UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES ZARAGOZA

QUÍMICA FARMACÉUTICO BIOLÓGICALaboratorio de Microbiología General I

REPORTE EXPERIMENTAL PRÁCTICAS: 8. AISLAMIENTO Y CUANTIFICACIÓN DE

MICROORGANISMOS Y 9. PATOGENICIDAD Y VIRULENCIA .

Resumen.Se llevó a cabo la siembra de una muestra

con agua de betabel para realizar la cuantificación de los microorganismos presentes mediante las técnicas de dilución y vaciado en placa como asa calibrada. Para ello, se utilizó agar EMB (para enterobacterias y/o gramnegativas), AN y ASC al 5%. Posteriormente, se realizaron las pruebas de patogenicidad, de Coagulasa (libre y ligada) con Sthapylococcus aureus, Hemolisina con Streptococcus pyogenes y Staphylococcus aureus, Catalasa con todas las bacterias del cepario (Pseudomona aeruginosa, Salmonella thypi, Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris, Micrococcus lysodeikticus, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Corynobacterium equi y Escherichia coli); asimismo, se analizó en la mesa redonda la presencia de cápsulas como factor de virulencia y, que la manera más adecuada de llevar a cabo la presencia de esta con las bacterias es mediante una tinción de capsula (desarrollada la clase pasada) con rojo Congo o tinta china.

Introducción.Para trabajar con un microorganismo

específico, se necesita aislar de una muestra, ya sea de algún fluido corporal, alimento o materia orgánica. El aislamiento implica la obtención de un cultivo puro (axénico), donde sólo existe un tipo de microorganismo. La separación de microorganismos presentes en una población mixta puede lograrse de varias maneras: separando a los microorganismos físicamente mediante diluciones seriadas y vaciado en placa, por agotamiento de un pequeño inóculo en un medio de cultivo sólido o utilizando medios de cultivo selectivos para inhibir a los microrganismos no deseados.

Existen métodos para cuantificar microorganismos de una determinada muestra. Estos métodos pueden cuantificar masa total de la población y otros el número de UFC. Su clasificación de acuerdo a la manera de cuantificar puede ser directa o indirecta y según los microorganismos que consideren pueden se clasifican en métodos viables y métodos totales. El vaciado y cuantificación en placa es un método indirecto que cuantifica células viables, al igual que el método de “asa calibrada”.

La cuantificación para productos alimenticios está autorizada según la NOM- 113-SSA1-1994 y la NOM-110-SSA1-1994 con placas que contienen 25 – 250UFC o bien, la literatura avala su conteo con placas en un rango de 30-300UFC. En tanto, el procedimiento se realiza según esta imagen:

Generalmente los microorganismos se pueden clasificar como saprofitos si no producen enfermedad o “patógenos” si producen una enfermedad en el hospedero. Los microorganismos patógenos tienen una virulencia que implica la infecciosidad del microorganismo y la severidad de la infección producida (virulencia alta, moderada y baja). Los factores de virulencia que desarrolla el microorganismo patógeno para sobrevivir y multiplicarse en el huésped son la cápsula propia de la bacteria, toxinas, enzimas, etc.Las toxinas pueden ser endotoxinas, presentes en microorganismos Gram (-) y que se encuentran dentro de la bacteria en su pared celular compuestas por LPS; o exotoxinas, secretadas por bacterias Gram (+) y Gram (-), compuestas de polipéptidos y tienen alta toxicidad.También las bacterias cuentan con algunas enzimas para establecer una infección o simplemente para su propio metabolismo. La catalasa es una enzima que cataliza la degradación del H2O2 en hidrogeno y agua, la prueba de laboratorio, permite diferenciar organismos Gram (+) de Gram (-). La coagulasa es una enzima que transforma el fibrinógeno en

fibrina. La hemolisina, es una enzima que transforma la hemoglobina en biliverdina.

Se realizó conteo de UFC en placas 18h después de que se inocularon

Se realizaron descargas con el método de asa calibrada en los medios AN, y EMB mediante la técnica de estría cruzada.

