“reconocimiento de contaminaciÓn microbiolÓgica en

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA

“RECONOCIMIENTO DE CONTAMINACIÓN MICROBIOLÓGICA

EN FERMENTADORES DE 50, 70, 90 Y 190 m³”

TESINA DE LA OPCIÓN CURRICULAR EN LA

MODALIDAD DE:

ESTANCIA INDUSTRIAL

QUE PARA OBTENER EL TÍTULO DE

INGENIERO FARMACÉUTICO

PRESENTA:

VELASCO ALCÁNTARA RAFAEL ELÍAS

ASESORES: ING. RODOLFO MARTÍNEZ RAMOS

BIÓLOGO ROBERTO GUTIÉRREZ

EVALUADORES: ING. LINALOE LOBATO AZUCENO

DR. EN C. CARLOS OROZCO ÁLVAREZ

México, D. F. Mayo de 2010

“RECONOCIMIENTO DE CONTAMINACIÓN MICROBIOLÓGICA

EN FERMENTADORES DE 50, 70, 90 Y 190m³”

BIOLOGO GUTIÉRREZ ROBERTO, ING. MARTÍNEZ RAMOS RODOLFO, VELASCO ALCÁNTARA RAFAEL ELÍAS*

Calle Reforma 873, Colonia San Nicolás Tolentino, México, D.F. C.P. 09850, Delegación Iztapalapa. Teléfono 56561644, e-mail [email protected]

Área Temática: Bioprocesos

Palabras clave: bioproceso, biorreactor, contaminación microbiológica, pruebas de esterilidad

Introducción. FERMIC S. A. DE C. V. es una empresa privada que inició operaciones en la Ciudad de México en el año de 1968, en su inicio se dedicó a la fabricación de antibióticos como una planta de mono-producto (tetraciclina). En la actualidad produce varios productos, por medio de fermentaciones en biorreactores2.

En los procesos de fermentación un problema muy común, es la presencia de contaminación microbiana, esta puede ser debida a múltiples causas como por ejemplo deterioro natural del equipo, o características ambientales1. En Fermic se realizan pruebas diariamente para poder asegurar la calidad del producto, una productividad satisfactoria y favorable crecimiento del microorganismo. Estas pruebas son conocidas como “pruebas de esterilidad”.

Metodología. Cada pruebas de esterilidad se dividen en cuatro etapas: etapa a) en esta etapa se realizaron los medios de cultivo y se esterilizaron tubos, con forme a un proceso normalizado, para no tener una contaminación, etapa b) aquí se etiquetaron los tubos estériles que se llevaron al área de fermentación para tomar las muestras de los biorreactores, etapa c) después se realizó una siembra con el caldo fermentado (muestras) en los medios de cultivo y se llevaron a la incubadora para que finalmente, etapa d) transcurridas 24 horas, se realizó las lecturas de los medios, de manera directa o al microscopio.

Resultados y discusión. Se muestreó durante 96 días y se realizaron 683 pruebas en total, de los 15 biorreactores a nivel industrial de la planta. A las 3 semanas la técnica se había detallado, para obtener resultados confiables en este análisis.

En los casos en que se detecto un microorganismo contaminante, la decisión de que acciones realizar, se toma considerando múltiples factores, por ejemplo:

El producto con el que se está trabajando y el posible impacto del contaminante sobre la calidad del producto. Con esto se desarrolló un plan de acciones a tomar, para evitar contaminaciones en el futuro, que incluyó actividades de mantenimiento y revisión preventiva.

Las principales causas de contaminación de los biorreactores pueden agruparse en técnicas y humanas. Las técnicas se asocian con desgaste o fallas del equipo como roturas. Y las humanas, por el personal, que se corrigen con capacitación y entrenamiento.

Conclusiones.

Se desarrolló un seguimiento detallado, para la realización de las pruebas de esterilidad con base a los procedimientos de la empresa y a la práctica diaria en su realización.

La realización de las pruebas de esterilidad confiables y a tiempo, ayuda a mejorar los procesos de producción de los fermentadores.

Cuando un tanque está contaminado, se deben de tomar medidas inmediatas, que pueden ir desde un control más estricto del proceso, hasta drenado del tanque.

Cuando los tanques fermentadores, presentan contaminación se debe de realizar de inmediato las acciones preventivas según el proceso normalizado de operación.

Referencias.

1. Collins, C; Lyne Patricia. 1989. Microbiological Methods. Sixth edition. USA: Burtterworth-Heinemann.

2. Tecnología FERMIC. 3. Ordaz, L; Orozco, C. 1998. Ingeniería de

Fermentaciones. UPIBI.

DEDICATORIA

Yo Rafael Elías Velasco Alcántara quiero dedicar este trabajo, a Dios padre, porque solo él sabe, todo lo que he logrado a base de esfuerzos y dedicación, pero sobre todo, por darme una familia maravillosa.

Me gustaría dedicar esta Tesina a toda mi familia y personas que siempre confiaron en mí. Para mi madre Maribel Alcántara, por su comprensión y ayuda en momentos malos y no tan malos. Me ha enseñado, a encarar las adversidades sin perder nunca la dignidad, ni desfallecer en el intento. Me ha dado todo lo que soy como persona, mis valores, mis principios, mi perseverancia y mi empeño, y todo ello con una gran dosis de amor y sin pedir nunca nada a cambio. A esa persona tan especial para mí, mi padre Elías Velasco, que siempre me está cuidando desde allá arriba, porque él me enseño, que “siempre hay que pensar las cosas, antes de hacerlas”, para no cometer tantos errores.

Y no puedo irme sin antes decirles a todas aquellas personas tan especiales para mí, que sin ustedes a mi lado, no lo hubiera logrado. Les agradezco a todos ustedes el compartir momentos agradables y momentos tristes, porque esos momentos son los que nos hacen crecer y valorar a las personas que nos rodean.

Detrás de cada línea de llegada, hay una de partida. Detrás de cada logro, hay otro desafío.

Si extrañas lo que hacías, vuelve a hacerlo. Sigue aunque todos esperen que abandones.

No dejes que se oxide el hierro que hay en ti.

AGRA

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INGENIERÍA FARMACÉUTICA

FERMIC: Laboratorio de Control Proceso Página I

UÍNDICE

1.‐INTRODUCCIÓN 1 1.1.‐Descripción de la empresa 1 1.1.1.‐Breve historia de la compañía 1 1.1.2.‐Misión 3 1.1.3.‐Visión de la empresa 3 1.1.4.‐Objetivo de la empresa 3 1.1.6.‐Organigrama de FERMIC 4 1.2.‐Bioproceso 5 1.2.1.‐Características de un bioproceso 6 1.2.2.‐Fermentación concepto básico 7 1.2.3.‐Clasificación de microorganismos 9 1.2.4.‐Esterilización 10 1.2.5.‐Formas de sembrado y manejo de inóculo 14 1.2.6.‐Crecimiento microbiano 15 1.2.7.‐Descripción de los fermentadores o biorreactores 16 1.2.8.‐Clasificación de los biorreactores 18 1.2.9.‐Escalamiento de un bioproceso 20

2.‐JUSTIFICACIÓN 23

3.‐OBJETIVOS 24 3.1.‐Generales 24 3.2.‐ Particulares 24

4.‐METODOLOGÍA 24 4.1.‐ Medios de cultivo y tubos estériles 25 4.2.‐ Toma de muestras 29 4.3.‐ Siembra e incubación 31 4.4. ‐ Lectura de contaminación de los tubos 32

5. ‐ RESULTADOS 33

6.‐ ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS 39

7. – CONCLUSIÓN 44

8. ‐ SUGERENCIAS PARA FUTURAS ESTANCIAS 45

9. – BIBLIOGRAFÍA 46

10.‐ANEXOS 47


FERMIC: Laboratorio de Control Proceso Página II

UÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1.‐ Ubicación de la empresa 2

Figura 2.‐ Organigrama de la empresa 4

Figura 3.‐ Cuadro sinóptico de un bioproceso 6

Figura 4.‐ Cuadro sinóptico de las características de un bioproceso 7

Figura 5.‐ Ejemplo de un diagrama de flujo de un bioproceso fermentativo 9

Figura 6.‐ Cuadro sinóptico con los métodos de esterilización 12

Figura 7.‐ Gráfica del ciclo de una esterilización 13

Figura 8.‐ Tipos de estrías en la siembra de microorganismos 14

Figura 9.‐ Consejos para un buen manejo del inóculo 15

Figura 10.‐ Gráfica con la cinética del crecimiento microbiano 15

Figura 11.‐ Cuadro sinóptico del concepto básico de un biorreactor y los tipos 16

Figura 12.‐ Esquema de las partes de un fermentador aerobio agitado 17

Figura 13.‐ Estructura interna de un fermentador a nivel industrial 17

Figura 14.‐ Cuadro sinóptico de los niveles de escalamiento 20

Figura 15.‐ Actividades que se lleve a cabo un proceso de fermentación 20

Figura 16.‐ Etapas principales en el proceso fermentativo 21

Figura 17.‐ Seguimiento para la realización de las pruebas de esterilidad 25

Figura 18.‐ Esquema de las partes del equipo de esterilización 28

Figura 19.‐ Preparación de material para esterilizarse por calor húmedo 29

Figura 20.‐ Equipo utilizado para la esterilización por calor húmedo: “Autoclave” 29

