula como se muestra en la Ilustración 8. La
absorción de β-caroteno aumenta si se consume con grasas, ya que es liposoluble
(Wanfeng, 2018).
Fuente:(Wikipedia, 2010)
Ilustración 8. Estructura química del beta-caroteno
2.2.17 Ruta Biosintética de Betacaroteno
21
La biosíntesis de los carotenoides se realiza en los plástidos, cloroplastos o
cromoplastos. Todos los carotenoides son derivados del isopentenil difosfato (IPP) y de
su isómero dimetilalil difosfato (DMAPP). Comienza con la condensación del piruvato
y el gliceraldehído3-fosfato (Ga3P) para la obtención de 2-metil-D-eritritol-4-fosfato
(MEP) por medio de las enzimas (DOXP) sintasa y (DOSP) reductoisomerasa , es asi
como a partir de la reducción de la molécula de MEP se obtiene el hidroximetil butenil
difosfato (HMBPP); este origina los isómeros IPP y DMAPP que están continuamente
interconvirtiéndose. Cuatro moléculas de IPP y una de DMAPP producen el geranil
geranil pirofosfato (GGPP). Dos moléculas de GGPP se convierten a fitoeno, el primer
carotenoide incoloro.
La molécula de fitoeno pasa por una serie de reacciones de desaturación con ayuda de
las enzimas (PSY) fitoeno sintasa y (PDS) fitoeno desaturasa que crean enlaces dobles
extendiendo el cromóforo. Por último, se obtiene el licopeno por la acción de la caroteno
isomerasa (CRTISO). Una vez que se obtiene el licopeno (primer carotenoide con color)
se pueden tomar dos vías para la posterior ciclación de los compuestos .Con la acción de
la ε-licopeno ciclasa (ε-LCY) se cicla uno de los extremos del licopeno y con una segunda
reacción por parte de la β-licopeno ciclasa (β-LCY) se cicla el otro extremo, obteniéndose
el α-caroteno. Por la otra vía, se ciclan los dos extremos con la ayuda de la β-LCY, para
la obtención del β-caroteno. A partir de estos dos compuestos se dan reacciones de
hidroxilación para la obtención de xantofilas como la luteína y la zeaxantina. La
violaxantina y neoxantina, se derivan de estas mismas vías por la acción de numerosas
enzimas (Ordóñez & Rodríguez, 2013).
En la Ilustración 9 se detalla la biosíntesis de carotenoides.
La conversión de beta-caroteno en vitamina A (retinol) se realiza en el hígado,
principal órgano de almacenamiento, que puede absorber y convertir tan sólo una porción
determinada de beta-caroteno proveniente de la dieta necesaria para el organismo y cubrir
los requerimientos; 6 mg de beta-caroteno en el alimento equivale más o menos a 1 mg
de retinol. Si no se consumen productos animales y el cuerpo debe depender por entero
del caroteno vegetal para su provisión de vitamina A, el consumo de caroteno debe
aumentarse a fin de lograr los niveles recomendados de vitamina A, es decir de 400-900
µg de retinol (FAO, 2002).
22
Ruta Biosintética de Betacaroteno
Fuente:(Ordóñez & Rodríguez, 2013)
Ilustración 9.Biosíntesis de Carotenoides
*Biosíntesis de carotenoides. Las elipses azules simbolizan las enzimas involucradas en
el proceso. DOXP: 1-deoxi-D-xilulosa-5-fosfato, MEP: 2-C-metil-D-eritritol-4-fosfato,
HMBPP: hidroximetil butenil difosfato, IPP: isopentenil difosfato, DMAPP: dimetilalil
difosfato, GGPP: geranil geranil pirofosfato.
2.2.18 Beneficios del Beta caroteno
Al ser una fuente segura de vitamina A, ayuda al cuerpo mantener un crecimiento y
desarrollo correcto, una buena visión y salud ocular, estimula el sistema inmunitario y
mantiene una piel sana.
23
Es un antioxidante que protege el organismo humano contra los efectos nocivos de
los radicales libres, los cuales aumentan el riesgo de desarrollar ciertas enfermedades
cardiovasculares y cáncer (Zapata, 2015).
2.2.19 Requerimientos de Beta Caroteno
Las sugerencia de la FAO y la Organización Mundial de la Salud (OMS) la ingesta
diaria para los adultos es 750 µg de retinol por día; para las madres lactantes se necesita
50 por ciento más, y para los niños y bebés cantidades menores. Estas recomendaciones
se basan en dietas mixtas que incluyen la vitamina A y caroteno.
2.2.20 Métodos de Deshidratación
La deshidratación de la muestra vegetal tiene por objeto eliminar el contenido del
agua. De esta forma se garantiza la calidad y estabilidad de la materia prima, evitando el
crecimiento de hongos y desarrollo de bacterias. Así mismo se interrumpen los procesos
enzimáticos como el pardeamiento, que en muchas ocasiones no son deseados. Por
último, la deshidratación fija los constituyentes propios de los alimentos y facilita el
proceso de aislar los principios activos y metabolitos secundarios (Barbosa & Vega,
2000).
2.2.21 Secado en Bandeja
Una de las técnicas de deshidratación es el empleo de estufas eléctricas donde se
puede controlar la temperatura, humedad relativa, corriente de aire forzado. En estufas
más equipadas se pueden realizar secados con atmosfera inerte y a presión reducida. La
configuración básica de una estufa de aire atmosférico es una cámara donde se coloca el
alimento sobre las bandejas misma que está equipado con ventiladores y canales que
permiten la circulación del aire caliente alrededor y a través de cualquier alimento o
material (Barbosa & Vega, 2000).En la Ilustración 10 se presenta un ejemplo de la estufa
de desecación
24
Fuente:(LABOLAN, 2018)
Ilustración 10. Estufa de desecación por aire forzado
2.2.22 Liofilización
La liofilización es un proceso de desecado mediante sublimación de agua, utilizado
con el fin de conservar los componentes volátiles o termo-sensibles. “este método junta
dos de los procesos que mejores resultados tienen en la conservación de alimentos como
son: la congelación y la deshidratación, con este método los productos no se ven alterados
en sus propiedades y pueden ser fácilmente rehidratados” (Ramirez, 2006).
La Ilustración 11 expone el equipo utilizado para la liofilización.
El método de liofilización consiste esencialmente en dos etapas: 1. El producto se
congela y 2. El producto se deshidrata por sublimación directa del hielo bajo una presión
reducida, es decir el agua del producto pasa, por tanto, directamente de estado sólido a
estado gaseoso sin pasar por el estado líquido La liofilización es un método efectivo para
ampliar la vida útil de los alimentos y productos sometidos a este proceso (Barbosa &
Vega, 2000).
Fuente:(SCIENTIFIC, 2019)
Ilustración 11. Equipo de Liofilización
25
2.3 Fundamentación Legal
LEY ORGÁNICA DEL RÉGIMEN DE LA SOBERANÍA ALIMENTARIA
EL PLENO DE LA COMISIÓN LEGISLATIVA Y DE FISCALIZACIÓN
Considerando:
Que, el inciso primero del artículo 1 de la Constitución de la República establece que el
Ecuador es un Estado constitucional de derechos y justicia, social, democrático,
soberano, independiente, unitario, intercultural, plurinacional y laico.
Que, entre los Derechos del Buen Vivir, el artículo 13 de la Constitución prescribe que
las personas y las colectividades tienen derecho al acceso seguro y permanente a
alimentos sanos, suficientes y nutritivos; preferentemente producidos a nivel local y en
correspondencia con sus diversas identidades y tradiciones culturales, para lo cual el
Estado deberá promover la soberanía alimentaria.
Que, el Art. 281 de la Constitución de la República establece que la soberanía alimentaria
constituye un objetivo estratégico y una obligación del Estado para que las personas,
comunidades, pueblos y nacionalidades dispongan de alimentos sanos y culturalmente
apropiados de forma permanente.
2.4 Hipótesis
2.4.1 Hipótesis Alterna.(Hi)
La concentración de carotenoides en mashua (Tropaeolum tuberosum) se ve afectada por
la variedad y por los métodos de deshidratación aplicados a las muestras.
