Universidad de La Salle Universidad de La Salle

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Ingeniería Ambiental y Sanitaria Facultad de Ingeniería

1-1-2010

Remoción de trinitrotolueno (TNT) en agua residual sintética Remoción de trinitrotolueno (TNT) en agua residual sintética

mediante bacterias aisladas de ambientes con presencia de mediante bacterias aisladas de ambientes con presencia de

explosivos explosivos

Leidy Carolina Bravo Pérez Universidad de La Salle, Bogotá

Diana Alexandra Aldana Labrador Universidad de La Salle, Bogotá

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Citación recomendada Citación recomendada Bravo Pérez, L. C., & Aldana Labrador, D. A. (2010). Remoción de trinitrotolueno (TNT) en agua residual sintética mediante bacterias aisladas de ambientes con presencia de explosivos. Retrieved from https://ciencia.lasalle.edu.co/ing_ambiental_sanitaria/657

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REMOCIÓN DE TRINITROTOLUENO (TNT) EN AGUA RESIDUAL SINTÉTICA MEDIANTE BACTERIAS AISLADAS DE AMBIENTES CON

PRESENCIA DE EXPLOSIVOS.

LEIDY CAROLINA BRAVO PÉREZ DIANA ALEXANDRA ALDANA LABRADOR

UNIVERSIDAD DE LA SALLE FACULTAD DE INGENIERIA

PROGRAMA DE INGENIERIA AMBIENTAL Y SANITARIA BOGOTA D.C

2010

REMOCIÓN DE TRINITROTOLUENO (TNT) EN AGUA RESIDUAL SINTÉTICA MEDIANTE BACTERIAS AISLADAS DE AMBIENTES CON

PRESENCIA DE EXPLOSIVOS.

LEIDY CAROLINA BRAVO PÉREZ DIANA ALEXANDRA ALDANA LABRADOR

TESIS DE GRADO PARA OPTAR AL TITULO DE

INGENIERO AMBIENTAL Y SANITARIO

Director JOAQUÍN LORENZO BENAVIDES LÓPEZ DE MESA

UNIVERSIDAD DE LA SALLE FACULTAD DE INGENIERIA

PROGRAMA DE INGENIERIA AMBIENTAL Y SANITARIA BOGOTA D.C

2010

Nota de aceptación

________________________

________________________

________________________

________________________

______________________ Firma de la directora

______________________ Firma del jurado

______________________ Firma del jurado

Bogotá, Enero de 2010

Tengo que agradecer a todo lo que me rodea, no puedo omitir a nadie ni a ningún detalle; pese a la lucha el cansancio, los malos días, los compañeros de lucha, sin ellos no

se hubiese podido cumplir un pequeño y a la vez grande sueño, que forma uno de los primeros escalones para seguir mi vida.

A mi padre y a mi madre pasamos alegría, entusiasmo, satisfacción, pero también angustias.

A los que me dieron la vida, que sin más remedio dando todo por mí, con su amor genuino y sincero. A ellos a los que siempre me han sostenido, me vieron crecer y son los

escritores de este sueño. Gracias por este esfuerzo, gracias por ser quien son.

A mi querido hermano, eres un tesoro, gracias por el acompañamiento.

A mí querido amado, mi gran confidente, gracias por tu amor, comprensión, gracias por compartir este sueño y hacerlo tuyo; por esperarme todos estos años y aun seguir

esperándome… Te AMO.

Y por ultimo y mas importante en mi vida, a ti Dios que te debo todo, te debo mi gran preciada vida, te debo tu mirada sobre mi, te debo tanto, que ni aun en la

eternidad alcanzaría a pagártelo. Gracias Dios por el conocimiento y sabiduría que me has dado hasta llegar a este punto, gracias por no dejarme desfallecer y darme

fuerzas cada día aun cuando no quería levantarme. Gracias Eterno por estar presente en mi vida todos lo días.

הנצחי לאל תודה

Carolina Bravo

A Dios por ser el que maneja este universo infinito de cosas

maravillosas y ser él quien me permita disfrutarlas, por

enviarme al ser que lógro llenarme de vida y esperanza para

lograr terminar esta carrera, a ese hijo que me levanta en las

mañanas con mil sonrisas, a él esta tesis, mi vida y mis ganas de

seguir adelante.

A mi mamá y hermano que se llenaron de paciencia y amor, y

que sobre todo fueran el piso para que yo pusiera esta nueva base

de mi vida.

A mi familia en general, que siempre estuvieron presentes en la

lucha y siempre esperaron lo mejor de mí.

A mis compañeros de luz y amigos del alma, Gabo, Vanessa y Juli,

porque siempre están ahí.

DIANA ALDANA

AGRADECIMIENTOS

Agradecemos a las siguientes personas por su apoyo en la realización del

presente proyecto de grado:

A Joaquín Benavidez MSc. Director del proyecto.

A Fabio Roldán PhD. Director del grupo y proyectos de Investigación de

Biorremediación en la Unidad de Saneamiento y Biotecnología Ambiental, de

la Pontificia Universidad Javeriana, por guiarnos y apórtanos conocimiento

para la realización de este proyecto.

Al Químico Ziv Arbeli. Coordinador de laboratorio.

A Hoover Varón y Ricardo Amaya. Coordinadores de Laboratorio de Ciencias

Básicas de la Universidad de la Salle y de la Unidad de Saneamiento y

Biotecnología, por tener las respuestas a muchas preguntas.

Al personal de laboratorios de Ciencias Básicas de la Universidad de la Salle.

Al personal del Laboratorio de la Unidad de saneamiento y Biotecnología

Ambiental de la PUJ.

TABLA DE CONTENIDO

TABLA DE CONTENIDO 7

1. MARCO DE REFERENCIA 22

1.1 MARCO TEÓRICO 22

1.1.1 Explosivos. 22

1.1.2 Características de los explosivos. 22

1.1.3 Clasificación de los explosivos. 23

1.1.4 Características del 2, 4,6 trinitrotolueno (TNT) 23

1.1.5 Propiedades químicas del TNT 24

1.1.6 Biorremediación de explosivos. 25

1.1.7 Metabolismo microbiológico de la degradación del TNT 28

1.1.7.1 Metabolismo con Enterobacter cloacae sp. 29

1.1.7.2 Metabolismo con Pseudomonas sp. 29

1.1.8 Formación del complejo Meisenheimer. 29

1.1.9 Medio de cultivo. 30

1.1.10 Características de la colonia. 31

1.1.11 Agua residual sintética. 33

1.2 MARCO LEGAL. 35

2. MATERIALES Y MÉTODOS 38

2.1 DISEÑO METODOLOGICO. 39

2.1.1 Toma de muestras. 39

2.1.2 Análisis preliminares del suelo. 41

2.1.3 Medición de conductividad y pH de las muestras. 41

2.1.4 Pre-enriquecimiento de las muestras 43

2.1.5 Aislamiento de cepas. 46

2.1.6 Criterio de selección de colonias. 47

2.1.7 Bioensayo. 58

2.1.8 Análisis estadístico. 62

2.1.8.1 Modelo. 62

2.1.8.2 Hipótesis 63

3. Análisis de resultados 65

4. CONCLUSIONES 70

5. RECOMENDACIONES 71

6. BIBIOGRAFIA 72

ANEXOS

LISTA DE TABLAS

Tabla 1. Características explosivo TNT. ........................................................... 24

Tabla 2.Legislación ambiental aplicable para investigación. ............................ 35

Tabla 3. Puntos de toma de muestras. ............................................................. 40

Tabla 4. Método de medición de parámetros fisicoquímicos ............................ 41

Tabla 5. Valores de pH y conductividad de las muestras ................................. 42

Tabla 6. Composición de medio nutritivo. ......................................................... 43

Tabla 7. Cantidades para la elaboración del medio. ......................................... 44

Tabla 8. Composición fuentes de energía. ....................................................... 45

Tabla 9. Morfotipos 78 aislamientos seleccionados en la replica. .................... 48

Tabla 10. Lecturas de los 78 aislamientos por HPLC. ...................................... 54

Tabla 11. Aislamientos bacterianos con mayor capacidad de degradación del

TNT seleccionados al azar................................................................................ 57

Tabla 12. Componentes agua residual sintética ............................................... 58

Tabla 13. Resultados medición por HPLC del bioensayo. ................................ 60

Tabla 14.Porcentajes de remoción a través del tiempo, por cada aislamiento

bacteriano. ........................................................................................................ 62

Tabla 15.Análisis de varianza. .......................................................................... 63

Tabla 16.Resultados del análisis de varianza. .................................................. 63

Tabla 17. Concentraciones de TNT en bioensayo ............................................ 66

Tabla 18.Resultados Bioensayo en porcentajes de remoción de TNT. ............ 67

LISTA DE ILUSTRACIONES

Ilustración 1.Estructura del 2, 4,6 Trinitrotolueno .............................................. 24

Ilustración 2. Biorremediación de contaminantes. ............................................. 26

Ilustración 3. Metabolismo microbiano .............................................................. 26

Ilustración 4. Formación del complejo Meisenheimer. ...................................... 30

Ilustración 5. Toma de muestras. ........................ ¡Error! Marcador no definido.

Ilustración 6. Muestras obtenidas de los doce ................................................. 40

Ilustración 7.Frascos de pre-enriquecimiento ................................................... 45

Ilustración 8. Población bacteriana caja de petri con T1. ................................. 47

Ilustración 9. Población bacteriana caja de petri con T2. .................................. 47

Ilustración 10.Cromatograma curva patrón 100mg/L. ....................................... 68

Ilustración 11.Cromatograma aislamiento T109. Tiempo 0 ............................... 68

Ilustración 12.Cromatograma aislamiento T109, tiempo3. ................................ 69

LISTA DE CROMATOGRAMAS

Cromatograma. 1. 100 mg/l .............................................................................. 77

Cromatograma. 2. Cero. ................................................................................... 77

Cromatograma. 3 Patrón .................................................................................. 77

Cromatograma. 4 T54A .................................................................................... 77

Cromatograma. 5 T87B .................................................................................... 78

Cromatograma. 6 T88B .................................................................................... 78

Cromatograma. 7 T92B .................................................................................... 78

Cromatograma. 8. T 109 .................................................................................. 78

Cromatograma. 9. T54 A.2 ............................................................................... 79

Cromatograma. 10 T54B2 ................................................................................ 79

Cromatograma. 11. T54C1 ............................................................................... 80

Cromatograma. 12.T 54D2 ............................................................................... 80

GLOSARIO

ACEPTOR DE ELECTRONES: Sustancia que acepta electrones durante una

reacción de oxido reducción.

ACIDÓFILO: Organismo que crece mejor a pH bajos.

AEROBIO: Organismo que crece en presencia del oxigeno.

AISLAMIENTO: El aislamiento de cepas puede llevarse a cabo utilizando las

técnicas empleadas normalmente en microbiología.

AGUA RESIDUAL SINTÉTICA: Agua elaborada a nivel de laboratorio que

posee características de un agua residual industrial.

ALCALÓFILOS: Organismo que crece mejor a pH Altos.

BACTERIAS DESNITRIFICANTES: Bacterias con potencial de reducción

nitritos relativamente altos de manera aeróbica las cuales están muy

ampliamente distribuidas por los suelos y las aguas. Un grupo de organismo

(Nitrosomonas) oxida amoniaco a nitrito y otro grupo (Nitrobacter) oxidan nitrito

a nitrato.

BIODEGRADACIÓN: Es el resultado de los procesos de digestión, asimilación

y metabolismo de un compuesto orgánico llevado a cabo por bacterias, hongos,

protozoos y otros organismos.

BIOENSAYO: Es la evaluación de la actividad biológica de una sustancia

mediante pruebas de su efecto sobre un organismo en general.

microorganismo.

CEPA: población celular descendiente de una única célula.

COLONIA: Población de células que pueden observarse macroscópicamente, y

que crecen en un medio solido, procedentes de una sola célula.

CRECIMIENTO MICROBIANO: Aumento de número de células de un

microorganismos en la que el numero de estas se dobla en un periodo de

tiempo fijo.

CULTIVO: Cepa particular o tipo de organismo que crece en un medio en el

laboratorio.

CULTIVO DE ENRIQUECIMIENTO: Empleo de medios de cultivo y

condiciones de incubación selectivos para aislar microorganismos directamente

de muestras naturales.

DILUCIÓN: Es una mezcla homogénea, conformadas por un soluto y un

solvente.

DONADOR DE ELECTRONES: Compuesto que proporciona electrones

durante una reacción de oxido reducción.

ESPECIE: En procariotas colección de cepas estrechamente relacionadas

(> 97% homología en las secuencias del rRNA16s) pero lo bastante distintas

de las otras cepas como para ser reconocidas como una unidad diferente.

EXPLOSIVOS: Son sustancias que mediante una reacción química se

convierten en gases. Al hacerlo liberar presión y calor por igual, en todas las

direcciones. Se clasifican en: alto explosivo y explosivo lento, de acuerdo con la

rapidez con que se lleve a efecto este cambio.

HPLC (CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS DE ALTA EFICACIA): Es un método

para determinar concentraciones cuantitativas exactas de compuestos no

volátiles, Aminoácidos, proteínas, ácidos nucleícos, hidrocarburos,

carbohidratos, fármacos, terpenoides, plaguicidas, antibióticos, esteroides, etc.