Figura 21.‐ Forma adecuada en la que se debe de tomar la muestra 31

Figura 22.‐ Gráfico comparativo en donde se observa el porcentaje de pruebas 34

Figura 23.‐ Apariencia de los medios de cultivo, cuando acaban de ser inoculados 36

Figura 24.‐ Medio líquido contaminado 36

Figura 25.‐ Medios sólido, que no está contaminado 37


FERMIC: Laboratorio de Control Proceso Página III

UÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1.‐ Datos generales de FERMIC 1

Tabla 2.‐ Productos que se producen en FERMIC 2

Tabla 3.‐ Clasificación de microorganismos de acuerdo a su temperatura de óptimo crecimiento 9

Tabla 4.‐ Relación tiempo‐temperatura para la esterilización de un medio líquido por calor húmedo 11

Tabla 5.‐ Tiempo requerido (a 121 °C) para alcanzar el mismo grado de esterilización en distintos volúmenes de medios de cultivo 11

Tabla 6.‐ Parámetros de esterilización por calor húmedo a nivel del mar 13

Tabla 7.‐ Las principales clasificaciones de un bioproceso 18

Tabla 8.‐ Parámetros comunes en fermentadores a nivel industrial 19

Tabla 9.‐ Actividades que se realizan en cada etapas de todo el proceso de fermentación 22

Tabla 10.‐ Medios de cultivo utilizados para las pruebas 26

Tabla 11.‐ Período de muestreo durante la estancia industrial 33

Tabla 12.‐ Número de pruebas realizadas en total 33

Tabla 13.‐ Incidentes más frecuentes durante el desarrollo de las pruebas 35

Tabla 14.‐ Exactitud de las pruebas de esterilidad 35

Tabla 15.‐ Ventajas y desventajas de las pruebas de esterilidad 40


FERMIC: Laboratorio de Control Proceso Página 1

UFERMIC S. A. DE C. V.

1.‐INTRODUCCIÓN

1.1.‐DESCRIPCIÓN DE LA EMPRESA

1.1.1.‐Breve historia de la compañía

FERMIC S. A. DE C. V. es una empresa privada que inició operaciones en la Ciudad de México en el año de 1968, en su inicio se dedicó a la fabricación de antibióticos como una planta de mono‐producto (tetraciclina) 17.

Tabla 1.‐ Datos generales de FERMIC

Detalles de la empresa Nombre: FERMIC, S.A. DE C.V. Giro: ELAB. DE MEDICAMENTOS Y PRODUCTOS FARMACÉUTICOS Actividad: FABRICACIÓN DE OTROS PRODUCTOS NO CLASIFICADOS EN OTRA

PARTE Página internet: www.fermic.com Teléfono: 56561644 Domicilio: CALLE REFORMA 873 Asentamiento: COLONIA SAN NICOLÁS TOLENTINO C. P.: 09850 Municipio: IZTAPALAPA Estado: DISTRITO FEDERAL

Inicia su producción con una capacidad de fermentación de aproximadamente 60 m³. Actualmente la capacidad de fermentación es cerca de 1600 m³.

17.‐Tecnología FERMIC



Tabla 2.‐ Productos que se producen en FERMIC

TIPO PRODUCTO Antibiótico Sales de Eritromicina

Claritromicina Clavulanato de potasio oral mezclado con Avicel o Syloid

Clavulanato de potasio estéril para inyectables

Agentes Anti hipercolesterolémicos Lovastatina Simvastatina

Maquila : Biocolorantes Astaxantinas Enzimas Varios productos

FERMIC es una empresa aprobada por las autoridades mexicanas (Secretaria de Salud), mediante la licencia sanitaria No. 09 009 01 0002. También es un establecimiento aprobado por la FDA registro de establecimiento No. 3002806980 desde 1974.

Figura 1.- Ubicación de la empresa: en avenida 11 esquina con calle Reforma, a 15 minutos del Vergel, en Iztapalapa20.

20.‐ Hwww.guiaroji.com H



1.1.2.‐Misión de la empresa

FERMIC S.A. de C.V. tiene como misión fundamental, contribuir a mejorar a la salud de las personas y el desarrollo industrial en base a la producción, venta y comercialización de principios activos para la industria farmacéutica y materias primas de interés industrial, logrando esto a través de:

‐Productos resultados de su investigación y desarrollo.

‐Personal capacitado.

‐Tratando de estar siempre a la vanguardia de todas las tareas.

‐Asociándose con otras empresas de clase mundial.

1.1.3.‐Visión de la empresa

Que los productos que fabriquemos, sean la mejor opción en materia prima para la industria farmacéutica y otras áreas industriales, comprometiéndonos con los clientes, proveedores y personal que esté involucrado en nuestro proceso.

1.1.4.‐Objetivo de la empresa

Se considera imprescindible alcanzar los siguientes objetivos.

‐Cumplir los plazos de entrega.

‐Cumplir con las especificaciones del producto.

‐Garantizar que los productos fabricados sean seguros, de tal forma que no presenten contaminación cruzada tanto química o microbiológica que pudieran impactar en la calidad del producto.

‐Disminuir las quejas de los clientes de tal forma que no existan más de dos lotes rechazados por año.



1.1.6.‐Organigrama de FERMIC

El organigrama de la empresa, está basado en las necesidades y en la experiencia que se han generado a lo largo de la trayectoria de la misma, además, existen áreas dedicadas a resolver problemas específicos, en cada etapa de todo el bioproceso, para la obtención de un producto de alta calidad.

Director General Presidente

Administración y Finanzas

Relaciones Industriales

Compras

Director de Planta

Garantía de Calidad

Control de Calidad

Laboratorio de Microbiología

Investigación y Desarrollo

Ingeniería

Proyectos

Ventas

Director de Ventas

Director de Producción

Fermentación Síntesis IISeguridad e Higiene

Laboratorio de Cepas

Piloto

Asuntos Regulatorios y Documentación

Validación

Extracción Síntesis III

Destilación

Almacén

Síntesis I

Síntesis IV

Síntesis VI

Enzimas

Bio‐colorantes

Figura 2.- Organigrama de la empresa



1.2.‐BIOPROCESO

Ahora, como nunca antes, el ser humano tiene en sus manos las herramientas más versátiles para descubrir los misterios de la vida. De esta nueva revolución intelectual emergen nuevas ideas y nuevas esperanzas como: nuevas medicinas, órganos semi‐sintéticos, alimentos nutritivos, organismos degradadores de sustancias nocivas y un amplio panorama de productos industriales y de consumo16.

Uno de estos casos son los productos obtenidos de las fermentaciones, los cuales se generan por medio de microorganismos modificados o altamente seleccionados, con el fin de producir compuestos de interés, como antibióticos, colorantes, enzimas, entre muchos otros, los cuales a nivel industrial son muy caros, dejando ganancias considerables.

Para seguir avanzando, debemos tener en cuenta ciertos principios indispensables para entender lo que es un bioproceso. Estos principios se resumen en 4 puntos:

En primera instancia la biotecnología; es la aplicación intencionada y controlada de agentes biológicos, ya sea microorganismos, células o sus partes, en operaciones tecnológicamente útiles, tanto en la industria manufacturera como en operaciones de servicio.

Así mismo, la bioingeniería; es la aplicación de los conceptos y métodos de las ciencias físicas y matemáticas para resolver problemas en el campo de la biología.

Por otro lado la ingeniería de bioprocesos es útil en la aplicación de los principios de ingeniería para diseñar, desarrollar y analizar procesos industriales, a partir de especificaciones de productos.

Finalmente, la ingeniería bioquímica, en la cual, la aplicación de los principio de ingeniería química se ve reflejada en los sistemas que utilizan biocatalizadores para lograr las transformaciones químicas deseadas.

De las cuatro aplicaciones anteriores, obtenemos lo que es denominado comúnmente un bioproceso: que es cualquier proceso que usa células vivas o sus componentes (enzimas, cloroplastos…) para obtener los cambios físicos o químicos deseados para la obtención de un producto biotecnológico de alta calidad y seguridad.

16.‐Stanier, Roger. Microbiología.1992

18.‐Vázquez Dynora. Apuntes de Síntesis y Análisis de Bioprocesos.2009



BIOPROCESO

Aplicación de las

herramientas de la

ingeniería a la producción de metabolitos producidos por vía

fermentativa.

Biotransformación

Etapa I

Etapa II

Etapa III

MicroorganismoMateria(s) prima(s)Condiciones ambientales

BIORREACTOR

•Productos y subproductos •Residuos de materias primas sin transformar•Masa celular•Agua contaminada

Figura 3.- Cuadro sinóptico con una visualización de lo que es un bioproceso y donde se especifican las tres etapas en las que se lleva a cabo un proceso fermentativo de esta índole, junto con los pasos que le

corresponden a cada una (Ordaz, L., 1998).

A continuación se da un panorama general, sobre todos los conocimientos necesarios implicados en la realización de una prueba de esterilidad en fermentadores a nivel industrial.

1.2.1.‐Características de un bioproceso

Un bioproceso es complicado de realizar, ya que en esté influyen muchas variables y parámetros que se deben de tomar en cuenta, además de necesitar una alta seguridad, debido al hecho de que se están manipulando microorganismos o sus partes a diferencia de un proceso químico. En los bioprocesos las principales etapas que hay que tomar en cuenta son las que se mencionan en la figura 3.