Para los tubos 10-4, 10-5 y 10-6, fue tomado1mL de muestra y se vertió en cada caso a placas de Petri estériles etiquetadas, se agregó agar nutritivo fundido a cada placa y el contenido total se mezcló con mivimientos de "8", arriba - abajo, derecha - izquierda

En condiciones estériles se tomó 1mL de muestra, se vertió en un tubo con solución salina y fue etiquetado con 10-1.Se repitió la operación anterior tomando muestra diluida, del tubo 10-1 para el 10-2 de manera sucesiva hasta obtener el tubo 10-6.

Práctica 8 Aislamiento y cuantificación de Microorganismos

Prueba de Hemolisisnas

Se inóculo por la técnica de 4 cuadrantes a Staphylococcus aureus y Steptococcus pyogenes en placas de Agar sangre al 5%. Se incubó a 37°C (la placa de S. pyogenes se selló con cinta adhesiva) y, tras leer 18h después se observaron reacciones de

hemólisis y morfología colonial.

Prueba de catalasaSe hizo reaccionar con H2O2 a un inóculo de cada

bacteria del cepario.

Prueba de coagulasaSe tomó un inóculo de

Staphylococcus aureus, vertiéndose en tubo con

plasma de conejo.

Se incubó a 37°C por 4h.

Práctica 9. Patogenicidad y virulencia

Objetivos:

Dominar las técnicas más utilizadas en el aislamiento de microorganismos de diferentes fuentes.

Explicar el fundamento de las técnicas más utilizadas en el recuento microbiano: turbidimétrico, microscópico, dilución y vaciado en placa.

Comprender y observar mecanismos de patogenicidad y virulencia de un grupo de microorganismos.Materiales y Metodología.

Instrumentos y material

Microorganismos(bacterias de cepario)

Reactivos

Asa calibrada

Asabacteriológica

Portaobjetos

Mecherobunsen

-Pseudomona aeruginosa- Salmonella thypi- Klebsiella pneumoniae- Proteus vulgaris- Micrococcus lysodeikticus,- Staphylococcus aureus- Bacillus subtilis- Corynobacterium equi- Eschericgia coli- Streptococcus pyogenes-Muestra de agua de fresa betabel

H2O2

Resultados.

Tabla I. Aislamiento y cuantificación. Método Cuantificación y vaciado en placa.

Imagen

Resultado

COLONIAS INCONTABLES.

Tabla II Prueba de Coagulasa.

Tabla IV Prueba de CatalasaBacteria Reacción con H2O2

1. Pseudomonas aeruginosa

+++

2. Salmonella typhi +3. Streptococcus pyogenes -4. Klebsiella pneumoniae ++5. Proteus vulgaris +++6. Micrococcus

lysodeikticus+++

7. Staphylococcus aureus ++8. Bacillus subtilis ++9. Corynebacterium equi +10.Escherichia coli. +

Prueba de coagulasa. A pesar de

que se monitoreó cada 15minutos

el tubo con esta reacción no pudo

observarse la formación del

coágulo: PRUEBA NEGATIVA.

Método Asa calibrada (1µL)

Imagen

Agar Nutritivo EMB

Resultado

A simple vista es posible observar la existencia de más de 300 colonias de la muestra inoculada: COLONIAS INCONTABLES.

Colonias muy juntas de fermentadores de lactosa fuertes y moderados, que por tanto reporta también:COLONIAS INCONTABLES.

*Algunas reacciones no se aprecian debido a que la foto fue tomada una vez que se terminaron las pruebas.

Tabla III Prueba de Hemolisina (AS5%)

Bacteria Imagen Resultado

Streptococcuspyogenes

Negativo

Staphylococcusaureus

Negativo

Análisis y conclusiones.

