PÉPTIDOS ANTIMICROBIANOS: UN MECANISMO DE DEFENSA ANCESTRAL CON MUCHO FUTURO

Karla Montaño-Pérez y Francisco Vargas-Albores

PALABRAS CLAVES / Péptidos Antimicrobianos / Inmunidad Innata / PAM /

Karla Montaño-Pérez. Maestría en Ciencias. Estudiante de Doctorado, CIAD.

Francisco Vargas-Albores. Doctor en Biotecnología, Universidad Nacional Autónoma de México. Investigador Titular, Laboratorio de Biotecnología Marina, Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo (CIAD). Dirección: Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo. Apartado Postal 1735, Hermosillo, Son. 83000, México. e-mail: fvargas@cascabel.ciad.mx

Resumen

Los microorganismos son las formas de vida más abundantes en el planeta, siendo muchos de ellos potencialmente patógenos para otros seres vivos. Tanto plantas como animales han evolucionado combatiendo al ataque constante de microorganismos mediante el desarrollo de sistemas de defensa que varían en complejidad de acuerdo al grado evolutivo del organismo. En todos los seres vivos donde se ha estudiado, se ha descrito un mecanismo de defensa conocido como inmunidad innata, la cual es una respuesta no específica e inmediata que se activa por el contacto con agentes extraños. En los últimos años se han descrito diversas moléculas efectoras de la respuesta innata dentro de las que se encuentran las proteínas de bajo peso molecular, conocidas como péptidos antimicrobianos. Aunque combaten un amplio espectro de microorganismos, debido a su mecanismo de acción, estos péptidos no afectan a las células eucarióticas. Por ello, los péptidos antimicrobianos se están estudiando intensamente y se están ensayando como agentes antimicrobianos con aplicación en la producción de alimentos y como agentes terapéuticos.

Summary

Microbes are the most abundant living forms on the planet, yet many of them are potentially pathogens to other living creatures. Plants and animals have survived fighting against microbes through the development of defense systems which vary in complexity according to the evolutionary position of each organism. In all studied organisms, a defense mechanism named innate immunity been described. It is a non-specific and immediate response following the contact with a foreign particle. In the last years diverse effector molecules of the innate immunity have been described, including low molecular weight proteins, known as antimicrobial peptides. Although they can kill a wide range of microbes, due to its action mechanism these peptides are harmless to eukariotic cells. Antimicrobial peptides are the subject of intense research and are being tested as antimicrobial agents in food industry and as therapeutic agents.

Resumo

Os microorganismos são as formas de vida mais abundantes no planeta, sendo muitos deles potencialmente patogênicos para outros seres vivos. Tanto plantas como animais têm evoluído combatendo ao ataque constante de microorganismos mediante o desenvolvimento de sistemas de defesa que variam em complexidade de acordo ao grau evolutivo do organismo. Em todos os seres vivos onde foi estudado, se descreveu um mecanismo de defesa conhecido como imunidade inata, a qual é uma resposta não específica e imediata que se ativa pelo contato com agentes estranhos. Nos últimos anos foram descritas diversas moléculas da resposta inata dentro das que se encontram as proteínas de baixo peso molecular, conhecidas como péptidos antimicrobianos. Ainda que combatem um amplo espectro de microorganismos, devido ao seu mecanismo de ação, estes péptidos não afetam às células eucarióticas. Por isso, os péptidos antimicrobianos estão sendo estudados intensamente e estão sendo experimentados como agentes antimicrobianos com aplicação na produção de alimentos e como agentes terapéuticos.

 

Las plantas y los animales han logrado sobrevivir en coexistencia con microorganismos, muchos de ellos potencialmente patógenos, siendo sorprendente el índice de sobrevivencia logrado gracias a las diversas estrategias de defensa desarrolladas. Estas estrategias incluyen la llamada inmunidad innata y una forma más evolucionada conocida como inmunidad adquirida. El estudio de la inmunología se ha centrado en los mecanismos de defensa adquirida, la cual involucra células especializadas (efectoras y de memoria) y la síntesis de inmunoglobulinas dirigidas a blancos específicos. Este mecanismo parece estar presente únicamente en vertebrados, los cuales representan un reducido número de las especies vivientes. Investigaciones recientes han demostrado la existencia, tanto en el reino animal como en el vegetal, de la inmunidad innata o inmediata (Boman, 1996; 2000; Hoffmann et al., 1999; Nissen-Meyer y Nes, 1997). En este mecanismo participan moléculas que son las primeras en reconocer e intentar la destrucción de las partículas extrañas y que muestran especificidad hacia componentes de la pared celular microbiana como lipopolisacáridos (LPS) de bacterias Gram-, glicolípidos de micobacterias, el ácido lipoteicnoico de bacterias Gram+, -glucanos de levaduras y dobles cadenas de RNA virales, entre otros (Boman, 2000; Hoffmann et al., 1999). Aunque el espectro parece ser reducido, es lo suficientemente eficiente para reconocer la mayoría de los microorganismos. La inmunidad innata comprende también la acción de células fagocíticas, activación del sistema del Complemento y la liberación de péptidos bioactivos (Raa, 1996; Ratcliffe, 1985). Estos elementos de inmunidad han sido detectados en todos los animales, vertebrados e invertebrados, aunque con ligeras variaciones (Figura 1). Por ejemplo, mientras que los vertebrados poseen el sistema del Complemento, los invertebrados cuentan con el sistema de activación de la profenoloxidasa, el cual podría considerarse como un sistema análogo (Vargas-Albores y Yepiz-Plascencia, 1998).