CARACTERÍTICAS DEUN BIOPROCESO

CATÁLISIS

CONDICIONES DE REACTIVOS

MATERIAS PRIMAS

PROCESO

El producto es más activo y selectivoFácil regeneraciónConstrucción de nuevos

catalizadores mediante ingeniería genética

Moderadas presiones y temperaturasDemanda biológica de nutrientesMutaciones y estrés en

microorganismos

ImpurasInactivasDiluidas

No hay recuperación de intermediariosAmigables al ambienteEquipos sofisticadosMenores concentraciones

Figura 4.-Cuadro sinóptico con las características que posee un bioproceso con respecto a ciertos parámetros en su etapa fermentativa (Vázquez, D., 2009).

1.2.2.‐Fermentación concepto básico

La fermentación es un proceso HcatabólicoH de Hoxidación H incompleta, totalmente HanaeróbicoH, siendo el producto final un compuesto orgánico. Estos productos finales son los que caracterizan los diversos tipos de fermentaciones.

Pasteur la denominó "la vie sans l'air" o "la vida sin aire".



El proceso de fermentación es anaeróbico, ya que se produce en ausencia de HoxígenoH; ello significa que el aceptor final de los HelectronesH del HNADH H* producido en la Hglucólisis H no es el oxígeno, sino un Hcompuesto orgánicoH que se HreduciráH para poder HreoxidarH el NADH a NAD+. El compuesto orgánico que se reduce (HacetaldehídoH, HpiruvatoH,...) es un derivado del sustrato que se ha oxidado anteriormente.

Desde el punto de vista energético, las fermentaciones son muy poco rentables si se comparan con la Hrespiración aerobia H, ya que a partir de una HmoléculaH de Hglucosa H sólo se obtienen 2 moléculas de adenosina trifosfato ( HATPH), mientras que en la respiración se producen 36. Esto se debe a la oxidación del NADH, que en lugar de penetrar en la cadena respiratoria, cede sus electrones a compuestos orgánicos con poco poder oxidante16.

Definiremos fermentación como un proceso metabólico generador de ATP, en el que compuestos orgánicos, sirven tanto de donadores de electrones como de aceptores de electrones.

En la industria, la fermentación puede ser oxidativa, es decir, en presencia de oxígeno, pero es una oxidación aeróbica incompleta, como la producción de Hácido acéticoH a partir de Hetanol H.

Todas las fermentaciones a nivel industrial que se realizan, requieren la ayuda de microorganismos, productores de compuestos de interés, ya sean metabolitos secundarios o enzimas, como se muestra en la figura 5, que es un esquema de los pasos para realizar una fermentación a gran escala.

Las fermentaciones pueden ser: naturales, cuando las condiciones ambientales permiten la interacción de los microorganismos y los sustratos orgánicos susceptibles; o artificiales, cuando el hombre propicia condiciones y el contacto referido.

*La dinucleótido de nicotinamida adenina (abreviada NAD+ en su forma HoxidadaH y NADH en su forma Hreducida H)




Figura 5.- Ejemplo de un diagrama de flujo de un bioproceso fermentativo, donde en los pasos 1, 2 y 3 se ve

la generación del inóculo a partir de una cepa pura, para que posteriormente en los pasos 4 y 5 se lleve a cabo la fermentación a nivel industrial y del paso 6 en adelante se observa la recuperación y purificación del

producto por medio de operaciones unitarias (Deindoerfer, F., 1957).

1.2.3.‐Clasificación de microorganismos Existen muchas maneras de clasificar a los microorganismos, por ejemplo en base a sus nutrimentos, en presencia o no de oxígeno, luz, entre muchas otras cuestiones. Una de las más utilizadas es su clasificación con respecto a la temperatura en la cual los microorganismos se desarrollan satisfactoriamente (Tabla 3). Esto nos dará pauta para conocer, que microorganismos pueden interferir en nuestro proceso y qué condiciones requiere nuestro microorganismo de interés.

Tabla 3.‐ Clasificación de microorganismos de acuerdo a su temperatura de óptimo

crecimiento. Tipo de

microorganismo Temperatura Mínima (°C)

Temperatura Óptima (°C)

Temperatura Máxima (°C)

Psicrófilo -5 +5 12 - 15 15 - 20 Psicrótrofo -5 +5 25 - 30 30 - 35

Mesófilo 5 - 15 30 - 45 35 - 47 Termófilo 40 - 45 55 - 75 60 - 90



1.2.4.‐Esterilización

En la industria de fermentaciones, una práctica común es la esterilización. Existen distintas definiciones de esterilización; aún cuando desde un punto de vista médico se pueda entender la esterilización como la incapacidad reproductiva de los organismos vivos, aquí la definiremos como la remoción o destrucción total de toda forma de vida contenida en un elemento de volumen o en una superficie de un determinado material. La anterior definición implica que al esterilizar un material orgánico rico en elementos nutritivos, estos jamás podrán ser descompuestos por microorganismos mientras el frasco en el que se encuentre dicho material se mantenga perfectamente hermético.

Debe distinguirse entre lo que es desinfección y esterilización . Este último término se define como la remoción o destrucción de microorganismos patógenos o dañinos. A pesar de la subjetividad de la definición anterior, la desinfección debe entenderse como la disminución de la carga microbiana contenida en un determinado material, sin llegar a la destrucción o remoción total de los mismos. Desde este punto de vista, existen agentes esterilizantes y agentes desinfectantes, que pueden ser químicos o físicos. Para hacer aún más compleja la situación, existen agentes químicos que tienen la particularidad de destruir totalmente un determinado grupo microbiano, estos se denominan con el nombre genérico del grupo microbiano sobre el que actúan con la terminación "cida" (bactericida, fungicida, esporocida, viricida, etc.). Si un determinado agente químico detiene o retarda la reproducción de un determinado grupo microbiano sin destruirlo, se denominará con el nombre del grupo en el que actúa con la terminación "stático" (bacteriostático, etc.)11.

Si se divide el proceso de obtención de un producto por vía fermentativa en las siguientes etapas: i) preparación de materias primas y medio de cultivo; ii) fermentación; iii) recuperación y purificación del producto; la esterilización puede practicarse en cualquiera de las tres, por lo que pueden distinguirse tres tipos de procesos de esterilización: a) esterilización de medios de cultivo y de productos fermentativos (véase tabla 4 y 5); b) esterilización de aire y gases de fermentación; c) esterilización del fermentador, tuberías y equipos auxiliares.

11. Ordaz, L; Orozco, C. 1998. Ingeniería de Fermentaciones.



Tabla 4.‐ Relación tiempo‐temperatura para la esterilización de un medio líquido por calor húmedo2.

TIEMPO (minutos) TEMPERATURA (°C)

30 116

18 118

12 121

8 125

2 132

Tabla 5.‐ Tiempo requerido (a 121 °C) para alcanzar el mismo grado de esterilización en distintos volúmenes de medios de cultivo2.

Tamaño del fermentador.

Tiempo total del ciclo de calentamiento.

Tiempo de esterilización.

(Galones). (minutos) (minutos)

50 28.0 17.5

150 33.7 12.6

1,500 41.3 11.3

15,000 51.5 8.8

2. Deindoerfer, F. H. Calculation of heat sterilization times for fermentation media. 1957.



La esterilización es la remoción o destrucción total de toda forma de vida contenida en un elemento de volumen o en una superficie de un determinado material1. Los métodos más utilizados se muestran en la figura 6.

MÉTODOS DE LA ESTERILIZACIÓN

DESECACIÓN

SUPRESIÓN

DESTRUCCIÓN

TemperaturaInhibiciónPresión Colorantes

Filtración Centrifugación

Temperaturas altas: incineraciónCalor seco: hornoCalor húmedo: autoclaveProductos químicos: cloro y

ozonoMecánicos: vibracionesRadiación: rayos X y rayos

gamma

Figura 6.- Cuadro sinóptico con los métodos más utilizados, para llevar a cabo una esterilización (Collins, C., 1989).

.Para comprobar que un tanque a nivel industrial, cuenta con una óptima esterilización, y que durante el proceso de fermentación sigue con estas condiciones, se necesita realizar

un plan de muestreo, tomando en cuenta las siguientes características:

Tipo de producto Tamaño del lote (unidades de producción) Naturaleza del defecto (contaminación, bacteriana, toxinas, residuos químicos) Grado de riesgo para la salud humana Criterios de aceptación y rechazo: ausencia de patógenos, adulteración, cierres defectuosos, contenido neto...

1.‐Collins, C. Microbiological Methods.1989



A nivel laboratorio, una esterilización se lleva a cabo por medio de calor húmedo en una autoclave con los siguientes parámetros. (Figura 7).

Tabla 6.‐ Parámetros de esterilización por calor húmedo a nivel del mar PARAMETRO CONDICIONES

Tiempo 15 minutos Presión 15 lb/plg²

Temperatura 121 °C

Figura 7.- Gráfica del ciclo de una esterilización en donde se compara la temperatura de la autoclave con la del objeto que se está esterilizando y así poder conocer el tiempo necesario para llevar a cabo este proceso

(Collins, C., 1989).

A nivel industrial, se trata de igual manera las condiciones de presión y temperatura en los fermentadores, aunque el tiempo varía según el tipo de producto que se quiera obtener y el microorganismo con el que se va a trabajar. Es mucho más complicado llegar a estos parámetros, debido a que se necesitan varios componentes para llevarlo a cabo, como es el caso de las calderas, que tienen que ser de alta capacidad, de lo contrario no van a proporcionar la temperatura adecuada para la esterilización.