2.4.2 Hipótesis Nula.(Ho)
La concentración de carotenoides en mashua (Tropaeolum tuberosum) no se ve afectada
por la variedad y por los métodos de deshidratación aplicados a las muestras.
2.5 Sistema de Variables
2.5.1 Variable Dependiente o respuesta
Las variables dependientes o respuesta, son:
26
- la concentración de carotenoides totales (mg /100 g)
- beta caroteno (µg de beta caroteno/100 g) de mashua (Tropaeolum tuberosum)
seca.
2.5.2 Variables Independientes
El Factor A: Sistemas de deshidratación y sus dos niveles: Secado en bandeja (50°C; 6
horas) y liofilizado (-40°C; 4 días; 0,7 bares).
El Factor B: Variedades de mashua (Tropaeolum tuberosum) con sus cuatro niveles: ECU
8768, ECU 1144, ECU 8552, ECU 1107 en su estado de madurez fisiológica.
27
Capítulo III
Metodología
3.1 Diseño de Investigación
La investigación planteada se desarrolló con un paradigma cuantitativo pues se
emplearon métodos experimentales haciendo uso de técnicas desarrolladas y probadas,
el nivel de la misma es explicativo debido a que se enfocaron en relacionar la causa y
efecto entre los métodos de deshidratación y las variedades de mashua (Tropaeolum
tuberosum), variables independientes, sobre la variable dependiente (carotenoides
obtenidos). Los datos fueron analizados mediante estadística descriptiva e inferencial,
utilizando un diseño factorial. El enfoque cuantitativo está determinado por la línea de
investigación en el área de fitonutrientes y fitoalimentos. Además se empleó una
investigación de tipo experimental y documental.
3.2 Población y Muestra
3.2.1 Población
La población de la investigación corresponde a cuatro variedades de mashua
(Tropaeolum tuberosum) variedades ECU 8768, ECU 1144, ECU 8552, ECU 1107 en su
estado de madurez fisiológica.
3.2.2 Muestra
Con el fin de asegurar la trazabilidad experimental, la muestra estuvo constituida por
4 kg de cada variedad de tubérculo previamente deshidratados y pulverizados
proporcionado por el Instituto Nacional de Investigaciones Agropecuarias de Ecuador
(INIAP), del Departamento de Nutrición y Calidad procedentes de la comunidad de
Aláquez (ver Anexo C) ubicada en la provincia de Cotopaxi .
Gutiérrez en su libro “Análisis y Diseño de Experimentos” menciona que una
decisión importante en cualquier diseño de experimentos es decidir el número de réplicas
que se hará por cada tratamiento (tamaño de muestra). Por lo general, si se esperan
diferencias pequeñas entre tratamientos será necesario un mayor tamaño de muestra
(Gutiérrez, 2008).
Debido a lo citado para determinar los carotenoides totales y beta caroteno, se
realizaron seis repeticiones de cada variedad de mashua (Tropaeolum tuberosum) y
método de deshidratación, sumando así un total de 48 muestras.
28
A continuación se resume las especificaciones de cada variedad (Tabla 5) y las
condiciones de cada proceso de deshidratación que fueron la liofilización (Tabla 6) y el
secado en bandeja (Tabla 7).
Tabla 5. Especificaciones de cada variedad de las muestras
ESPECIFICACIONES
VARIEDAD Estado de Madurez Color Aroma Textura
ECU 8768 fisiológica-
organoléptica amarillo intenso dulce granulada
ECU 1144 fisiológica-
organoléptica
verde parcialmente
amarillo intenso dulce granulada
ECU 8552 fisiológica-
organoléptica
blanco parcialmente
amarillo pálido dulce granulada
ECU 1107 fisiológica-
organoléptica totalmente morado dulce granulada
Elaborado por: Alemán Julissa
Tabla 6. Condiciones de deshidratación por liofilización y las especificaciones de
muestra obtenida.
LIOFILIZACIÓN
Muestras Temperatura Presión Tiempo Humedad
Variedad °C bares días %
ECU 8768
-40 0,7 4
6,00
ECU 1144 4,39
ECU 8552 5,01
ECU 1107 5,10
Elaborado por: Alemán Julissa
Tabla 7. Condiciones de deshidratación en bandejas y las especificaciones de las
muestras obtenidas.
*SECADO EN BANDEJA
Muestras Temperatura Presión Tiempo Humedad
Variedad °C bares horas %
ECU 8768
50 - 6
10,25
ECU 1144 7,50
ECU 8552 9,75
ECU 1107 7,70
*Secadas en bandeja con aire forzado Elaborado por: Alemán Julissa
3.3 Métodos de Ensayo
29
3.3.1 Método CIP para determinación de Carotenoides.
El método para determinación de carotenoides del Centro Internacional de la Papa
(CIP) menciona que el procedimiento de los análisis (Anexo D) consiste en:
Molienda: Operación unitaria que permite la pulverización y desintegración del
material sólido (tubérculos) para reducir el tamaño de partícula.
Extracción: Técnica empleada para separar un producto orgánico (carotenoides) para
aislarlo de sus fuentes naturales, la técnica es utilizada aprovechando las diferencias de
solubilidad de los componentes de la mezcla en un disolvente adecuado.
Transferencia a éter de petróleo: Proceso utilizado pues cuando un alimento
(Mashua) está en contacto con este disolvente no polar, los compuestos lipídicos
muestran tal afinidad que al disolverse se separan del resto de los componentes, a este
principio se le conoce como extracción sólido-líquido.
Lavado: Etapa que se lleva acabo pata eliminar restos inorgánicos presentes en la
mezcla orgánica de reacción.
Saponificación: Proceso químico utilizado para remover clorofilas y lípidos
indeseables y en hidrolizar hidroxicarotenoides esterificados con ácidos grasos, liberando
los carotenoides.
Filtración: Operación unitaria que permite la separación de sólidos insolubles de un
líquido mediante un medio poroso, que retiene los sólidos permitiendo el paso del
líquido.
Identificación y Cuantificación: Se utilizan técnicas espectrofotométricas y
cromatográficas para determinar los analitos de interés.
3.3.2 Método de cuantificación de Carotenoides Totales
3.3.2.1 Preparación de muestra.
Se realizó la extracción pesando la muestra previamente molida (utilizando un
moledor eléctrico) de la siguiente manera: 6 g para las muestras de mashua amarilla y
30
blanca; 8 g para las muestras del tubérculo morado. Se añadió 40 mL de acetona a
temperatura de refrigeración 4°C y se homogenizó agitando durante 1-2 minutos
utilizando un agitador eléctrico en seguida se filtró y se lavó el filtrado con acetona. La
extracción se repitió por 3 veces hasta que el residuo carezca de color.
Cada variedad se realizó: en un embudo de separación se colocó 30 mL de éter de
petróleo y 10 mL de agua, y se transfirió en cuatro partes iguales el extracto con acetona,
seguido de 200 mL de agua destilada, se agitó, se dejó separar las fases y se descartó la
fase acuosa (parte inferior).
El extracto lipídico (parte superior) se lavó 4 veces con 200 mL de solución de NaCl
al 1%. Para evitar la formación de una emulsión, se dejó reposar las fases por 3 minutos
para que se separen y se descartó la fase acuosa.
Para la saponificación del extracto se recogió el extracto lipídico en un matraz de 250
mL y se añadió 1.5 g de antioxidante BHT (Butil hidroxitolueno), se añadió 40 mL de
KOH al 20%, el matraz utilizado fue cubierto con papel aluminio para evitar la
exposición a la luz y que el extracto se degrade, se dejó en un agitador eléctrico constante
durante 3 horas.
Concluidas las 3 horas, se transfirió a un embudo de separación y en el mismo matraz
se recogió la parte metanólica (inferior), se añadió 40 mL de acetona a temperatura de
refrigeración 4°C en cuatro partes iguales con 200 mL de agua al embudo de separación
que contenía 25 mL de éter etílico para lavar el extracto, después de la última fracción se
dejó reposar por 3 minutos, se descartó la fase acuosa y se filtró en un balón aforado de
25 mL añadiendo al embudo Na2SO4 para desecar y evitar que los restos de fase acuosa
pasen al balón, finalmente se aforó con éter de petróleo, se utilizó celdas de cuarzo para
realizar la lectura espectrofométrica de absorbancia a 450 nm.