Uno de los elementos de la inmunidad innata que tiene un papel crucial para combatir las infecciones son los péptidos antimicrobianos (PAM). Estas proteínas de bajo peso molecular aparecen en organismos primitivos y se han conservado hasta los mamíferos donde, curiosamente, han sido de los últimos en descubrirse (Boman, 1995; 1996; 2000).

Los PAM fueron reportados por vez primera a mediados de la década 1980-1990 a través de dos líneas de investigación: la primera dirigida a la definición de los mecanismos de la hemolinfa (sangre) de los insectos inmunizados para combatir crecimiento microbiano; mientras que la segunda estudiaba los mecanismos de las células fagocíticas de mamíferos para matar bacterias después de haberlas ingerido (Boman, 1995).

En términos generales, los PAM son péptidos de bajo peso molecular (usualmente menores de 10kDa) codificados en el genoma, a diferencia de otros antimicrobianos producidos por acción enzimática, como la penicilina. Típicamente, son moléculas catiónicas debido a su alto contenido de lisina y arginina. Son anfipáticas, lo que les concede estabilidad en ambientes tanto acuosos como hidrofóbicos. Pueden presentar modificaciones post-traduccionales como glicosilación, circularización, amidación de los extremos y modificación de aminoácidos incluyendo D-aminoácidos (Boman, 1995; Nissen-Meyer y Nes, 1997; Rao, 1995).

Los PAM se sintetizan principalmente en tejidos epiteliales regularmente expuestos al ataque microbiano como la piel, intestino y pulmones. Las células sanguíneas de defensa también son importantes productoras de PAM, donde constituyen parte de los mecanismos efectores no-oxidativo contra patógenos potenciales (Nissen-Meyer y Nes, 1997; Rao, 1995). Los PAM se sintetizan hasta cien veces más rápido que una inmunoglobulina y a mucho menor costo metabólico, pueden almacenarse en altas concentraciones, estar disponibles para actuar inmediatamente y se liberan o producen cuando las células se estimulan por contacto con microorganismos (Nissen-Meyer y Nes, 1997; Rao, 1995). Son un medio rápido, no específico para combatir una amplia variedad de bacterias, hongos, virus e incluso protozoarios (Evans y Harmon, 1995).

Distribución de los PAM

A la fecha se han descrito cerca de 500 PAM provenientes de diversos organismos incluyendo humanos, plantas, invertebrados marinos, anfibios, peces y microorganismos. A pesar de la diversidad de organismos de donde provienen, los PAM comparten similitudes funcionales y estructurales (Tabla I) que han permitido su clasificación.

PAM de plantas

Las plantas no producen ningún tipo de inmunoglobulinas; sin embargo, al igual que los animales, producen sustancias que controlan el crecimiento e invasión de microorganismos. La lista de PAM de plantas continúa creciendo y algunas parecen ser representativas. Las thioninas se sintetizan predominantemente en hojas y flores y tienen una clara actividad contra hongos y bacterias. Del mismo modo, las defensinas tienen una marcada actividad contra hongos (Broekaert et al., 1995; Evans y Harmon, 1995). Aparentemente la función de los PAM es proteger a las semillas durante la germinación, período en el que su concentración llega a ser hasta el 30% del total de proteínas liberadas. Otros ejemplos de PAM de origen vegetal son las heveinas y knottinas que son eficientes en combatir infecciones causadas por hongos y bacterias Gram+ (Broekaert et al., 1995; Evans y Harmon, 1995), así como las circulinas A y B del árbol tropical africano Chassalia

parvifolia. Estos últimos son péptidos circularizados, resistentes a la acción de proteasas y además tienen actividad antiviral (Tam et al., 1999).

PAM de insectos

Los insectos, al igual que el resto de los invertebrados, no son capaces de producir anticuerpos específicos. Aún así, pertenecen al grupo mas exitoso en términos de sobrevivencia y dominio de hábitats (Ratcliffe, 1985). Gran parte de este éxito se debe a sus mecanismos de defensa, donde los PAM tienen un papel decisivo. En los insectos, los PAM son producidos en el cuerpo graso (equivalente al hígado en vertebrados) y en los hemocitos (Bullet, 1999; Gillespie et al., 1997; Hetru et al., 1998). Los PAM fueron descritos primero en insectos por Boman y Steiner 1981, y son, seguramente, los más estudiados y mejor caracterizados. La cecropina es una proteína de poco mas de 3kDa, capaz de inhibir el crecimiento de bacterias Gram- y se produce al inyectar bacterias a la pupa de Hyalophora cecropia (Boman, 1995; 1996). Las cecropinas conforman una familia de proteínas relacionadas, con secuencias similares, un alto contenido de prolina y libres de cisteína, fuertemente catiónicas y particularmente activas contra bacterias Gram-. Están ampliamente distribuidas y se han detectado en varios grupos de insectos, ascideas e incluso en vertebrados, como en el intestino de puerco (Lee et al., 1989).

Miembros de la familia de las defensinas también han sido descritos en insectos como péptidos catiónicos conteniendo 3 puentes disulfuros y con especificidad contra bacterias Gram+. Otros PAM activos contra bacterias Gram- descritos en insectos son las apidaecina, abaecina y royalisina de la abeja Apis mellifera o drosocina de Drosophila, los cuales tienen alto contenido de prolina. También se han descrito PAM de aproximadamente 20kDa y ricos en glicina conocidos como atacinas, sarcotoxinas y diptericinas, entre otros, los cuales actúan en sinergismo con otros péptidos, intensificando su acción. Además, en insectos se han descrito péptidos con actividad fungicida, como la drosomycina, la cual tiene una secuencia similar a las defensinas vegetales (Gillespie et al., 1997; Hetru et al, 1998).

