purificaciÓn y caracterizaciÓn bioquÍmica de … · nih de trombina/mg. la enzima fue inhibida...
TRANSCRIPT
Purificación y caracterización bioquímica de la enzima similar a trombina del veneno de la serpiente... 463
Rev Soc Quím Perú. 83(4) 2017
Recibido el 23-10-17Aprobado el 18-12-17
PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA DE LA ENZIMA SIMILAR A TROMBINA DEL VENENO DE LA
SERPIENTE Bothrops brazili
LuisRuiz*a,DanVivas-Ruiza,FannyLazoa,WolframSeiferta,EdithRodrígueza,GustavoSandovala,ArmandoYarlequéa.
RESUMEN
Se ha purificado una enzima coagulante del veneno de la serpiente Bothrops brazili denominadaenzimasimilaratrombina(TLE)mediantetrespasoscromatográficossucesivossobreSephadexG-75,DEAESephadexA-50ySephadexG-50,empleandobufferTris-HCl0,05MpH8,5.Laenzimafuepurificada15,9vecesconunrendimientodel28,6%yporPAGE-SDSseobtuvounasolabandaproteicade48kDa,tantoencondicionesreductorascomo no reductoras usando 2β-Mercaptoetanol. Se trata de una proteína con actividadcoagulante,tantosobreplasmahumanocitratadocomosobrefibrinógenobovino.LaenzimamostróactividadamidolíticasobreelsustratocromogénicoBenzoil-Arginil-p-Nitroanilina(BApNA)ylapotenciacoagulantesobreelfibrinógenobovinofuecalculadaen121unidadesNIHde trombina/mg.Laenzimafue inhibidaporPMSFyporel inhibidorde tripsinadesoya,porloquesetratadeunaserinoproteasa;elpHóptimoparalaactividadamidolíticafuede8,5y laproteína fue estable al tratamiento térmico solohasta los40 ºC.Ladosisdefibrinogenantemínimafue8μg/gderatónymediantepruebasdeinmunodifusióndobleseobservóinmunorreactividadconrespectoalsueroantibotrópicopolivalentedelINS.
Palabras clave: Bothrops brazili,enzimasimilaratrombina,veneno,serpiente,coagulación.
PURIFICATION, BIOCHEMICAL AND BIOLOGICAL CHARACTERIZATION OF THE THROMBIN-LIKE ENZYME
PRESENT IN THE VENOM OFTHE SNAKE Bothrops brazili
ABSTRACT
AcoagulantenzymefromBothrops brazilisnakevenomcalledthrombin-likeenzymewaspurified by three successive chromatographic steps on SephadexG-75,DEAE SephadexA-50andSephadexG-50using0.05MTris-HClbufferpH8.5.Theenzymewaspurified15.9timeswithayieldof28.6%andbyPAGE-SDSasingleproteinbandof48kDawasobtainedbothinreducingandnon-reducingconditionsusing2β-Mercaptoethano.,Itisaunicatenary
aLaboratoriodeBiologíaMolecular,FacultaddeCienciasBiológicas.UNMSM.*[email protected]
Luis Ruiz, Dan Vivas-Ruiz, Fanny Lazo, Wolfram Seifert, Edith Rodríguez, Gustavo Sandoval...464
Rev Soc Quím Perú. 83(4) 2017
proteinwithcoagulantactivityonbothcitratedhumanplasmaandbovinefibrinogen.Theenzyme showed amidolytic activity on the chromogenic substrate Benzoyl-Arginyl-p-Nitroaniline(BApNA)and thecoagulantpotencyonbovinefibrinogenwascalculatedon121NIHunitsofthrombin/mg.TheenzymewasinhibitedbyPMSFandthesoybeantrypsininhibitor,therefore,itisaserineprotease;theoptimumpHfortheamidolyticactivitywas8.5andtheproteinwasstabletoheattreatmentonlyupto40°C.Theminimaldefibrinogenatingdosewas8μg / gofmouse andbydouble immunodiffusion tests immunoreactivitywasobservedwithrespecttoINSpolyvalentantibothropicserum.
Key words: Bothrops brazili,Thrombin-likeenzyme,snake,venom,coagulation.
INTRODUCCIÓN
Losvenenos de serpientes son una de las sustancias demayor complejidad en elmundoanimal,enestassepuedenencontrarunadiversidaddemoléculasorgánicaseinorgánicasqueactúandeunamanerasinérgicaconelobjetivodeinmovilizar,matarydigeriralapresao,encasoalternativo,defendersedesusdepredadores.Loscomponentesorgánicos,ensumayoría, son de naturaleza proteica y entre estas destacan las serinoproteasas, un grupoparticulardeenzimasqueposeenaunresiduodeserinaquedirigeelataquenucleofílicoenla actividad catalítica.
Lasserinoproteasasactúanprincipalmenteanivelsistemahemostáticointerfiriendoconlosprocesosdecoagulación(activandooinhibiendo),procesosfibrinolíticososobrelaagregacióndeplaquetas.EnestegrupodeproteasasdestacanlasenzimassimilaresatrombinaoTLE(delinglésThrombin-likeenzymes)lascualestienenlacapacidaddecoagularelfibrinógenodeunamanerasemejantea la trombina(enzimaencargadade lacoagulaciónsanguíneayotros procesos fisiológicos)1, no obstante, existen marcadas diferencias estructurales yfuncionalesentrelasTLEsylatrombina,entrelasquedestacanlainsensibilidaddelasTLEsantelaheparina,principalinhibidordelatrombinaylanonecesidaddeionesparaactivarsucatálisis.