INÓCULO: Material biológico usado para hacer un cultivo microbiano.

MEDIO DE CULTIVO: Solución acuosa o solida de varios nutrientes adecuada

para el crecimiento de los microorganismos.

METABOLISMO: Se refiere a la suma de reacciones bioquímicas requeridas

para la generación de energía y el uso de la energía para sintetizar material

celular a partir de moléculas del medio ambiente.

MICROORGANISMOS. Son formas de vida muy pequeñas que sólo pueden

ser observados a través del microscopio.

NUTRIENTE: Substancia que la célula toma de su ambiente y que utiliza en

reacciones catabólicas o anabólicas.

TNT (2, 4,6-TRINITROTOLUENO): Es un sólido amarillo, sin olor, que no

ocurre naturalmente en el ambiente. Comúnmente se le conoce como TNT y es

un explosivo usado en proyectiles militares, bombas y granadas, en la industria,

y en explosiones bajo el agua.

QUIMIOLITÓTROFO: Organismo que obtiene su energía de la oxidación de

compuestos inorgánicos.

QUIMIOORGANOTROFO: Organismo que obtiene su energía de la oxidación

de compuestos orgánicos.

REACCIÓN DE OXIDACIÓN- REDUCCIÓN: Reacción en la que un compuesto

se oxida mientras otro se reduce y toma los electrones liberados en la

oxidación.

RESIDUO PELIGROSO: Es aquel residuo o desecho que por sus

características corrosivas, reactivas, explosivas, tóxicas, inflamables,

infecciosas o radiactivas puede causar riesgo o daño para la salud humana y el

ambiente. Así mismo, se considera residuo o desecho peligroso los envases,

empaques y embalajes que hayan estado en contacto con ellos.

RESPIRACIÓN: Reacciones catabólicas que producen ATP, cuyos donadores

primarios de electrones son compuestos orgánicos o inorgánicos, 7y cuyos

aceptores finales de electrones son también compuestos orgánicos o

inorgánicos.

SUBSTRATO: Molécula que reacciona con una enzima. También substancia

que utiliza un microorganismo para crecer.

XENOBIOTICO: Son aquellos compuestos químicos introducidos por el

hombre que no pertenecen a la naturaleza.

RESUMEN

El 2,4,6 Trinitrotolueno (TNT), es un compuesto nitroaromático utilizado como

materia prima para la elaboración de explosivos esenciales como pentolitas;

se caracteriza por ser altamente tóxico al igual que las derivaciones

provenientes de sus transformaciones. Las industrias productoras de esta clase

de explosivos presentan una gran cantidad de desechos, que tienen una alta

incidencia en el medio ambiente; debido a esto se encuentra en la lista de los

contaminantes más importantes de la Agencia de protección Ambiental de los

Estado Unidos(Halasz et al.,2002)

La problemática en Colombia por el uso de este tipo de compuestos radica en

los productos y subproductos que quedan sin detonar en el medio ambiente,

acumulándose en los ecosistemas y microecosistemas; sumado a esto la

carencia de investigaciones en nuestro país conlleva a una falta de

implementación de mecanismos que apliquen fundamentos de la microbiología

con el fin de desestabilizar la estructura molecular del explosivo sin generar

mayores impactos negativos al medio ambiente.

La presente investigación plantea una alternativa preliminar de reducción del

explosivo TNT en agua residual sintética a partir de aislamientos bacterianos

que posean mayor capacidad degradadora del explosivo.

Este proyecto se llevo a cabo estableciendo en primer lugar las condiciones

fisicoquímicas y microbiológicas para aislar las bacterias que tengan la

capacidad de reducir el compuesto TNT en agua residual sintética, para ello se

tomaron doce puntos de muestreo en ambientes expuestos al explosivo TNT, a

partir de estas muestras se realizó un pre- enriquecimiento, donde hubo un

aumento de la población bacteriana existente en ellas, para luego ser

sembradas a partir de diluciones seriadas en medio mineral sólido con

diferentes fuentes de energía. Después de verificar un crecimiento de la

población, se dio paso a la resiembra teniendo como criterio de selección, el

morfotipo de la colonia; estos aislamientos se sembraron en medio mineral

líquido para luego realizar la lectura de las concentraciones de explosivo con

el equipo de Cromatografía Liquida de Alta Eficacia (HPLC), de esta manera

identificar las bacterias con mayor capacidad de degradación del 2,4,6

trinitrotolueno.

Consecutivamente se realizo un bioensayo con las bacterias que presentaron

una mayor capacidad degradadora, las cuales fueron inoculadas en agua

residual sintética que contenía concentraciones específicas de TNT. Para

determinar el porcentaje de remoción del explosivo se realizaron mediciones a

través del tiempo donde se seleccionaron cinco aislamientos que presentaron

mayor capacidad de degradación los cuales se inocularon en agua residual

sintética por un periodo de cuatro días; en este ensayo se obtuvo bajos

porcentajes de remoción en cada una de las lecturas realizadas cada 24 horas

mediante el equipo HPLC, los aislamientos bacterianos presentaron un

comportamiento homogéneo en la degradación, lo que nos indica que el tiempo

de inoculación de las bacterias en el agua residual sintética y los aislamientos

seleccionados no tuvieron efecto significativo sobre el porcentaje de remoción

esperado.

ABSTRACT

2,4,6 Trinitrotoluene (TNT) is a nitroaromatic compound used as raw material

for the manufacture of explosives as pentolite essential and is characterized by

being highly toxic as well as referrals from their transformations. Industries

producing this kind of explosives have a lot of waste, which have a high impact

on the environment, because this is in the list of the major pollutants of the

Environmental Protection Agency of the United States (Halasz et al., 2002)

The problem in Colombia for the use of this compound lies in the products and

byproducts that remain unexploded on the environment and accumulate in

ecosystems and microecosystem, in addition to that the lack of research in our

country leads to a lack of implementation mechanisms involving the

microbiological to destabilize the molecular structure of the explosive without

causing major negative environmental impacts.

This preliminary investigation raises an alternative reduction of the explosive

TNT in synthetic sewage isolates from having more explosive degrading

abilities.

This project was carried out by establishing physicochemical and

microbiological conditions to isolate bacteria that are capable of reducing TNT

compound in synthetic sewage for it took twelve points of sampling in exposed

to the explosive TNT, from these samples conducted a pre-enrichment, there

was an increase of the bacterial population existing in them and then be sown

from serial dilutions on solid mineral medium with different substrates, after

checking the growth of population, led to the reseeding each bearing bacteria

isolated as a selection criterion, the morphotype of the colony, these isolates

were inoculated in liquid mineral medium and then doing the reading of

explosive concentrations with the team of high-performance liquid

chromatography (HPLC ), thereby identifying the bacteria with greater capacity

for degradation of 2,4,6 trinitrotoluene.

Running a bioassay was conducted with the identified bacteria, were inoculated

in synthetic wastewater containing specific concentrations of TNT.

In determining the rate of removal of explosive measurements were made over

time where five isolates were selected that showed higher degradation capacity

which were inoculated in synthetic sewage for a period of four days in this test

is low removal percentages obtained in each of the readings taken every 24

hours using the HPLC equipment, the bacterial isolates showed a

homogeneous behavior in the breakdown, which indicates that the time of

inoculation of bacteria in the synthetic sewage and the selected isolates had no

effect significant on the percentage of expected removal.

19

INTRODUCCIÓN

La fabricación y uso de explosivos por la industria militar, la minería y la de

construcción deja grandes áreas de suelo y agua contaminados, debido a los

residuos generados por la manufactura, almacenamiento y disposición de estos

explosivos se han introducido al ambiente una cantidad de compuestos

nocivos considerados residuos peligrosos por sus características de toxicidad y

volatilidad, ya que interaccionan con el medio ambiente propiciando la

destrucción y desequilibrio de los ecosistemas.1

Los explosivos en su mayoría poseen una estructura molecular compleja ya

que están constituidos por compuestos nitro aromáticos o esteres de nitrato,

en lo que radica su alto poder de detonación y hace complejo el proceso de

degradación natural, acumulándose en el medio ambiente sin llegar a ser

degradado debido a la falta de mecanismos biológicos que contribuyan a su

disminución. Por estas características, los explosivos representan un alto

riesgo a la salud humana debido a sus propiedades mutagénicas y

carcinogénicas2.

Las técnicas tradicionales de remediación para la eliminación de los explosivos

han sido la incineración y el almacenamiento en depósitos; la primera genera

graves problemas en el ambiente ya que al incinerar estos compuestos se

provoca emisión de gases tóxicos que contribuyen al deterioro de la calidad

del aire, además de la destrucción de los suelos en los que se realizan estas

actividades; y la segunda técnica requiere de la implementación de vertederos

1 Biological degradation of 2, 4, 6 trinitrotoluene Microbioligy and molecular biology reviews

2001. 2 Ibíd. 1 pág. 35.

20

de almacenamiento lo que genera riesgos de infiltración a las aguas

subterráneas contaminando estas importantes fuentes hídricas.3

Por esta razón, se han adelantado investigaciones para buscar métodos

biológicos que permitan disminuir el efecto que los explosivos tienen sobre el

ambiente. El uso de microorganismos como las bacterias ha sido uno de los

métodos que contribuye en procesos naturales de degradación por su

versatilidad metabólica y su capacidad de adaptarse con gran rapidez a

condiciones en su hábitat natural, siendo estos factores importantes para la

transformación a moléculas más simples y de fácil degradación.

La presente investigación plantea la reducción del explosivo TNT a partir de

bacterias aisladas en laboratorio que tengan un posible potencial degradador

del 2, 4,6 trinitrotolueno, este proceso se evaluará mediante un bioensayo

realizado en agua residual sintética para determinar el porcentaje de remoción

en un periodo de cuatro días en condiciones de laboratorio.

3 BRANCO, S.M: Limnología sanitaria, estudio de la polución de aguas continentales.

Monografía científica No 28, 1984 serie Biología, OEA, 119 p.

21

OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL

Determinar la remoción de trinitrotolueno (TNT) en agua residual

sintética mediante bacterias aisladas de ambientes con presencia de

explosivos.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Establecer las condiciones fisicoquímicas y microbiológicas para el

aislamiento de las bacterias degradadoras de TNT.

Aislar bacterias degradadoras de TNT a partir de muestras de ambientes

(agua, suelo y lodo), con presencia de explosivos.

Identificar las bacterias con mayor capacidad degradadora de TNT con

base en la reducción del sustrato estudiado.

Evaluar de manera preliminar el porcentaje de remoción de TNT en agua

residual sintética mediante cromatografía líquida (HPLC).

22

1. MARCO DE REFERENCIA

1.1 MARCO TEÓRICO

1.1.1 Explosivos.

Son Es todas aquellas sustancias o compuestos de naturaleza química, cuya

reacción de descomposición está determinada por la detonación, concluyendo

en un tiempo muy breve; esta detonación produce una gran cantidad de

energía química (reacción exotérmica).

Se debe tener en cuenta, que todo explosivo debe tener como obligación la

presencia de un agente oxidante, es decir una sustancia con preferencia a

ceder oxígeno, y un agente combustible; Estas dos sustancias anteriores se

pueden encontrar incluidas dentro de la molécula que hacen parte del

explosivo.4

1.1.2 Características de los explosivos.

Estas son las que permiten elegir cuál de los explosivos es idóneo para un fin

determinado, dichas características pueden predecir cuales serán los posibles

efectos que se presentaran en el momento de ser utilizados.

Una de las principales características de los explosivos es la estabilidad, que

define la modificación del explosivo en sus condiciones normales de

operación, desde el punto de vista de los riesgos que pueden generar, la

variación de sus propiedades o efectos explosivos. La estabilidad puede

considerarse desde el punto de vista químico y físico. Otras características

importantes son: Temperatura, humedad, potencia explosiva, densidad,

resistencia al agua, resistencia al contacto con el agua, resistencia a la

humedad y resistencia al agua bajo presión de la misma 5.

4 Determinación del impacto ambiental al recurso agua ocasionado por la desactivación de los explosivos

pólvora y anfo con el método de disolución química y valoración del ruido producido por la destrucción de los explosivos incautados por la Policía Nacional 5 Ibíd. 4. Pág. 24.

23

1.1.3 Clasificación de los explosivos.

Los explosivos se pueden clasificar según su origen en:

Explosivos artesanales. Como su nombre lo indica son sustancias o

mezclas fabricadas artesanalmente, son muy peligrosos por no tener

normas de fabricación específicas y son generalmente usados por grupos al

margen de la ley. Ejemplo: Amonal, R1, BENCLO, ANFO, Amatol.

Explosivos industriales. A diferencia de los anteriores estos se fabrican

bajo normas y pautas comúnmente señaladas en tratados o leyes

internacionales, debiendo llevar el mismo patrón de fabricación.

Explosivos comerciales: son utilizados en actividades cotidianas como en

industria, minería, obras civiles, se deben trabajar bajo todas las normas de

seguridad, por ser altamente peligrosos. Ejemplos: ANFO, Pentofex,

Indugel, entre otros.6

1.1.4 Características del 2, 4,6 trinitrotolueno (TNT)

El TNT es un explosivo fabricado mediante una nitración secuencial del

tolueno, empleando ácido nítrico y sulfúrico (C 6 H 2 (NO 2) 3 CH 3),

generalmente es un procedimiento realizado en lotes, tanto para la producción

de mono-, di-, y, finalmente, trinitrotolueno.