Al igual que en todos los animales estudiados, la lisozima ha sido descrita en insectos y durante mucho tiempo se pensó que era el principal factor antimicrobiano de estos organismos y su secuencia ha sido altamente conservada a través de la evolución. Aunque, por su actividad y tamaño molecular, originalmente se incluyó dentro de los PAM, la lisozima es una enzima que rompe enlaces glicosídicos -(1,4) de los peptidoglicanos de la pared celular bacteriana y su función puede ser digestiva o antimicrobiana (Hetru et al., 1998). Por tratarse de una enzima con diferente estructura y mecanismo de acción, actualmente la lisozima no se considera dentro de los típicos PAM.

Por otra parte, algunos insectos se han utilizado como modelos en estudios genéticos, incluyendo la expresión de los genes de PAM. En Drosophila se ha demostrado que la respuesta antimicrobiana humoral no es específica; sin embargo, puede producir diferentes PAM según el tipo de microorganismo que ha propiciado la infección (Lemaitre et al., 1997). La expresión de los genes de PAM en insectos se da mediante la activación de rutas reguladoras que guardan una estrecha similitud con la regulación y expresión de diversos genes de la respuesta inmune en mamíferos. Estas similitudes sugieren que quizás los genes

de la respuesta inmune, así como su regulación, tengan un ancestro común (Gillespie et al., 1997).

PAM de invertebrados marinos

Al igual que el resto de los invertebrados, los de origen marino carecen de sistema inmune adquirido, pero tienen varios mecanismos de defensa que responden a la presencia de microorganismos. Estos sistemas incluyen la coagulación de la hemolinfa, melanización, aglutinación celular, fagocitosis, producción de oxígeno activo y liberación de PAM (Ratcliffe, 1985; Vargas-Albores y Yepiz-Plascencia, 1998). Actualmente se investigan los PAM en los invertebrados marinos de interés comercial, como crustáceos y moluscos (Charlet et al., 1996; Chisholm y Smith, 1992, 1994, 1995; Hubert et al., 1996), para explicar los mecanismos de defensa de estos organismos y evitar infecciones que afectan la producción. También la investigación busca de información básica para estudios de evolución a nivel molecular, donde se ha utilizado como modelo al cangrejo cacerola (Limulus polyphemus), un organismo considerado fósil viviente (Iwanaga y Kawabata, 1998).

Varios PAM han sido detectados en diferentes especies de cangrejo cacerola existentes (L. polyphemus, Tachypleus tridentatus, T. gigas y Carcinoscopius rotundicauda). Entre ellos están tachyplesinas, tachyticina, tachystatina y defensinas que cubren un amplio rango de actividad antimicrobiana (Armstrong et al., 1996; Ehret-Sabatier et al., 1996; Kawano et al., 1990; Morvan et al., 1997; Nakamura et al., 1988; Saito et al., 1995). Así mismo, se han detectado PAM en algunas especies comerciales como el cangrejo de arena Carcinus maenas (Chisholm and Smith, 1992, 1994), el camarón blanco Penaeus vannamei (Destoumieux et al., 1997, 1999, 2000) y el mejillón Mytillus edulis (Charlet et al., 1996; Hubert et al., 1996), lo cual ha abierto la posibilidad de manipular genes codificadores de PAMs para obtener organismos cultivables más resistentes a enfermedades (Bachère et al., 1995).

PAM de vertebrados

Un grupo interesante para el estudio de PAM son las ranas. Los estudios se iniciaron al observar que animales con heridas en la piel y viviendo en aguas estancadas no presentaban infecciones (Boman, 2000; Rao, 1995). Hoy en día se conocen varios PAM de la piel de diferentes especies de ranas, incluyendo las magaininas, xenopinas y bombininas (Schröder, 1999). Todas presentan un amplio espectro de actividad contra bacterias Gram+ y Gram-, hongos y protozoarios. La piel humana, además de actuar como barrera física protectora, produce una considerable cantidad de PAM, entre los que se encuentran los del tipo cathelicidinas y defensinas, con efectividad contra bacterias Gram+, Gram- y la levadura Candida albicans (Gallo y Huttner, 1998; Schröder, 1999).

Otros epitelios que están constantemente en contacto con microorganismos, tambien expresan defensinas. En las células de Panneth del intestino, el cual posee una flora microbiana específica que rara vez está fuera de control, se han identificado defensinas- (de mayor tamaño que las defensinas-) responsables del control de la flora entérica (Boman, 2000; Evans y Harmon, 1995; Rao, 1995). En los epitelios de la mucosa traqueal,

lengua, pulmón, bronquios, colon y recto de bovinos se ha demostrado la presencia de defensinas que in vitro son efectivas contra E. coli, Kleibsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosas y C. albicans (Evans y Harmon, 1995; Rao, 1995).

Por otra parte, los gránulos de los leucocitos de vertebrados contienen altas concentraciones de defensinas- capaces de combatir bacterias Gram+ y Gram-, hongos filamentosos, muchos virus envueltos y algunas especies de micobacterias. Su importancia se ha demostrado al observar que los pacientes cuyos neutrófilos no producen defensinas, sufren frecuentes infecciones y presentan una respuesta inflamatoria tardía (Evans y Harmon, 1995).