3.3.2.2 Cuantificación de Carotenoides totales.
La concentración de carotenoides totales se calculó usando el coeficiente de absorción
para mezclas de carotenoides 2500, utilizando como solvente éter de petróleo
recomendado por Manual Harvest Plus para análisis de carotenoides (Schmalzer,
Thompson, & Simpson, 2008).
31
Ecuación 1. Cálculo de carotenoides totales
𝐶𝑎𝑟𝑜𝑡𝑒𝑛𝑜𝑖𝑑𝑒𝑠 𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙𝑒𝑠 =𝐴𝐵𝑆 ∗ 𝑉 (𝑚𝐿) ∗ 10000
𝐴 1% ∗ 𝑤 (𝑔)= µ𝑔/𝑔 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎
ABS =Absorbancia medida a 450 nm
V= Volumen de aforo
A 1%= Coeficiente de absorción recomendado por el Manual Harvest Plus
para mezcla de carotenoides totales 2500
w = peso de la muestra
3.3.3 Método de determinación de Beta Caroteno
3.3.3.1 Preparación de muestras
Se realizó la extracción pesando la muestra previamente molida (utilizando un
moledor eléctrico) de la siguiente manera: 6 g para las muestras de mashua amarilla y
blanca; 8 g para las muestras del tubérculo morado. Se añadió 40 mL de acetona a
temperatura de refrigeración 4°C y se homogenizó agitando durante 1-2 minutos
utilizando un agitador eléctrico en seguida se filtró y se lavó el filtrado con acetona. La
extracción se repitió por 3 veces hasta que el residuo carezca de color.
Cada variedad se realizó: en un embudo de separación se colocó 30 mL de éter de
petróleo y 10 mL de agua, y se transfirió en cuatro partes iguales el extracto con acetona,
seguido de 200 mL de agua destilada, se agitó, se dejó separar las fases y se descartó la
fase acuosa (parte inferior).
El extracto lipídico (parte superior) se lavó 4 veces con 200 mL de solución de NaCl
al 1%. Para evitar la formación de una emulsión, se dejó reposar las fases por 3 minutos
para que se separen y se descartó la fase acuosa.
Para la saponificación del extracto se recogió el extracto lipídico en un matraz de 250
mL y se añadió 1,5 g de antioxidante BHT (Butil hidroxitolueno), se añadió 40 mL de
KOH al 20%, el matraz utilizado fue cubierto con papel aluminio para evitar la
exposición a la luz y que el extracto se degrade, se dejó en un agitador eléctrico constante
durante 3 horas.
Concluidas las 3 horas, se transfirió a un embudo de separación y en el mismo matraz
se recogió la parte metanólica (inferior), se añadió 40 mL de acetona a temperatura de
refrigeración 4°C en cuatro partes iguales con 200 mL de agua al embudo de separación
que contenía 25 mL de éter etílico para lavar el extracto, después de la última fracción se
dejó reposar por 3 minutos, se descartó la fase acuosa y se filtró en un balón aforado de
32
25 mL añadiendo al embudo Na2SO4 para desecar y evitar que los restos de fase acuosa
pasen al balón, finalmente se aforó con éter de petróleo, se filtró y se dispuso en viales
para la separación cromatográfica.
3.3.3.2 Cuantificación de Beta caroteno
Para la calibración del método se realizó varias corridas del estándar de -caroteno de
96,4 % pureza (ver certificado Anexo H) con concentraciones de 6 mg/mL; 15 mg/mL;
30 mg/mL; 45 mg/mL; 55 mg/mL y 70 mg/mL , utilizando como solvente metanol,
acetonitrilo y cloroformo en proporciones de 47; 47 y 6 respectivamente (fase móvil),
se utilizaron filtros adaptados a jeringuillas aptos para que las muestras sean transferidas
a viales de 1,5 ml para HPLC (ver condiciones cromatográficas en la Tabla 8). Se realizó
la separación cromatográfica de los estándares y las muestras de mashua para obtener
el área del pico y realizar el cálculo de la concentración de β-caroteno.
Tabla 8. Condiciones Cromatográficas para determinación de β caroteno
SISTEMA DE CROMATOGRAFÍA
Modelo DionexMT UltiMate 3000 UHPLC+
DETECTOR
PDA Detector de matriz de diodos
HORNO
Temperatura inicial 30°C
Temperatura final 30°C
COLUMNA CROMATOGRÁFICA
Modelo XTERRA® MS C18 5um-3,9x150 mm
Temperatura 30°C
INYECTOR
Longitud de onda 450 nm
Flujo 1 mL/min
Presión 1800 psi
Fase móvil Modalidad Isocrática
ESPECIFICACIONES ADICIONALES
Tiempo de corrida 10 min
Temperatura de muestra 30°C
Fase móvil Acetonitrilo;Metanol;Cloroformo
(47:47:6)
Elaborado por :Alemán Julissa
33
La concentración de beta caroteno se calculó de la siguiente manera.
Ecuación 2. Cálculo de β-caroteno
𝐵𝑒𝑡𝑎 𝑐𝑎𝑟𝑜𝑡𝑒𝑛𝑜 =𝐴𝑚 ∗ 𝐶𝑠 (
µ𝑔𝑚𝐿) ∗ 𝑉 (𝑚𝐿)
𝐴𝑠 ∗ 𝑤 (𝑔)= µ𝑔/𝑔 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎
Am = Área del pico de la muestra
Cs = Concentración del estándar beta-caroteno
V= Volumen de aforo
As= Área del pico del estándar beta-caroteno
w = peso de la muestra
3.3.4 Verificación del Método de Ensayo de Beta Caroteno
CONSIDERO QUE DEBE IR ANTES DE LAS DETERMINACIONES.
Según la ISOO 9000 citada en la Guía Eurachem se define la verificación como
“confirmación, a través de la aportación de evidencias objetivas, de que se cumplen los
requisitos especificados”(Bravo, R Ellison, & F Gjengedal, 2010).
Para asegurar que los resultados sean reproducibles y confiables, se realizó la
adaptación de los métodos de análisis de carotenoides totales y beta-caroteno. Para esto
se realizaron los siguientes estudios:
Linealidad: La linealidad del método se evaluó mediante una curva de calibración
con el estándar de β-caroteno a concentraciones (6 mg/mL; 15 mg/mL; 30 mg/mL; 45
mg/mL; 55 mg/mL; 70 mg/mL), que permitieron estimar el coeficiente de correlación
lineal (r2) y la pendiente de la regresión (m).
Tabla 9. Resultados obtenidos para el estándar de β-caroteno
%
CONCENTRACIÓN
masa teórica
(mg)
masa
experimental
(mg)
tiempo de
retención
(min)
Área
UA*min
20 6
6,6528 6,833 5,7042
6,6528 6,833 6,0823
6,6528 6,833 5,6252
6,6528 6,833 5,9050
Promedio 6,833 5,8292
34
40 15
16,2552 6,830 11,5896
16,2552 6,817 11,8018
16,2552 6,830 11,7787
16,2552 6,833 11,8519
Promedio 6,828 11,7555
70 30
32,9885 6,827 23,1351
32,9885 6,823 22,9252
32,9885 6,827 22,9056
32,9885 6,823 22,9713
Promedio 6,825 22,9843
100 45
48,5254 6,830 37,3179
48,5254 6,827 37,3401
48,5254 6,837 37,5515
48,5254 6,840 37,6029
Promedio 6,834 37,4531
120 55
57,8986 6,823 44,6523
57,8986 6,823 43,2565
57,8986 6,843 44,5214
57,8986 6,843 45,2129
Promedio 6,833 44,4108
150 70
72,9896 6,840 55,8756
72,9896 6,843 55,2567
72,9896 6,843 55,2568
72,9896 7,301 56,4529
Promedio 6,957 55,7105
Elaborado por :Alemán Julissa
Con base a los datos de la Tabla 9, se realizó una curva con los promedios de las
concentraciones de beta caroteno mismo que se puede observar en la Ilustración 12,
donde se observa la tendencia lineal, la misma que presenta un coeficiente de correlación
lineal (r2) de 0,9970 y la pendiente (m) de 8,0827.