Este explosivo sirve para la detonación directa o como materia prima para la

elaboración de otros explosivos esenciales como la Pentolita, lo que lo hace un

elemento importante para la Industria militar.

El TNT tiene una velocidad de detonación de 6900m/s, solo basta dejarlo caer

a 35cm de altura del suelo para que este detone; esta reacción proveniente de

6 Manual técnico de explosivos. España: Dirección General de Armamento y Material, 1984.

450 p.

24

la detonación es exotérmica lo que produce la destrucción total alrededor de un

radio de 12 metros, es insoluble en agua pero soluble en acetona y benceno,

este explosivo 2,4,6 trinitrotolueno no produce vapores, pero si genera un polvo

toxico en el momento de la detonación.

Este explosivo es un compuesto altamente tóxico al igual que sus derivaciones

provenientes de sus posibles transformaciones, debido a esto se encuentra en

la lista de los contaminantes más importantes de la Agencia de protección

Ambiental de los Estado Unidos.

Tabla 1. Características explosivo TNT.

CH3

Ilustración 1.Estructura del 2, 4,6 Trinitrotolueno

Fuente: Esteve A,Caballero A, Ramos J. 2001.

1.1.5 Propiedades químicas del TNT

El 2, 4,6 TRINITROTOLUENO presenta una estructura aromática tipo bencillo

distribuida simétricamente con tres grupos nitro, la electronegatividad de estos

grupos ejerce una atracción sobre los electrones beta del anillo aromático,

confiriendo a este cierto carácter electrófilo. Este referente será fundamental

para el metabolismo microbiano.

Compuesto

explosivo

Formula

empírica

Peso

molecular

(g/mol)

Densidad

(g/cm3) a

20°c

Velocidad

de

detonación

Estructura

de

explosivo

Presión de

vapor (Pa)

a 20°c

TNT C7H5N3O6 227.1 1.654 6900 1.46X10-4

25

El grupo nitro está conformado por dos elementos diferentes, estos dos muy

electronegativos los cuales compiten por los electrones disponibles, debido a

que la electronegatividad del oxígeno es mayor que la del nitrógeno se origina

una polarización del enlace entre estos dos elementos. La carga positiva sobre

el átomo de nitrógeno, combinada con la electronegatividad del elemento hace

que el grupo nitro sea fácilmente reducible.

En la molécula de TNT la velocidad con la que se reduce el primer grupo nitro

es mucho mayor que los restantes, esto se debe a que la conversión de grupo

nitro a grupo amino disminuya la deficiencia electrónica del anillo, haciendo

más difícil la reducción del el otro grupo nitro.

1.1.6 Biorremediación de explosivos.

La biorremediación comprende cualquier proceso que utilice microorganismos

para retornar a su estado natural un recurso alterado por contaminación. Esta

técnica de remediación consiste en que los microorganismos transforman un

contaminante en compuestos menos tóxicos o inicuos, eliminado o removiendo

de manera eficiente y controlada el contaminante presente en el suelo, agua o

aire sin transferirlo de un ambiente a otro (Kulkarni y Chaudhari, 2007; Bar et

al., 2006). Este proceso se favorece debido a que los microorganismos son

ubicuos y poseen una amplia versatilidad metabólica para degradar y utilizar

diferentes compuestos como fuente de carbono y energía para su crecimiento.

Las actividades microbianas en el proceso de biorremediación se pueden

resumir en el siguiente esquema:

26

Ilustración 2. Biorremediación de contaminantes.

Para que pueda ocurrir la biorremediación del explosivo (TNT), se debe tener

en cuenta que la biodegradación es parte fundamental en ello, por eso el

metabolismo en cada una de las bacterias va estar sujeto a diferentes

variables, según sus requerimientos. Los microorganismos muestran una

impresionante variedad de procesos metabólicos, para ello se puede establecer

dos grandes categorías, aquellos que la fuente de energía es un compuesto

químico y aquellas que la fuente de energía es la luz, como lo podemos ver en

el siguiente gráfico.

TODOS LOS

MICROORGANISMOS

Quimiótrofos (Compuestos químicos

como fuente primaria de energía)

Fotótrofos (Luz como fuente

principal de energía)

Quimiólitotrofos

(Compuestos

inorgánicos)

Quimioorganotrofos

(Compuestos orgánicos)

Fuente: Brock, Biología de los

microorganismos

Ilustración 3. Metabolismo microbiano

27

Los explosivos como el 2-4-6 TRINITROTOLUENO, contienen compuestos

nitrogenados, que requieren para su degradación microorganismos

quimiótrofos, específicamente las llamadas bacterias nitrificantes. Estas

bacterias oxidan el amoniaco y el nitrito (compuestos nitrogenados más

comunes como donadores de electrones), y lo transforman en nitrato, la

oxidación completa del compuesto implica la pérdida de ocho (8) electrones y

se realiza por dos grupos de consorcios actuando secuencialmente. La

nitrificación del amoniaco es el resultado de la acción secuencial de dos grupos

separados de organismos; las bacterias oxidantes de amoniaco, que producen

acido nitroso es decir nitritos y las bacterias oxidantes de nitrito que son las

verdaderas bacterias nitrificantes; estas bacterias a su vez trabajan de la mano

de enzimas para que ocurra la oxidación y dirigir la síntesis del ATP energía

7.Hasta ahora no se conoce la primera bacteria nitrificante que realice por si

sola la oxidación completa de amoniaco a nitrato.

Las bacterias nitrificantes están ampliamente distribuidas en el suelo y en el

agua, estas se encuentran en gran cantidad en hábitats donde abunda el

amoniaco, tales como lagos y corrientes de agua que reciben aportes de agua

residual no tratada.8

En diferentes investigaciones, se han encontrado diversos microorganismos en

suelos contaminados por explosivos, donde utilizan el TNT en este caso, como

sustrato respiratorio y como fuente de energía, ya que este explosivo resulta

ser una buena fuente de nitrógeno que las bacterias pueden utilizar, sin

embargo la biodegradación de este compuesto resulta ser diferente a otros

compuestos tóxicos, por la complejidad de la estructura y la localización del

grupo amonio y nitrito.

Para ello se han aislados microorganismos de muestras de suelos específicos,

con el fin de proporcionar la información requerida para encontrar o establecer

7MANDIGAN Michel T., MARTINKO Jhon M., PARQUER Jack Brock,:Biología de los

microorganismos; Prentice Hall, octava edición 2001.

8 Ibíd 7 pág. 502

28

rutas metabólicas que sigan el patrón de degradación, estos estudios se han

realizado en EE.UU y España9

1.1.7 Metabolismo microbiológico de la degradación del TNT10

Las rutas metabólicas para reducir este compuesto, consisten en una

degradación donde los microorganismos pueden romper la molécula y

reducirla. El 2,4,6-trinitrotolueno, consta de un anillo de benceno, un grupo

metilo, y tres grupos nitro); Cuando se produce mediante la reducción de la

degradación de estos grupos nitro en un forma gradual, se va dejando el anillo

aromático de manera cada vez más reducido. La degradación de estos

intermediarios, son Am-DNT (Dinitrotolueno), 2,4-DA-6-NT (Di-amino 6,

nitrotolueno), 2-6-DA-4-NT(Di-amino,4 nitrotolueno), 2,4-DNT(Dinitrotolueno),

4-A-2-NT(Amino,2 nitrotolueno), 2-A-4 – NT(Amino ,4 nitrotolueno), y 2,4-

DAT(Di-amino-tolueno.

Sin embargo se ha demostrado (ejurnal.vudat.msu.edu, Robert Weise) que

muchos de los microorganismos que trabajan en esta degradación no

necesariamente pasan por todas las sustancias intermedias peligrosas,

dependiente tanto la bacteria como las condiciones anaerobias y aerobias del

medio.

Las especies de bacterias encontradas en la degradación del TNT son:

Enterobacter cloacae

Pseudomonas putida11

Clostridium sp.

9 SCHEIBNER et al., 1997; Boopathy, 1994; Funk et al., 1996. 10

Bases Genéticas y Bioquímicas . 11

ESTEVE NUÑEZ, Abraham , DUQUE MARTIN DE Oliva, Estrella pseudomona putida y su empleo en la eliminación biológica de TNT.

29

1.1.7.1 Metabolismo con Enterobacter cloacae sp.

La Bacteria Enterobacter cloacae, del genero Escherichia, hace parte de los

bacilos facultativos Gram negativos, estos se caracterizan por ser aerobios

facultativos, con requerimientos nutritivos muy sencillos ya que pueden crecer a

partir de una gran variedad de fuentes de carbono y energía.

En investigaciones realizadas (SCHEIBNER et al., 1997; Boopathy, 1994; Funk

et al., 1996), esta cepa fue aislada directamente de focos contaminados con

TNT, para confirmar la capacidad de utilizar el nitrato de esteres (base para la

fabricación del TNT) como única fuente de energía para el crecimiento.

1.1.7.2 Metabolismo con Pseudomonas sp.

Las pseudomonas son bacilos rectos o ligeramente curvados; GRAM

negativos, que utilizan los compuestos orgánicos como fuente de energía

(quimioorganotrofo) y a su vez utilizan el H2 y CO, como únicos donadores de

electrones; algunos usan nitrato como aceptor de electrones anaeróbicamente

(Brock, Biología de los microorganismos Cap. 16). Las pseudomonas tienen

requerimientos nutritivos muy sencillos, crecen a pH neutro y temperaturas en

la zona mesófila, una de las propiedades más importante de este grupo es la

gran variedad de compuestos orgánicos que usan como fuente de carbono y

como donadores de electrones para la producción de energía, en el caso

particular de de la degradación de TNT, las pseudomonas utilizan el mismo

explosivo como fuente de carbono.

1.1.8 Formación del complejo Meisenheimer.

La formación del complejo Meisenheimer consiste en una sustitución

nucleofílica al anillo aromático de TNT, debido a la alta densidad de electrones

que presenta el benceno, los tres grupos nitro presentes en el TNT, son los

atrayentes de electrones haciendo que los electrones del anillo sean atacados

reductivamente.

30

Estos compuestos presentan una intensa coloración rojo- anaranjada en

solución y una carga negativa deslocalizada sobre el anillo y los grupos nitro.

Ilustración 4. Formación del complejo Meisenheimer. Fuente: Esteve A,Caballero A, Ramos J. 2001.

1.1.9 Medio de cultivo.

Para conocer mejor las características de los microorganismos es necesario

estudiarlas en un medio puro. Un cultivo puro es aquel formado por células

que provienen un solo microorganismo perteneciente a la misma especie y

cepa. Por eso es de gran importancia evitar la contaminación en los medios de

cultivo, para esto se debe cultivar con la cantidad de nutrientes y los medios

necesarios12.

Las condiciones adecuadas en que se debe preparar un medio de cultivo son la

disponibilidad de nutrientes apropiados, consistencia del medio, presencia o

ausencia de oxigeno y otros gases, condiciones adecuadas de humedad, luz

ambiental, pH, temperatura y esterilidad del medio.

La solución acuosa con los nutrientes necesarios se llama medio de cultivo. Un

medio de cultivo requiere de una fuente de carbono, nitrógeno y otros

nutrientes. La célula requiere de dos tipos de nutrientes: macro y

micronutrientes. El carbono es muy importante porque a partir de éste la célula

fabrica material celular. El siguiente elemento más abundante es el nitrógeno

12

Op. Cit. 230.Biología de los microorganismos 1999.

31

ya que forma parte de proteínas, ácidos nucléicos y otros constituyentes

celulares. Algunos otros macronutrientes son el fósforo, el azúfre, el potasio,

magnesio, calcio, sodio y hierro. Entre los micronutrientes se encuentran

metales que forman parte de enzimas, trazas,sales etc. Los factores de

crecimiento incluyen vitaminas, aminoácidos, purinas y pirimidinas.

En el medio de cultivo se emplea un elemento solidificante, el agar se licua

con agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40°C

1.1.10 Características de la colonia.

Tras un periodo de incubación a una temperatura apropiada en el medio de

cultivo solido donde previamente se ha realizado la siembra, se espera es que

aparezcan unas pequeñas masas visibles a simple vista que han sido

formadas por el crecimiento de una célula bacteriana. La multiplicación de esa

bacteria en el medio de cultivo sólido es conocida como colonias.13

Estas colonias presentan morfología propia de las bacterias que esta

constituida por una serie de características fundamentales entre las que se

encuentra: el tamaño, forma, estructura y tipo o modo de agrupación.

Tamaño: Característica de cada tipo bacteriano, se observa muchas veces

con mayor exactitud a través del microscopio, por las dimensiones

microscópicas de las bacterias.

Forma: Puede presentarse formas: esféricas, cocoides, cilíndricas o

bacilares, de espirales o helicoidales, formas coco bacilares, de coma, etc.

Agrupación: Se pueden agrupar macroscópicamente y microscópicamente,

la primera puede visualizarse a simple vista estas corresponden al

crecimiento en un punto medio de la colonia en el medio de cultivo, puede

visualizarse a simple vista, estas presentaran características distintas para

cada tipo bacteriano. Por otra parte las segundas son visualizables por

microscopia pudiendo observar los distintos tipos bacterianos que se

asocian entre sí formando pequeños grupos de 2 o más bacterias, por

13

GRANADOR PEREZ Raquel, Villaverde María del Carmen: Bacteriología, características y

clasificación bacteriana. Microbiología tomo 1, pág.249-261.