PAM de bacterias

La producción de PAM por bacterias se considera también un mecanismo de defensa, ya que así combaten a otros microorganismos que compiten por nutrientes. Los PAM de origen microbiano generalmente se conocen como bacteriocinas y en su mayoría presentan muchas modificaciones postraduccionales entre las que se incluye circularización y aminoácidos inusuales como los D-aminoácidos y lantioninas (Ryan et al., 1999).

Las bacterias Gram- producen dos tipos de PAM: a) bacteriocinas que pesan alrededor de 20kDa, como las colicinas producidas por E. coli, y b) microcinas menores de 10kDa, producidas por Enterobacteriaceae. Estas ultimas son altamente modificadas y presentan tres diferentes mecanismos de acción: inhibición de enzimas metabólicas, inhibición de la replicación del DNA e interferencia en los procesos energéticos (Nissen-Meyer y Nes, 1997; Rao, 1995; Ryan et al., 1999).

Las bacterias Gram+ producen bacteriocinas menores de 6kDa, usualmente catiónicas, anfifílicas y permeables en membranas, como los PAM de eucariotes. Existen dos grupos de bacteriocinas de bacterias Gram+. El primero no presenta modificaciones postraduccionales (pediocina PA1, sakacina P, leucocina A y mesentericina Y105), mientras que el segundo grupo lo conforman bacteriocinas modificadas o lantibióticos. Estos últimos son péptidos menores de 4kDa con extensas modificaciones postraduccionales incluyendo aminoácidos inusuales, conocidos como lantioninas (3-metilantionina, dehidroalanina y dehidrobutirina), derivados de serina y treonina. Los lantibióticos mejor conocidos son nicina, subtilina y epidermina, los cuales presentan actividad contra bacterias Gram+, aparentemente a través de la formación de poros en la membrana y provocando la lisis celular (Nissen-Meyer y Nes, 1997; Rao, 1995; Ryan et al., 1999).

Clasificación de los PAM

Pese a la diversidad de origen y las modificaciones evolutivas, los PAM han podido ser clasificados basándose en su secuencia y estructura (Boman, 1995; Hwang, 1990). En la actualidad se conocen 5 grupos de PAM que característicamente tienen: 1) hélice-, 2) alto contenido de cisteína, 3) hojas-, 4) alto contenido de un aminoácido y 5) aminoácidos modificados. Estos últimos se han descrito en bacterias y hongos.

Péptidos hélice-. A este grupo pertenecen las cecropinas y las magaininas, entre otros. Estos PAM no contienen cisteína, en sistemas acuosos son lineares, pero adoptan una conformación de hélice- en solventes orgánicos como trifluoroetanol (reproduce las condiciones hidrofóbicas de membrana), lo cual explica su acción a nivel de membrana. La hélice presenta una superficie hidrofóbica y otra altamente positiva que les permite interactuar con los lípidos de las membranas (Boman, 1995; Hwang, 1990; Matsuzaki, 1998) como se explica en la sección Mecanismos de Acción.

Péptidos ricos en cisteína. A este grupo pertenecen las defensinas, las cuales van de 3 a 5kDa y se agrupan en varias clases según la localización de los pares de cisteína, estructura tridimensional y similitud de secuencias. Se incluyen las defensinas- y de vertebrados y las defensinas de plantas e insectos. Estas últimas son las de mayor tamaño y tienen una estructura hélice- que no presentan las defensinas de vertebrados. Las defensinas- fueron detectadas primero en los gránulos de leucocitos y posteriormente en células de Panneth del intestino delgado. Las defensinas- se expresan en células epiteliales y en leucocitos de algunas especies. En su conjunto, las defensinas son activas contra muchas bacterias, hongos, levaduras y virus envueltos. Se ha demostrado que algunas defensinas también presentan actividad quimotáctica, mitogénica, corticostática y citotóxica (Evans y Harmon, 1995; Yang et al., 1999; Yu et al., 2000).

Péptidos de hoja-. Se caracterizan por tener aproximadamente 20 residuos y uno o dos enlaces disulfuro que estabilizan su estructura de hojas- antiparalelas. A este grupo pertenecen polyphemusina II, y lactoferricina B (Hwang, 1990).

PAM con alto contenido de un aminoácido. Tienen una alta concentración relativa de un mismo aminoácido, el cual puede ser triptofano, prolina o histidina como es el caso de las apidaecinas, abaecina, drosocina, protegrinas y cathelicidinas. Su estructura presenta diferentes patrones en soluciones acuosas, pero se vuelven estables en presencia de fosfolípidos (Boman, 1995; Evans y Harmon, 1995; Hwang, 1990).

PAM de origen microbiano. Como su nombre lo indica, a este grupo pertenecen los PAM producidos por bacterias y hongos, los cuales característicamente tienen aminoácidos modificados, como se describió anteriormente.

Mecanismo de Acción

Para llevar a cabo su función microbicida, los PAM utilizan uno de los siguientes mecanismos: a) interferir en la síntesis de enzimas metabólicas ó del DNA, como en el caso de algunos PAM de origen microbiano, cuyo proceso aún no es bien conocido; o b) actuar directamente a nivel de la membrana celular ya sea alterando la permeabilidad o lisándola mediante la formación de canales o poros, como en el caso de los péptidos hélice- (Nissen-Meyer y Nes, 1997; Shai, 1998).