1.2.5.‐Formas de sembrado y manejo de inóculo

En Hmicrobiología H, una siembra es un método para la multiplicación de HcélulasH o Hmicroorganismos H, en el que se prepara un medio óptimo para favorecer el proceso deseado; es un HmétodoH fundamental para el HestudioH de las HbacteriasH.

Esto se lleva a cabo al cultivarlas en un medio líquido o en la superficie de un medio sólido, como se observa en la figura 8, más sin embargo una mala forma de sembrar o manipular el inóculo, provocará que los resultados no sean los deseados, por lo cual se debe de tomar en cuenta el objetivo que se desea alcanzar por ejemplo:

Una estría simple nos ayuda para obtener solamente un crecimiento microbiano como es en nuestro caso.

Una estría cruzada es utilizada principalmente para obtener colonias aisladas y de ahí seleccionar a los microorganismos de interés.

Y una estría masiva se ocupa para el recuento de microorganismos.

FORMAS DE SEMBRADO

ESTRÍA SIMPLE

ESTRÍA CRUZADA

ESTRÍA MASIVA

Figura 8.- Tipos de estrías en la siembra de microorganismos, las cuales nos ayudan a identificar, resembrar

o aislar el microorganismo de interés (Collins, C., 1989).

. 1.‐Collins, C. Microbiological Methods.1989



Figura 9.- Consejos para un buen manejo del inóculo (Stanier, R., 1992).

1.2.6.‐Crecimiento microbiano

Cuando se siembran microorganismos en un medio de cultivo apropiado, los mismos comienzan a dividirse activamente, empleando los nutrientes que le aporta el medio de cultivo para que se "generen" nuevos microorganismos. Este proceso continúa hasta que algún nutriente del medio de cultivo se agota (sustrato limitante) y el crecimiento se detiene, esto es una cinética microbiana y se muestra en la figura 10, de una manera más gráfica. También puede detenerse el crecimiento por acumulación de alguna substancia inhibidora formada por los mismos microorganismos16.

Figura 10.- Gráfica que muestra la cinética del crecimiento microbiano, dependiendo de la etapa en la que se encuentre el microorganismo (Stanier, R., 1992).




Las cepas de interés industrial debe cumplir con: 1. Ser genéticamente estable 2. Reproducirse rápidamente. 3. Preferentemente tendrá una fase de adaptación corta. 4. Producir el metabolismo requerido. 5. Estar constituida por un cultivo puro. 6. Resistente a mantenimientos por tiempo largos.

1.2.7.‐Descripción de los fermentadores o biorreactores

Un biorreactor es un recipiente o sistema que mantiene un ambiente HbiológicamenteH activo, un ejemplo de este equipo se ve en la figura 12. En algunos casos, un biorreactor es un recipiente en el que se lleva a cabo un proceso HquímicoH que involucra Horganismos H o sustancias HbioquímicamenteH activas derivadas de dichos organismos. Estos equipos poseen varias características como se muestra en la figura 11.

BIORREACTOR

Recipiente en donde se efectúa dicha biotrans‐formación

Contenido

Entrada o salida de sustancias

Forma de operación

Geometría

Tipo de flujo

Uso del oxígeno

Contenido de agua

HomogéneosHeterogéneos

Abiertos

Cerrados

Continuos

Discontinuos

Tanque

Columna

MEZCLA COMPLETA, CSTR

FLUJO PISTÓN

PropelasAirliftJet

En sustrato sólido

SumergidosAgitados mecánicamenteColumna

Circulación

Aeróbicos

Anaeróbicos

Figura 11.- Cuadro sinóptico en donde se representa el concepto básico de un biorreactor y los tipos de biorreactores dependiendo de las características con los que se va a trabajar en dicho fermentador

(Ordaz, L., 1998).



Figura 12.- Esquema de las partes de un fermentador aerobio agitado, con chaqueta, así como las principales líneas de entrada y salida en dicho equipo (Deindoerfer, F., 1957).

En términos generales, un biorreactor busca mantener ciertas condiciones ambientales propicias (HpH H, HtemperaturaH, concentración de HoxígenoH, etcétera) al elemento que se cultiva (véase figura 13). En función de los flujos de entrada y salida, la operación de un biorreactor puede ser de tres modos distintos:

1. Lote (Batch) 2. Lote alimentado (Fed‐Batch) 3. Continuo

Figura 13.- La estructura interna de un fermentador a nivel industrial, con las principales partes que

lo componen (www.carbofil.com/images/photos/ind_02.jpg)



1.2.8.‐Clasificación de los biorreactores

0BTabla 7.‐ Las principales clasificaciones de biorreactores

CLASIFICACIÓN DE

BIORREACTORES

OPERACIÓN

‐Discontinuo

‐Semicontinuo

‐Continuo

MIXTA BIOLÓGICA

‐Anaeróbico

‐Facultativo

‐Aeróbico

Clasificación Operativa

Tanto biorreactores como fermentadores se clasifican primeramente de acuerdo al modo de operación: discontinuo, semicontinuo, continuo. Esta es una clasificación operativa y se aplica a cualquier reactor, sea químico o biológico (biorreactor). En los reactores biológicos el modo de operación define el sistema de cultivo que es el mismo y delimita la clasificación procesal‐productiva del bioproceso (cultivo). Al operar un biorreactor en una determinada categoría (discontinua, semicontinua, continua), automáticamente queda determinado el modo de cultivo del sistema y se definen los parámetros y las características operativas y de diseño que intervienen en el proceso productivo del sistema.

Clasificación Biológica

Los sistemas biológicos deben interaccionar con el ambiente externo para poder crecer y desarrollarse; es por eso que los biorreactores se clasifican biológicamente de acuerdo al metabolismo procesal del sistema de cultivo: anaeróbico, facultativo, aeróbico. Los bioprocesos de cultivo y las fermentaciones están basados en el metabolismo celular del cultivo. El metabolismo define los parámetros y características operativas‐biológicas de diseño y de operación del biorreactor. Estas características son las que intervienen en la parte biológica del sistema y tienen que ver con el crecimiento, productividad y rendimiento del cultivo; por lo que, definen la clasificación biológica‐procesal del sistema de cultivo.



Clasificación Biológica‐Operativa

Ambas clasificaciones; la biológica y la operativa, son procesalmente interdependientes y en su conjunto afectan el diseño final del biorreactor. Al conjuntarse ambas clasificaciones, se conjuntan también la función operativa y la biológica para establecer entre ambas un propósito de utilización, el modo de cultivo y el bioproceso. Siendo el propósito de utilización, el destino de cultivo del biorreactor; para qué tipo de cultivo va a ser utilizado el biorreactor; el modo de cultivo es sinónimo de sistema de cultivo y el bioproceso es en sí, todo el proceso.

Los datos de la tabla 8, muestran un rango de las condiciones en las que se trabaja normalmente un fermentador industrial, aunque siempre están en constante cambio, ya que estos parámetros dependen de las necesidades de los microorganismos con los que se esté trabajando.

Tabla 8.‐ Parámetros comunes en fermentadores a nivel industrial

TANQUE CAPACIDAD (m³)

PRESIÓN (kg/cm²)

FLUJO DE AIRE (m³/min)

AGITACIÓN (rpm)

TEMPERATURA (°C)

50 0‐1 0‐8.25 0‐70 25‐35

70 0‐1 0‐55 0‐85 25‐35

90 0‐1 0‐35 0‐70 25‐35

190 0‐10 0‐65 0‐60 25‐35

4.‐Koshkin N. I; Shirkévich M. Manual de Física Elemental.1975



1.2.9.‐ Escalamiento de un bioproceso18.

ESCALAMIENTO DE UN

BIOPROCESO

LABORATORIO

PLANTA PILOTO

PLANTAINDUSTRIAL

Diseña u obtiene el producto, a través del aislamiento, selección y mejoramiento genético del microorganismo.

Se observan las características de diseño y operación de equipos, para garantizar la factibilidad y confiabilidad del proceso.

Escalamiento del proceso (Figura 15).

Figura 14.- Cuadro sinóptico de los niveles, de cómo se lleva a cabo el escalamiento de un bioproceso hasta su etapa industrial, con los puntos más relevantes en cada nivel (Vázquez, D., 2009).

Figura 15.- Las actividades más relevantes, para que se lleve a cabo un proceso de fermentación a una escala industrial (Deindoerfer, F., 1957).

18.‐Vázquez Dynora. Apuntes de Síntesis y Análisis de Bioprocesos.2009



En primera instancia, no hay que perder de vista las tres etapas principales, en las que se lleva a cabo todo el proceso fermentativo (véase figura 16), aunque nos enfocaremos de manera más detallada, desde la inoculación, hasta el término de la fermentación.