32

ejemplo: tétradas, diplococos, racimos, cadenas, etc. Las anteriores

también conforman parte de la morfología de una colonia.

Es importante considerar las diferentes formas, tamaños y aspectos de las

colonias ya que esto puede servir como:

Un dato para identificar el tipo de colonia y poderla clasificar

taxonómicamente.

Medida de control apara una siembra correcta. Lo ideal es que las

colonias estén separadas y que el medio no presente contaminación.

Estas características son diferentes para cada uno de los tipos bacterianos,

aunque algunas especies presenten otras características de las ya

mencionadas.

Tamaño de las colonias: El tamaño de la colonia se considera un factor

importante que suele ser uniforme para cada género y especies bacterianos.

El tamaño de las colonias puede variar y ser clasificado en:

Tamaño pequeño, de 1-2 mm de diámetro.

Tamaño grande, de 4 -6 mm de diámetro.

Extendidas en forma de velo invadiendo todo el medio de cultivo (tamaño

muy grande).

Puntiformes con aproximadamente 0.5 mm de diámetro o inferiores.

Forma de las colonias: La forma de la colonia depende de su espesor y

borde, en la primera cuando el espesor es mucho mayor en el centro

disminuye uniformemente hacia el borde se dice que la colonia es elevada,

también pueden haber planas, semiconvexas, cóncavas, semiconcavas,

semiesféricas, en meseta, etc. El borde puede ser liso o irregular y aserrado en

mayor o menor grado. (Wolin, et al. 1973)

33

Superficie de la colonia: Corresponde al aspecto de la colonia y se divide en:

lisa, rugosa, plana, acuminada, umbilicada, seca, etc.

Consistencia de la colonia: las colonias pueden ser duras, viscosas,

mucosas, secas, muy secas, cremosas, etc. Por ejemplo las colonias mucosas

son típicas en levaduras y menos frecuentes en bacterias.

Estas características de las colonias son un criterio importante para su

posterior aislamiento tanto en medio sólido como en medio líquido.14

1.1.11 Agua residual sintética.

El agua residual sintética es una composición de compuestos orgánicos e

inorgánicos basada en aguas residuales, esta es utilizada en estudios de

pequeña escala ya que muchas veces se hace difícil trabajar con aguas

residuales industriales o domesticas, ya sea por el tipo de tratamiento o el

contaminante. Este tipo de agua tiene la ventaja de ser plenamente controlada

tanto en composiciones como en concentraciones, de forma que se evita todos

los problemas inherentes al agua residual real tanto por su composición y

estado, adaptándose el efluente al requerimiento marcado por la

experimentación.15

1.1.12 Cromatografía Líquida de Alto Rendimiento (HPLC)

La cromatografía es un método físico de separación basado en la distribución

de los componentes de una mezcla entre dos fases inmiscibles, una fija o

estacionaria y otra móvil. En la cromatografía líquida, la fase móvil es un líquido

que fluye a través de una columna que contiene a la fase fija y líquida para

separar los compuestos que se encuentran disueltos en solución. Con el objeto

de aumentar la eficiencia en las separaciones, el tamaño de las partículas de

14

Ibíd 13. Pág.251- 252 15

Torres Lozada Patricia, Foresti Eugenio, Vazoller Rosana F Composición y uso de agua

residual doméstica en reactores a escala de laboratorio Univalle.Fac.Ing. Pág, 2.

34

fase fija va disminuyendo hasta el tamaño de los micrones, lo cual genera la

necesidad de utilizar altas presiones para lograr que fluya la fase móvil. 16

Los instrumentos del HPLC consisten en un depósito de la fase móvil, una

bomba, un inyector, una columna de separación, y un detector. Los

compuestos están separados por la inyección de la mezcla de la muestra en la

columna. Los diferentes componentes de la mezcla pasa a través de la

columna a diferentes velocidades debido a diferencias en su comportamiento

de partición entre la fase líquida móvil y la fase estacionaria.

El método EPA 8330B para Nitroaromáticos, nitraminas, y ésteres de nitrato es

aplicable para análisis de trazas de explosivos y residuos de carburante por

cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) con un doble longitud de onda

ultravioleta (UV) en un detector de agua, suelo, o de la matriz de sedimentos. 17

16

www.quiminet.com . Cromatografía liquida. Consultado Ene 10 de 2010 17 Método 8330 A para nitroaromáticos y nitraminas, HPLC planteado por la Agencia de

Protección Ambiental de los Estados Unidos (EPA) del año 2007.

35

1.2 MARCO LEGAL.

La Legislación Ambiental Colombiana hace referencia al conjunto de

normatividad que definen objetivos principios, criterios y orientaciones

generales para la protección del Ambiente de nuestro país.

En Colombia la normatividad ambiental se ha fortalecido en las tres últimas

décadas, en especial desde la llamada Constitución ecológica y la Ley 99 de

1993, donde se estableció la organización y principios para propender por el

buen manejo y uso de nuestros Recursos Naturales.

Para la ejecución de este proyecto se contempla la siguiente legislación.

Tabla 2.Legislación ambiental aplicable para investigación.

NORMA CORRESPONDE A

Constitución Política de Colombia.

Art. 7, 79, 80.

Ley 99 de 1993 Art. 83, 84 sanciones y medidas de policía ART 85 sanciones y medidas de policía.

Ley 61 de1993 por lo cual se reviste al presidente al presidente de la república de facultades extraordinarias sobre armas municiones y explosivos y para reglamentar la vigilancia y seguridad privada

Decreto 2811 de 1974 Por el cual se expide el Código Nacional de los Recursos Renovables y de Protección del Medio Ambiente

Ley 525 de1999 Por medio de la cual se aprueba la "Convención sobre la prohibición del desarrollo, la producción, el almacenamiento y el empleo de armas químicas y sobre su destrucción" hecha en París el trece (13) de enero de mil novecientos noventa y tres (1993).

Ley 540 de 1999 Por medio de la cual se aprueba la "Convención Interamericana contra la fabricación y el tráfico ilícito de armas de fuego, municiones, explosivos y otros materiales relacionados".

Ley 554 de 2000 Por medio de la cual se aprueba la "Convención sobre la prohibición del empleo, almacenamiento, producción y transferencia de minas antipersonal y sobre su destrucción", hecha el dieciocho (18) de septiembre de mil

36

novecientos noventa y siete (1997). Ley 670 de 2001 Por medio de la cual se desarrolla parcialmente

el artículo 44 de la Constitución Política para garantizar la vida, la integridad física y la recreación del niño expuesto al riesgo por el manejo de artículos pirotécnicos o explosivos.

Ley 737 de 2002 del 5 de Marzo Diario Oficial No 44.734, de 9 de marzo de 2002 por medio de la cual se aprueba la "Convención Interamericana contra la fabricación y el tráfico ilícitos de armas de fuego, municiones, explosivos y otros materiales relacionados".

Decreto 2003 de 1982 Por el cual se modifica parcialmente el Decreto No. 1663 del 06 de Julio de 1979. Modifica el Estatuto Nacional para el control comercio armas, municiones y explosivos.

Decreto 695 de 1983 Por el cual se determina el material de Guerra o reservado de las fuerzas militares y la Policía Nacional. Clasifica sistemas de armas, armamento mayor y menor de todos los tipos, modelos o calibres usado por las Fuerzas militares y la Policía Nacional.

Decreto 1594 de 1.984 Este decreto reglamenta el uso del agua y los residuos líquidos a nivel nacional. En este decreto se establecen los parámetros y las concentraciones máximas admisibles, que pueden estar presentes en un residuo líquido según el uso que se quiera dar a este.

Decreto1335 de 1987 Reglamento de seguridad en las labores subterráneas Regula aspectos relacionados con productos explosivos los cuales son vendidos por Indumil.

Decreto 2535 de 1993 Por el cual se expiden normas sobre armas, municiones y explosivos. En este decreto se fijan normas y requisitos que se deben tener en cuenta para la tenencia y el porte de armas, municiones, explosivos y sus accesorios. Además establece algunas condiciones para la importación y exportación de armas, municiones y explosivos.

Decreto 334 de 2002 Por el cual se establecen normas en materia de explosivos. Mecanismos de control relacionados con la producción, importación, comercialización, distribución, venta directa, almacenamiento de explosivos.

Decreto 1609 de 2002 Por el cual se reglamenta el manejo y transporte terrestre de mercancías peligrosas por carretera. Tiene por objeto establecer los

37

requisitos técnicos y de seguridad para el manejo y transporte de mercancías peligrosas por carretera en vehículos automotores en todo el territorio nacional.

Decreto 4741 de 2005 Por el cual se reglamenta parcialmente la prevención y el manejo de los residuos peligrosos en el marco de la gestión integral.

Resolución número 02400 Mayo 22 de1979

Disposiciones sobre vivienda, higiene y seguridad industrial en establecimientos de trabajo. En esta resolución se establecen algunas consideraciones relacionadas con la manipulación, transporte y almacenamiento de explosivos.

Resolución 081 de 2002 Por la cual se clasifican como explosivos para todos los efectos legales, las materias primas o insumos que sin ser explosivos individualmente, en conjunto conforman una sustancia explosiva

Fuente. Adaptado por las autoras, 2010.

38

2. MATERIALES Y MÉTODOS

Para realizar esta investigación se tomaron doce muestras de diferentes

ambientes donde la presencia del explosivo es relevante en cuanto a tiempo de

exposición y fabricación del producto. Las muestras se obtuvieron de suelo,

lodos y agua, tomando parámetros físicos en términos de pH y conductividad,

para determinar en que condiciones se encontraban las muestras y de este

modo adaptarlas a los medios de aumentación microbiana.

Se realizo un pre-enriquecimiento en medio mineral líquido con una

concentración de 50 mg/l de TNT, durante 45 días, con el fin de aumentar la

población bacteriana en las muestras tomadas. Para determinar donde se

presenta más población y diversidad bacteriana se utilizaron tres tipos de

tratamientos: explosivo como única fuente, explosivo más fuente de Carbono y

explosivo más fuente de Nitrógeno.

Los pre-enriquecimientos fueron sembrados en medio mineral sólido por

triplicado, mediante diluciones seriadas base 10; el cultivo se incubó a 26 ºC

durante 20 días, realizando monitoreo diario.

Las colonias obtenidas en cada uno de los tratamientos, fueron repicadas en

medio mineral liquido con fuente de carbono y en medio mineral sólido con las

fuentes de nitrógeno, carbono y solo explosivo, aumentando la concentración

de explosivo de 50 mg/L a 100 mg/L, y usando como criterio la diversidad

morfotípica en cuanto a su color, borde, tamaño y forma (selección de las

colonias).

A los aislamientos bacterianos obtenidos bajo esta nueva condición, se les

determinó su capacidad de degradación del explosivo TNT, mediante

monitoreo por HPLC Cromatografía Liquida de Alta Eficacia aplicando el

método de la EPA 8330B para la extracción y filtración.

Con el área de cada curva obtenida durante la corrida se estableció el límite

mínimo de TNT que registra el equipo, con esta información se establecieron

los cinco aislamientos bacterianos que presentaron mayor degradación.

39

Finalmente se realizó un bioensayo con agua residual sintética a la cual se le

agrego explosivo TNT; los cinco aislamientos bacterianos fueron inoculados en

esta agua y se realizaron mediciones a través del tiempo (cuatro días),

tomando un blanco de referencia (tiempo cero) para establecer la

concentración inicial del explosivo; posteriormente se realizó una medición

diaria para determinar la degradación de este a través del tiempo; estos

ensayos se hicieron por triplicado.

Se llevo a cabo un total de 78 análisis en HPLC para el caso de la selección de

las cinco cepas con mayor capacidad degradadora y se realizaron un total de

45 análisis de HPLC durante el periodo de experimentación de bioensayo con

el agua residual sintética.

Las etapas desarrolladas para ejecutar la investigación se describen a

continuación en el diseño metodológico.

2.1 DISEÑO METODOLOGICO.

Para la realización del proyecto de grado es de importancia resaltar que se

hizo bajo un contrato de confidencialidad con la parte interesada donde no se

podía mencionar, el nombre de la entidad financiadora y la ubicación

geográfica de donde se obtuvieron la muestras con las que se desarrollo la

investigación.

2.1.1 Toma de muestras.

Para la realización de este proyecto se trabajó con doce muestras extraídas de

diferentes puntos de muestreo (agua, suelo y lodo) los cuales presentaban

exposición directa al explosivo ya sea por el proceso de fabricación o el tiempo

de exposición a este. Primero se limpió el terreno superficial sobre los puntos

de muestreo y se procedió a introducir un barreno recto para tomar una

muestra de suelo.

40

Ilustración 5. Toma de muestras Ilustración 6. Muestras obtenidas de los doce

puntos de muestreo.

La siguiente tabla menciona los puntos de la toma de muestras.

Tabla 3. Puntos de toma de muestras.