Estructuralmente,lasTLEssonmonoméricasypresentanunatriadacatalíticacompuestaporlosresiduosHis57,Asp102ySer195.Además,cuentaconseispuentesdisulfuroencargadosdelaestabilidad,deloscualescincodeellosestánpresentesentodaslasserinoproteasas,yelsexto(Cys91-Cys245)esexclusivodelasserinoproteasasdevenenosdeserpientes2.
LasTLEssonestudiadasporsupotencialaplicaciónterapéuticacomoReptilasa®yAncrodde Bothrops atroxyCalloselasma rhodostoma,respectivamente,ambasempleadasparatratarafecciones cardiovascularesdebido a la acciónfisiológica coagulante invivoque ejercensobreelsistemahemostático.
EnelPerúseharealizadoestudiosrigurosossobreestaenzimaenlosvenenosdeB. barnetti, B. pictus, B. atroxyL. muta3,4,5,6. En cuanto a Bothrops brazili,peruana,conocidatambién
Purificación y caracterización bioquímica de la enzima similar a trombina del veneno de la serpiente... 465
Rev Soc Quím Perú. 83(4) 2017
como“jergónshushupe”,solosecuentaconunestudiopreliminardelaTLEensuponzoña,apartirdeunapurificaciónparcialycuyaactividadsolohasidoensayadasobresustratoscromogénicos7, sinembargo, la referenciamás recientecon respectoa serinoproteasasdeestaespeciefuereportadaporZaqueoet al.8,quieneslograronpurificarunadeestasenzimasdeunespécimenoriundodeBrasil.B. braziliesunaespecieparticularmenteabundanteenla selvanortedelPerúabarcando losdepartamentosdeLoretoyAmazonas, fronteraconEcuador,yesunaserpientecapazdeinocularhasta4mLdevenenopormordedura.
Laimportanciadeesteestudioestribaenconocerlascaracterísticasmásrelevantesdeestaproteínacoagulanteyrelacionarlasconelgradodetoxicidaddelveneno,suantigenicidadylacapacidaddelantivenenobotrópicocomercialparaneutralizarla.
PARTE EXPERIMENTAL
VenenoSeobtuvovenenodeespecímenesadultosdeBothrops braziliprocedentesdelazonadelAltoMarañón,departamentodeAmazonas,ymantenidosenelSerpentario“OswaldoMeneses”delMuseodeHistoriaNaturaldelaUNMSM.Posteriormentefueliofilizadoysemantuvoa-20°Chastasuuso.
Cuantificación de proteínasLa cantidad de proteína fue calculadamidiendo la absorbancia de luzUV a 280 nm9 en unespectrofotómetroGenesys5.Además,seempleóelmétododeLowry10modificadoennuestrolaboratorio,utilizandounfotocolorímetroSpectronicBausch&Lomb,empleandoalbúminaséricabovinacomoproteínaestándar.
Actividad coagulanteSerealizódeacuerdoconelManualdelInstitutoClodomiroPicado11,usandocomosustratosplasmahumanocitratadoyfibrinógenobovinocomercial(5mg/mL).Elplasmahumanoseobtuvodedonantesvoluntariossaludables,paraelloseextrajosangrevenosa, lacual fuemezcladaconsolucióndecitratodesodio3,8%enrelación9:1ysecentrifugóa4000rpmdurante10minutosparasepararelplasmadelospaquetesglobulares.Elfibrinógenobovinocomercialfuepreparadoaunaconcentraciónde5mg/mLenbufferTrisHCl0,05MpH7,4a37ºC.Laactividadconsistióenpreincubar0,2mLdelsustratoa37°Cyposteriormenteseadicionó50µLdeenzimapurificadaysemidióeltiempodecoagulacióncompletadelsustrato.Laactividadenzimáticasedeterminódividiendolainversadeltiempodecoagulaciónentrelosmgdeproteínautilizados.
Actividad amidolíticaSedeterminóempleandoelmétododeErlangeret al.12,utilizandoelsustratocromogénicoBenzoil-Arginil-p-nitroanilida (BApNA) midiéndose la liberación de p-Nitroanilina porespectrofotometría.Lamezcladereaccióncontenía1,5mLdeBApNAaunaconcentraciónde 9x10-4M; 0,5mLde bufferTris-HCl 0,05MpH8,1 y 50μLde lamuestra.Luegode
Luis Ruiz, Dan Vivas-Ruiz, Fanny Lazo, Wolfram Seifert, Edith Rodríguez, Gustavo Sandoval...466
Rev Soc Quím Perú. 83(4) 2017
incubarpor15minutosa37°Cseadicionó1mLdeácidoacéticoal60%paradetenerlareacciónycuantificarlap-Nitroanilinaporsuabsorbanciaa405nm.
