19© OFICINA ESPAÑOLA DEPATENTES Y MARCAS

ESPAÑA

11© Número de publicación: 2 277 35851© Int. Cl.:

G01N 33/53 (2006.01)

C12N 5/06 (2006.01)

A61K 45/00 (2006.01)

A61K 39/00 (2006.01)

G01N 33/569 (2006.01)

12© TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA T3

86© Número de solicitud europea: 97936461 .986© Fecha de presentación : 12.08.199787© Número de publicación de la solicitud: 093725187© Fecha de publicación de la solicitud: 25.08.1999

54© Título: Purificación de células T específicas de antígeno.

30© Prioridad: 06.09.1996 US 25588 P

45© Fecha de publicación de la mención BOPI:01.07.2007

45© Fecha de la publicación del folleto de la patente:01.07.2007

73© Titular/es: Ortho-McNeil Pharmaceutical, Inc.U.S. Route No.202, P.O. Box 300Raritan, New Jersey 08869-0606, US

72© Inventor/es: Luxembourg, Alain, T.;Jackson, Michael, R. yPeterson, Per, A.

74© Agente: Carpintero López, Francisco

Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, dela mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europeade Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo seconsiderará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 delConvenio sobre concesión de Patentes Europeas).E

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Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. Pº de la Castellana, 75 – 28071 Madrid

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DESCRIPCIÓN

Purificación de células T específicas de antígeno.

Campo de la invención

Esta invención está dirigida a un procedimiento para derivar líneas de células T específicas de antígeno a partir deuna población heterogénea de linfocitos, incluyendo poblaciones totales de linfocitos T de individuos no expuestos.Este procedimiento está basado en una etapa de enriquecimiento para linfocitos específicos de antígeno por medio dela captura de los linfocitos T específicos de antígeno en un sustrato recubierto con complejos péptido antigénico-CMHque sirven como ligandos para receptores antigénicos específicos de células T, seguido por una etapa de expansiónusando superficies recubiertas con complejos péptido antigénico-CMH.

Antecedentes de la invención

Las respuestas inmunes específicas de antígeno están mediadas por linfocitos B y T efectores específicos de an-tígeno. Estas células se originan a partir de células precursoras latentes generalmente de baja frecuencia expresandoreceptores para diversos antígenos que representan el repertorio total y que, tras encontrarse con antígenos específicosy una coestimulación adecuada, se activan, expanden y diferencian en células efectoras.

El desarrollo de inmunoterapia ex vivo para afecciones tales como cáncer o infecciones virales está limitado porla baja frecuencia de linfocitos precursores específicos de antígeno. Por ejemplo, las frecuencias en tejidos linfoidesperiféricos de ratón de los precursores de CTL específicas de virus (CTLp) son generalmente menores que 1/100.000 -1/1.000.000 (Lau y col., 1994; Hou y col., 1994). El aislamiento de linfocitos específicos de antígenos por medio decaptura en un soporte recubierto de antígenos ha sido descrito para células B latentes de bazo de ratón específicas paraTNP (Snow y col, 1983a). El procedimiento de aislamiento incluye una etapa de formación de rosetas en glóbulos ro-jos de caballo con hapteno y permite la recuperación de células B específicas de hapteno con una pureza del 40%. Estatécnica fue útil para estudiar los requerimientos de activación (Stein y col., 1986) así como los acontecimientos inicia-les de señal que siguen a la activación (Snow y col., 1986; Myers y col, 1987; Grupp y col., 1987; Noelle y Snow, 1990;Gold y DeFranco, 1994). Sin embargo, ésta fue una situación muy favorable debido a la relativamente alta frecuenciade células B específicas para TNP (aproximadamente 1%) (Snow y col., 1983a). No se ha informado hasta la fecha deningún otro estudio de activación de células B usando células B latentes específicas para otro antígeno con frecuenciabaja de precursores (Radbruch y Recktenwald, 1995). La baja frecuencia de precursores es también un problema conlas células T. Además, mientras que las células B reconocen directamente al antígeno, las células T reconocen unaestructura compleja formada por la combinación de un péptido antigénico unido a una molécula del complejo mayorde histocompatibilidad (CMH). La interacción TCR/CMH-péptido tiene una afinidad baja a moderada (intervalo 10−4-10−7 M: Matsui y col., 1991; Weber y col., 1992; Sykulev y col., 1994a; Corr y col., 1994; Sykulev y col., 1994b). Losanticuerpos usualmente exhiben afinidades superiores de varios órdenes de magnitud y aprovechan la multivalencia.Actualmente están disponibles técnicas nuevas de aislamiento de poblaciones celulares raras. Éstas están basadas enla clasificación celular y/o separación magnética (Bellone y col., 1995; Radbruch y Recktenwald, 1995). También, seencuentran actualmente disponibles ligandos recombinantes para TCR combinando moléculas del CMH vacías recom-binantes (Jackson y col., 1992) y péptidos antigénicos de unión al CMH (Engelhard, 1994; Ramensee y col., 1995).Estos complejos sintéticos CMH-péptido pueden inmovilizarse en perlas para dar ligandos multivalentes para el TCR.Teóricamente, la multivalencia ayudaría a solucionar la baja afinidad. Se ha visto previamente que la interacción entreTCR y el complejo péptido-CMH inmovilizado lleva al establecimiento de interacciones estables en ciertos sistemas invitro. En primer lugar, los antígenos del CMH clase I inmovilizados en monocapas lipídicas (Nakanashi y col., 1983)o en perlas del tamaño de células recubiertas con lípidos (Kane y col., 1988) son suficientes para causar la unión decélulas T citotóxicas alogénicas clonadas (CTL). En segundo lugar, las CTL singénicas clonadas se unen a perlas recu-biertas con CMH en una manera dependiente de péptidos (Kane y Mescher, 1993; Mescher, 1995). En tercer lugar, unaCTL singénica clonada puede formar agregados con células RMA-S, una línea celular que expresa grandes cantidadesde moléculas CMH vacías, en una manera específica de péptido (De Bruijn y col., 1992). En dos de estos informes,las interacciones TCR-CMH-péptido no fueron los mediadores primarios de adhesión. Éstos jugaron un papel másbien inicial en los acontecimientos tempranos de agregación, presumiblemente transduciendo señales que llevaron ala activación de la adhesión a través de moléculas accesorias. En este documento, se describe un procedimiento paraaislar células T específicas de antígeno usando moléculas del CMH clase I vacías purificadas de células de Drosophilamelanogaster (Jackson y col., 1992) inmovilizadas en perlas magnéticas y cargadas con péptido. Este sustrato artificialpara células T está recubierto con una alta densidad de complejos idénticos CMH-péptido. El aislamiento de célulasT se optimizó usando poblaciones de células T no expuestas purificadas de ratones transgénicos para el 2C TCR (Shay col., 1988). Se han identificado ligandos de diversas afinidades y especialidades para el 2C TCR (Sykulev y col.,1994a, b). Pudieron adsorberse las células T 2C sobre perlas con complejos péptido-CMH con una afinidad para 2CTCR tan baja como 10-4 M. La adsorción estuvo restringida a CMH y específica de péptido ya que se produjo sólocon las combinaciones adecuadas CMH-péptido reconocidas por 2C TCR. Además, pudieron recuperarse células T2C mezcladas con células T irrelevantes a partir animales no expuestos usando este procedimiento de adsorción. Estatécnica se usó exitosamente para recuperar células T específicas de antígeno de animales no expuestos.