MUESTRA PUNTO DE MUESTREO

1 Exterior, frente a la planta de cristalización.

2 Canal exterior.

3 Trampa taller multiplicador.

4 Canal trampa producción.

5 Caneca residuos de lavado.

6 Tanque de transporte.

7 Tanque exterior caja de captación

8 Tanque concentración de tenso activo

9 Campo de prueba

10 Lodos de la PTAR

11 Fitorremediación

12 Caño PTAR

Fuente: las autoras

41

2.1.2 Análisis preliminares del suelo.

Inicialmente se le realizó un análisis a las doce muestras recolectadas. Estas

muestras se analizaron de acuerdo a los parámetros establecidos por la EPA

en los métodos 9050 A y 9045 C del año 2000.

Tabla 4. Método de medición de parámetros fisicoquímicos

Ensayo Norma /especificación Producto al que se le aplica

pH ICE -131/203-092 Método valido base de referencia EPA 9045C Potenciometría Equipo utilizado potenciómetro Fisher Accumet® pH-meter model 600

Suelos, lodos.

Conductividad ICE -131/203-096 Método valido base de referencia EPA 9050ª

Suelos, lodos

Fuente.www.cesmec.cl

2.1.3 Medición de conductividad y pH de las muestras.

Estas mediciones se realizaron con el fin de establecer las condiciones

fisicoquímicas iniciales de las muestras obtenidas, para de esta manera

estandarizar estas condiciones a los medios de cultivo. Para desarrollar este

análisis se pesan 20 g de muestra de suelo, se le adicionan 20 ml de agua

destilada y se agita a 200 rpm durante 5 minutos. Luego la muestra se deja en

suspensión por una hora. Para la medición de conductividad se utilizo una

celda conductimétrica que consta de dos electrodos del mismo tipo. Finalmente

se inserta el electrodo en el sobrenadante acuoso y se reporta el resultado de

pH y conductividad.

42

Los resultados de conductividad y pH para las doce muestras se muestran en

la siguiente tabla:

Tabla 5. Valores de pH y conductividad de las muestras

La tabla 5 muestra los valores de conductividad los cuales presentan

uniformidad a diferencia del punto 8, donde hay una concentración de sales

iónicas por tenso activos haciendo que los valores de conductividad se

eleven.

Así mismo se evidencia un rango de valores de pH entre 2.11 y 9.20, lo que

indica que las muestras proviene de diferentes ambientes, por lo tanto se hace

necesario estandarizar el pH con una solución buffer en los medios utilizados

para el pre- enriquecimiento, siembra y replica.

Fuente: Pontificia Universidad Javeriana. Sonia Villegas 2009.

MUESTRA PUNTO DE MUESTREO CONDUCTIVIDAD (g/l)

pH

1 Exterior, frente a la planta de cristalización. 0.34 7.11

2 Canal exterior. 0.22 7.34

3 Trampa taller multiplicador. 0.17 6.58

4 Canal trampa producción. 1.15 3.68

5 Caneca residuos de lavado. 1.47 2.11

6 Tanque de transporte. 0.70 7.10

7 Tanque exterior caja de captación 0.44 7.54

8 Tanque concentración de tenso activo 14.96 9.20

9 Campo de prueba 0.63 6.72

10 Lodos de la PTAR 1.57 8.73

11 Fitorremediación 0.47 7.42

12 Caño PTAR 0.44 8.95

43

2.1.4 Pre-enriquecimiento de las muestras A partir de las muestras tomadas en los doce puntos de muestreo, se realizó el

pre enriquecimiento el cual consiste en adicionar dichas muestras en un

medio mineral líquido para aumentar la población microbiana existente en las

muestras dicho medio contiene las condiciones necesarias para el crecimiento

de las bacterias a aislar teniendo en cuenta reportes hechos por diferentes

investigaciones donde se mencionan los componentes necesarios de

macronutrientes y micronutrientes, condiciones ambientales, concentración del

explosivo y tiempo de crecimiento de las bacterias en los medios de cultivo.

Con base a lo anterior se obtuvieron componentes y concentraciones para la

elaboración del medio mineral tanto líquido como sólido.

Tabla 6. Composición de medio nutritivo.

Sustancias

Tipo y Cantidad Concentración

Sales

HCl (3 ml) 1 M

NaCl (12.5 g) 8,5 mM

MgSO4 – 7H2O (5 g) 0,81 mM

CaCl2 2H2O (1g) 0,27 mM

Buffer K2HPO4 (17,5 g) 4,02 mM

K2H2PO4 (7,5 g) 2,2 mM

Vitaminas

Clorhidrato de piridoxina (0,05 g)

Ácido p-aminobenzoico (0,025 g)

Ácido nicotínico (0,025g)

Pantotenato de calico (0,025 g)

Riboflavina (0,025 g)

Vitamina B12 (0,025 g)

Tiamina-HCl (0,025 g)

Biotina (0,01 g)

Ácido fólico (0,01 g)

α-lipoico (0,01 g)

Trazas

HCl (20 ml) 18 -19%

MnSO4 H2O (0,2 g)

H3BO3 (0,1g)

ZnSO4 7H2O (0,1 g)

44

Las cantidades para la elaboración del medio se mencionan en la tabla 7.

Tabla 7. Cantidades para la elaboración del medio.

Del medio mineral se toma 45 mL y se lleva a frascos tapas azul

debidamente marcadas según la procedencia del punto de muestreo, al cual

se le agrega 5gr/mL de la muestra (agua, suelo, lodo). Este procedimiento se

hace con tres tipos de tratamientos: explosivo como única fuente de energía,

explosivo más fuente de carbono y explosivo mas fuente de nitrógeno.

Los componentes de cada fuente de energía se muestran a continuación en la

tabla 8.

CaSO4 5H2O (0,05 g)

CoCl2 H2O (0,05 g)

CuSO4 5H2O ( 0,01 g)

Na2MoO4 2H2O (0,01 g)

NiSO4 6H2O

Explosivo

TNT (2,5 ml)

Hierro HCl (3 ml) 1 M

FeSO4 7H2O ( 0,3 g) 10, 8 µM

Preparación del medio mineral para 1L de medio

Solución de Buffer 10 ml

Solución de Sales 10 ml

Fuente de carbono 10 ml

Fuente de nitrógeno 10 ml

Después del Autoclave se adicionará

Solución de Hierro 1 ml

Elementos de trazas 1 ml

Solución de vitaminas 1 ml

Solución de explosivo 2,5 ml

Fuente: las autoras

Fuente: las autoras

45

Tabla 8. Composición fuentes de energía.

A continuación se menciona la composición de cada uno de los tres

tratamientos.

T1: Medio de cultivo mineral liquido (MML)+ Fuente de Nitrógeno (FN)+

Explosivo (EXP). (MML+FN+EXP).

T2: Medio de cultivo mineral liquido (MML) + Fuente de Carbono (FC) +

Explosivo (EXP). (MML+FC+EXP).

T3: Medio de cultivo mineral liquido (MML) + Explosivo. (EXP)

(MML+EXP).

Se realizaron dos pre-enriquecimientos, el primero para las muestras de

uno a seis, y el segundo para las muestras siete a la doce con un tiempo

diferencia de 45 días18 estos dos pre-enriquecimientos se mantuvieron a

temperatura ambiente, con una agitación de 120 rpm, como se muestra en

la siguiente ilustración:

Ilustración 7.Frascos de pre-enriquecimiento

18

El pre-enriquecimiento fue necesario hacerlo en dos partes, por las grandes cantidades de material que se requerían.

FUENTE DE ENERGIA COMPOSICIÓN Y CANTIDAD

Fuente de Carbono Glucosa

2,5 g

Citrato

2,5 g

Glicerol

2 ml

Acetato

2,5 g

Fuente de Nitrógeno NH4NO3 1g

Fuente: Las autoras

46

2.1.5 Aislamiento de cepas.

Luego de los cuarenta y cinco días de pre- enriquecimiento donde se

bioaumento la población bacteriana, fue necesario hacer diluciones seriadas

base 10, ya que se parte del supuesto que estas presentan un alto grado de

diversidad y cantidad de heterótrofos totales, por lo tanto se hicieron diluciones

de 10-2 a 10-7, en solución salina (0.86%); para esto se tomo de cada uno de

los pre enriquecimientos una cantidad de 0.5 mL y se agregó en los tubos de

ensayo que contenían 10 mL de solución salina.

Las tres diluciones más altas fueron sembradas en medio mineral solido, en los

tratamientos mencionados anteriormente: explosivo como única fuente,

explosivo más fuente de Carbono y explosivo mas fuente de Nitrógeno,

partiendo de una concentración inicial del explosivo TNT de 50mg/L. Cada

siembra se realizo por triplicado, en condiciones asépticas y fueron incubadas

a 21 ºC durante 20 días.

Después de un monitoreo continuo se evidencio que las bacterias

presentaban un crecimiento lento y una diversidad en morfología, a

continuación se muestran dos ilustraciones donde se evidencia algunas de las

bacterias encontradas, en los diferentes tratamientos.

47

2.1.6 Criterio de selección de colonias.

Para la selección de las bacterias se tomaron como criterios de los morfotipos

(color, forma, tamaño, borde, textura).

Las bacterias seleccionadas se sembraron en cajas de petri divididas con

cuadriculas de igual de igual tamaño 1.5 X 1.5 mm para así colocar cada

aislamiento esta siembra se realizo mediante capilares de vidrio sellados,

limados y esterilizados. Simultáneamente, las bacterias aisladas fueron

inoculadas en medio mineral liquido con fuente de carbono y 100 ppm de TNT

con el fin de inhibir el crecimiento de las colonias que tengan menor capacidad

degradadora. Los aislamientos fueron incubados a 21°C durante 20 días.

Los aislamientos bacterianos obtenidos fueron en total setenta y ocho. A

continuación se presenta la tabla 9 donde se describe la morfología bacteriana,

la nomenclatura y el origen.

Ilustración 8. Población bacteriana caja de petri con T2.

Fuente: las autoras

Ilustración 9. Población

bacteriana caja de petri con T1.

Fuente: las autoras

48

MUESTRA TRATAMIENTO AISLAMIENTO COLOR TEXTURA TAMAÑO ELEVACIÓN FORMA BORDE

N°1

T2 + 10-6 T1 Amarillo Cremosa Pequeño Convexa Irregular Ondulado

T2 + 10-6 T2 Transparente cremosa Grande Convexa Irregular Irregular

T2 + 10-7 T3 Amarilla viscosa grande Convexa Circular Redondo

T2 + 10-7 T4 Transparente viscosa pequeño Plana Circular Ovalado

T1 + 10-7 T5 Lechosa blanca mucosa grande Convexa Circular Redondo

T1 + 10-7

T6 Trasparente con centro amarillo cremosa grande Plana Papilada Irregular

T2 + 10-7

T7 Amarillo viscosa pequeño Plano - convexa

Fusiforme Irregular

T1 + 10-7

T8 Amarillo transparentoso Mucosa Pequeño Plana Irregular Irregular

T2 + 10-7

T9 Blanca Mucosa Pequeño Plana Fusiforme Alargado

T2 + 10-7

T10 Transparente viscosa Pequeño Convexa Circular Lobulado

T2 + 10-7

T11 Blanca centro amarillo Mucosa Pequeño Plana Circular Ondulado

T2 + 10-7

T12 Tranparente viscosa grande Plano - convexa

Papilada Ondulado

T2 + 10-7

T13 Transparente viscosa Pequeño Convexa Circular Redondo

T2 + 10-7

T14 Naranja dura grande Convexa Circular Redondo

T2 + 10-5 T15 Amarilla oscuro cremosa grande Plana Circular Redondo

T3 + 10-6 T16 Blanca con centro amarillo cremosa Pequeño Convexa Rizoide Rizoide

T3 + 10-5

T17 Transparente Dura grande Plana Circular Redondo

Tabla 9. Morfotipos 78 aislamientos seleccionados en la replica.