Purificación de la enzima100 mg de veneno de Bothrops brazilifuerondisueltosen1mLdebufferTris-HCl0,05MpH8,5yaplicadosenunacolumnadefiltraciónmolecularSephadexG-75(28x1,2cm)previamenteequilibradaconbufferTris-HCl0,05MpH8,5.Secolectaronfraccionesde1mLaunflujode10mL/h.Sedeterminólacantidaddeproteínaencadafracciónporabsorbanciaa280nm,elmonitoreodelaenzimafuerealizadoporlaactividadamidolíticaylasfraccionesconmayor actividad fueron juntadas, concentradas y aplicadas a una columna deDEAESephadexA-50(30cmx1,5cm).LaenzimaeluyóalaplicarelbufferyamencionadoconNaCl0.3Maunflujode16mL/hysemonitoreólaactividadamidolítica.LasfraccionesresultantesconmayoractividadfueronposteriormenterecromatografiadasenunacolumnadeSephadexG-50(28x1,2cm)conbufferTris-HCl0,05MpH8,5aunflujode9mL/h.Finalmente,luegodeevaluarlaactividadamidolítica,sejuntóyconcentrólasfraccionesdeinterésparalaevaluacióndelpesomolecular.
Electroforesis en geles de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (PAGE-SDS)Cantidadesequivalentesa10μgdelaenzimaenestudiofuerontratadasconbuffermuestrapara PAGE-SDS en condiciones reductoras (β-mercaptoetanol) y no reductoras usandounacámaraverticalMINI-GELSystem(Sigma), siguiendo lametodologíadeLaemmli13. Se realizó la corrida electroforética en gel de poliacrilamida al 10% durante a 1h a unvoltajeconstantede120voltiosyseemplearoncomoproteínaspatronesdepesomolecular:albúminaséricabovina(66kDa),ovoalbúmina(45kDa),anhidrasacarbónica(29kDa)ylisozima(14,3kDa).
Determinación de la potencia coagulanteSerealizóempleandoelmétododeBaughman14usandofibrinógenobovinocomercialcomosustrato,paracompararlostiemposdecoagulaciónobtenidoscontrombinabovinacomercial(100unidades),venenototal(0,1mg/mL)yenzimapurificada(0,06mg/mL).
LaaccióncoagulantedelatrombinaodelaenzimasimilartrombinaseexpresaenunidadesNIHdetrombina/mgdeproteína.Sedefineunaunidadcomolacantidaddetrombinacapazdecoagularunamuestrade0,2mLdeplasmaofibrinógenoenuntiempode15segundosa37ºC.
pH óptimo y efecto térmicoElpHóptimo fuedeterminadoempleandobuffer acetatode sodio0,2Menun rangode4,0a6,0;bufferfosfatodesodio0,2MpH6,0-7,0ybufferTrisHCl0,2MpH8,0-10,0.Semidió laactividadsobreBApNAempleando25μLde laenzimapurificada.Encuantoal tratamientotérmico,alícuotasde30μLdelaenzimafueronsometidasacalentamientopor15minutosa temperaturasde37,40,50,60,70,80y90°C.Luegofueronenfriadosrápidamente,colocándolosenhieloparainmediatamentedespués,medirlaactividadsobreBApNA.
Purificación y caracterización bioquímica de la enzima similar a trombina del veneno de la serpiente... 467
Rev Soc Quím Perú. 83(4) 2017
Efecto de iones metálicos e inhibidoresSeprepararonpreincubadosdelaenzimaconlosionescalcio,magnesio,sodio,potasioymanganesobajo la formadeclorurosaconcentracionesfinalesde5y10mM.Elmismotratamientoseempleóparaensayarlosagentes:Fenil-metilsulfonilfluoruro(PMSF),Tosillisil clorometil cetona (TLCK), Ácido Etilendiaminotetraacético (EDTA), iodoacetatoe inhibidor de tripsina de soya, registrándose las actividades enzimáticas luego de estostratamientos.
Actividad Defibrin(ogen)anteSedeterminósiguiendoelprotocolodelManualdel InstitutoClodomiroPicado11,usandoratonesalbinosde lacepaBalbcobtenidosdel InstitutoNacionaldeSalud(INS-Perú).Ladosisdefibrinogenantemínima(DDM)correspondealamenorcantidaddevenenoqueproduceincoagulabilidadtotaldelasangreenellotecorrespondientederatonesinyectados.
InmunodifusiónSe evaluó siguiendo el método de Ouchterlony y Nilsson15. Para este ensayo se utilizóantiveneno botrópico polivalente (INS-Perú lote 1000376). Para el revelado se empleóazul brillante deCoomasie al 0,1%y solucióndecolorante para evidenciar las líneas deprecipitación.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Purificación y peso molecular de la enzimaEnlafigura1seresumenlospasosdepurificacióndelaenzimasimilaratrombinadelvenenodelaserpienteB. brazili,nuestroprocedimientofinalizóconlaobtencióndelaproteínaalestadohomogéneoconunfactordepurificaciónde15,9vecesyunrendimientode28,5%(tabla1).LaproteínamostróuncomportamientobásicoapH8,5debidoaqueseligóalaresinadeDEAEy fuenecesaria laadicióndelNaClparadesligarla.LosdatosobtenidosreflejansermáseficacesconrespectoaloreportadopreviamenteporLimán7.