Aunque se desconocen muchos detalles sobre los mecanismos de acción de los PAM hélice-, como las magaininas, se considera que actúan directamente en la membrana celular y que su secuencia de aminoácidos es importante (Matsuzaki, 1998), ya que si se sustituyen aminoácidos que alteren la polaridad del péptido, su actividad disminuye.

Aparentemente no requieren receptores específicos, como se ha demostrado al sustituir aminoácidos por sus correspondientes D-enantiómeros sin alterar su actividad. Ésto ha sido reforzado al demostrar, por resonancia magnética nuclear y dicroismo circular, que el mecanismo de daño se inicia por una interacción electrostática. Este comportamiento molecular y su carácter catiónico hacen que los PAM presenten una mayor afinidad por los fosfolípidos ácidos de las bacterias Gram- y polisacáridos de las bacterias Gram+, que por los fosfolípidos anfipáticos de las membranas de células de mamíferos. Lo anterior permite explicar la falta de citotoxicidad para las células animales y permite proponer a los PAM como agentes terapéuticos altamente específicos (Matsuzaki, 1998; Nissen-Meyer y Nes, 1997; Shai, 1998).

En general, se ha propuesto que el mecanismo de acción de los PAM está dado por los siguientes pasos (Figura 3)

1) La reacción inicia con la unión del PAM y los fosfolípidos ácidos (LPS) de las membranas microbianas mediante fuerzas electrostáticas. Los monómeros de los péptidos anfipáticos se acomodan en la superficie de la membrana de manera que la carga positiva de los aminoácidos básicos concuerden con las cabezas de fosfolípidos con carga negativa. Cuando la concentración relativa entre el péptido y el lípido (P/L) localmente es baja el péptido tiende a orientarse paralelamente en la membrana y es inactivo.

2) Cuando la concentración local relativa del PAM se incrementa, el péptido tiende a tomar una posición perpendicular a la membrana y se inserta, orientando los residuos hidrofóbicos hacia la región hidrofóbica de la membrana. La capacidad de "aceptación" de la membrana por una mayor cantidad de péptido dependerá de la composición lipídica y propiedades fisicoquímicas de la misma. Esto explica los diferentes grados de susceptibilidad de una célula por un determinado PAM y la especificidad hacia ciertas bacterias.

3) Finalmente, la inserción de los péptidos en la bicapa lipídica alteran la permeabilidad de la membrana o bien ocurre la lisis celular por la presencia de los poros (Huang, 2000; Matsuzaki, 1998; Nissen-Meyer y Nes, 1997; Shai, 1998).

Estructura y regulación de los genes de PAM

En los últimos años se han logrado importantes avances en los conocimientos bioquímicos y genéticos sobre la estructura y mecanismos de regulación de los genes de PAM en mamíferos e insectos (Figura 3), particularmente en Drosophila (Barillas-Mury et al., 2000; Boman, 1995; Bullet et al., 1999; Hetru et al., 1998; Hoffmann et al., 1999; Lemaitre et al., 1997). Por ejemplo, se ha demostrado que en el genoma pueden presentarse una o varias copias de estos genes, con variado número de intrones e incluso transposones (Boman, 1995; 2000).

En Drosophila se ha demostrado que los genes codificadores de PAM contienen secuencias de DNA reguladoras conocidas como elementos B. Este tipo de secuencias son similares a las responsables de la regulación de la expresión de la cadena ligera de la inmunoglobulina y de proteínas de respuesta de fase aguda en mamíferos. Por otra parte, en las células del cuerpo graso de Drosophila también se han caracterizado tres factores de

transcripción del tipo rel conocidos como Dorsal, Dif y Relish, los cuales se translocan al núcleo celular en respuesta a un estímulo microbiano. Estos factores nucleares B (NFB) reconocen secuencias B en la región reguladora del gen y, consecuentemente, promueven la producción de PAM (Barillas-Mury et al., 2000; Engström, 1999; Hoffmann et al., 1999; Lemaitre et al., 1997). La activación de los genes de PAM están bajo el control de diversas rutas reguladoras, donde la mejor caracterizada es la ruta Toll, la cual incluye la activación de proteínas de reconocimiento (Spaetzle) que se unen a receptores (Toll). La unión al receptor activa una cascada de fosforilación de proteínas citoplasmáticas (Tir, Tube, Pelle) que a su vez inactivan al inhibidor IB (cactus), para permitir la translocación de los factores de transcripción B (Dorsal, Dif) al núcleo, activando la expresión de genes de la respuesta inmune, incluyendo los PAM (Barillas-Mury et al., 2000; Engström, 1999; Hoffmann et al., 1999; Lemaitre et al., 1997).

Estudios recientes han revelado la presencia de receptores homólogos de Toll en humanos. Estos receptores se activan por la presencia de LPS y participan en la transducción de señales de los LPS a través de la membrana y activan la transcripción de citocinas y moléculas co-estimuladoras como IL-1, IL-6, IL-8 y TNF-. A su vez, estas moléculas estimulan el sistema inmune adquirido, activando la respuesta celular o a la producción de anticuerpos específicos. Así, en los vertebrados, la participación del sistema inmune innato se manifiesta al detectar la presencia de antígenos no propios, activar los primeros mecanismos (respuesta inmediata) y estimular al sistema inmune adquirido (Barillas-Mury et al., 2000; Engström, 1999; Hoffmann et al., 1999; Lemaitre et al., 1997; Yang et al., 1999). Las similitudes funcionales y estructurales de las rutas de señalización de la inmunidad innata tanto en Drosophila como en mamíferos, indican que este mecanismo tiene una importancia vital y que ha tenido que ser conservado a través de la evolución hasta los organismos mas avanzados (Barillas-Mury et al., 2000; Engström, 1999; Hoffmann et al., 1999; Lemaitre et al., 1997).