Figura 16.- Etapas principales en el proceso fermentativo

Antes de la Fermentación

Durante la Fermentación

Término de la Fermentación



Ahora bien, cada una de estas etapas conlleva ciertas actividades que se enuncian en la tabla siguiente:

Tabla 9.‐ Actividades que se realizan en cada etapas de todo el proceso de fermentación

ANTES DE LA FERMENTACIÓN

DURANTE LA FERMENTACIÓN

TÉRMINO DE LA FERMENTACIÓN

Lavado Inoculación del tanque Termina la fermentación cuando se cumplen cuatro cosas, las cuales son:

Cuando se cumple el tiempo promedio de fermentación

Cuando el volumen del fermentador llega a su límite con caldo fermentado

Cuando el microorganismo ha consumido la mayor cantidad de sustrato en un volumen máximo

Cuando se llega a la generación de producto promedio o por encima de este

Revisión del funcionamiento adecuado de los equipo y herramientas a utilizar

Conservación de las características y parámetros adecuadas, para la proliferación de los microorganismos

Corrida de prueba, para asegurarse que todo esté en orden

Muestreo constante del caldo fermentado para conocer la concentración del medio de cultivo

Llenado del tanque con el medio de cultivo

Alimentación continua de sustratos

Esterilización del tanque con el medio de cultivo

Muestreo constante, para conocer el crecimiento del microorganismo

Enfriamiento hasta la temperatura óptima de crecimiento del microorganismo

Muestreo constante, para conocer la concentración de producto generado

*Se deben respetar todos los parámetros establecidos en los PNO correspondientes



2.‐JUSTIFICACIÓN

En los procesos de fermentación un problema muy común, es la presencia de contaminación microbiana, esta puede ser debida a múltiples causas como por ejemplo deterioro natural del equipo, o características ambientales. En Fermic se realizan pruebas diariamente para poder asegurar la calidad del producto, una productividad satisfactoria y favorable crecimiento del microorganismo.

En fermentadores a nivel industrial, se deben de tomar ciertas medidas y parámetros muy específicos y controlados en las etapas de esterilización y durante el proceso de fermentación, para que de ese modo, poder tener un control y reducir los factores que ponen en peligro el proceso de fermentación, pero sobre todo evitar el choque directo de manera económica a la empresa, debido a que cuando se contamina un fermentador de cualquier capacidad, lo que se hace es esterilizarlo y desechar el cultivo con el microorganismo, dando pérdidas de alto valor monetario y pérdida de tiempo.

Ahora bien, no es fácil mantener la esterilidad en los tanques, ya que cualquier daño físico o deterioro en el equipo puede provocar una contaminación y más aún porque el proceso de fermentación se lleva a cabo en un periodo de tiempo prolongado, por lo cual es complicado controlar todos los parámetros mientras el microorganismo está en su etapa de crecimiento.

El procedimiento que se realiza para conocer si un fermentador está contaminado o se ve afectado por la carga microbiana de un agente externo se llama “prueba de esterilidad”, la cual se realiza durante todo el proceso en el que se lleva a cabo la fermentación, ya que es la única forma de saber si nuestra fermentación lleva un proceso adecuado o se ha realizado de manera confiable. Por tal motivo, esta prueba debe realizarse cumpliendo todas las especificaciones, para tener datos confiables. Ya que si ocurre una contaminación, se deberán tomar de inmediato las medidas adecuadas, según la magnitud del problema.

He aquí la importancia de tener un procedimiento claro, sencillo de realizar, bajo costo de realización y sobre todo que sirva de manera eficiente para darnos resultados con alta confiabilidad, para la identificación de microorganismos contaminantes en el desarrollo de los lotes de producción.



3.‐OBJETIVOS

3.1.‐GENERALES

Identificación de la contaminación microbiológica en fermentadores de 50, 70, 90 y 190 m3, antes, durante y al término de la fermentación.

3.2.‐ PARTICULARES

Comprobar mediante las pruebas de esterilidad, que el proceso de fermentación, se encuentra en condiciones óptimas de trabajo con respecto a microorganismos contaminantes.

Identificar las posibles causas de contaminación en la fermentación. Implementación de las acciones que se deben de realizar, de modo preventivo, en un proceso fermentativo.

Implementación de las acciones correctivas que se deben de realizar, en caso de presentarse contaminación en los fermentadores.

4.‐METODOLOGÍA

Uniforme y equipo de seguridad

Ropa de trabajo Bata Casco Tapones auditivos Zapatos anti‐derrapantes Lentes de seguridad



Etapas de las pruebas de esterilidad

Figura 17.- Seguimiento para la realización de las pruebas de esterilidad

4.1.‐ MEDIOS DE CULTIVO Y TUBOS ESTÉRILES

Material y Equipos

Autoclave Tubos de 20ml Matraz Erlenmeyer

Tapones de algodón

Gradilla Medios de cultivo Tripie Mechero Espátula Incubadora

Balanza analítica Balanza granataria



Medios de cultivo

El material que se empleo en estas pruebas, fue completamente estéril y proporcionado por el laboratorio de cepas.

Los medios de cultivo usados fueron:

Tabla 10.‐ Medios de cultivo utilizados para las pruebas

MEDIO DE CULTIVO NOMBRE DEL MEDIO DE CULTIVO

PREPARACIÓN

1 Caldo Esterilidad En tubos de ensaye con 8ml de solución. En matraces Erlenmeyer con 20ml de solución.

2 Agar Esterilidad En tubos de ensaye con 8 ml (solución de color café).

3 Agar “F” En tubos de ensaye con 12ml (sólido de color amarillo claro).

Procedimiento utilizado para la preparación de un medio de cultivo9

1.‐Asegurarse que el frasco que contiene el medio de cultivo esté bien cerrado, no presente grumos, no esté hidratado y se encuentre dentro de su vigencia. 2.‐Leer cuidadosamente las especificaciones del fabricante, generalmente son las siguientes: 2.1.‐Contenido de humedad (medio deshidratado) 2.2.‐Composición del medio 2.3.‐Método de preparación 2.4.‐Condiciones de presión y temperatura para la esterilización del medio preparado 2.5.‐ Advertencia de no esterilizar el medio. 2.6.‐Características de desarrollo de los microorganismos en el medio. 2.7.‐ Advertencia sobre la conservación del medio preparado. 2.8.‐Resultados de las pruebas de estabilidad del medio. 2.9.‐Resultado de las pruebas de viabilidad del medio. 2.10.‐pH del medio preparado.

9.‐NOM‐065‐SSA1‐1993



3.‐Calcular la cantidad de medio de cultivo que se necesita

4.‐Abrir el frasco y con una espátula pesar

5.‐Colocar la pesada en un recipiente cuya capacidad sea por lo menos dos veces mayor a la del volumen de medio que se desea preparar

6.‐Adicionar el volumen de agua deseado, agitar vigorosamente y dejar reposar para iniciar su disolución.

7.‐Se requiere calentar, para lograr una disolución completa, efectuar esta operación en platina caliente o sobre una rejilla de asbesto calentando con mechero.

8.‐Ajustar el pH a 25 °C con potenciómetro. 9.‐ Esterilizar los medios y/o soluciones preparadas, usando calor húmedo. Errores en la técnica

Deficiente homogenización Uso de pipetas con graduación defectuosa Esterilización incorrecta Presencia de inhibidores en la muestra

Precauciones y limitaciones del método

* Temperatura del agar debe ser 44°C a 45°C. * Precisión: analista. * Exactitud: analista. * Cúmulos de bacterias por una incorrecta homogenización. *Preparación de medios (pesada, agua destilada). *Presencia de substancias inhibitorias (material de vidrio, diluyente, competencia con otros microorganismos). *Temperatura de incubación inadecuada. *El sustrato mismo (inhibición del crecimiento, restos de sustrato que se puede confundir con colonias).



Método de aseguramiento de la calidad de los tubos y medios de cultivo1

a) Contaminación

Esto se llevó a cabo por medio de testigos, a los cuales se agregó un bioindicador (Geobacillus stearothermophilus), al medio de cultivo que se iba a esterilizar. Al término de la esterilización se dejó incubando por 24 horas a 34 °C. Transcurrido este tiempo se checó si los cultivos fueron esterilizados de manera correcta.

b) Viabilidad del medio

Esta prueba se llevó a cabo al igual que la anterior, por medio de testigos, uno positivo y otro negativo, en los cuales se inocularon microorganismos conocidos, que crecen en este medio. Se incuban y se hace la lectura correspondiente después de las 24 horas.

Figura 18.- Esquema de las partes del equipo de esterilización y la forma de cómo se debe de colocar el material de manera adecuada (Stanier, R., 1992).

1.‐Collins, C. Microbiological Methods.1989



Figura 19.- Preparación de material para esterilizarse por calor húmedo

Figura 20.- Equipo utilizado para la esterilización por calor húmedo: “Autoclave”

4.2.‐ TOMA DE MUESTRAS

Recomendaciones generales

Para la toma de muestras en la planta de fermentación, estas deben de realizarse en presencia de personal calificado de esta área, ya que son los que manipularán las válvulas de la línea toma‐muestra.

Siempre se debe de verificar las buenas condiciones del material estéril que se está usando, esto para garantizar la esterilidad del medio, así como también el desarrollo de la misma.

Para ingresar al área de fermentaciones, en donde se realizará el muestreo, se debe de contar con un encendedor, un mechero, una franela y una gradilla con tubos estériles para la toma de muestra.



Este procedimiento de muestreo y siembra sólo se realizará cada 24 horas por los analistas del laboratorio de Control de Proceso y después de ser incubadas, el personal del departamento de Fermentación se hace responsable del resultado de las pruebas y aplica hasta que la fermentación del lote termine.

Material

Tubos estériles

Encendedor

Franela

Gradilla

Método de muestreo

Se identificaron los tubos estériles con los tanques a muestrear. Se abrió la válvula de la toma de muestra del tanque, para que pasara vapor y se esperó a que la línea se enfriara, aproximadamente 1‐2 minutos, ya que esta línea se mantiene estéril porque contiene vapor.