Luis Ruiz, Dan Vivas-Ruiz, Fanny Lazo, Wolfram Seifert, Edith Rodríguez, Gustavo Sandoval...468
Rev Soc Quím Perú. 83(4) 2017
Figura 1. Purificación de la enzima similar a trombina de B. brazili. (A) Primer paso de purificación de la
TLE sobre Sephadex G-75. (B) Segundo paso de purificación sobre DEAE Sephadex A-50. (C) Tercer
paso purificación sobre Sephadex G-50. (D) Análisis en PAGE-SDS de la enzima purificada en
condiciones reductoras (carril 2) y no reductoras (carril 3).
El análisis electroforético, tanto en condiciones reductoras como en no reductoras,
mostró que la enzima purificada de B. brazili aparece como una banda de 48 kDa
calculado mediante la determinación del Rf (Fig. 1d), valor que se encuentra en el rango
reportado para otras TLEs, que va desde los 29 kDa hasta los 67 kDa1 y que difiere de
lo reportado por Zaqueo et al8 para una serinoproteasa aislada de la ponzoña de B.
brazili de Brasil, donde se tuvo un peso molecular de 36kDa de masa relativa
determinada por SDS-PAGE 12,5%. La presencia de una única banda indica que la
enzima purificada está compuesta de una sola banda proteica al igual que la mayoría de
las TLEs1.
Actividad similar a trombina
El veneno total de B. brazili presentó una DCM-P de 18,32 µg., mientras que para la
misma especie Rojas16 obtuvo una DCM-P de 7,39 µg. Esta variabilidad podría deberse
a factores como la edad del ofidio, el hábitat, la dieta alimentaria y la estación en la cual
se realizó la colecta del veneno. Casos similares se observan para el veneno total de
Figura 1. Purificaciónde la enzima similar a trombinadeB. brazili. (A)Primer pasodepurificacióndelaTLEsobreSephadexG-75.(B)SegundopasodepurificaciónsobreDEAESephadexA-50.(C)TercerpasopurificaciónsobreSephadexG-50.(D)AnálisisenPAGE-SDSdelaenzimapurificadaencondicionesreductoras(carril2)ynoreductoras(carril3).
Elanálisiselectroforético,tantoencondicionesreductorascomoennoreductoras,mostróquelaenzimapurificadadeB. braziliaparececomounabandade48kDacalculadomedianteladeterminacióndelRf(Fig.1d),valorqueseencuentraenelrangoreportadoparaotrasTLEs,quevadesdelos29kDahastalos67kDa1yquedifieredeloreportadoporZaqueoet al8paraunaserinoproteasaaisladadelaponzoñadeB. brazilideBrasil,dondesetuvounpesomolecularde36kDademasarelativadeterminadaporSDS-PAGE12,5%.LapresenciadeunaúnicabandaindicaquelaenzimapurificadaestácompuestadeunasolabandaproteicaaligualquelamayoríadelasTLEs1.
Actividad similar a trombinaEl veneno total de B. brazilipresentóunaDCM-Pde18,32µg.,mientrasqueparalamismaespecieRojas16obtuvounaDCM-Pde7,39µg.Estavariabilidadpodríadeberseafactorescomolaedaddelofidio,elhábitat,ladietaalimentariaylaestaciónenlacualserealizólacolectadelveneno.CasossimilaresseobservanparaelvenenototaldeCrotalus durissusyLachesis muta,puestoquesusactividadescoagulantesdifierensegúnlazonageográfica17,18. LaactividadamidolíticadelaenzimasobreBApNA(0,317U/mgdeproteína)resultamenorque las exhibidas por otras enzimas purificadas de venenos de serpientes peruanas comoLachesis muta(2,25U/mg)6,B. barnetti(1,025U/mg)19,B. atrox,(0,874U/mg)5yB. pictus (0,635U/mg.)4. Sin embargo, y en contraste con lo reportado porLimán7 (0,074U/mg),la actividadespecíficadenuestraenzimapurificada fuemuchomayor,debido tambiénalmejorgradodepurificaciónyrendimientoalcanzadoconlametodologíadesarrolladaenesteestudio.
Purificación y caracterización bioquímica de la enzima similar a trombina del veneno de la serpiente... 469
Rev Soc Quím Perú. 83(4) 2017
Potencia coagulanteLa potencia coagulante calculada para el veneno de B. brazilisobreelfibrinógenobovinofuede7,1NIHdetrombina/mg,mientrasqueparalaenzimapurificadafuede121NIHdetrombina/mg.LapotenciacoagulantedelasTLEspurificadasestándentrodeunrangode0,03a2000UnidadesNIHde trombina/mgdeproteínaydentrodelgéneroBothrops,elrangovade0,7a1100unidadesNIHdetrombina/mg19,21.
pH óptimo y termoestabilidadLamayoríadelasTLEssonóptimamenteactivasapHcercanosa8,0ysonestablesapHneutrosyalcalinos.Laenzimaaisladaenestetrabajodemostrótenerunaactividadporencimadel50%desdeunpHneutro(7,0)amoderadamentealcalino(9,0),conunvaloróptimoapH8,5usandoBApNAcomosustrato.EstemismovalorfueobtenidoparaTLEdelasserpientesperuanasB. pictus4yB. barnetti19yseasemejaaloreportadoparaB. brazilideBrasil8.