Alavez González Teresa de Jesús

Análisis de resultados.De acuerdo a los resultados obtenidos, se toma en

cuenta que para el conteo de colonias viables en ambas técnicas realizadas (asa calibrada como dilución y vaciado en placa), se desarrollaron según las referencias consultadas pero con ciertos detalles; por ejemplo, el vaciado de muestra fue con una sola pipeta estéril de 1mL, factor que influyó para generar ciertas incongruencias en el conteo, teniendo así distorsión en las diluciones que se iban obteniendo y, finalmente en la cantidad de colonias desarrolladas en placas. Cabe señalar, que el conteo de colonias fue un tanto difícil y errático, pues para determinar el número total no podíamos cerciorarnos de un número objetivo (principalmente en AN y EMB donde se desarrolló técnica de asa calibrada), dada la posible agrupación en algunas UFC y que la lectura se desarrolló en un tiempo muy límite, apenas 18h después de la inoculación.

En lo que respecta a la práctica de patogenicidad y virulencia, fue muy importante el desarrollo adecuado de las reacciones y posterior análisis de cada bacteria analizada frente a ellas. Por ejemplo, en la reacción de coagulasa que debía ser positiva para Staphylococcus aureus pudo influir la pureza de la cepa empleada así como la calidad del plasma empleado en la reacción. Ahora bien en el desarrollo de la prueba de catalasa (reacción con peróxido de hidrógeno), resultó positiva en casi todas las bacterias porque es característica de bacterias aerobias y anaerobias faculativas, por tanto, pueden descomponer el peróxido en oxígeno y agua; sin embargo, Streptococcus pyogenes al ser una bacteria que es control negativo para esta prueba que produce otra enzima que descompone el peróxido de hidrógeno

(peroxidasa). Finalmente, para la prueba de hemolisinas se presentó como negativa para ambas bacterias y, aunque para S. aureus si hubo un buen desarrollo la hemólisis fue gamma al no presentar cambios en el medio que se inoculó. Finalmente, el conocimiento de este tipo de reacciones puede mostrar la capacidad de las bacterias para producir daño en el hospedero así como tiempo y cantidad de peligro del hospedero en cuanto los microorganismos acceden a él, y entender así importancia médica de estos.

ConclusionesSe realizaron las técnicas de asa calibrada y dilución

y vaciado en placa para el conteo de microorganismos, donde se obtuvo el resultado de colonias incontables; asimismo, se desarrollaron reacciones de catalasa, hemolisinas, coagulasa ligada y conjugada como factores de patogenicidad de los microorganismos del cepario, destacando a S. pyogenes como catalasa negativa a excepción de las restantes como positivas.También de forma teórica, se discutió la presencia de cápsula como factor de virulencia.

Muñiz Ángeles Marcela Irene

Análisis de resultados.

Como se puede observar en los resultados, la técnica de dilución dio bastantes colonias y muy pequeñas (puntiformes) lo que hace incontable las colonias aun cuando las diluciones fueron aumentando de dilución. Por otro lado en la prueba de asa calibrada en los Agar nutritivo y EMB se muestran también bastantes colonias la diferencia es que son más grandes y se encuentran menos distribuidas, en el Agar Nutritivo se decidió solo contar las colonias que no se ven aglutinadas y se encuentran bien aisladas y con ello hacer el cálculo y saber cuántas UFC

había por mL. En el agar de EMB no fue posible pues no se distinguieron tan bien las colonias para el conteo. En la prueba de catalasa como bien se explica en los resultados nos dio un resultado negativo ya que no se formó ningún coagulo, en esta prueba se esperaba determinar si era Coagulasa ligada o libre así que al dar un resultado negativo se determinó que fue Coagulasa libre. En la prueba de catalasa todas las muestras a excepción de Streptococcus pyogenes, fueron positivas sin embargo en unas hubo más reacción que en otras.  Por ultimo para la prueba de hemolisinas se puede observar que en la placa de Streptococcus pyogenes no se mostró presencia de hemolisis, de hecho ni si quiera muestra formación de colonias, quizás se deba a que el tiempo en que se hizo el estudio no pasaban las 24 horas necesarias de incubación; por otro lado para la placa con Staphylococcus aureus se ve una muy buena siembra y se observa una hemolisis Gama ya sé que no hubo cambio alguno en el medio alrededor de la colonia.   Conclusiones. Para concluir cabe mencionar que los objetivos planteados se llevaron a cabo pues después de terminar esta práctica se adquirió el conocimiento necesario para el aislamiento y cuantificación de colonias. Así como las técnicas necesarias y adecuadas para cada prueba realizada.     Flores Rebollo Cruz Análisis de resultados. En la tabla de resultados se puede observar cómo el número de UFC presentes en el Agar Nutritivo va disminuyendo conforme a la concentración de las diluciones de las muestras. Con esto, se evidencia un correcto procedimiento al realizar esta práctica.  Al presentar crecimiento en el Agar EMB con la técnica de asa calibrada, se nota la presencia de coliformes, al presentar un color verde metalico de la colonia,  se pudiera decir que hay presencia de Escherichia coli  o bacterias de la familia Enterobacteriaceae.  Conclusiones. Debido al correcto manejo de los instrumentos y al correcto procedimiento de la práctica, se pudo cuantificar satisfactoriamente a los microorganismos presentes en la muestra de agua de betabel.  