Se encendió el mechero con mucho cuidado, (ya que hay veces que sale el flamazo al colocar el encendedor) y se colocó por debajo de la salida del caldo.

Se prendió el encendedor y se observó hacia donde se encontraba el flujo de aire, para poder colocarse de manera adecuada y no quemarse o contaminar la muestra. Siempre el operador debe coloca en dirección donde pasa la corriente de aire.

Se tomó el tubo estéril de la parte de abajo con la mano izquierda y con la mano derecha se retiró el tapón de algodón, dentro de la zona estéril marcada por la flama (aproximadamente 10 cm).

Se flameó el tubo y se tomó la muestra del tanque (aproximadamente 5 ml), el tubo ya con la muestra, se volvió a flamear para asegurar la integridad de la muestra, para que posteriormente se colocara el tapón de algodón, recordando que este no debe de estar a no más de 10 cm por encima de la flama.



4.3.‐ SIEMBRA E INCUBACIÓN

Método de siembra

Estas siembras se llevaron a cabo en un área cerrada con la ayuda de un mechero. Para la siembra de los caldos contenidos en los fermentadores, se realizaron en tubos, uno conteniendo agar sólido, otro con agar líquido y ambos se identificaron con:

o ‐Número de Lote o ‐Fecha o ‐Hora de la Siembra

Se consideró el tipo de medio de cultivo que se usará por cada producto.

Se limpió la mesa de trabajo, para que posteriormente se desinfectara con alcohol.

Después se encendió el mechero y antes de empezar a sembrar, se desinfectaron las manos con alcohol.

Se colocó la gradilla con los medios de cultivo y las muestras, en la parte izquierda de la mesa y en la parte derecha se colocaron las pipetas estériles que se iban a ocupar.

Se retiró el empaque estéril de las pipetas de vidrio y se tomó el caldo fermentado, después se depositó la muestra en el tubo de ensaye con agar sólido y en tubo de ensaye con agar líquido (aproximadamente 1ml).

Todo este proceso de siembra se hizo cerca de la flama a un radio menor de 10 cm.

Figura 21.- Imagen representativa, de la forma adecuada en la que se debe de tomar la muestra, para siembra en medios de cultivo



Después de realizar la siembra, se llevaron los tubos al área de incubación (34°C).

Se colocaron los tubos en la gradilla correspondiente, los cuales permanecieron ahí durante todo el tiempo que duró la fermentación.

Después de usar el área de siembra, se dejó la mesa de trabajo limpia, y el material sucio en el lugar correspondiente.

4.4.‐ LECTURA DE CONTAMINACIÓN DE LOS TUBOS

Después de haber transcurrido 24 horas, se realizó la lectura de los tubos antes inoculados. Esto se llevó a cabo de 2 formas:

A simple vista: se observó de manera directa si los medios de cultivo, cambiaban de color, si hubo crecimiento de colonias extrañas, morfología de las colonias, que tanto crecimiento existió y la consistencia de los cultivos. Ahora bien, si presentaban todo lo mencionado anteriormente, significaba una clara y contundente contaminación, por lo cual la prueba fue positiva.

Microscopio: se realizó una preparación temporal, colocando de manera directa una pequeña muestra del cultivo en el portaobjetos y se observó en un microscopio, aquí se ve si solo se encuentra el microorganismo de interés o hay presencia de otros microorganismos. Y si existen otros microorganismos, que tan contaminada estaba la muestra.

En el caso de que varias muestras se vieron contaminadas por el mismo microorganismo, se procedió a realizar las pruebas bioquímicas, para la identificación de manera exhaustiva de dicho microorganismo, para que de esa forma se tuviera una noción de la causa donde se originó la contaminación.

Cuando se identificó que existía contaminación en las pruebas de esterilidad, se informó de manera inmediata al departamento de fermentación, para que ellos tomaran las medidas adecuadas sobre los fermentadores que presentan dicho problema. Aunque ellos monitorearon las pruebas que se realizaron todos los días.

Y para finalizar, después de que se realizaron las medidas correspondientes a los fermentadores contaminados, se llevó a cabo el seguimiento de las posibles causas que originaron la contaminación en el proceso.



5.‐ RESULTADOS

Los resultados más sobresalientes durante todo el transcurso de la realización de las pruebas, las acciones preventivas, correctivas y el seguimiento durante una contaminación a nivel industrial son las que se muestran a continuación:

Tabla 11.‐ Periodo de muestreo durante la estancia industrial

DÍA DE INICIO DÍA DE TÉRMINO DÍAS TOTALES

31‐Ago‐09 04‐Dic‐09 96

Tabla 12.‐ Número de pruebas realizadas en total a todos los biorreactores

MICROORGANISMO PRODUCTOR

NÚMERO DE PRUEBAS

Streptomyces 1 446

Streptomyces 2 44

Streptomyces 3 5

Levadura 1 54

Levadura 2 83

Bacteria 1 39

Bacteria 2 8

Bacteria 3 4

TOTAL 683

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Cabe mencionar que la estancia comenzó el día jueves 27 de agosto y que de manera inmediata se impartió la capacitación, para el desarrollo de estas pruebas, por lo cual en un principio se cometieron muchos errores, que con el paso del tiempo se fueron eliminando. En la siguiente tabla se muestran los más comunes.

Tabla 13.‐ Incidentes más frecuentes durante el desarrollo de las pruebas

ETAPA INCIDENTES MÁS COMUNES

Realización de medios de cultivo Contaminación

Realización de medios de cultivo Agar muy seco

Realización de medios de cultivo Agar con agua

Toma de muestra Falta de tubos

Toma de muestra Mal etiquetado

Toma de muestra Mala toma de muestra

Toma de muestra Quemarse con el mechero

Toma de muestra Falta de toma de muestra

Siembra Falta de asepsia

Siembra Mal sembrado

Siembra Quemarse con el mechero

Siembra Quemar el algodón

Lectura de resultados Falsos positivos

En la siguiente tabla se muestra como se vio afectada la eficiencia, con los incidentes iniciales al número total de pruebas realizadas.

Tabla 14.‐ Eficiencia de las pruebas de esterilidad

Pruebas Número de Pruebas Porcentaje (%)

Resultados confiables 632 92.5

Resultados inconfiables 18 2.6

Pruebas mal realizadas 9 1.3

Pruebas que se repitieron 24 3.6



Después de haber transcurrido 3 semanas, los resultados eran muy confiables, por lo cual, este fue el tiempo en que se tardó en perfeccionarse la técnica, para que no se cometiera ningún error en el procedimiento, a la hora de realizar las pruebas.

Cabe mencionar que el día 4 de diciembre, las pruebas de esterilidad cambian de laboratorio y las empiezan a realizar los analistas del laboratorio de cepas, por lo cual, se les dio una pequeña capacitación con la metodología utilizada en este trabajo, para que sus pruebas siguieran aportando los resultados deseados.

Se muestran a continuación algunas imágenes, de cómo se hace la comparación de los medios de cultivo, para conocer si están o no contaminados los fermentadores.

Figura 23.- Esta es la apariencia de los medios de cultivo, cuando acaban de ser inoculados por el caldo fermentado.

Figura 24.- Medio líquido contaminado después de haber transcurrido el tiempo de incubación, en estos medios se observa principalmente el cambio de color o la turbidez de dichos medios.



Figura 25.- Medios sólido, que no está contaminado después de haber transcurrido el tiempo de incubación. Y esto se puede ver porque no presenta colonias específicas de bacterias.

Después de haber realizado las pruebas de esterilidad, y dar resultados positivos, se toma una decisión como por ejemplo:

Cuando el fermentador se inocula y la primera prueba que se realiza, afirma que está contaminado, se para la producción de inmediato y se esteriliza nuevamente, para que de ese modo, se pueda obtener un mejor rendimiento, ya que los microorganismos competirían por el sustrato desde un inicio, generándose otros productos que no son de nuestro interés.

Si la contaminación se detecta en la etapa media de la fermentación (cabe mencionar que el tiempo de fermentación para cada producto varia considerablemente), y no altera la producción durante el proceso, no se para la fermentación, debido al hecho de que los microorganismos contaminantes no afectan en gran medida la producción del metabolito secundario de interés. En estos casos se realiza la identificación del microorganismo, para garantizar que no afecte la calidad del producto.

Ahora tenemos el caso contrario al anterior, se presenta una contaminación, pero sí se ve afectado el rendimiento del producto, y dicho producto no llega a la concentración mínima a la cual todavía su proceso de recuperación y purificación es económicamente viable. En este caso se esteriliza el tanque, para eliminar a todos los microorganismos presentes y como el sustrato ya es mínimo, no tiene caso recuperarlo, por lo cual, se desecha con forme a los procedimientos de la NOM‐087‐ECOL‐SSA1‐2002, Protección ambiental‐Salud ambiental‐Residuos peligrosos biológico‐infecciosos‐Clasificación y especificaciones de manejo.



Cuando la fermentación está llegando a su término y se detecta una contaminación, que afecta el crecimiento del microorganismo de interés y la concentración del metabolito secundario es favorable, de inmediato se descarga para seguir con la siguiente etapa del proceso.