ElpHóptimovaríadeacuerdoconlaenzimaylosdiferentessustratossobreloscualesellasactúan.ValoresextremosdepHpuedencausardesnaturalizaciónproteicaconsiderableylaconsecuenteinactivaciónenzimática,poresoesmuyútilsaberenquérangodepHlaenzimaesmásestable,yaqueelpHdemáximaestabilidadnosiemprecoincideconeldemáximaactividad3.
LaenzimasimilaratrombinadeB. brazilimostróunaactividadenzimáticacrecienteentrelos37y40ºC,manteniendomásdel50%desuactividadhastalos50ºCyregistrandosuacciónmáximaa37ºC.LosresultadosobtenidossecorroboranconlosyareportadosporLimán7,dondelaenzimadeB. brazilipresentaactividadmáximahastalos40ºC,peropierderápidamentesuactividadllegandoatenersolamenteel17%deactividadalos70ºC.Estosresultadosindicanquelaenzimadeestaespecienoesmuyestablealtratamientotérmico(igualmente señalado por Zaqueo et al.8), a diferencia de las enzimas que poseen otrasespeciesperuanas,comoeselcasodeB. pictus,cuyaactividadamidolíticasemantieneporencimadel50%hastalos90ºC4.LaTLEdeB. barnettimostróóptimaactividadamidolíticaa40ºCymantuvomásdel50%delamismahastalos60ºC19.EncuantoalaTLEdelvenenode L. mutaperuanapresentaactividadenunrangodetemperaturadesdelos37ºCalos100ºC,siendolatemperaturaóptimaparasuactividadamidásicade45ºC6.
Crotalus durissus y Lachesis muta, puesto que sus actividades coagulantes difieren
según la zona geográfica17,18.
La actividad amidolítica de la enzima sobre BApNA (0,317 U/mg de proteína) resulta
menor que las exhibidas por otras enzimas purificadas de venenos de serpientes
peruanas como Lachesis muta (2,25 U/mg)6, B. barnetti (1,025 U/mg)19, B. atrox,
(0,874 U/mg)5 y B. pictus (0,635 U/mg.)4. Sin embargo, y en contraste con lo reportado
por Limán7 (0,074 U/mg), la actividad específica de nuestra enzima purificada fue
mucho mayor, debido también al mejor grado de purificación y rendimiento alcanzado
con la metodología desarrollada en este estudio.
Tabla 1. Cuadro de purificación de la enzima similar a trombina del veneno de Bothrops brazili.
Potencia coagulante
La potencia coagulante calculada para el veneno de B. brazili sobre el fibrinógeno
bovino fue de 7,1 NIH de trombina/mg, mientras que para la enzima purificada fue de
121 NIH de trombina/mg. La potencia coagulante de las TLEs purificadas están dentro
de un rango de 0,03 a 2000 Unidades NIH de trombina/ mg de proteína y dentro del
género Bothrops, el rango va de 0,7 a 1100 unidades NIH de trombina/mg19,21.
pH óptimo y termoestabilidad
La mayoría de las TLEs son óptimamente activas a pH cercanos a 8,0 y son estables a
pH neutros y alcalinos. La enzima aislada en este trabajo demostró tener una actividad
Tabla 1. CuadrodepurificacióndelaenzimasimilaratrombinadelvenenodeBothrops brazili.
Luis Ruiz, Dan Vivas-Ruiz, Fanny Lazo, Wolfram Seifert, Edith Rodríguez, Gustavo Sandoval...470
Rev Soc Quím Perú. 83(4) 2017
De las dos propiedades bioquímicas anteriormente analizadas, se puede observar que laestabilidadfrentealpHeslamásresaltanteenlaenzimaenestudio.Seconocequelaformaencomoesteestructuradaunaproteínalevapermitirunaciertaadaptabilidadalosmediosen donde ejerce su acción catalizadora. Un claro ejemplo es el caso de las fosfolipasasA2de las serpientes,particularmentepor lospuentesdisulfuroqueposeen (S-S)ypor latermoestabilidadqueestoslesconfierenaesasenzimas,permitiéndolesactuaratemperaturasdehasta100ºC19.
Porotrolado,sehallegadoaestablecerquelapresenciadecarbohidratosasociadosalasTLEslesconfierenosólolacapacidaddeunaestabilidadtérmica,sinotambiénlaestabilidadenciertosrangosdepH3.
Efectos de iones metálicos e inhibidores enzimáticosEnesteestudioseobservóquelaenzimasimilaratrombinafueinhibidaparcialmenteporlosionesMg2+yNa+aconcentracionesde10mM(9y31%,respectivamente),mientrasqueeliónCa+2aumentóun14%laactividadenzimáticaaunaconcentraciónde10mM(tabla2).ElefectodeesteúltimoiondifieredeloreportadopreviamenteporLiman7,quienseñalóquelosionesCa2+producíanunafuerteinhibicióndelaactividaddeTLEdeB. brazili.Porotrolado,Vivaset al.,demostraronqueelionCa2+a25mMnoejerceefectoalgunosobrelapictobinaaisladadelaserpienteperuanaB. pictus.18
Figura 2. A) Determinación del pH óptimo para la actividad amidolítica de la enzima purificada. B)
Efecto de la temperatura sobre la enzima purificada, evaluado en su actividad amidolítica.