Perspectivas

Por sus características estructurales y funcionales, así como por su baja toxicidad para células eucarióticas, los PAM están siendo evaluados como agentes terapéuticos y profilácticos. Por ejemplo, las magaininas, dermaseptinas y otros PAM aislados de la piel de ranas se están probando como tratamiento contra infecciones cutáneas (Gallo et al., 1998; Schröder, 1999). Se ha visto además que células cancerígenas presentan alteraciones en la composición lipídica de la membrana haciéndola más ácida que las de células normales. Bajo este principio, los PAM también se están evaluando como agentes anticancerígenos (Shai, 1998).

Debido al potencial que los PAM tienen como agentes terapéuticos, se están diseñando péptidos de novo basados en las características de los péptidos naturales, tales como su estructura tridimensional (Figura 4), su tendencia anfipática y carácter catiónico. Aunque la técnica de producción de péptidos es aún nueva, promete importantes logros en un futuro cercano en el diseño de péptidos más eficientes o que sean estables en diferentes ambientes. Tal es el caso de las defensinas circulares, las cuales son más estables a los cambios de salinidad, y se ha propuesto su aplicación en pacientes con fibrosis cística (Yu et al., 2000). Por otra parte el lantibiótico Nisin, producido por varias cepas de lactococos, ya se está

usando como conservador de alimentos en la industria láctea (Nissen-Meyer y Nes, 1997; Rao, 1995).

Desde el punto de vista bioquímico, los PAM son interesantes modelos para el estudio del mecanismo de incorporación de D-aminoácidos y la modificación post-traduccional de los aminoácidos (Ryan et al., 1999). Para la biotecnología vegetal se abre la posibilidad de diseñar plantas transgénicas resistentes a enfermedades y a plagas a través de la introducción de genes de PAM (Broekaert et al., 1995). Esto mismo crea expectativas para introducir genes de defensa a organismos cultivables, incluyendo a los invertebrados marinos de interés comercial, principalmente moluscos y crustáceos (Bachere et al., 1995). Por último, estudios comparativos sobre la actividad de los PAM en varias especies podrían ayudar a comprender por qué algunos organismos que son comensales en una especie pueden ser patógenos para otra.

Conclusiones

Aunque al principio los PAM se consideraron una curiosidad biológica de menor importancia, hoy se ha confirmado que estas moléculas, además de su acción antimicrobiana directa, también intervienen en procesos reguladores. La inmunidad adquirida surgió hace unos 450 millones de años en los primeros vertebrados mandibulados, quienes desarrollaron la capacidad de "recordar" los patógenos con los que estuvieron en contacto y la selección natural hizo de esta adaptación una característica de los vertebrados. Sin embargo, la ancestral respuesta innata no se eliminó, sino que se integró al estimular y orientar a la respuesta adaptativa controlando la expresión de moléculas co-estimuladoras.

Los estudios sobre los constituyentes y los mecanismos de este ancestral sistema de defensa han ayudado a comprender las estrategias de sobrevida ante microorganismos y han abierto perspectivas en la concepción de tratamientos terapéuticos contra infecciones. Debido a la aparición de cepas resistentes, muchos antibióticos comerciales ya no son efectivos. Por ello, una solución prometedora es la producción de nuevos antibióticos lo más diferentes posibles a aquellos que han perdido efectividad y cuya resistencia no parece ser fácil de alcanzar, ya que no solamente depende de la neutralización de un agente químico, sino de la alteración de la membrana celular.

Los PAM, cuya acción protectora han usado plantas y animales por millones de años, llenan muchos requerimientos que demanda la industria farmacéutica, la agricultura, acuacultura y producción de alimentos en general. Ante esta perspectiva se abre un amplio campo de investigación tanto en ciencia básica como en la biotecnología y bioingeniería de agentes terapéuticos más durables. Aunque forman parte de un mecanismo de defensa ancestral, los PAM representan un futuro prometedor en la lucha contra microorganismos patógenos.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen a Rogerio Sotelo Mundo por su ayuda en la elaboración de las figuras de estructuras tridimensionales y a CONACyT por el apoyo a través del Proyecto No. 31544-B.

Figura 1. Diagrama simplificado de activación del sistema inmune. En la primera etapa de la infección se da el reconocimiento del elemento extraño mediante proteínas plasmáticas y/o receptores celulares. Se da así mismo una señalización extracelular por la liberación de citocinas que "alertan" a otras células. Una vez reconocido el elemento extraño el organismo reacciona ante la infección dando una respuesta de activación celular, extracelular e intracelular expresándose genes que contrarrestan la infección. Este proceso de reconocimiento y reacción se conoce como inmunidad innata, presente en vegetales y animales tanto vertebrados como invertebrados. La proliferación y diferenciación celular que lleva a la producción de inmunoglobulinas contra antígenos específicos se conoce como inmunidad adquirida, exclusiva de los vertebrados.

Figura 2. Esquema representativo del mecanismo de acción de péptidos antimicrobianos del tipo hélice alfa. a: El péptido que en solución acuosa tiene una conformación lineal, al contacto con una membrana adquiere una estructura de hélice donde se polarizan los aminoácidos hidrofóbicos y los aminoácidos catiónicos. b: La interacción electrostática entre los lipopolisacáridos de la membrana microbiana y los péptidos hace que éstos tomen una posición paralela a la membrana. c: Al aumentar la concentración del PAM, estos se insertan perpendicularmente en la membrana dando lugar a la formación de canales o poros por los que fluyen elementos celulares. Basada en Hetru et al., 1998, Huang, 2000; Shai, 1998.