Adicionalmente se verificaron:
Límite de detección (LOD) y límite de cuantificación (LOQ): Los parámetros fueron
evaluados aplicando ecuaciones matemáticas y tomando en cuenta la desviación estándar
de la regresión (S y/x) y la pendiente (m).
Ecuación 3.Límite de detección y límite de cuantificación
𝐿𝑂𝐷 =3 ∗ 𝑆𝑦/𝑥
𝑚 𝐿𝑂𝑄 =
10 ∗ 𝑆𝑦/𝑥
𝑚
35
Fuente: (Skoog, F. James Holler, & Stanley R. Crouch, 2008)
Para la evaluación de precisión se realizaron 6 extracciones de cada variedad de mashua
Precisión: Este parámetro se determinó mediante un ensayo de repetibilidad de los
resultados determinando la desviación estándar y el coeficiente de variación de las
concentraciones las cuatro variedades de mashua (Tropaeolum tuberosum) sometidas a
los dos métodos deshidratación (Secado en bandeja y Liofilización). Los resultados del
ensayo de precisión se representan en la Tabla 10.
Tabla 10. Evaluación de precisión en cuatro variedades de Mashua para determinar
Carotenoides Totales
Concentración mg /100 g
Variedad Secado en
Bandeja Liofilizado
ECU 8768
A B
14,46 40,57
14,58 40,86
14,52 41,08
14,64 41,24
14,56 40,86
14,40 40,75
ECU 1144
7,47 18,75
7,51 18,62
7,61 18,45
7,57 19,24
7,46 19,78
7,41 18,62
ECU 8552
5,64 14,34
5,98 14,37
6,21 14,25
5,74 14,72
5,63 14,37
5,77 14,45
ECU 1107
4,89 5,22
4,94 5,14
4,88 5,18
5,86 5,18
4,43 5,23
4,93 5,11
Elaborado por: Alemán Julissa
36
Tabla 11. Evaluación de precisión en cuatro variedades de mashua para determinar
β-caroteno
Concentración ug/100g
Variedad
SECADO
EN
BANDEJA
LIOFILIZADO
ECU 8768
A B
1988,12 1987,44
1991,93 1987,98
2000,69 1990,81
1996,41 1993,93
2008,14 1723,49
1830,18 1757,32
ECU 1144
924,27 917,60
939,48 924,28
940,84 988,84
948,00 988,44
923,94 1195,49
927,90 1194,59
ECU 8552
17,34 23,70
18,11 22,93
23,77 27,73
19,37 23,87
19,64 19,93
22,08 23,32
ECU 1107
11,78 14,80
14,55 14,12
14,24 17,59
14,30 14,46
14,26 8,28
15,53 16,44
Elaborado por: Alemán Julissa
Los resultados del ensayo se representan en la Tabla 17.
Exactitud : La exactitud fue evaluada tomando en cuenta las cuatro corridas
cromatográficas del estándar de β-caroteno de concentración 4,6051 mg/mL, que
corresponde al 100 % de β-caroteno, es así que para comprobarlo se calculó el porcentaje
de recuperación haciendo uso de la siguiente ecuación.
37
Ecuación 4. Porcentaje de recuperación del estándar de β-caroteno
% 𝑅𝑒𝑐𝑢𝑝𝑒𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 =𝐶𝑜𝑛𝑐. 𝑟𝑒𝑎𝑙
𝐶𝑜𝑛𝑐. 𝑡é𝑜𝑟𝑖𝑐𝑎∗ 100
Conc. Real: Concentración de la lectura cromatográfica del estándar de β-caroteno
Conc. Teórica: Concentración teórica del estándar de β-caroteno
Los datos y resultados se presentan en la Tabla 18.
3.3 Materiales, reactivos y equipos
Tabla 12.Materiales para determinación de carotenoides totales y β-caroteno
MATERIALES MARCA DESCRIPCIÓN
Embudos de
separación KIMAX USA 250 mL
Embudos PIREX ® Medianos
Erlenmeyers KIMAX USA-
BOECO GERMANY 125 mL
Probeta de vidrio GLASSCO ® 100 mL
Probeta de plástico VITALAB 100 mL
Pipeta graduada KIMAX USA 10 mL
Balón aforado SIMAX
CZECHOSLOVAKIA
500 mL-1000 mL
ámbar
Frascos tapa rosca SIMAX
CZECHOSLOVAKIA 1000 mL ámbar
Balones aforados GLASSCO ® 25 mL-10 mL
ámbar
Papel filtro SUPERMAXI 125 mm*10 circles
Viales de boca
rosca MERCK 1,5 mL
Jeringuillas sin
aguja NIPRO 10 mL
Filtros PTFE - 0,22 µL
38
Pera de tres vías BOECO GERMANY -
Imanes para
agitación - Medianos
Mascarilla para
gases 3M 6003
Toallas absorbentes ASEO TOTAL -
Guantes - Nitrilo
Elaborado por: Alemán Julissa
Tabla 13.Reactivos para determinación de carotenoides totales y β-caroteno
REACTIVO MARCA GRADO # CAS
Acetona EMSURE ® Analítico -
Éter de petróleo EMSURE ® Analítico -
Etil éter PHARMCO-AAPER Analítico 60-29-7
Agua destilada - Analítico -
Cloruro de sodio FISHER SCIENTIFIC Analítico 7647-14-5
Hidróxido de potasio EMSURE ® Analítico 1310-58-3
Metanol EMSURE ® Analítico -
Metanol MERCK ® HPLC 67-56-1
Cloroformo FISHER SCIENTIFIC HPLC 67-66-3
Acetonitrilo MERCK ® HPLC 75-05-8
Estándar de Beta-
caroteno 94,9% Pureza SIGMA USP 7235-40-7
Butilhidroxitolueno - Analítico -
Sulfato de sodio
anhidro FISHER SCIENTIFIC Analítico 7757-82-6
Elaborado por: Alemán Julissa
39
Tabla 14.Equipos para determinación de carotenoides totales y β-caroteno
EQUIPO MARCA DESCRIPCIÓN
Sorbona FRONTIER*JUNIOR-
ESCO -
Agitador THERMO SCIENTIFIC -
Balanza analítica OHAUS/METTLER
TOLEDO 210 g Peso máx.
Refrigerador ELECTROLUX -
Estufa HS-122A -
Celdas de cuarzo AGILENT 10 mm/3mL
Columna para
cromatografía XTERRA® MS C18 5um-3,9x150 mm
Cromatógrafo DIONEX ULTIMATE 300
UHPLC+ focused con
detector de matriz de
diodos
Espectrofotómetro THERMO SCIENTIFIC Modelo Evolution 201
UV-VISIBLE
Cámara de secado TORBAL -
Liofilizador LABCONCO -
Elaborado por: Alemán Julissa
3.5 Diseño Experimental
El cumplimiento de los objetivos determinados requirió del programa estadístico IBM
SPSS Statistics 25 y las herramientas de EXCEL versión 2012 para realizar la validación
de las hipótesis aplicando un Diseño Factorial 4x2, sirviéndose del estadístico F y la
probabilidad para verificar si existe efecto entre los factores y la variable dependiente,
además se realizó DMS y TUKEY como pruebas de contraste de hipótesis específicas y
comparaciones múltiples por parejas para determinar si las medias de la variable
dependiente difieren entre sí. El análisis de varianza factorial se realizó al 95% de
confianza.
40
3.6 Matriz de Operacionalización de variables
Tabla 15. Operacionalización de variables para la determinación de carotenoides
totales y β caroteno
Tipo de
variable Variable Dimensiones Variable Dependiente
Independiente
Variedad de mashua
(Tropaeolum
tuberosum)
ECU 8768
mg /100 g
carotenoides totales de
muestra seca.