Efectos de iones metálicos e inhibidores enzimáticos
En este estudio se observó que la enzima similar a trombina fue inhibida parcialmente
por los iones Mg2+ y Na+ a concentraciones de 10 mM (9 y 31 %, respectivamente),
mientras que el ión Ca+2 aumentó un 14 % la actividad enzimática a una concentración
de 10 mM (tabla 2). El efecto de este último ion difiere de lo reportado previamente por
Liman7, quien señaló que los iones Ca2+ producían una fuerte inhibición de la actividad
de TLE de B. brazili. Por otro lado, Vivas et al., demostraron que el ion Ca2+ a 25mM
no ejerce efecto alguno sobre la pictobina aislada de la serpiente peruana B. pictus.18
Figura 2. A)DeterminacióndelpHóptimoparalaactividadamidolíticadelaenzimapurificada.B)Efectodelatemperaturasobrelaenzimapurificada,evaluadoensuactividad
amidolítica.
Purificación y caracterización bioquímica de la enzima similar a trombina del veneno de la serpiente... 471
Rev Soc Quím Perú. 83(4) 2017
Elusodeagentesquímicoscapacesdecausarinhibicióny/omodificaciónendiversosgruposfuncionalesqueposeenlasenzimaspermitióelucidardetallesestructuralesdelaproteínaenestudio.SeobservóquelaTLEtuvounainhibicióndel45%desuactividadconelPMSF,agentequefosforilaalgrupohidroxilodelaminoácidoserinapresenteenelsitioactivodelasserinoproteasas,elmismoporcentajedereducciónquereportaVivas17 para la actividad delaTLEdeB. barnettiusandolamismaconcentracióndeesteagente.Enrelaciónconloobtenido,Limán7 reporta la inhibicióndel47%deactividadenzimáticade laTLEdeB. braziliempleandounaconcentraciónde1mMdelagente.
Asimismo,elinhibidordetripsinadesoya(3mg)inhibióenun20%laactividadenzimática,esto debido al acoplamiento que realiza el inhibidor al bolsillo catalítico, región que essemejanteenlasenzimasdelafamiliagénicatripsina/kalikreinaalacualtambiénpertenecelatrombina21.
Asimismo,nosedetectóinhibiciónporlaadicióndeEDTA(5mM),Iodoacetato(5mM)yTLCK(5mM)(tabla3)indicandoquelaenzimanoprecisadeionesparasuactividad,noposeeresiduosdecisteínalibresyquenousaalresiduodehistidinacomoagentenucleofílico,respectivamente.EstosresultadossonsemejantesparalasTLEsdeB. pictus4,B. brazili7,B. barnetti19yLachesis muta6.
Tabla 2. Efectodediversosionesmetálicossobrelaenzimapurificada.
Tabla 2: Efecto de diversos iones metálicos sobre la enzima purificada.
El uso de agentes químicos capaces de causar inhibición y/o modificación en diversos
grupos funcionales que poseen las enzimas permitió elucidar detalles estructurales de la
proteína en estudio. Se observó que la TLE tuvo una inhibición del 45 % de su actividad
con el PMSF, agente que fosforila al grupo hidroxilo del aminoácido serina presente en
el sitio activo de las serinoproteasas, el mismo porcentaje de reducción que reporta
Vivas17 para la actividad de la TLE de B. barnetti usando la misma concentración de
este agente. En relación con lo obtenido, Limán7 reporta la inhibición del 47 % de
actividad enzimática de la TLE de B. brazili empleando una concentración de 1mM del
agente.
Asimismo, el inhibidor de tripsina de soya (3 mg) inhibió en un 20 % la actividad
enzimática, esto debido al acoplamiento que realiza el inhibidor al bolsillo catalítico,
región que es semejante en las enzimas de la familia génica tripsina/kalikreina a la cual
también pertenece la trombina21.
Asimismo, no se detectó inhibición por la adición de EDTA (5mM), Iodoacetato (5mM)
y TLCK (5mM) (tabla 3) indicando que la enzima no precisa de iones para su actividad,
no posee residuos de cisteína libres y que no usa al residuo de histidina como agente
nucleofílico, respectivamente. Estos resultados son semejantes para las TLEs de B.
pictus4, B. brazili7, B. barnetti19 y Lachesis muta6.
Luis Ruiz, Dan Vivas-Ruiz, Fanny Lazo, Wolfram Seifert, Edith Rodríguez, Gustavo Sandoval...472
Rev Soc Quím Perú. 83(4) 2017
Tabla 3: Acción de inhibidores de proteasas sobre la proteína purificada
Dosis coagulante mínima (DCM) y acción defibrin(ogen)ante
La Dosis Coagulante Mínima sobre plasma humano citratado (DCM-P) para el veneno
fue de 18,3 µg, en tanto que para la enzima fue de 5,97 µg. Por otro lado, usando
fibrinógeno bovino comercial, los valores de la DCM-F fueron 60,3 µg para el veneno y
26,4 µg para la enzima purificada. Otros valores de DCM de TLEs de venenos peruanos
nos muestran que la Barnetobina obtenida de B. barnetti tuvo una DCM-F de 0,9 µg y
una DCM-P de 1,1 µg, y para la Pictobina de B. pictus se tuvo valores de DCM-P = 18
µg y DCM-F = 6 µg. En cuanto a la acción defibrin(ogen)ante empleando el modelo
murino, se determinó una DDM de 8 µg para la enzima purificada (tabla 4). Este valor
resulta más elevado en comparación con los obtenidos para las enzimas purificadas de
B. barnetti y B. pictus (1 µg y 1,2 µg, respectivamente)3,20
Tabla 4. Cuadro comparativo de la acción similar a trombina de la TLE purificada frente al veneno total.