Piñón Rosales Jennifer Celeste.

Análisis de resultados.

En la presente práctica se cumplieron la mayoría de los

objetivos. La cuantificación de UFC, no se pudo reportar

debido a que aun en el método de vaciado en placa, donde

se realizaron diluciones, las colonias formadas rebasaron

el número máximo al cuantificar que es de 300 UFC. Por

ello se reporta como incontable, sin embargo, se puso en

práctica la técnica como tal. En el método de “asa

calibrada”, se utilizó un asa de plástico calibrada que

permitió inocular un cierto número de bacterias para que

con la técnica de estriado se pudieran separar las UFC y

así realizar su cuantificación sin embargo tampoco esta

técnica fue exitosa, pues las colonias se aglutinaron en las

estrías y las que quedaron esparcidas por el resto de la

superficie del agar crecieron demasiado juntas, evitando

así la distinción entre una colonia y otra.

Es claro que la inoculación por estría debe ser más

separada y asegurarse de sumergir únicamente el arillo del

asa para evitar obtener una muestra demasiado grande,

para permitir su conteo. En cuanto a las diluciones se

podría hacer una más (10 -7), para tener colonias

contables.

Por otro lado, se pueden distinguir algunas diferencias en

las colonias , lo que sugiere la presencia de diferentes

tipos de microorganismos en la muestra. Si se quisiera

llegar a su identificación se podrían realizar pruebas

bioquímicas , aislamientos en medios determinados y

tinciones , para averiguar de que bacteria se trata, y poner

analizar si la muestra de jugo de betabel es un producto

alimenticio confiable o puede provocar infecciones en el

cuerpo humano.

Las pruebas de patogenicidad y virulencia fueren exitosas

a excepción de la prueba de coagulasa, ya que no se

observó la producción del coagulo de fibrina. La prueba de

catalasa solo dio negativo para Streptococcus pyogenes,

y esto era un resultado esperado ya que esta prueba es

para observar la presencia de la enzima catalasa que

degrada el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno, y

los estreptococos y enterococos no poseen la enzima.

La prueba de hemolisina dio negativa para Streptococcus

pyogenes y Staphylococcus aureus, ambos Gram (+), ya

que no se observó la hemolisis de los eritrocitos en el agar

sangre 5%.

Conclusiones.

La práctica permito adquirir habilidad en el manejo de las

técnicas de aislamiento y cuantificación de partículas

viables por métodos indirectos, aunque no pudo realizarse

la cuantificación ya que llas UFC salían de los rangos

establecidos por la NOM-110-SSA1-1994 que van de 25 a

250 colonias, e incluso a los rangos establecidos por la

literatura que son de 30-300 colonias.

Las pruebas para identificar enzimas que proporcionan

patogenicidad a las bacterias como la catalasa y

hemolisina, así como la de virulencia que es la prueba de

teñido de cápsula (realizada en la práctica pasada) fueron

exitosas. La prueba de coagulasa que también indica

patogenicidad, no se pudo observar posiblemente debido a

que el plasma ya no estaba en las condiciones

necesarias para la prueba.

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SSA1-1994, BIENES Y SERVICIOS. MÉTODO

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