Figura 3. Rutas de señalización conservadas del sistema inmune innato en mamíferos y en Drosophila. Izquierda: activación de genes de proteínas co-estimuladoras por unión del complejo LPS-LBP-CD14 con el receptor homólogo Toll. Derecha: inducción del gen antifúngico, drosomicina, activado por el receptor transmembranal Toll. Nótese la similitud de los componentes en ambos organismos: 1) activación del receptor por una proteína de reconocimiento del agente microbiano; 2) activación de una cascada de fosforilación; 3) fosforilación del inhibidor del factor de transcripción; 4) translocación del factor de transcripción que intensifica la expresión de genes de la respuesta inmune. Basada en Bullet et al., 1999; Engström, 1999; Hetru et al., 1998.

Figura 4. Estructura tridimensional de algunos péptidos antimicrobianos. a: Defensina de planta Tomada del archivo PDB 1BK8 Determination of the three-dimensional solution structure of Aeusculus hippocastanum antimicrobial protein 1 (Ah-AMP1) by 1H NMR. b: Defensina A de insecto. Tomada del archivo PDB 1ICA Source flesh fly (Phormia terranovae) larva recombinant form expressed in Saccharomyces cerevisiae. c: Lantibiótico, vista del hexámero mostrando la posición de las fenilalaninas que forman el canal hidrofóbico. Tomada del archivo PDB 1QOW Mersadicidin from Bacillus strain: HILY-85,54728. d: Vista de una subunidad del lantibiótico. En línea gruesa se muestra el

esqueleto polipeptídico y en línea delgada los puentes covalentes entre las cisteínas y el residuo del alfa-amino butírico o dehidroalanina.

REFERENCIAS

Armstrong PB, Melchior R, Quigley JP (1996) Humoral immunity in long-lived arthropods. J. Insect Physiol. 42: 53-64.

Bachère E, Mialhe E, Noel D, Boulo V, Morvan A, Rodriguez J (1995) Knowledge and research prospects in marine mollusc and crustacean immunology. Aquaculture 132: 17-32.

Barillas-Mury C, Wizel B, Soo Han Y (2000) Mosquito immune responses and malaria transmission: lessons from insect model systems and implications for vertebrate innate immunity and vaccine development. Insect Biochem. Mol. Biol. 30: 429-442.

Boman HG (1995) Peptide antibiotics and their role in innate immunity. Ann. Rev. Immunol. 13: 61-92.

Boman HG (1996) Peptide antibiotics: holy or heretic grails of innate immunity? Scand. J. Immunol. 43: 475-482.

Boman HG (2000) Innate immunity and the normal microflora. Immunological Rev. 173: 5-16.

Boman HG, Steiner H (1981) Humoral immunity in Cecropia pupae. Current Topics in Microbiological Immunology 94-95: 75-91.

Broekaert WF, Terras FRG, Cammue BPA, Osborn RW (1995) Plant defensins: novel antimicrobial peptides as components of the host defense system. Plant Physiol. 108: 1353-1358.

Bullet P, Hetru C, Dimarcq J-L, Hoffmann D (1999) Antimicrobial peptides in insects; structure and function. Devel. Comp. Immunol. 23: 329-344.

Charlet M, Chernysh S, Philippe H, Hetru C, Hoffmann JA, Bullet P (1996) Innate Immunity. Isolation of several cysteine-rich antimicrobial peptides from the blood of a mollusc, Mytilus edulis. J. Biol. Chem. 271: 21808-21813.

Chisholm JRS, Smith VJ (1992) Antibacterial activity in the haemocytes of the shore crab, Carcinus maenas. J. Marine Biol. Assoc. UK 72: 529-542.

Chisholm JRS, Smith VJ (1994) Variation of antibacterial activity in the hemocytes of the shore crab, Carcinus maenas, with temperature. J. Marine Biol. Assoc. UK 74: 979-982.

Chisholm JRS, Smith VJ (1995) Comparison of antibacterial activity in the hemocytes of different crustacean species. Comp. Biochem. Physiol. 110A: 39-45.

Destoumieux D, Bullet P, Loew D, Vandorsselaer A, Rodriguez J, Bachere E (1997) Penaeidins, a new family of antimicrobial peptides isolated from the shrimp Penaeus vannamei (decapoda). J. Biol. Chem. 272: 28398-28406.

Destoumieux D, Bullet P, Strub JM, van Dorsselaer A, Bachère E (1999) Recombinant expression and range of activity of penaeidins, antimicrobial peptides from penaeid shrimp. European J. Biochem. 266: 335-346.

Destoumieux D, Muñoz M, Cosseau C, Rodríguez J, Bullet P, Comps M, Bachère E (2000) Penaeidins, antimicrobial peptides with chitin-binding activity, are produced and stored in shrimp granulocytes and released after microbial challenge. J. Cell Sci. 113: 461-469.

Ehret-Sabatier L, Loew D, Goyffon M, Fehlbaum P, Hoffmann JA, Vandorsselaer A, Bullet P (1996) Characterization of novel cysteine-rich antimicrobial peptides from scorpion blood. J. Biol. Chem. 271: 29537-29544.