Tabla 3: Acción de inhibidores de proteasas sobre la proteína purificada
Dosis coagulante mínima (DCM) y acción defibrin(ogen)ante
La Dosis Coagulante Mínima sobre plasma humano citratado (DCM-P) para el veneno
fue de 18,3 µg, en tanto que para la enzima fue de 5,97 µg. Por otro lado, usando
fibrinógeno bovino comercial, los valores de la DCM-F fueron 60,3 µg para el veneno y
26,4 µg para la enzima purificada. Otros valores de DCM de TLEs de venenos peruanos
nos muestran que la Barnetobina obtenida de B. barnetti tuvo una DCM-F de 0,9 µg y
una DCM-P de 1,1 µg, y para la Pictobina de B. pictus se tuvo valores de DCM-P = 18
µg y DCM-F = 6 µg. En cuanto a la acción defibrin(ogen)ante empleando el modelo
murino, se determinó una DDM de 8 µg para la enzima purificada (tabla 4). Este valor
resulta más elevado en comparación con los obtenidos para las enzimas purificadas de
B. barnetti y B. pictus (1 µg y 1,2 µg, respectivamente)3,20
Tabla 4. Cuadro comparativo de la acción similar a trombina de la TLE purificada frente al veneno total.
Tabla 3. Accióndeinhibidoresdeproteasassobrelaproteínapurificada
Tabla 4. CuadrocomparativodelaacciónsimilaratrombinadelaTLEpurificadafrentealveneno total.
Dosis coagulante mínima (DCM) y acción defibrin(ogen)anteLaDosisCoagulanteMínimasobreplasmahumanocitratado(DCM-P)paraelvenenofuede18,3µg,entantoqueparalaenzimafuede5,97µg.Porotrolado,usandofibrinógenobovinocomercial,losvaloresdelaDCM-Ffueron60,3µgparaelvenenoy26,4µgparalaenzimapurificada.OtrosvaloresdeDCMdeTLEsdevenenosperuanosnosmuestranquelaBarnetobinaobtenidadeB. barnettituvounaDCM-Fde0,9µgyunaDCM-Pde1,1µg,yparalaPictobinadeB. pictussetuvovaloresdeDCM-P=18µgyDCM-F=6µg.Encuantoalaaccióndefibrin(ogen)anteempleandoelmodelomurino,sedeterminóunaDDMde8µgparalaenzimapurificada(tabla4).Estevalorresultamáselevadoencomparacióncon losobtenidospara lasenzimaspurificadasdeB. barnettiyB. pictus (1µgy1,2µg,respectivamente)3,20
Reactividad antigénicaEl veneno de B. brazili demostró ser reconocido,mediante inmunodifusión, por el sueroantibotrópicopolivalenteproducidoporelInstitutoNacionaldeSalud,lomismoocurrióconlaenzimapurificada,porloquesepuedeinferirqueestaproteínapromuevaunarespuestainmune contra su estructura. Se tiene un reporte similar obtenido de la evaluación de lareactividadantigénicadelasTLEdeL. muta mutaprocedentedePerúyBrasilfrenteaunsuerodeorigenequinoproducidoporelInstitutoButantándeBrasil18.
Purificación y caracterización bioquímica de la enzima similar a trombina del veneno de la serpiente... 473
Rev Soc Quím Perú. 83(4) 2017
CONCLUSIONES
• ElvenenodelaserpienteBothrops braziliposeeunaenzimasimilaratrombinaconunpesomolecularde48kDa.
• La enzima en estudio presenta actividad coagulante sobre plasma humano y sobrefibrinógeno bovino comercial con una potencia coagulante de 121 NIH U/mg detrombina.
• LaenzimatienesumayoractividadenunrangodepHde7,5a9,0conunpHóptimode8,5,yestermolábil.
• Laenzimaesunaserionoproteinasaynodependedeionesmetálicos.• El antiveneno botrópico polivalente producido por el InstitutoNacional de Salud es
capazdereconocerantigénicamentealaenzimapurificada.
AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen el financiamiento del programa FINCyT (ahora Innóvate Perú)ProyectoContratoN°131-FINCyT-IB-2013“ProduccióndeantivenenosespecíficoscontraserpientesperuanasempleandotecnologíaIgY”.ElpresentetrabajofuepartedelatesisdeLicenciaturaenBiologíadelautorprincipal.