49

N°2

T1 + 10-6

T23 Amarilla cremosa Pequeño Convexa Circular Redondo

T1 + 10-6

T24 Blanca viscosa grande Convexa Circular Redondo

T1 + 10-6

T25 Blanca Dura Pequeño Plana Rizoide Irregular

T1 + 10-6 T26 Amarilla cremosa Pequeño Plana Circular Redondo

T1 + 10-6

T27 Rosado claro cremosa Pequeño Plana Circular Redondo

T2 + 10-6

T28 Rosado intenso cremosa Pequeño Convexa Circular Redondo

T2 + 10-6 T29 Amarillo claro Dura Pequeño Plana Irregular Ondulado

T2 + 10-6 T30 Rosado claro Dura Mediano Plana Circular Redondo

T2 + 10-6 T31 Transparente centro amarillo cremosa Mediano Convexa Circular Redondo

N°3

T2 + 10-6

T45 Amarilla cremosa Pequeño Convexa Circular Redondo

T1 + 10-6

T46 Transparente Mucosa Pequeño Convexa Irregular Ondulado

T2 + 10-4 T47 Transparente Mucosa Pequeño Convexa Circular Redondo

T1 + 10-6

T48 Transparente Mucosa Mediano Plana Circular Redondo

T2 + 10-4

T49 Transparente cremosa Pequeño Plana Rizoide Irregular

T3 + 10-6

T50 Transparente cremosa Pequeño Plana Rizoide Irregular

T3 + 10-6 T51 Blanca cremosa Pequeño Convexa Circular Redondo

T1 + 10-5

T52 Amarillo quemado Dura Mediano Plana Circular Redondo

T1 + 10-5

T53 Blanca centro amarillo Cremosa Mediano Plana Circular Irregular

T2 + 10-4

T54 Amarilla Cremosa Grande Plana Circular Redondo

T1 + 10-5

T55 Amarilla Dura Grande Plana Circular Redondo

N°4

T1 + 10-5

T67 Amarilla centro quemado amarillo Dura Pequeño Convexa Irregular Ondulado

T1 + 10-6

T68 Transparente Mucosa Pequeño Plana Irregular Ondulado

T2 + 10-4

T69 Transparente Cremosa Mediano Plana Circular Redondo

T2 + 10-4

T70 Transparente Mucosa Pequeño Acuminada Circular Redondo

50

T2 + 10-4

T71 Blanca centro amarillo Cremosa Mediano Plana Rizoide Filamentoso

T2 + 10-5

T72 Transparente Cremosa Pequeño Acuminada Circular Redondo

T2 + 10-6

T73 Amarilla Mucosa Pequeño Papilada Circular Redondo

T2 + 10-6

T74 Blanca Mucosa Mediano Acuminada Circular Redondo

T2 + 10-6

T75 Naranja Cremosa Pequeño Convexa Irregular ondulado

T1 + 10-5

T76 Transparente Mucosa Mediano Convexa Filamentoso Filamentoso

T3 + 10-6

T77 Transparente Mucosa Mediano Papilada Irregular Filamentoso

N°5

T2+ 10-4

T89 Rosada Dura Pequeño Plana Circular Irregular

T1 + 10-5

T90 Rosada Cremosa Pequeño Plana Circular Redondo

T2 + 10-6

T91 Naranja Mucosa Pequeño Convexa Circular Redondo

N°6

T1 + 10-6

T109 Naranja con centro amarillo Viscosa Pequeña Convexa Irregular Ondulado

T1 + 10-6

T110 Amarilla Mucosa Pequeño Plana Circular redondo

T1 + 10-6

T111 Café Dura Pequeño Plana Irregular Ondulado

T2 + 10-4

T112 Blanca Mucosa Mediano Papilada Circular redondo

T2 + 10-6

T113 Transparente con centro blanco Cremosa Grande Papilada Circular redondo

T2 + 10-6

T114 Blanca Cremosa Mediano Papilada Irregular Ondulado

T2 + 10-6

T115 Amarilla Cremosa Pequeño Umbilicada Irregular Ondulado

N° 7

T1 + 10-2

T1B Blanca Cremosa Pequeño Convexa Circular redondo

T1 + 10-6

T2B Transparente Cremosa Pequeño Convexa Irregular Ondulado

T1 + 10-6

T3B Rosada Cremosa Grande Papilada Circular redondo

T1 + 10-5

T4B Blanco en el centro un circulo amarillo

Cremosa Grande Papilada Circular redondo

T1 + 10-6

T23B Café Cremosa Pequeño Convexa Circular redondo

T2 + 10-6

T24B Café borde transparente Mucosa Grande Convexa Irregular Ondulado

T1 + 10-6

T25 B Rosada Cremosa Pequeño Convexa Circular redondo

51

T1 + 10-6

T26 B Transparente Mucosa Pequeño Plana Circular redondo

N°8

T2 + 10-4

T27B Café Dura Pequeño Plana Circular redondo

T2 + 10-4

T28B Café Mucosa Grande Papilada Irregular Ondulado

T2 + 10-4

T29B Amarillo quemado Cremosa Pequeño Papilada Circular redondo

T2 + 10-6

T30B Café Mucosa Pequeño Convexa Circular redondo

N°9

T1 + 10-6

T45 B Café Dura Pequeño Plana Circular redondo

T2 + 10-5

T87B Blanco Dura Mediana Plana Irregular Ondulado

T2 + 10-5

T88B Café Dura Mediana Plana Irregular Ondulado

N°11

T2 + 10-5

T89B Naranja en el centro punto blanco Mucosa Pequeño Papilada Circular redondo

T1 + 10-5

T90B Blanca Cremosa Mediano Convexa Circular redondo

T2 + 10-5

T91B Transparente Mucosa Grande Convexa Circular redondo

T2 + 10-5

T92B Blanco Mucosa Pequeña Convexa Irregular Ondulado

N°12 T1 + 10

-5 T110B Blanca con borde café Cremosa Grande Papilada Circular redondo

T1 + 10-5

T111B Café Dura Mediana Convexa Circular redondo

Fuente: Las autoras

52

En la tabla anterior se evidencia un mayor crecimiento en la muestra 1 frente a la

planta de cristalización, así mismo en las diluciones 10- 5 y 10-6. El tratamiento que

presento mayor crecimiento fue tratamiento con fuente de carbono con 54%,

seguido el tratamiento con fuente nitrógeno con 40%, por ultimo se puede ver un

menor crecimiento en el tratamiento que tenía como única fuente explosivo con un

6%. Como se puede observar en la gráfica 1.

Grafica 1. Porcentajes de aislamientos en los tratamientos.

Fuente. Las autoras.

6%

54%

40%

Explosivo T1 Fuente de carbono +Explosivo T2

Fuente de Nitrógeno

+Explosivo T3

% de aislamientos

Porcentajes de aislamientos en los tratamientos

53

2.2.3 Selección de los aislamientos bacterianos con mayor capacidad de

degradación.

Para determinar cuáles de los setenta y ocho aislamientos bacterianos tenían

mayor capacidad de degradación del explosivo TNT, fue necesario realizar una

extracción y filtración para separar la biomasa (células bacterianas) del

sobrenadante (MML+ Explosivo). Este proceso consistió en homogenizar con

vortex durante 1 min los aislamientos inoculados en MML; posterior a esto se

realizo el lavado de las células en un nuevo tubo de ensayo, se centrifugo a 6000

rpm por veinte minutos, luego se tomaron 650 µl del sobrenadante y se

adicionaron 650 µL de acetonitrilo grado HPLC, en un eppendorf, esto se

homogenizo en vortex por 1 min. Por otro lado el tubo donde se hizo el lavado de

las células se unifico con el contenido del eppendorf ya homogenizado en un

frasco de vidrio cerum, este último se pasa por vortex 30 segundos; del volumen

unificado se toma 1 mL y es filtrado con filtros membrana 11mm x 0.22µ tipo

HPLC, se tomar con una jeringa 0,5 mL de acetonitrilo y se pasa por el filtro, para

realizar el lavado de este, depositando el volumen en el mismo vial para un

volumen total de 1.5 ml. Por último el sobrenadante filtrado (MML+ Explosivo) se

pasa por HPLC para cuantificar la concentración de explosivo. Se siguió el

método 8330 A de cromatografía líquida de Alta Eficacia (HPLC) para

nitroaromáticos y nitraminas. Se utilizo una columna C-18 fase de fase reversa,

25 cm X4.6 mm (Shimadzu) y un HPLC marca Shimadzu; prominence LC 20AT,

equipo que fue prestado por la Unidad de Saneamiento Ambiental (USBA) de la

Pontificia Universidad Javeriana. Las condiciones de cromatografía se ajustaron a

las recomendaciones del fabricante, estas fueron: un flujo de 1 ml /min con un

volumen de inyección de 20 µl, detector UV a 254 nm. Para la corrida de las

muestras se empleo una fase móvil 54:10:34 (Metanol: acetonitrilo: agua tipo1).

La tabla 10 muestra los valores de concentración, tiempo de retención y área para

el sobrenadante filtrado (MML+ Explosivo) para cada uno de los setenta y ocho

aislamientos. Con el área de cada cromatograma que se obtuvo durante la corrida

54

por HPLC, se establecieron las concentraciones más bajas que se registraron de

TNT en el equipo; con esta información se seleccionaron las cinco muestras que

presentaron mayor degradación por el aislamiento bacteriano contenido en cada

uno de ellas.

Tabla 10. Lecturas de los 78 aislamientos por HPLC.

MUESTRA EXPLOSIVO TIEMPO DE RETENCIÓN

(MIN)

CONCENTRACIÓN DEL EXPLOSIVO

(PPM)

CONCENTRACIÓN FINAL (PPM)

PATRON TNT 6,35 96,56 144,84

T1A TNT 6,34 1,75 2,62

T2A TNT 6,33 2,38 3,56

T6A TNT 6,34 1,73 2,60

T7A TNT 6,36 1,68 2,52

T8A TNT 6,33 1,69 2,53

T10A TNT 6,36 1,72 2,58

T11A TNT 6,35 1,69 2,53

T12A TNT 6,35 1,68 2,52

T13A TNT 6,33 1,86 2,79

T14A TNT 6,34 1,75 2,63

T15A TNT No peak is detected.

0,00 0,00

T16A TNT 6,32 1,68 2,51

T17A TNT No peak is detected.

0,00 0,00

T23A TNT 6,35 1,98 2,96

T24A TNT 6,33 1,83 2,74

T30A TNT 6,35 1,69 2,54

T45A TNT 6,35 1,70 2,55

T47A TNT 6,35 1,69 2,53

T48A TNT 6,36 1,70 2,55

T49A TNT 6,33 1,71 2,56

T50A TNT No peak is detected.

0,00 0,00

T51A TNT 6,58 1,71 2,56

T52A TNT 6,60 1,80 2,71

T53A TNT 6,73 1,70 2,55

T54A TNT 6,57 1,70 2,55

T70A TNT 6,64 1,72 2,58

55

T71A TNT 6,54 1,71 2,56

T74A TNT No peak is detected.

0,00 0,00

T1B TNT No peak is detected.

0,00 0,00

T2B TNT 6,71 1,72 2,57

T3B TNT 6,74 1,71 2,56

T4B TNT 6,74 1,70 2,55

T25B TNT 6,75 1,71 2,56

T26B TNT 6,75 1,82 2,73

T0 TNT 6,74 96,27 144,41

T29B TNT 6,75 2,74 4,11

T30B TNT 6,76 1,71 2,57

T45B TNT 6,76 1,71 2,57

T65B TNT 6,45 1,71 2,56

T84B TNT No peak is detected.

0,00 0,00

T87B TNT No peak is detected.

0,00 0,00

T88B TNT No peak is detected.

0,00 0,00

T90B TNT No peak is detected.

0,00 0,00

T91B TNT No peak is detected.

0,00 0,00

T92B TNT No peak is detected.

0,00 0,00

T110B TNT No peak is detected.

0,00 0,00

T111B TNT No peak is detected.

0,00 0,00

T54 TNT No peak is detected.

0,00 0,00

T66 TNT No peak is detected.

0,00 0,00

T67 TNT No peak is detected.

0,00 0,00

T4B.2 TNT No peak is detected.

0,00 0,00

T24B TNT No peak is detected.

0,00 0,00

T65A TNT No peak is detected.

0,00 0,00

T68 TNT No peak is detected.

0,00 0,00

T109 TNT No peak is 0,00 0,00

T69 TNT No peak is 0,00 0,00

T110 TNT No peak is 0,00 0,00

T112 TNT No peak is 0,00 0,00

Autor. Adaptación por las autoras.

Fuente. Equipo HPLC de la Pontificia Universidad Javeriana.

56

De los setenta y ocho aislamientos se evidencio una mayor capacidad de

degradación en veinticuatro, los cuales registraron lecturas en la concentración

cero del explosivo TNT, de estos se escogieron al azar cinco aislamientos

bacterianos como se presentan en la tabla 11.

57

Tabla 11. Aislamientos bacterianos con mayor capacidad de degradación del TNT seleccionados al azar.

Muestra Tratamiento Aislamiento Color Textura Tamaño Elevación Forma Borde

3. Canal exterior

T2 +10-5 T54 Amarillo Cremosa Grande Convexa Circular Redondo

11.Fitorremediacion

T2 +10-5 T88 Café Dura Mediana Plana Irregular Ondulado

11.Fitorremediacion

T2 +10-5 T87 Blanco Dura Mediana Plana Irregular Ondulado

11.Fitorremediacion

T2 +10-5 T92 Blanco Mucosa Pequeña Convexa Irregular Ondulado

6.Tanque de transporte

T2+10-6 T109 Naranja Viscosa Pequeña Convexa Irregular Ondulado

Fuente: las autoras

58

2.1.7 Bioensayo.

Con los cinco aislamientos bacterianos seleccionados que poseían mayor

capacidad de degradación se realizo el bioensayo. Para esto es importante

determinar las siguientes condiciones: tiempos de retención, concentración del

explosivo, componentes del agua residual sintética, unidades experimentales y

densidad óptica de los Inóculo.

Para el tiempo de retención se estimo un periodo de cuatro días19, los cuales se

les asigno una nomenclatura especifica con mediciones cada veinte cuatro horas

±1, la concentración del explosivo fue de 100 mg/L, se trabajaron cinco unidades

experimentales con un control. Estas unidades se trabajaron por triplicado (n=3)

para un total de 18 unidades experimentales. Para determinar la concentración de

los inóculos en los bioensayos, se hizo necesario hacer una escala de Mac

Farland (Ver Anexo D), la cual fue comparada con los aislamientos bacterianos

inoculados en 10 mL de medio mineral líquido después de cinco días en agitación

a 75 rpm y a temperatura ambiente en shaker. El valor obtenido en esta

comparación fue igual al tubo 3 es decir que contenía 9.0X108 u.f.c/ml. Para el

bioensayo se trabajo con agua residual sintética (ARS), que contiene los

siguientes componentes:

Tabla 12. Componentes agua residual sintética

19

Este periodo de tiempo fue estipulado de acuerdo a la disponibilidad de material y utilización del equipo HPLC. 20 Remoción Biológica De Materia Orgánica, Nitrógeno Y Fósforo en un Sistema Tipo anaerobio-Anóxico-Aerobio Revista

EIA, ISSN 1794-1237 Número 10, p. 45-53.