µg betacaroteno /100 g
de muestra seca.
ECU 1144
ECU 8552
ECU 1107
Tubérculo
6-8 gramos de cada
variedad
Sistemas de
deshidratación
Secado en bandeja
Liofilizado
Elaborado por: Alemán Julissa
3.7 Técnicas e Instrumentos de Recolección de Datos (IRD)
Se recolectaron los datos de la verificación de los métodos (linealidad, precisión y
exactitud) que se reflejan en el Anexo E.
3.8 Técnicas de procesamiento y Análisis de Datos
El equipo de Espectrofotometría UV-VISIBLE que utiliza el software INSIGHT 2
integrado en Microsoft™ permitió obtener los valores de absorbancia de las muestras
dato necesario para calcular la concentración de carotenoides.
El equipo de cromatografía líquida HPLC que utiliza como software ChromeleonTM
Chromatography Data System (CDS), programado para realizar la corrida
cromatográfica e integrar el área del pico de las muestras en un tiempo programado
permitió obtener los datos necesarios para calcular la concentración β caroteno.
Los análisis de las muestras se realizaron por triplicado en dias diferentes, lo que
permitió calcular la media aritmética, desviación estándar, coeficiente de variación y
41
porcentaje de recuperabilidad de las muestras, con el fin de verificar los métodos
aplicados a los analitos de estudio.
Capítulo IV
Análisis e Interpretación de Resultados
4.1 Verificación del Método de Ensayo
Linealidad: La linealidad del método se evaluó mediante una curva de calibración
realizando cuatro lecturas cromatográficas en cuatro días con el estándar de β-caroteno.
La Tabla 16 expone los resultados de concentraciones y el área de los picos respectivos
mismos que permitieron realizar una regresión lineal para estimar el coeficiente de
correlación lineal (r2) y la pendiente de la regresión (m).
Tabla 16. Corridas cromatográficas de concentración y área de pico del estándar
de β-caroteno
Concentración
mg/ml
Área
UA*min
0,6314 5,8292
1,5426 11,7555
3,1306 22,9843
4,6051 37,4531
5,4946 44,4108
6,9267 55,7105
Coef.corr ( r2 ) 0,9970
Intercepto (a) -0,3919
Pendiente (m) 8,0827
Elaborado por: Alemán Julissa
A partir de los datos de la Tabla 16 se elaboró una curva de calibración del estándar
de β-caroteno que se muestra en la Ilustración 12 que describe la tendencia lineal de la
curva, pues se obtiene un coeficiente de correlación (r2) cercano a 1 es decir 99,70 %
(Porcentaje de variación de la variable dependiente), afirmando que el método de ensayo
empleado es adecuado para determinar la relación existente entre las variables
concentración y área del pico del estándar.
42
Elaborado por: Alemán Julissa
Ilustración 12.Curva de calibración para el estándar de β-caroteno
Límite de detección (LOD) y límite de cuantificación (LOQ): Utilizando las
ecuaciones matemáticas y tomando en cuenta la desviación estándar de la regresión Sy/x
= 1,1517 y la pendiente m = 8,0827, se obtuvo 4,15 mg/mL para el límite de detección
es decir la concentración más baja de analito que puede detectarse y 5,15 mg/mL siendo
esta la concentración más baja de analito que puede cuantificarse
Precisión: Para este parámetro se valoró la dispersión de los datos obtenidos de
concentración de Beta Caroteno tomando como referencia el coeficiente de variación CV
representado en porcentaje, mismo que relaciona la variedad de Mashua y el método de
deshidratación.
Tabla 17.Parámetros de precisión para concentración de Beta Caroteno
BETA CAROTENO Concentración µg/100g
Variedad Parámetros Secado en
Bandeja Liofilizado
ECU 8768
Promedio 1969,24 1906,83
Des.Estándar 68,48 129,38
Coef.Variación % 3,48 6,78
ECU 1144 Promedio 934,07 1034,87
Des.Estándar 10,06 127,72
y = 8,0827x - 0,3919
R² = 0,997
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00
Áre
a U
A*m
in
Concentración mg/mL
Curva de calibración para Beta Caroteno
43
Coef.Variación % 1,08 12,34
ECU 8552
Promedio 20,05 23,58
Des.Estándar 2,44 2,50
Coef.Variación % 12,15 10,58
ECU 1107
Promedio 14,11 14,28
Des.Estándar 1,24 3,22
Coef.Variación % 8,79 22,58
Elaborado por: Alemán Julissa
El %CV para la concentración de Betacaroteno es relativamente bajo motivo por el
cual se establece que los datos son homogéneos y por lo tanto precisos.
Exactitud: Este ensayo se realizó preparando por cuadruplicado el estándar de β-
caroteno con concentración al 100% del estándar y se compró calculado el porcentaje de
recuperación, la Tabla 18 expone el porcentaje obtenido.
Tabla 18.Porcentaje de recuperación del estándar de β caroteno
Evaluación estadística de la disolución al 100% de beta caroteno
Área Conc. Inicial ui Conc. Obtenida xi ui-xi % recuperación xi
37,3179 4,6051 4,5685 0,0365 99,2066 Recuperación 99,68 %
37,3401 4,6051 4,5713 0,0338 99,2662 Des.Estándar 0,42 %
37,5515 4,6051 4,5974 0,0076 99,8342 % Recuperación 99,68 %
37,6029 4,6051 4,6038 0,0013 99,9723 Coef.Variación 0,42 %
37,6622 4,6051 4,6111 -0,0061 100,1316
Elaborado por: Alemán Julissa
El porcentaje de recuperación obtenido es de 99,68%, mismo que permite establecer
que se encuentra en el rango de 98-102% establecido para análisis por HPLC en los
laboratorios OSP de la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad Central del
Ecuador.
4.2 Cuantificación de Carotenoides Totales y Beta Caroteno por método de
deshidratación y variedad
44
Tabla 19. Concentración de Carotenoides Totales
Carotenoides Totales
mg/100 g
Variedad Secado en
bandeja Liofilizado
ECU 8768 14,53±0,09 40,89±0,24
ECU 1144 7,50±0,07 19,81±0,51
ECU 8552 5,83±0,23 14,42±0,16
ECU 1107 4,99±0,47 5,18±0,04
Elaborado por: Alemán Julissa
*Para cuantificar y obtener la media aritmética con su respectiva desviación estándar
(expuestos en el Anexo F) de la concentración de carotenoides totales se realizó seis
repeticiones de cada variedad.
Tabla 20.Concentración de Beta Caroteno
Beta Caroteno
µg/100 g
Variedad Secado en
bandeja Liofilizado
ECU 8768 1969,24±68,48 1906,83±129,38
ECU 1144 934,07±10,06 1034,87±127,72
ECU 8552 20,05±2,44 23,58±2,50
ECU 1107 14,11±1,24 14,28±3,22
Elaborado por: Alemán Julissa
*Para cuantificar y obtener la media aritmética con su respectiva desviación estándar
(expuestos en el Anexo G) de la concentración de β-caroteno se realizó seis repeticiones
de cada variedad.
4.3 Análisis de varianza factorial para Carotenoides Totales y Beta Caroteno
Un análisis de varianza factorial prueba la hipótesis de que las medias de dos o más
poblaciones son iguales. Los Análisis de varianza evalúan la importancia de uno o más
45
factores al comparar las medias de la variable de respuesta en los diferentes niveles de
los factores. La hipótesis nula establece que todas las medias de la población (medias de
los niveles de los factores) son iguales mientras que la hipótesis alternativa establece que
al menos una es diferente (Minitab, 2019).
Carotenoides Totales
Tomando en cuenta los factores que intervienen en el ANOVA, se plantearon
hipótesis que permitieron determinar si hay o no influencia de los factores sobre la
variable dependiente.
FACTOR A: VARIEDAD DE MASHUA
Ho: El factor variedad no influye sobre la concentración de Carotenoides Totales en
Mashua.
Hi: El factor variedad influye sobre la concentración de Carotenoides Totales en Mashua.