Es importante hacer notar, que la decisión de que hacer en cada caso incluye diferentes consideraciones, dependiendo del tipo de producto con el que se esté trabajando, pues es diferente un producto para uso humano, que uno para industria papelera, por ejemplo enzimas para el petróleo.

Después de que se tomaron las medidas necesarias en las contaminaciones, se realizó un seguimiento a fondo, de las probables causas de dicho accidente, para que en un futuro no vuelva a ocurrir lo mismo, ya que un error de esta magnitud, le cuesta a la empresa mucho dinero.

Para llevar a cabo el seguimiento adecuado, la empresa tiene un formato establecido, el cual contiene paso a paso el seguimiento del proceso de fermentación, por lo tanto dicho documento pasó a todos los departamentos involucrados, para que lo firme cada supervisor o encargado de turno, el cual se aseguró de llevar a cabo la acción correspondiente.



6.‐ ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS

El proceso de fermentación a nivel industrial es complejo, porque para llevar a cabo este proceso con rendimientos altos, se necesita que una infinidad de variables se mantengan en las condiciones óptimas para la proliferación de los microorganismos, mas sin embargo estas variables van cambiando conforme pasa el tiempo de fermentación y también dependen del tamaño del tanque con el que se esté trabajando.

Los biorreactores son sistemas adaptados, para que el microorganismo de interés crezca en las condiciones óptimas, por lo cual, se toman medidas, para que no se contaminen, pero la base principal es una buena esterilización.

La esterilización de los fermentadores y medios de cultivo, es necesaria para eliminar la competencia por el sustrato entre los microorganismos contaminantes contenidos en las materias primas y el microorganismo empleado en el proceso, con el objetivo de maximizar la producción.

Por otro lado, la contaminación trae como consecuencia, en el mejor de los casos, una disminución en el rendimiento del producto y, en el peor de los casos la pérdida total del lote de producción, por lo que desde el punto de vista técnico y económico la contaminación es indeseable.

Las razones de la esterilización en un proceso de fermentación resultan obvias para el personal con experiencia en los mismos, sin embargo, para personas con poca o nula experiencia no lo son tanto, por lo que a continuación se mencionan brevemente algunas: i) evitar la competencia por el sustrato entre los microorganismos contaminantes y los empleados en el proceso fermentativo; ii) evitar la dispersión al ambiente de microorganismos patógenos o potencialmente patógenos; iii) evitar la contaminación del producto.

La base de este trabajo, fue realizar de manera detallada un procedimiento, que nos asegure de manera confiable, si existe o no contaminación en los lotes de producción durante el proceso fermentativo, por medio de las pruebas de esterilidad. Que aunque ya se realizaban en la empresa, había ciertos aspectos que corregir, que no venían en el proceso normalizado de operación y que se mencionaban en la capacitación o hasta que se enfrentaba a la hora de realizar dicha prueba.



Después de realizar varias pruebas de este tipo, se analizan varios puntos a favor y en contra de este procedimiento, las cuales se muestran en la siguiente tabla.

Tabla 15.‐ Ventajas y desventajas de las pruebas de esterilidad

PRUEBAS DE ESTERILIDAD

VENTAJAS DESVENTAJAS

La realización de esta prueba es relativamente barata.

Toma tiempo su realización, debido al número de pasos a seguir.

Es fácil de realizar la prueba No se puede considerar una prueba crítica de la fermentación, ya que para que se pueda leer, deben de pasar por lo menos 24 horas para la proliferación de los microorganismos.

Es la única prueba que se puede llevar a cabo, para la identificación de microorganismos contaminantes en una fermentación.

Involucra a bastante personal, para su realización.

Si se lleva a cabo de manera adecuada, los resultados obtenidos son muy confiables.

La exactitud de la prueba depende de la técnica y habilidad del analista.

El seguimiento de la pruebas, nos da una idea en la etapa en la que se contaminó la fermentación.

Existen muchos puntos críticos, que ponen en riesgo las pruebas.

Durante todo el tiempo de muestreo, se detectó de manera adecuada y confiable, algunas contaminaciones de los fermentadores. Las cuales ayudaron a tomar decisiones, sobre lo que iba a acontecer con los fermentadores.



Aunque es el mismo procedimiento que se lleva a cabo a la hora de realizar las pruebas de esterilidad en los tanques, la importancia de diferenciar entre fermentadores de 50, 70, 90 y 190 m3, varían en algunos aspectos muy importantes que pudieran afectar la integridad de los fermentadores, como por ejemplo:

El microorganismo con el que se esté trabajando, ya que sus características lo hacen más resistente o más susceptible a la contaminación.

Los medios de cultivo óptimos para el microorganismo, ya que un cultivo más nutritivo, es más fácil que se contamine.

Lógicamente el tamaño del tanque de fermentaciones, ya que a mayor tamaño es más difícil que se conserve en estado de esterilidad.

El producto con el que se esté trabajando, ya que si se ve alterado el microorganismo por otro microorganismo ajeno, este se pone a la defensiva y cambia su metabolismo produciendo otras cosas.

El área donde este localizado, ya que los fermentadores están separados y las condiciones ambientales son distintas.

La línea para obtener la muestra es diferente en los fermentadores, debido al diseño del tanque, por lo cual cambia un poco al muestrear.

Son diferentes sistemas con los que se manipulan los tanques.

De esta manera, como podemos observar, la contaminación va a depender de muchas variables, que tal vez no estén relacionadas entre sí, esto quiere decir, que la contaminación de cada tanque va a ser independiente uno del otro, aunque compartan líneas de alimentación.

Por otra parte, en los casos en los que se recupera el medio de cultivo, por medio de una reesterilización cuando ha sido contaminado el tanque, hay que tomar en cuenta, que las propiedades de este medio no son las mismas y no son las óptimas que debería de tener, por lo cual el aspecto del caldo fermentado cambia y se vuelve más obscuro, pero además los rendimientos de este lote de producción son relativamente menores.



En el seguimiento para conocer las causas de contaminación del fermentador, hay cuestiones de deterioro de los equipos por el constante uso, lo cual provoca la falla y esto solamente se puede conocer, cuando se realiza una corrida de prueba en todas las líneas, equipos, medidores, etc. Debido a las condiciones de operación, esto se previene con mantenimiento preventivo, sin embargo en ocasiones no es suficiente.

No hay que perder de vista que este seguimiento se detiene, hasta que se encuentre la falla del problema, ya que si se ignora, podría causar, muchas consecuencias de pérdida de material y recursos.

Después de haber realizado el seguimiento correspondiente, tras la contaminación de varios fermentadores, las principales causas que se encontraron fueron las siguientes:

Una mala esterilización: en este caso hubo varias causas por las cuales no se llevó a cabo la esterilización de manera adecuada, una de ellas fue que el personal encargado de este proceso era nuevo y no controló los parámetros establecidos de manera adecuada, otra fue por la falta de vapor en la línea.

Llevar a cabo procesos de fermentación muy seguidos, sin dar tiempo para que se cumplan las condiciones mínimas adecuadas, esto provoca en primera, la realización de las revisiones de prueba con falsos positivos y en segunda un descontrol en el proceso de fermentación.

La contaminación de las líneas de alimentación por un mal lavado o una mala esterilización según sea el caso, por lo cual a la hora de estar suministrando el sustrato o cualquier otro componente que necesite el microorganismo, este no está estéril y contamina la producción.

Se llegan a fracturar las tuberías o agrietarse, por lo cual a la hora de que los sustratos pasaban por dicha línea, se contaminaban y así entraban a los fermentadores.

Algunas veces se acababa el vapor, por lo cual los fermentadores perdían presión, además de que cuando se obtiene una muestra, la línea se esteriliza, antes y después de tomar la muestra, y al no haber vapor y no existir la presión interna del fermentador a la hora de abrirse, es una posible causa de contaminación.



No llevar a cabo una buena limpieza del fermentador, por lo cual quedan residuos de la fermentación anterior, y como los medios de cultivo son muy ricos y es muy fácil que prolifere cualquier microorganismo, afecta de manera directa la integridad del cultivo.

La aireación de los fermentadores es un punto clave para el crecimiento de los microorganismos, y una fuente de contaminación, ya que para disminuir el número de partículas viables y no viables en el aire se utilizan filtros, los cuales con el constante uso se desgastan.

Existencia de fugas o pequeñas aberturas en las líneas o aparatos que estén conectados directamente al fermentador, debido al constante uso de los equipos.

Una esterilización inadecuada del medio de cultivo, que está ingresando de manera continua a los fermentadores, es otra causa de contaminación.

Deterioro del equipo por vibraciones y uso del mismo, donde la acción preventiva en este caso es el mantenimiento periódico.

Errores humanos, en donde la acción preventiva es la capacitación y entrenamiento del personal.

Falla en la detección oportuna de la contaminación en un tanque semillero, donde la acción preventiva es una mejor capacitación del personal y la búsqueda de nuevos medios de cultivo.



7.‐ CONCLUSIÓN

Se desarrolló un seguimiento detallado, para la realización de las pruebas de esterilidad con base a los procedimientos de la empresa y a la práctica diaria en su realización.

Se logró dar a conocer la importancia que tienen las pruebas de esterilidad en el proceso fermentativo.

El procedimiento para la realización de las pruebas de esterilidad en los diferentes tamaños de tanques es el mismo, cambiando varios parámetros; como medios de cultivo, tomas de muestra, tiempos, etc. y estos depende del producto con el que se esté trabajando.