Material Cantidad Unidades

Suero de leche 0,326 mg/L

Sucrosa 0,49 mg/L

Fosfato ácido

de potasio

0,45 mg/L

Urea 2,4 mg/L

Acetato de sodio 1,12 mg/L

Fuente. Escuela de Ingeniería de Antioquia, Medellín (Colombia)20

59

Las cinco cepas son inoculas por separado en el ARS en tubos de ensayo de 10

mL; las proporciones para cada tubo fueron 5mL de ARS, 0.125 mL de explosivo y

de inoculo 5 mL de inoculo.

Para determinar las concentraciones iniciales del explosivo en el bioensayo se

realizo una primera medición donde el ARS no contenía inoculo del aislamiento

bacteriano. Seguido de esto se inoculo el aislamiento bacteriano en el ARS,

incubando a 25°C±1 por un periodo de 24 horas, después de este periodo de

tiempo se realizaron las siguientes mediciones. Las mediciones para el bioensayo

se hicieron con el mismo método de filtración antes mencionado, estos se llevaron

al HPLC con las condiciones antes mencionadas de corrida.

La curva de calibración (Anexo E) reporto un factor de correlación (r2) de 0.9936

indicando la estrecha relación entre los valores del eje X y el eje Y, que se ve

representado en la distribución lineal de la curva y por ende el comportamiento

normal de los datos.

La tabla 13 muestra los resultados obtenidos por HPLC y los porcentajes de

remoción para cada uno de los aislamientos bacterianos tanto en las

concentraciones iniciales, como en la variación con respecto al tiempo, este último

se hizo con el fin de obtener la representatividad en cuanto a la degradación por

periodo de tiempo y comportamiento individual de los aislamientos bacteriano

(porcentaje de remoción acumulado).

f(x)=2.26479e-005*x+11.1662

Rr1=0.9968314 Rr2=0.9936729

60

Tabla 13. Resultados medición por HPLC del bioensayo.

Tiempo (días)

Muestra Tiempo de retención

(min)

Concentración del explosivo

(ppm)

Concentración Final (ppm)

Porcentaje de

remoción

Porcentaje de

remoción acumulado

Patrón 100mg/l 7,47 93.50 N/A

Control

t1 7,47 50,1 75,15

t2 7,47 53,05 79,575

t3 7,47 51,42 77,13

t0

T54A2 7,47 60,05

T54A.1 7,47 77,15 83,5

T54A 7,47 29,8

t1

T54B2 7,46 52,58

T54B1 7,47 51,77 74,76 10,47 10,47

T54B 7,47 45,162

t2

T54C 7,47 42,72

T54C1 7,46 42,08 62,46 25,19 16,45

T54C2 7,46 40,12

t3

T54D 7,47 38,54

T54D1 7,46 36,96 54,43 34,81 12,86

T54D2 7,47 33,36

Patrón 100mg/l 7 103.48

t0

T109.A 7 59,75

T109.A1 7,11 56,62 86,85

T109.A.2 7 57,34

t1

T109.B 7 53,83

T109.B1 7,11 52,79 79,54 8,42 8,42

T109.B2 7,12 52,47

t2

T109.C 7,11 43,56

T109.C1 7,11 52,14 78,7 9,38 1,06

T109.C2 7,11 52,79

t3

T109.D 7,12 41,17

T109.2D 7,12 28,34 52,83 39,17 32,87

T109.2 7,11 36,15

t0

T87A 6,9 42,13

T87A1 6,9 42,4 63,79

T87.A2 6,9 43,05

t1

T87.B2 6,9 42,6

T87.B1 6,9 39,13 60,01 5,92 5,93

61

T87.B 6,9 38,31

t2

T87.C 6,9 31,84

T87.C1 6,9 34,14 47,76 25,12 20,41

T87.C2 6,9 29,53

t3

T87D2 6,9 28,13

T87.D1 6,9 28,83 41,05 35,6 14,05

T87.D 6,9 25,16

t0

T92.A 6,9 39,605

T92.A1 6,9 35,41 55,08

T92.A2 6,9 35,14

t1

T92.B 6,9 35,21

T92B1 6,9 32,63 50,67 8,01 8,01

T92B2 6,9 33,51

t2

T92C 6,9 30,51

T92.C1 6,9 30,25 44,74 18,77 11,70

T92.C2 6,9 28,73

t3

T92.1D 6,9 26,28

T92.D 6,9 26,94 39,45 28,37 11,82

T92.D2 6,9 25,69

t0

T88A2 6,9 45,9

T88.A1 6,9 49,61 67,56

T88A 6,9 39,6

t1

T88.B1 6,8 38,75

T88.B 6,9 36,16 53 21 21,07

T88.B2 6,8 31,75

t2

T88.C 6,9 29,92

T88.C2 6,8 30,51 45,36 32,85 14,94

T88.C2 6,9 30,3

t3

T88.D 6,9 28,05

T88.D1 6,9 27,08 41,46 38,63 8,60

T88.D2 6,9 27,24

Fuente. Las autoras .Equipo HPLC de la Pontificia Universidad Javeriana.

Los datos de cada uno de los triplicados del ensayo con las bacterias aisladas se

promediaron para obtener las concentraciones finales a través de los tiempos

establecidos y se multiplican por el factor 1.5 ya que hubo una dilución en

acetonitrilo 0,5mL y ARS 1mL.

62

2.1.8 Análisis estadístico.

El bioensayo tuvo como propósito determinar el porcentaje de remoción en

agua residual sintética mediante los aislamientos bacterianos seleccionados, a

través de un tiempo pre establecido. Para ello se eligió un periodo de cuatro días,

haciendo mediciones cada veinticuatro horas por HPLC. Para esto se aplico un

diseño por bloques para determinar el efecto que tiene el tiempo (pre–establecido)

y las cepas aisladas sobre la remoción del explosivo TNT.

2.1.8.1 Modelo.

El número de unidades experimentales para cada bloque coincide con el número

de tratamientos, en este caso el boque es el tiempo y el tratamiento es el

aislamiento bacteriano.

Yij = μ + αi + βj + εij

Donde:

Yij: Porcentaje de remoción.

μ: Es el porcentaje de remoción que se espera.

αi: Período de tiempo utilizado en el bioensayo.

Βj: Aislamiento bacteriano utilizado en cada bioensayo.

εij: Error estándar.

Tabla 14.Porcentajes de remoción a través del tiempo, por cada aislamiento bacteriano.

Tiempo(días) T54 T109 T87 T88 T92

t1 10% 8% 5% 21% 8%

t2 16% 1% 20% 15% 1%

t3 13% 33% 14% 8% 32%

Fuente: Las autoras

63

2.1.8.2 Hipótesis

Ho: El tiempo y el aislamiento bacteriano no tienen efecto sobre el porcentaje de

remoción.

μ + tiempo + cepa =0

Ha: El tiempo y el aislamiento bacteriano tienen efecto sobre el porcentaje de

remoción.

μ + tiempo + cepa ≠0

Se obtiene una tabla ANOVA

Tabla 15.Análisis de varianza.

ANOVA

Tabla 16.Resultados del análisis de varianza.

Variables Hipótesis P valor

Tiempo αi =0 vs αi ≠ 0 0.36

Aislamiento Βj =0 vs Βj ≠0 1.00

Yij = μ + αi + βj + εij

ANÁLISIS DE VARIANZA

Origen de las

variaciones

Suma de cuadrados

Grados de libertad

Promedio de los

cuadrados

F Probabilidad Valor crítico para F

Tiempo 0,02917142 2 0,01458571 1,15401791 36% 4,458970108

Bacteria 0,00058638 4 0,0001466 0,01159862 100% 3,837853355

Error 0,10111253 8 0,01263907

Total 0,13087033 14

0 0

Fuente: Las autoras

64

Los resultados obtenidos tabla 16 (análisis de varianza), nos indican que tanto el

tiempo utilizado para el bioensayo 4 días, como los cinco aislamientos

bacterianos no tienen efecto en la remoción esperada del explosivo TNT.

Frente a la hipótesis planteada anteriormente el p valor dio mayor del 0.5 en el

tiempo y en los aislamientos bacterianos lo que indica que estas dos variables no

tienen representatividad; aunque se haya presentado un porcentaje de remoción

por los aislamientos bacterianos, mostrando un comportamiento homogéneo de la

degradación a través del tiempo.

65

3. Análisis de resultados

Los aislamientos bacterianos en las muestras tuvieron la capacidad de crecer a un

pH neutro, ya sea por tolerancia o adaptación debido a la regulación de su pH

citoplasmático que es cercano a 7, indicando que estas bacterias no son acidofilas

o alcalofilas obligadas.

De las siembras realizadas al pre- enriquecimiento se obtuvieron setenta y ocho

aislamientos bacterianos las cuales presentaron una amplia gama morfo- típica.

En algunos de los medios de cultivo incubados a 21° C presentaron una

coloración naranja indicando la presencia del complejo Meisenheimer (Ver

ilustración 2), a partir de lo anterior se puede deducir que las bacterias emplearon

este vía de degradación.

Se pudo observar que en el tratamiento T2 se presentó un mayor porcentaje

(54%) de crecimiento bacteriano, esto quiere decir que las bacterias aisladas

tomaron la fuente de carbono como su fuente de energía y la fuente de nitrógeno

la tomaron del explosivo.

Los sitios de muestreo de donde se aislaron 3 de las 5 bacterias con mayor

capacidad de degradación del TNT, se caracterizan por estar directamente

involucrados con algún tratamiento biológico como es el punto de muestreo de

fitorremediación, donde las bacterias están adheridas a las raíces siendo allí

donde se presenta la degradación enzimática del TNT por los bacterios21; se

aislaron las bacterias T87, T88, T92,con las cuales se trabajo en el bioensayo; lo

que nos muestra que estos aislamiento bacterianos presenten una adaptación a

este tipo de degradación biológica.

En la primera medición (cero) se encontró que los valores iniciales de la

concentración del explosivo no eran iguales, como se muestra en la Tabla 14 esto

se debe a que posiblemente se presento una pérdida de TNT por adsorción en el

21

Revista científica Ozono 21. 31 de Julio de 2009. http://ozono21.blogcindario.com/2009/07/00198

66

plástico y en el vidrio de los elementos de laboratorio utilizados, como los tubos

falcon, tubos de ensayo, tubos eppendorf, etc.

Otra razón por la cual se pudo presentar variabilidad en las concentraciones

iniciales del explosivo, puede obedecer a que el TNT, se retenga en el filtro de

nylon utilizado durante las filtraciones.

Tabla 17. Concentraciones de TNT en bioensayo

Tiempo(días) T54 T109 T87 T88 T92

t0 83.50 ppm 86.85 ppm 63.79ppm 67.56ppm 55.08ppm

t1 74.76 ppm 79.54ppm 60.01ppm 53.325ppm 50.67ppm

t2 62.46 ppm 78.70ppm 47.76ppm 45.36ppm 44.74ppm

t3 54.43 ppm 52.83ppm 41.05ppm 41.46ppm 39.45ppm

Fuente: las autoras

30

40

50

60

70

80

90

T0 T1 T2 T3

Co

nc

en

tra

ció

n (

pp

m)

Tiempo (Min)

Concentración /Tiempo

T54

T109

T87

T88

T92

Fuente. Las Autoras.

Grafica 2. Comportamiento de la concentración del TNT en el tiempo.

67

Aunque el valor final de la concentración del explosivo TNT, no fue representativo

con referencia a los valores iniciales, se puede observar que la concentración del

explosivo disminuye a través del tiempo (grafica 2).

Tabla 18.Resultados Bioensayo en porcentajes de remoción de TNT.

Tiempo(días)

T54 T109 T87 T88 T92

t1 10% 8% 5% 21% 8%

t2 16% 1% 20% 15% 1%

t3 13% 33% 14% 8% 32%

Fuente. Las autoras.

Los porcentajes de reducción encontrados en los aislamientos después de un

periodo de cuatro días oscilan en un rango de 83 % y 32 %, lo que indica que

estos aislamientos poseen una capacidad para reducir los grupos nitro y de esta

manera degradar el TNT.

Para este bioensayo se parte de una curva patrón 100 ppm, la cual sirve de

referencia para comparar los picos de concentración obtenidos después de correr

las muestras del bioensayo.

A continuación se presenta los cromatogramas obtenidos del aislamiento

bacteriano T109, indicando para cada uno los tiempos de retención y las

concentraciones de explosivo parciales.

68

Ilustración 10.Cromatograma curva patrón 100mg/L.

Explosivo: TNT.

Tiempo de retención: 6.64 min.

Concentración :103.56 mg/L

Ilustración 11.Cromatograma aislamiento T109. Tiempo 0

Explosivo: TNT.

Tiempo de retención: 6.989min.

Concentración :59.75mg/L

69

Ilustración 12.Cromatograma aislamiento T109, tiempo3.