BIBLIOGRAFÍA1. Mackessy SP.Handbook ofVenoms andToxins of Reptiles. BocaRaton, FL:CRC
Press;2009.2. AmiconiG,AmoresanoA,BoumisG,BrancaccioA,DeCristofaroR,DePascalisA,et
al.AnovelvenombinBfromAgkistrodon contortrix contortrix:evidenceforrecognitionpropertiesinthesurfacearoundtheprimaryspecificitypocketdifferentfromthrombin.Biochemistry.2000;39:10294–10308.
3. Vivas-RuizD,SandovalG,MendozaJ,IngaR,GontijoS,RichardsonM,etal.Coagulantthrombin-likeenzyme(barnettobin)fromBothrops barnetti venom:molecularsequenceanalysisofitscDNAandbiochemicalproperties.Biochimie.2013;95(7):1476-86.
4. MesíaM, Lazo F,YarlequéA. Purificación y caracterización de un nuevo principiocoagulante de la serpiente peruana Bothrops pictus. Rev Soc Quim Perú. 2011;77(3):182-190.
5. Sandoval G, Ruiz N, Lazo F, Rodríguez E, YarlequéA, Zingali R. Aislamiento ycaracterización parcial de una enzima similar a trombina del veneno de la serpienteperuana Bothrops atrox"jergón".RevSocQuímPerú.2010;76(2):156-164.
6. YarlequéA,CamposS,EscobarE,LazoF,SánchezN,HyslopS,etal.Isolationandcharacterizationoffibrinogen-clottingenzymefromvenomofthesnakeLachesis muta. (Peruvianbushmaster).Toxicon.1989;27(11):1189-1197.
7. LimánJ.1996.Purificaciónycaracterizaciónparcialdelaenzimasimilaratrombinadel veneno de Bothrops brazili. [Tesisparaoptaral títuloprofesionaldebiólogoconmenciónengenética].Lima:UNMSM;1996.
Luis Ruiz, Dan Vivas-Ruiz, Fanny Lazo, Wolfram Seifert, Edith Rodríguez, Gustavo Sandoval...474
Rev Soc Quím Perú. 83(4) 2017
8. Zaqueo KD, KayanoAM, Domingos TF, Moura LA, FulyAL, da Silva SL, et al.BbrzSP-32,thefirstserineproteaseisolatedfromBothrops brazilivenom:Purificationandcharacterization.CompBiochemPhysiolAMolIntegrPhysiol.2016;195:15-25.
9. WarburgO,ChristianW.IsolierungandKristallisationderGarungsfermentsenolase.BiochemZ.1941;310:384-421.
10. LowryOH,RosebroughNJ,FarrAL,RandallRJ.ProteinmeasurementwiththeFolinphenolreagent.JBiolChem.1951;193(1):265-75.
11. Instituto Clodomiro Picado. Determinación de actividades tóxicas de venenos deserpientes y su neutralización por antivenenos. Manual de Laboratorio. San José:FacultaddeMicrobiología.UniversidaddeCostaRica;2007.P.21-22.
12. Erlanger B, Kokowsky N, Cohen W. The preparation and properties of two newchromogenicsubstratesoftrypsin.ArchBiochemBiophys.1961;95:271-278.
13. Laemmli U. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head ofbacteriophageT4.Nature.1970;227:680-685.
14. BaughmanDJ.Thrombinassay,In:Methodsinenzymology,proteoliticenzymes.G.E.Periman&L.LorandEds.NewYork-London:AcademicPress.1970:145-157.
15. OuchterlonyO,NilssonL.Immunodifussionandimmunoelectrophoresis.HandbookofExperimentalimmunology.1967;I(34):655-660.
16. RojasE,QuesadaL,ArceV,LomonteB,RojasG,GutiérrezJM.NeutralizationoffourPeruvianBothrops sp.snakevenomsbypolivalentantivenomsproducedinPeruandCostaRica:preclinicalassessment.ActaTrop.,2005;93:85-95.
17. Dos-SantosMC,AssisEB,MoreiraT,Pinheiro J, Fortes-DiasC. IndividualvenomvariabilityinCrotalus durissus ruruimasnakes,asubspeciesofCrotalus durissus from theAmazonianregion.Toxicon.2005;46:958-961.
18. MagalhaesA, Ferreira RN, Richardson M, Gontijo S, YarlequeA, Magalhaes HP,et al.Coagulant thrombin-like enzymes from the venoms ofBrazilian and Peruvianbushmaster(Lachesis muta muta)snakes.CompBiochemPhysiolBBiochemMolBiol.2003;136(2),255-266.
19. Vivas Ruiz D, IngaArellano R,Mendoza Fernández J, LazoManrique F,YarlequéChocasA. Barnetobina:Un nuevo principio coagulante purificado del veneno de laserpienteperuanaBothrops barnetti.RevSocQuímPerú.2010;76:261-270.
20. Vivas-Ruiz D, Sandoval GA, Lazo F, Rodríguez E,YarlequéA, Flores-Sánchez E.CaracterizacióndelaenzimasimilaratrombinadelvenenodeBothrops pictus"jergóndecosta”.RevPerúMedExpSaludPública.2015;32(4):652-658.
21. CastroHC,ZingaliRB,AlbuquerqueMG,Pujol-LuzM,RodríguezCR.Snakevenomthrombin-likeenzymes:fromreptilasetonow.CellMolLifeSci.2004;61:843-856.