Con el tipo de medio de cultivo con el que se trabaja, dependerá mucho de los cuidados que se deban de tener, ya que un medio muy enriquecido, es más fácil que se contamine.

Cuando un tanque está contaminado, el rendimiento dependerá del tipo de contaminante presente, ya que en ciertos casos no se ve afectada la producción.

La realización de las pruebas de esterilidad confiables y a tiempo, ayudó a mejorar los procesos de producción de los fermentadores.

Las causas de contaminación de los biorreactores, pueden ser muy variadas, debido al gran número de componentes del tanque y variables del proceso.

Cuando un tanque está contaminado, se deben de tomar medidas inmediatas, que pueden ir desde un control más estricto del proceso, hasta drenado del tanque.

Las acciones que se toman de modo preventivo antes de iniciar el proceso, dan la confianza para que la fermentación siga su curso de manera apropiada.

Cuando los tanques fermentadores, presentan contaminación se debe de realizar de inmediato las acciones preventivas y correctivas según el proceso normalizado de operación de la empresa.



8.‐ SUGERENCIAS PARA FUTURAS ESTANCIAS

Para la empresa

Seguir apoyando a los alumnos en progreso de ser ingenieros titulados y motivar las aptitudes y habilidades de cada uno.

Promover los vínculos establecidos con la escuela, para que los alumnos tengan conocimiento de los laboratorios en los cuales se puede desarrollar una estancia industrial.

Dirigir la estancia a actividades con la posibilidad de conocer la mayoría de las labores de la empresa para un conocimiento general del campo de trabajo.

Para los alumnos interesados:

En dado caso de que cometas algún error en alguna actividad es mejor decirlo y no quedarse callado, ya que se va a saber, que lo cometiste y perderás la confianza de los demás.

Tomar tiempo para leer los procedimientos normalizados de operación, y si no quedan claros o tienes dudas, “pregunta” recuerda que ahí se describe paso a paso como se debe de realizar cualquier actividad, que vayas a realizar.

Desarrollar una sana comunicación de compañerismo así como el buen trato de las relaciones humanas con todo el personal que labora en la empresa.

Aprende lo más rápido posible como se hacen las cosas y trata de mejorarlas para optimizar tus tiempos. De esa manera, tus compañeros con los que trabajas te enseñaran más cosas y tendrás buena reputación en toda la planta.

Cuando te toque realizar algún análisis o alguna prueba, trata de hacerla de inmediato, para que de ese modo no se te junte el trabajo.

Ten siempre en mente que debes de ser rápido, preciso y tener cero errores, eso te crea una mentalidad para ser de los mejores.

Siempre y en todo momento, utiliza tu equipo de seguridad y conoce las rutas de evacuación, ya que la empresa es considerada de alto riesgo, y estás en contacto directo con muchos reactivos y áreas peligrosas.



9. ‐ BIBLIOGRAFÍA

1. Collins, C; Lyne Patricia. 1989. Microbiological Methods. Sixth edition. USA: Burtterworth‐Heinemann.

2. Deindoerfer, F. H. 1957. Calculation of heat sterilization times for fermentation media. Appl. Microbiol. 5:221.

3. Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos.2009. 9a. Ed. México. 4. Guías generales de validación.2003. SSA. 5. Koshkin N. I; Shirkévich M. G.1975. Manual de Física Elemental. Mir ISBN. pp. 36‐

86 6. Ley General del Equilibrio Ecológico y la Protección al Ambiente (1996). 7. NMX‐CC‐2‐1990 Sistemas de Calidad‐Gestión de Calidad. Guía para la Selección, el

Uso de Normas de Aseguramiento de Calidad. 8. NTE‐CRP‐001/88‐2002‐ Criterios para la determinación de residuos peligrosos y

listado de los mismos. 9. Norma Oficial Mexicana NOM‐065‐SSA1‐1993, Que establece las especificaciones

sanitarias de los medios de cultivo. generalidades. 10. Norma Oficial Mexicana NOM‐164‐SSA1‐1998, Buenas prácticas de fabricación

para fármacos. 11. Ordaz, L; Orozco, C. 1998. Ingeniería de Fermentaciones. UPIBI 12. PNO LC‐009: Esterilización de Material.2009. 13. PNO LC‐011: Preparación de medios de cultivo.2009. 14. PNO FER‐076: Procedimientos de limpieza para los cuartos de microscopio y de

incubación.2009. 15. Reglamento de Insumos para la Salud.2009. 16. Stanier, Roger; Ingraham John.1992. Microbiología. Fifth edition. USA: Reverte. 17. Tecnología FERMIC 18. Vázquez Dynora. 2009. Apuntes de Síntesis y Análisis de Bioprocesos. Compilado

en Departamento de Bioingeniería. México, D. F.: Unidad Profesional Interdisciplinaria de Biotecnología. pp. 4‐12.

19. www.carbofil.com/images/photos/ind_02.jpg 20. Hwww.guiaroji.com H



10.‐ANEXOS

Glosario

Antibiótico. Agente químico que es producido por unos microorganismos que es dañino para otros.

Área. Cuarto o conjunto de cuartos y espacios diseñados y construidos bajo especificaciones definidas.

Área aséptica. Zona comprendida dentro de un área limpia, diseñada y construida para minimizar la contaminación por partículas viables y no viables, manteniéndola dentro de límites preestablecidos.

Área crítica aséptica. Zona dentro del área aséptica en la cual el producto, los recipientes y/o los dispositivos de cierre esterilizados, están expuestos al medio ambiente.

Área limpia. Área diseñada, construida y mantenida con el objeto de tener dentro de límites el número de partículas viables y no viables en superficies y medio ambiente.

Aseguramiento de calidad. Conjunto de actividades planeadas y sistemáticas que lleva a cabo una empresa, con el objeto de brindar la confianza, de que un producto o servicio cumple con los requisitos de calidad especificados.

Biocarga. Concentración de UFC presentes en un elemento determinado.

Buenas prácticas de fabricación. Conjunto de lineamientos y actividades relacionadas entre sí, destinadas a garantizar que los productos farmacéuticos elaborados tengan y mantengan la identidad, pureza, concentración, potencia e inocuidad, requeridas para su uso.

Calidad. Cumplimiento de especificaciones establecidas para garantizar la aptitud de uso.

Contaminación. Presencia de entidades físicas, químicas o biológicas indeseables.

Contaminación cruzada. Presencia de entidades físicas, químicas o biológicas indeseables, procedentes de otros procesos de fabricación.



Especificación. Descripción de un material, sustancia o producto, que incluye los parámetros de calidad, sus límites de aceptación y la referencia de los métodos a utilizar para su determinación.

Expediente legal. Conjunto de documentos que demuestran que el medicamento está registrado y cumple con las normas vigentes de la Secretaría de Salud.

Expediente maestro. Conjunto de documentos que proporcionan la información necesaria para la fabricación de un medicamento.

Fabricación. Operaciones involucradas en la producción de un medicamento desde la recepción de materiales hasta su liberación como producto terminado.

Inactivación. Acción de transformar la actividad química/biológica de los residuos medicamentosos inutilizándolos para su uso farmacéutico.

Lote. Cantidad de un fármaco o medicamento, que se produce en un ciclo de fabricación y cuya característica esencial es su homogeneidad.

Materia prima. Sustancia de cualquier origen que se use para la elaboración de medicamentos o fármacos.

Medicamento. Toda sustancia o mezcla de sustancias de origen natural o sintético que tenga efecto terapéutico, preventivo o rehabilitatorio, que se presente en forma farmacéutica y se identifique como tal por su actividad farmacológica, características físicas, químicas y biológicas.

Método de prueba. Procedimiento analítico utilizado en el laboratorio para comprobar que un producto satisface las especificaciones que establece la norma.

Número de lote. Combinación alfanumérica que identifica específicamente un lote.

Orden de producción. Copia de la fórmula maestra de producción a la cual se le asigna un número de lote y se utiliza como guía y registro de las operaciones para la producción de un lote de medicamento.



Orden de acondicionamiento. Copia de la fórmula maestra de acondicionamiento a la cual se le asigna un número de lote y se utiliza como guía y registro de las operaciones para el acondicionamiento de un lote de medicamento.

Principio activo. Fármaco.

Procedimiento normalizado de operación. Documento que contiene las instrucciones necesarias para llevar a cabo de manera reproducible una operación.

Producto. Es el resultado de un proceso específico.

Producto a granel. Producto que ha cubierto todas las etapas del proceso de producción y que será sometido a etapas posteriores de acondicionamiento antes de convertirse en producto terminado.

Producto intermedio. Material parcialmente procesado que será sometido a etapas posteriores de producción antes de convertirse en producto a granel.

Producto terminado. Medicamento en su presentación final.

Pureza. Grado en el cual las materias primas, los productos intermedios y a granel, están exentos de materiales extraños.

Rastreabilidad. Capacidad de reconstruir la historia, localización de un elemento o de una actividad, por medio de registros de identificación.

Rendimiento final. Cantidad de producto terminado obtenido al final del proceso de fabricación.

Rendimiento teórico. Cantidad de producto que será obtenida a través de un proceso.

Sistemas críticos. Son aquellos que tienen impacto directo en los procesos y/o productos.

Surtido. Entrega de materias primas, producto intermedio, producto a granel y/o materiales.

“reconocimiento de contaminaciÓn microbiolÓgica en

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