Explosivo: TNT.

Tiempo de retención: 6.989min.

Concentración :40.7mg/L

Se obtuvo los picos de concentración, evidenciando una disminución en la

concentración con respecto al patrón de 100mg/l, encontrándose una

concentración en el tiempo final (t3) de 33.36 mg/L.

Los cromatogramas presentaron, colas y solapamientos esto puede deberse a las

sustancias detectadas y los metabolitos resultado del proceso de degradación del

TNT.

70

4. CONCLUSIONES

Las condiciones fisicoquímicas establecidas para el crecimiento bacteriano

en los medios minerales, favorecieron la bioaumentación, tanto en el pre-

enriquecimiento como en las siembras y replicas de los aislamientos.

Los valores de pH muestran un rango muy amplio entre 2.11 – 8.95 lo que

nos indica que las muestras tomadas tienen variedad de ambientes

dependiendo de la línea de producción del explosivo y de los procesos

físicos y biológicos que se llevan a cabo en cada punto donde fue tomada

la muestra.

De los tratamientos evaluados T1, T2 y T3, se considera el mejor de ellos

es el tratamiento T2 ya que los aislamientos bacterianos presentaron un

mayor porcentaje (54%) de crecimiento bacteriano en la fuente de carbono

más explosivo.

Se obtuvieron setenta y ocho aislamientos procedentes de las muestras

tomadas, de los cuales veinticuatro presentaron una posible degradación

del explosivo. Obteniendo concentraciones de TNT con valores de cero en

los análisis realizados en HPLC.

Los análisis realizados en HPLC se presentaron picos que no

corresponden al explosivo, lo que puede indicar la presencia de otras

sustancias o metabolitos producto de la degradación del explosivo 2, 4,6

trinitrotolueno, por los aislamientos bacterianos.

Los resultados obtenidos demuestran que los aislamientos bacterianos

seleccionados poseen una capacidad degradadora del 35 % en promedio,

en un periodo de tiempo de 4 días, en condiciones de laboratorio.

71

5. RECOMENDACIONES

El bajo porcentaje de remoción del explosivo en el bioensayo, se debe

principalmente al tiempo de retención del aislamiento bacteriano en el agua

residual sintética, por lo que se sugiere que estos bioensayos superen un

tiempo de 30 días, para corroborar si el porcentaje de remoción del

explosivo, sigue disminuyendo de manera considerable.

Es necesario estandarizar la extracción y filtración de los bioensayos para

evitar la pérdida de explosivo por la variabilidad de recipientes utilizados

para dichos procedimientos, ya que esto altera los tiempos de retención de

la muestra y por consiguiente los datos obtenidos por el equipo.

Se recomienda tener en cuenta los diez y nueve aislamientos bacterianos

que presentaron concentración cero de explosivo, ya que estos

posiblemente poseen un potencial para la degradación del 2,4,6

TRINITROTOLUENO.

72

6. BIBIOGRAFIA

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76

ANEXOS.

77

ANEXO A. CROMATOGRAMAS AISLAMIENTOS ESCOGIDOS AL AZAR

Cromatograma. 1. 100 mg/l

Cromatograma. 2. Cero.

Cromatograma. 3 Patrón

Cromatograma. 4 T54

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 min

0

250

500mAU

254nm,4nm (1.00)

/1.7

03

/1.8

10

/3.2

04 /3

.407

/4.2

66

/4.4

87

/4.8

94

/5.3

55

/6.1

80

tnt/

6.7

12

/7.3

52

/8.5

01

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 min

0

25

50

mAU254nm,4nm (1.00)

/2.7

81

/3.4

19

/4.1

11

/4.9

60

tnt/

6.3

36

/8.3

35

/8.8

60

/10.8

74

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 min

0

250

500mAU

254nm,4nm (1.00)

/1.6

35

/1.7

45

/1.9

38

/2.1

01

/2.2

96

/3.4

11

/4.3

27

/4.9

37

tnt/

6.3

47

/6.9

65

/7.6

37

/8.2

13

/8.8

41

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 min

0

1

2

mAU254nm,4nm (1.00)

/0.4

27

/0.8

83

/2.9

21

/4.4

79

tnt/

6.5

74

/8.7

43

/9.0

20

/9.9

71

78

Cromatograma. 5 T87

Cromatograma. 6 T88

Cromatograma. 7 T92

Cromatograma. 8. T 109

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 min

0

1

2

3

mAU254nm,4nm (1.00)

/2.9

10

/3.4

12

/3.5

41

/3.9

89

/4.3

14

/4.7

01

/5.1

13

/6.2

15

/8.1

03

/8.5

28

/9.4

49

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 min

0

1

2

mAU254nm,4nm (1.00)

/1.4

26

/2.9

00

/3.3

95

/4.0

75

/5.1

31

/5.7

27

/6.2

60

/8.1

39

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 min

0

1

2

mAU254nm,4nm (1.00)

/2.9

38

/3.3

87

/4.4

87

/6.2

41

/8.1

46

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 min

0.0

2.5

5.0

mAU254nm,4nm (1.00)

/2.7

16

/2.8

05

/3.0

83

/3.3

85

/6.2

30

/8.1

32

79

ANEXO B. CROMATOGRAMAS BIOENSAYO

Cromatograma. 9. T54 para el tiempo 0

Cromatograma. 10 T54para el Tiempo 1

5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 min

-25

0

25

50

75

100

125

150

175

200

225

mAU210nm,4nm (1.00)

/0.0

00

/0.0

00

/0.0

00

tnt/6

0.05

2

/0.0

00

5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 min

-20

-10

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

120

130

140

150

160mAU

210nm,4nm (1.00)

TN

T/5

2.58

7

80

Cromatograma. 11. T54 tiempo 2

Cromatograma. 12.T 54 tiempo 3.

4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 10.5 min

-20

-10

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

120

130

140

150

160

170

mAU210nm,4nm (1.00)

/0.0

00

/0.0

00

/0.0

00

/0.0

00

tnt/4

2.08

5

2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 min

-10

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

120

130

140

150

160

170

180

mAU210nm,4nm (1.00)

/0.0

00

/0.0

00

/0.0

00

/0.0

00

/0.0

00

/0.0

00

/0.0

00

/0.0

00

/0.0

00

tnt/3

3.36

6

81

Cromatograma. 13 T109, tiempo 1.

Cromatograma. 14 T109.tiempo 2.

1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 min

-10

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

120

mAU210nm,4nm (1.00)

/0.0

00

/0.0

00

/0.0

00

TN

T/5

9.7

57

1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 min

-20

-10

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

120

130

140

mAU210nm,4nm (1.00)

/0.0

00

/0.0

00

/0.0

00

/0.0

00

TN

T/5

2.7

92

PE

TN

/2.0

25

82

Cromatograma. 15 T109 tiempo 2.

Cromatograma. 16 T109 tiempo 3

1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 min

-10

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

mAU210nm,4nm (1.00)

/0.0

00

/0.0

00/0

.000

/0.0

00/0

.000

TN

T/4

3.56

7

PE

TN

/2.4

92

1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 min

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

120

mAU210nm,4nm (1.00)

/0.0

00

/0.0

00

/0.0

00

/0.0

00 /0.0

00

TN

T/4

1.17

4

83

Cromatograma. 17 T87tiempo 0.

Cromatograma. 18 T87 tiempo 1.

1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 min

-10

-5

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

100mAU

210nm,4nm (1.00)

/0.0

00

/0.0

00/0

.000

TN

T/4

2.13

7

1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 min

-5

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

mAU210nm,4nm (1.00)

/0.0

00

/0.0

00

/0.0

00

/0.0

00

TN

T/3

8.31

7

84

Cromatograma. 19 T87.tiempo 2.

Cromatograma. 20 T87.tiempo 3.

2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 min

-10

-5

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75mAU

210nm,4nm (1.00)

/0.0

00

/0.0

00/0

.000

/0.0

00

/0.0

00

TNT/

31.8

46

1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 min

-5

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

mAU210nm,4nm (1.00)

/0.0

00

/0.0

00

/0.0

00

/0.0

00

/0.0

00

/0.0

00

TN

T/2

5.1

67

PE

TN

/23.

781

85

Cromatograma. 21 T92.tiempo 0.

Cromatograma. 22 T92 tiempo1.

2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 min

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

mAU210nm,4nm (1.00)

/0.0

00

/0.0

00

/0.0

00

/0.0

00

TN

T/3

5.4

12

1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 min

-5

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

mAU210nm,4nm (1.00)

/0.0

00

/0.0

00

/0.0

00

/0.0

00

TN

T/3

2.6

31

/0.0

00

PE

TN

/8.9

80

86

Cromatograma. 23 T92.tiempo 1.

Cromatograma. 24 T92.tiempo3.

1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 min

-10

-5

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

90

95

mAU210nm,4nm (1.00)

/0.0

00

/0.0

00

/0.0

00

/0.0

00

TN

T/2

8.73

7

/0.0

00

0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 13.0 14.0 min

-10

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

110

120

mAU210nm,4nm (1.00)

/0.0

00

/0.0

00

/0.0

00

/0.0

00

/0.0

00

/0.0

00

TN

T/2

5.6

95

/0.0

00

87

Cromatograma. 25 T88 tiempo 0.

Cromatograma. 26 T88 tiempo1.

1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 min

-5

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

85

mAU210nm,4nm (1.00)

/0.0

00

/0.0

00

/0.0

00

/0.0

00

/0.0

00

/0.0

00

TN

T/3

9.60

5

/0.0

00

1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 12.0 min

-5

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

75

80

mAU210nm,4nm (1.00)

/0.0

00

/0.0

00

/0.0

00

/0.0

00

/0.0

00

/0.0

00

/0.0

00

/0.0

00

TN

T/3

6.16

3

/0.0

00

PE

TN

/1.6

13

88

Cromatograma. 27 T88 teimpo2.

Cromatograma. 28 T88 tiempo3.

2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 min

-5

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

70

mAU210nm,4nm (1.00)

/0.0

00

/0.0

00

/0.0

00

/0.0

00

/0.0

00

TN

T/2

9.92

5

/0.0

00

1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 min

-5

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

mAU210nm,4nm (1.00)

/0.0

00

/0.0

00

/0.0

00

/0.0

00

/0.0

00

TN

T/2

8.0

55

/0.0

00

89

ANEXO C.PROTOCOLOS DE

LABORATORIO.

90

ANEXO D.CURVA DE CALIBRACION

PARA LAS LECTURAS DE HPLC.

91

ANEXO D. ESCALA DE MAC FRALAND

Fuente: http://perso.wanadoo.es/microdominguez/c.htm

TUBO Cl2Ba 1% SO4H2 1% u.f.c/ml

1 0,1 9,9 3,0x108

2 0,2 9,8 6,0x108

3 0,3 9,7 9,0x108

4 0,4 9,6 1,2x109

5 0,5 9,5 1,5x109

6 0,6 9,4 1,8x109

7 0,7 9,3 2,1x109

8 0,8 9,2 2,4x109

9 0,9 9,1 2.7x109

10 1,0 9,0 3,0x109

92

ANEXO E.CROMATOGRAMAS

CORRESPONDIENTES AL BIOENSAYO.

Cromatograma: curva patrón de 100 ppm.

Cromatograma: aislamiento T 54 para el tiempo 0.

Cromatograma: aislamiento T 54 para el tiempo 3.

Cromatograma: aislamiento T 87 para el tiempo 0.

Cromatograma: aislamiento T87 para el tiempo 3.

Cromatograma: aislamiento T 88 para el tiempo 0.

Cromatograma: aislamiento T88 para el tiempo 3.

Cromatograma: aislamiento T 92 para el tiempo 0.

Cromatograma: aislamiento T92 para el tiempo 3.

Cromatograma: aislamiento T109 para el tiempo 0.

Cromatograma: aislamiento T109 para el tiempo 3.

93

ANEXO F.REGISTRO FOTOGRAFICO

94

Extracción de las muestras en los doce puntos designados

1. Afluente caja de cristalización 2.Canal de recepción exterior.

Fuente. Grupo de investigación. Fuente. Grupo de investigación.

3. Caja de recepción taller multiplicadores 4. Canal recepción

Fuente. Grupo de investigación. Fuente. Grupo de investigación.

5. Caneca 6.Tanque transporte

Fuente. Grupo de investigación. Fuente. Grupo de investigación.

95

7. Caja de captación

Muestras empacadas de los doce

puntos de muestreo. Explosivos

Fuente. Grupo de investigación.

96

ACTIVIDADES REALIZADAS EN EL LABORATORIO

ELABORACIÓN PRE-ENRIQUECIMIENTO

Fuente. Grupo de investigación. Fuente. Grupo de investigación.

Fuente. Grupo de investigación. Fuente. Grupo de investigación.

MONITOREO SIEMBRA AISLAMEINTOS BACTERIANOS

Fuente. Grupo de investigación. Fuente. Grupo de investigación.

97

Fuente. Grupo de investigación. Fuente. Grupo de investigación.

Medio de cultivo liquido Caja de petri sembrada

Fuente. Grupo de investigación.

MEDIOS DE CULTIVO SEMBRADOS Siembre Cajas de petri Siembra Bacterias

98

AISLAMIENTOS BACTERIANOS Diversos morfo tipos encontrados

Muestras 1. Tratamiento 2

99

Cajas de petri siembra

100