Engström Y (1999) Induction and regulation af antimicrobial peptides in Drosophyla. Develop. Comp. Immunol. 23: 345-358.

Evans EW, Harmon, BG (1995) A review of antimicrobial peptides: defensins and related cationic peptides. Veterinary Clin. Pathol. 24: 109-116.

Gallo RL, Huttner, KM (1998) Antimicrobial peptides: an emerging concept in cutaneous biology. J. Investigative Dermatol. 111: 739-743.

Gillespie JP, Kanost MR, Trenczek T (1997) Biological mediators of insect immunity. Ann. Rev. Entomol. 42: 611-643.

Hetru C, Hoffmann D, Bullet, P (1998) Antimicrobial peptides from insects. en Hultmark. PTBaD (Ed), Molecular mechanisms of immune responses in insects. Chapman & Hall. London. pp 40-66.

Hoffmann JA, Kafatos FC, Janeway CA, Ezekowitz RAB (1999) Phylogenetic perspectives in innate immunity, Science 284: 1313-1318.

Huang HW (2000) Action of antimicrobial peptides: two-state model. Biochemistry 39: 1-6.

Hubert F, van der Knapp W, Noël T, Roch P (1996) Cytotoxic and antibacterial properties of Mytilus galloprovincialis, Ostrea edulis and Cassostrea gigas (bivalve molluscs) hemolymh. Aquatic Living Resources 9: 115-124.

Hwang HJ (1990) Structure-function relationships of antimicrobial peptides. Biochem. Cell Biol. 76: 235-246.

Iwanaga S, Kawabata SI (1998) Evolution and phylogeny of defense molecules associated with innate immunity in horseshoe crab. Frontiers in Bioscience 3: 973-984.

Kawano K, Yoneya T, Miyata T, Yoshikawa K, Tokunaga F, Terada Y, Iwanaga S (1990) Antimicrobial peptide, Tachyplesin I, isolated from hemocytes of the horseshoe crab (Tachypleus tridentatus) - NMR determination of the beta sheet structure. J. Biol. Chem. 265: 15365-15367.

Lee JY, Boman A, Sun C, Anderson M, Jörnvail H, Mutt V, Boman HG (1989) Antibacterial peptides from pig intestine: isolation of a mammalian cecropin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 9159-9162.

Lemaitre B, Reichhart JM, Hoffmann J (1997) Drosophyla host defense: differential induction of antimicrobial peeptide genes after infection by various classes of microorganisms. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 14614-14619.

Matsuzaki K (1998) Magainins as paradigm for the mode of action of pore forming polypeptides. Biochim.. Biophys. Acta 1376: 391-400.

Morvan A, Iwanaga S, Comps M, Bachere E (1997) In vitro activity of the limulus antimicrobial peptide tachyplesin on marine bivalve pathogens. J. Invertebrate Pathol. 69: 177-182.

Nakamura T, Furunaka H, Miyata T, Tokunaga F, Muta T, Iwanaga S, Niwa M, Takao T, Shimonishi Y (1988) Tachyplesin, a class of antimicrobial peptide from the hemocytes of the horseshoe crab (Tachypleus tridentatus). J. Biol. Chem. 263: 16709-16713.

Nissen-Meyer J, Nes IF (1997) Ribosomally synthesized antimicrobial peptides: Their function, structure, biogenesis and mechanism of action. Arch. Microbiol. 167: 67-77.

Raa J (1996) The use of immunostimulatory substances in fish and shellfish farming. Reviews in Fisheries Science 4: 229-288.

Rao AG (1995) Antimicrobial Peptides. Molecular Plant-Microbe Interactions 8: 6-13.

Ratcliffe NA (1985) Invertebrate immunity - a primer for the non-specialist. Immunol. Lett. 10: 253-270.

Ryan MP, Jack RW, Josten M, Sahl HG, Jung G, Ross RP, Hill C (1999) Extensive post-translational modification, including serine to D-alanine conversion, in the two component lantibiotic, lacticin 3147. J. Biol. Chem. 274: 37544-37550.

Saito T, Kawabata S, Shigenaga T, Takayenoki Y, Cho JK, Nakajima H, Hirata M, Iwanaga S (1995) A novel big defensin identified in horseshoe crab hemocytes - isolation, amino acid sequence, and antibacterial activity. J. Biochem. 117: 1131-1137.

Schröder JM (1999) Epithelial peptide antibiotics. Biochem. Pharmacol. 57: 121-134.

Shai Y (1998) Mode of action of antibacterial peptides. In Hultmark PTBaD (ed), Molecular Mechanisms of Immune Responses in Insects. Chapman & Hall. London. pp 111-131.

Tam JP, Lu Y, Yang J, Chiu K (1999) An unusual structural motif of antimicrobial peptides containing end-to-end macrocycle and cysteine-knot disulfides. Biochemistry 96: 8913-8918.

Vargas-Albores F, Yepiz-Plascencia G (1998) Shrimp Immunity. Res. Trends Comp. Biochem. Physiol. 5: 195-210.

Yang D, Chertov O, Bykovskaia SN, Chen Q, Buffo MJ, Shogan J, Anderson M, Schröeder JM, Wang JM, Howard OMZ, Oppenheim JJ (1999) B-defensins: linking innate and adaptive immunity through dendritic and T cell CCR6. Science 286: 525-527.

Yu Q, Lehrer RI, Tam JP (2000) Engineered salt-insensitive a-defensins with end-to-end circularized structures. J. Biol. Chem. 275: 3943-3949.