FACTOR B: MÉTODO DE DESHIDRATACIÓN
Ho: El factor métodos de deshidratación no influye sobre la concentración de
Carotenoides Totales en Mashua.
Hi: El factor métodos de deshidratación influye sobre la concentración de Carotenoides
Totales en Mashua.
INTERACCIONES
Ho: Las interacciones del factor A y B no influyen sobre la concentración de
Carotenoides Totales en Mashua.
Hi: Las interacciones del factor A y B influyen sobre la concentración de Carotenoides
Totales en Mashua.
46
Tabla 21. Análisis de varianza para Carotenoides Totales
ANÁLISIS DE VARIANZA
Variable dependiente: Concentración de Carotenoides Totales
Origen de las variaciones Suma de
cuadrados
Grados
de
libertad
Promedio
de los
cuadrados
Valor crítico
para F
experimental
Probabilidad
Valor
crítico para
F tabulado
A: Variedades 3397,70 3 1132,57 14465,84 9,88E-61 2,84
B :Deshidratación 1624,71 1 1624,71 20751,82 6,05E-56 4,08
A*B: Interacción Variedades*
deshidratación 1072,30 3 357,43 4565,37 9,87E-51 2,84
Dentro del grupo Error 3,13 40 0,08
Total 6097,853833 47
Elaborado por: Alemán Julissa
Para responder las hipótesis se realizó la prueba F y prueba de probabilidad p (95 %
de confianza) que se encuentran en el ANOVA mismas que permitieron conocer si existía
o no influencia de los factores sobre la variable dependiente, tomando en cuenta los
siguientes parámetros.
Si F exp > F tab; entonces se rechaza Ho y acepta Hi.
Si p < α (0.05); entonces se rechaza Ho y acepta Hi.
Según la Tabla 22 en la que se resume la estadística correspondiente a la medición de
efectos de cada uno de los factores que influyen sobre la cantidad de Carotenoides Totales
que se extrae de los tubérculos de mashua se establece:
Factor A: Se acepta Hi es decir el factor variedad influye sobre la concentración de
Carotenoides Totales en Mashua.
Factor B:Se acepta Hi es decir el factor métodos de deshidratación influyen sobre la
concentración de Carotenoides Totales en Mashua.
Factor A*B: Se acepta Hi es decir la interacción entre las variedades y métodos de
deshidratación influyen sobre la concentración de Carotenoides Totales en Mashua.
47
Elaborado por: Alemán Julissa
Ilustración 13. Diagrama de barras para resultados de Carotenoides Totales en
cuatro variedades de Mashua
La Ilustración 13 que es el grafico de barras permite observar que la concentración
de Carotenoides Totales se ve afecta por el Factor A: Variedades; Factor B: Métodos de
deshidratación y la interacción entre el Factor A y B, a pesar de que la concentración se
ve afectada por todos los factores se puede observar que las variedades ECU 8768; ECU
1144 y ECU 8552 sometidas a liofilización presentan mayor cantidad respecto al método
de secado en bandeja, lo que no sucede con la variedad ECU 1107 que presentan
concentraciones aproximadamente iguales.
Beta Caroteno
Para determinar si la variable dependiente es afectada o no por los factores planteados
en el ANOVA, se plantearon las siguientes hipótesis.
FACTOR A: VARIEDAD DE MASHUA
Ho: El factor variedad no influye sobre la concentración de Beta Caroteno en Mashua.
Hi: El factor variedad influye sobre la concentración de Beta Caroteno en Mashua.
48
FACTOR B: MÉTODO DE DESHIDRATACIÓN
Ho: El factor métodos de deshidratación no influye sobre la concentración de Beta
Caroteno en Mashua.
Hi: El factor métodos de deshidratación influye sobre la concentración de Beta Caroteno
en Mashua.
INTERACCIONES
Ho: Las interacciones del factor A y B no influyen sobre la concentración de Beta
Caroteno en Mashua.
Hi: Las interacciones del factor A y B influyen sobre la concentración de Beta Caroteno
en Mashua.
Tabla 22.Análisis de varianza para Beta Caroteno
ANÁLISIS DE VARIANZA
Variable dependiente :Beta Caroteno
Origen de las variaciones Suma de
cuadrados
Grados
de
libertad
Promedio de
los
cuadrados
Valor crítico
para F
experimental
Probabilidad
Valor
crítico para
F tabulado
A:Variedades 30451581,23 3 10150527,08 2144,48 3,37E-44 2,84
B: Deshidratación 1328,36 1 1328,36 0,28 5,99E-01 4,08
A*B: Interacción
Variedades*Deshidratación 40878,96 3 13626,32 2,88 4,78E-02 2,84
Dentro del grupo Error 189332,71 40 4733,32
Total 30683121,27 47
Elaborado por: Alemán Julissa
Para responder las hipótesis se realizó la prueba F y prueba de probabilidad p (95 %
de confianza) que se encuentran en el ANOVA mismas que permitieron conocer si existía
o no influencia de los factores sobre la variable dependiente, tomando en cuenta los
siguientes parámetros.
Si F exp > F tab; entonces se rechaza Ho y acepta Hi.
Si p < α (0.05); entonces se rechaza Ho y acepta Hi.
49
Según la Tabla 23 en la que se resume la estadística correspondiente a la medición de
efectos de cada uno de los factores que influyen sobre la cantidad de Beta caroteno que
se extrae de los tubérculos de mashua se establece:
Factor A: Se acepta Hi es decir el factor variedad influye sobre la concentración de Beta
Caroteno en Mashua.
Factor B: Se acepta Hi es decir el factor métodos de deshidratación influyen sobre la
concentración de Beta Caroteno en Mashua.
Factor A*B: Se acepta Hi es decir la interacción entre las variedades y métodos de
deshidratación influyen sobre la concentración de Beta Caroteno en Mashua.
Elaborado por: Alemán Julissa
Ilustración 14.Diagrama de barra para resultados de Beta Caroteno en cuatro
variedades de Mashua
La Ilustración 14 que es el grafico de barras permite observar que la concentración
del Beta Caroteno es afecta por el Factor A: Variedades y la interacción entre el Factor
A y B.
Sin embargo la concentración del Beta Caroteno no se ve afectada por el Factor B:
Métodos de deshidratación. Se puede observar que todas las variedades en los dos
métodos de deshidratación (secado en bandeja y liofilización) presentan concentraciones
numéricas aproximadamente iguales.
50
4.4 Cuantificación de Carotenoides Totales y Beta Caroteno
Los datos obtenidos de las concentraciones de carotenoides totales y β-caroteno de las 4
variedades del tubérculo mashua se realizaron pruebas estadísticas. La Tabla 24 presenta
la comparación de medias mediante las pruebas estadísticas DMS y TUKEY.
Tabla 23. Comparación de medias de Carotenoides Totales mediante DMS y
TUKEY para muestras secadas en bandeja
SECADO EN BANDEJA
Variedad Media Diferencia de
Medias Comparación DMS TUKEY Significancia
ECU 1107 4,99 9,54 > 0,34 0,48 *
ECU 8552 5,83 8,70 > 0,34 0,48 *
ECU 1144 7,50 7,03 > 0,34 0,48 *
ECU 8768 14,53 2,51 > 0,34 0,48 *
1,67 > 0,34 0,48 *
0,84 > 0,34 0,48 *
NS :No significativo * Significativo Elaborado por: Alemán Julissa
La comparación entre medias, mismas que representan el contenido de carotenoides
totales de muestras secadas en bandeja se realizó tomando en cuenta los estadísticos DMS
y TUKEY registrando que existe diferencia significativa entre las medias de las muestras
lo que permite exponer que las variedades de mashua ECU 1107; ECU 8552; ECU 1144
y ECU 8768 se ven afectadas por el método de deshidratación al que fueron sometidas.
Tabla 24. Comparación de medias de Carotenoides Totales mediante DMS y
TUKEY para muestras liofilizadas
LIOFILIZADO
Variedad Media Diferencia de
Medias Comparación DMS TUKEY Significancia
ECU 1107 5,18 35,71 > 0,34 0,48 *
ECU 8552 14,42 26,47 > 0,34 0,48 *
ECU 1144 18,91 21,98 > 0,34 0,48 *
ECU 8768 40,89 13,73 > 0,34 0,48 *
4,49 > 0,34 0,48 *
9,24 > 0,34 0,48 *
NS: No significativo * Significativo Elaborado por: Alemán Julissa
Como puede observarse en la Tabla 25 al realizar la comparación de medias mediante
las dos estadísticas DMS y TUKEY, existe diferencia significativa para las muestras de
51
diferentes variedades sometidas a liofilización ,lo que permite establecer que las medias
de concentración de carotenoides totales de las variedades ECU 1107; ECU 8552; ECU
1144 y ECU 8768 de Mashua se ven afectadas por el método de deshidratación al que
fueron sometidas, es decir la concentración de Carotenoides Totales si depende del
método de deshidratación aplicado.
Tabla 25. Comparación de medias de Beta Caroteno mediante DMS y TUKEY para
muestras secadas en bandeja
SECADO EN BANDEJA
Variedad Media Diferencia de
Medias Comparación DMS TUKEY Significancia
ECU 1107 14,11 1955,13 > 83,41 118,81 *
ECU 8552 20,05 1949,19 > 83,41 118,81 *
ECU 1144 934,07 1035,17 > 83,41 118,81 *
ECU 8768 1969,24 919,96 > 83,41 118,81 *
914,02 > 83,41 118,81 *
5,94 < 83,41 118,81 NS
NS: No significativo * Significativo Elaborado por: Alemán Julissa
La comparación de medias que se muestra en la Tabla 26 refleja que existe diferencia
significativa entre las medias de todas las variedades excepto en las variedades ECU 1107
y ECU 8552 lo que permite establecer que al aplicar cualquiera de los dos métodos
(secado en bandeja y liofilización) a estas dos variedades la concentración de β-caroteno
sigue siendo la misma.
Tabla 26. Comparación de medias de Beta Caroteno mediante DMS y TUKEY para
muestras liofilizadas
LIOFILIZADO
Variedad Media Diferencia de
Medias Comparación DMS TUKEY Significancia
ECU 1107 14,11 1955,13 > 83,41 118,81 *
ECU 8552 20,05 1949,19 > 83,41 118,81 *
ECU 1144 934,07 1035,17 > 83,41 118,81 *
ECU 8768 1969,24 919,96 > 83,41 118,81 *
914,02 > 83,41 118,81 *
5,94 < 83,41 118,81 NS
NS :No significativo * Significativo Elaborado por: Alemán Julissa
La Tabla 27 reporta la comparación de medias realizadas mediante DMS y TUKEY,
mismas que establecen que las muestras de las variedades ECU 1144 y ECU 8768 tienen
52
efecto significativo respecto a los métodos de deshidratación aplicados, por otro lado la
media entre las variedades ECU 1107 y ECU 8552 no tiene efecto significativo respecto
a los métodos de deshidratación secado en bandeja y liofilizado, es decir al aplicar
cualquiera de los dos métodos a estas dos variedades la concentración de β-caroteno sigue
siendo la misma.
4.5 Análisis Estadístico para la estimación del mejor método de deshidratación
para la concentración de Carotenoides Totales y β-caroteno
Tomando en cuenta las medias de los métodos de deshidratación, variedades y la
concentración de los analitos, se realizó el análisis estadístico denominado prueba t de
student expuesta en la Tabla 28, con la media de cada método de deshidratación para
establecer si existe o no diferencia entre métodos.
Tabla 27. Prueba t de student para dos grupos de muestras de Carotenoides Totales
considerando varianzas desiguales
SECADO EN
BANDEJA LIOFILIZADO
A B
Media 8,21 19,85
Varianza 14,79 179,70
Observaciones 24,00 24,00
Estadístico t -4,09
P(T<=t) dos colas 0,00
Valor crítico de t (dos colas) 2,05
Elaborado por: Alemán Julissa
Es asi como se establece que la prueba t de student P (T ≤ t) dos colas es menor a α =
0,05, por lo tanto existe diferencia significativa entre los dos métodos.
La Ilustración 15 muestra un diagrama de cajas que relaciona los métodos de
deshidratación y la concentración de carotenoides totales expresados en mg/100 g de
muestra, de todas la variedades, mismo que permite establecer que según las medias de
los métodos la liofilización presenta una media de 19,85 mg/100 g mayor comparado
con el método de secado en bandeja que expone una media de 8,21 mg/100 g.
53
Elaborado por: Alemán Julissa
Ilustración 15. Diagrama de cajas métodos de deshidratación vs concentración de
carotenoides totales
Para determinar si existe o no diferencia significativa entre métodos de deshidratación
se realizó la prueba t de student, expuesta en la Tabla 29.
Tabla 28. Prueba t de student para dos grupos de muestras de β-caroteno
considerando varianzas desiguales
SECADO EN
BANDEJA LIOFILIZADO
A B
Media 734,37 744,89
Varianza 677689,65 656301,34
Observaciones 24,00 24,00
Estadístico t -0,04
P(T<=t) dos colas 0,96
Valor crítico de t (dos colas) 2,01
Elaborado por: Alemán Julissa
Tomando en cuenta que la prueba t de student P (T ≤ t) dos colas es mayor a α = 0,05
se establece que no existe diferencia significativa entre los dos métodos. Con esto, no se
puede determinar cuál de los dos métodos es mejor pues estadísticamente son iguales.
8.21 mg/100 g
19.85 mg/100 g
54
Elaborado por: Alemán Julissa
Ilustración 16. Diagrama de cajas para métodos de deshidratación vs concentración
de β-caroteno
La Ilustración 16 muestra un diagrama de cajas que relaciona los métodos de
deshidratación y la concentración de β-caroteno expresados en mg/100 g de muestra, de
todas la variedades, mismo que permite establecer que según las medias de los métodos
la liofilización presenta una media de 744,89 µg/100 g y el método de secado en bandeja
que expone una media de 734,37 µg/100 g.
734.37 µg/100 g 744.89 µg/100 g
55
Capítulo V
Conclusiones y Recomendaciones
5.1 Conclusiones
Se determinó la concentración de carotenoides en cuatro variedades de mashua
(Tropaeolum tuberosum), deshidratada por métodos de liofilización y secado en
bandeja.
Se verificaron las metodologías para los análisis de Carotenoides Totales y β-
caroteno con la finalidad de asegurar que los resultados obtenidos son confiables
y reproducibles, por medio de linealidad, precisión y exactitud.
Se estableció que la mayor cantidad de carotenoides totales de mashua
(Tropaeolum tuberosum) sometidas a secado en bandeja se encuentran en la
variedad ECU 8768 con 14,53±0,09 mg /100 g de muestra seca.
Se determinó que la mayor cantidad de carotenoides totales de mashua
(Tropaeolum tuberosum) sometidas a liofilización se encuentran en la variedad
ECU 8768 con 40,89±0,24 mg /100 g de muestra seca.
Se determinó que para las cuatro variedades de mashua (Tropaeolum tuberosum)
secadas en bandeja la mayor cantidad de β-caroteno se encuentra en la variedad
ECU 8768 con 1969,24±68,48 µg /100 g de muestra seca.
Se estableció que la mayor cantidad de β-caroteno en mashua (Tropaeolum
tuberosum) sometidas a liofilización se encuentra en la variedad ECU 8768 con
1906,83±129,38 µg /100 g de muestra seca.
Se concluye que la mayor concentración de carotenoides totales y β-caroteno de
mashua (Tropaeolum tuberosum) se obtiene liofilizando el tubérculo es así como
la variedad con mayor cantidad de carotenoides totales corresponde a ECU 8768
con 40,89±0,24 mg /100 g y β-caroteno con 1969,24±68,48 µg /100 g, que
representa el 3,02% de provitamina A de la ingesta diaria recomendada por la
FAO.
56
Tomando en cuenta el análisis estadístico se concluye que la liofilización es el
mejor método de deshidratación para obtener mayor concentración de
carotenoides pues de esa manera se evitara la degradación de los mismos
presentes en los tubérculos.
El estudio realizado permite adoptar el enunciado de la hipótesis alterna de la
investigación: la concentración de carotenoides en el tubérculo mashua
(Tropaeolum tuberosum) se ve afectados por la variedad y por los métodos de
deshidratación aplicados a las muestras.
5.2 Recomendaciones
Realizar un estudio para determinar la cantidad de carotenoides totales y beta
caroteno en las cuatro variedades de mashua ECU 8768; ECU 1144; ECU8552 y
ECU 1107 en muestras en base fresca.
Debido a que la Mashua es un tubérculo que posee carotenoides se recomienda
incorporar a productos transformados para generar un aporte de provitaminas A,
con el fin de que los alimentos posean valor agregado.
Evaluar la estabilidad de Carotenoides Totales y Beta Caroteno del tubérculo
deshidratado incluido en alimentos elaborados a base de Mashua (Tropaeolum
tuberosum).
Se recomienda determinar vitamina A en las variedades de mashua mencionadas
en este estudio tanto en las muestras frescas como en las muestras deshidratadas.
57
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carotenogénica en Chlorella zofingiensis Chlorella zofingiensis Trabajo
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Dra . Ma Ángeles Vargas Muñoz , (October).
61
ANEXOS
Anexo A.Esquema de diagnóstico
Elaborado por: Alemán Julissa
C
A
U
S
A
S
E
F
E
C
T
O
S
Desconocimiento de la concentración de
carotenoides precursores de vitamina A
en mashua.
Susceptibilidad a infecciones respiratorias,
ceguera infantil y disminución en la
velocidad de crecimiento debido al
deficiente consumo de vitamina A.
Falta de aprovechamiento de mashua y
sus variedades como tubérculos ricos en
carotenoides precursores de vitamina A.
Desconocimiento de métodos de
conservación para prolongar vida útil del
tubérculo.
Desconocimiento del contenido de carotenoides totales y beta-caroteno
presente en mashua (Tropaeolum tuberosum) y sus variedades.
Falta de información de propiedades
nutricionales de mashua (Tropaeolum
tuberosum).
Escasa producción de alimentos a base
de mashua.
PROBLEMA
62
Anexo B.Categorización de variables
Determinación de carotenoides totales en cuatro variedades de mashua (Tropaeolum tuberosum), deshidratada.
Elaborado por: Alemán Julissa
TAXONOMÍA CLASIFICACIÓN
CAROTENOIDES Y
BETA-CAROTENO
MÉTODOS DE
DETERMINACIÓN MASHUA
CROMATOGRAFÍA
LIQUIDA DE ALTA
EFICACIA (HPLC)
MÉTODOS DE
DESHIDRATACIÓN
MÉTODOS DE
CONSERVACIÓN
MÉTODO DE
ESPECTROFOTO
METRÍA UV-VIS
LIOFILIZACIÓN SECADO EN
BANDEJA
TUBÉRCULOS
VARIEDADES
VALOR
NUTRICIONAL
ESTABILIDAD
IMPORTANCIA V
A
R
I
A
B
L
E
S
63
Anexo C.Situación geográfica de la comunidad Aláquez
San Antonio de Aláquez, es una parroquia rural del Cantón Latacunga, Provincia de
Cotopaxi, se encuentra ubicada al Noreste de la Ciudad de Latacunga. Tiene una
superficie de 142 kilómetros cuadrados. Se encuentra a 9,1 kilómetros de distancia de la
cabecera provincial, a una latitud de 2948 metros sobre el nivel del mar.
Limita: Al norte: Las parroquias Joseguango Bajo y Mulaló. Al Sur: Las parroquias San
Buenaventura y Juan Montalvo. Al este: Los páramos de Pasanchi. Al Oeste: La
parroquia Guaytacama (GAD, 2019).
Ubicación Geográfica
64
EXTRACCIÓN
INICIO
Muestras pesadas Muestras Homogenizadas
Anexo D. Procedimientos para la determinación de Carotenoides Totales y Beta Caroteno
Pesar alrededor 6 g (muestras
amarillas) y 8 g (muestras moradas)
Añadir 40 ml acetona T.Refrigeración
Filtrar (Filtro de poro 125 mm)
Transferir extracto en 4 partes y añadir
200 mL de agua destilada
Repetir extracción aprox. 3 veces
Hasta residuo carezca de color
Homogenizar 1 – 2 min
TRANSFERENCIA A
ÉTER DE PETRÓLEO
Embudo de separación colocar 30 mL
éter de petróleo +10 mL agua
65
Filtración de muestras
Saponificación de muestras
Dejar separar 2 fases y descartar fase
acuosa
Cubrir de la luz y agitar 3 horas
Añadir 40 ml solución metanólica de
KOH 20%
Lavar 4 veces con solución de NaCl
1%
Añadir 1,5 g de BTH
Recoger extracto etéreo en un matraz
125 mL
Dejar separar 2 fases y descartar fase
acuosa
SAPONIFICACIÓN
Recoger parte metanólica
Transferir a embudo de separación
1
2
66
Eliminación de fase
acuosa de las muestras
Aforo de muestras
Reposar 3 minutos
Descartar fase acuosa
Filtrar con embudo que contenga
sulfato de sodio
En un balón de 25 mL, aforar con éter
de petróleo
LECTURA
Espectrofotómetro a 450 nm
2
FIN
3
CAROTENOIDES
TOTALES
Al embudo añadir 25 mL éter etílico
Añadir 40 mL acetona helada
Transferir parte metanólica en 4
partes
Agitar embudo y añadir 200 mL agua
destilada
67
Preparación de muestras para
lectura cromatográfica
Lectura cromatográfica de
muestras
Elaborado por: Alemán Julissa
3
Filtrar y colocar en viales
LECTURA
BETA CAROTENO
PROTEGER DE LA LUZ DURANTE
TODOS EL PROCESO
Inyectar 20 µL
UHPLC+
FIN
68
69
70
Anexo E.Reporte de datos Carotenoides Totales
Concentración mg /100 g
Variedad Secado en
Bandeja Liofilizado
ECU 8768
A B
14,46 40,57
14,58 40,86
14,52 41,08
14,64 41,24
14,56 40,86
14,40 40,75
PROMEDIO 14,53 40,89
DESV ESTANDAR 0,09 0,24
ECU 1144
7,47 18,75
7,51 18,62
7,61 18,45
7,57 19,24
7,46 19,78
7,41 18,62
PROMEDIO 7,50 18,91
DESV ESTANDAR 0,07 0,51
ECU 8552
5,64 14,34
5,98 14,37
6,21 14,25
5,74 14,72
5,63 14,37
5,77 14,45
PROMEDIO 5,83 14,42
DESV ESTANDAR 0,23 0,16
ECU 1107
4,89 5,22
4,94 5,14
4,88 5,18
5,86 5,18
4,43 5,23
4,93 5,11
PROMEDIO 4,99 5,18
DESV ESTANDAR 0,47 0,04
71
Anexo F.Reporte de datos de Betacaroteno
Concentración ug/100g
Variedad
SECADO
EN
BANDEJA
LIOFILIZADO
ECU 8768
1988,12 1987,44
1991,93 1987,98
2000,69 1990,81
1996,41 1993,93
PROMEDIO 2008,14 1723,49
DESV ESTANDAR 1830,18 1757,32
1969,24 1906,83
68,48 129,38
ECU 1144
924,27 917,60
939,48 924,28
940,84 988,84
948,00 988,44
923,94 1195,49
927,90 1194,59
PROMEDIO 934,07 1034,87
DESV ESTANDAR 10,06 127,72
ECU 8552
17,34 23,70
18,11 22,93
23,77 27,73
19,37 23,87
19,64 19,93
22,08 23,32
PROMEDIO 20,05 23,58
DESV ESTANDAR 2,44 2,50
ECU 1107
11,78 14,80
14,55 14,12
14,24 17,59
14,30 14,46
14,26 8,28
15,53 16,44
PROMEDIO 14,11 14,28
DESV ESTANDAR 1,24 3,22
72
Anexo G.Certificado de Análisis del Estándar de β caroteno
73