El documento CA-A-2.069.541 describe la inducción una respuesta de linfocitos T específica de antígeno en uncultivo de linfocitos T. La inducción de la respuesta se logra cargando vehículos presentadores de antígeno que llevanmoléculas del CMH con un péptido de unión de CMH inmunogénico de células T derivado de antígeno.

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A. Stryhn y col., (1994) Eur. J. Immunol. 24:1404-1409 describen el panel de hibridomas de células T de CMHclase I específicos de antígeno que se usaron para examinar la capacidad de los complejos péptido-antígeno clase I deestimular células T.

K.P. Kane y col., (1993) J. Immunol. 150:4788-4797 describen la activación de adhesión y desgranulación delinfocitos T citotóxicos dependientes de CDH por complejos péptido-antígeno clase I. La activación de CTL requierela unión de TCR y del correceptor de CD8.

El documento WO 96/05287 describe un procedimiento para el aislamiento de células T a partir de sangre periféricausando complejos de antígenos del CMH.

El documento EP 0814838, que es una técnica anterior para los objetivos de lograr sólo procedimientos nuevos,describe un sistema presentador de antígenos y un procedimiento para activar células T. Una forma de realización dela invención es la matriz que contiene proteínas sintéticas presentadoras de antígenos. La matriz puede usarse paraactivar células T CD8+ para convertirlas en citotóxicas.

Resumen de la invención

La presente invención provee un procedimiento para el aislamiento y expansión en cultivo de linfocitos T es-pecíficos de antígeno a partir de una población heterogénea de linfocitos. La presente invención también provee unprocedimiento para preparar una población de linfocitos T específicos de antígeno de un paciente para el tratamientode la enfermedad o afección del paciente. Esta invención provee una matriz que contiene péptidos Clase I vacíos queson funcionales porque los péptidos Clase I vacíos pueden aceptar y unir una diversidad de antígenos. Pueden prepa-rarse estas matrices de manera que contengan cantidades específicas predeterminadas de uno o más antígenos. Talesmatrices son útiles para una diversidad de objetivos incluyendo, pero no limitándose al uso en los procedimientos dela presente invención.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1, Paneles A, B, D y D: Análisis de unión de Ld biotinilada a perlas magnéticas recubiertas con avidinausando citofluorometría de flujo.

El Panel A muestra una curva de dosis-respuesta de los valores medios de fluorescencia de perlas incubadas concantidades crecientes de Ld, posteriormente teñidas con anticuerpo anti-Ld marcado con fluoresceína 30.5.7. El Panel Bmuestra histogramas de fluorescencia verde (FL1) de perlas magnéticas recubiertas con avidina no marcadas. El PanelC muestra histogramas de fluorescencia verde (FL1) de perlas magnéticas recubiertas con avidina tras la incubacióncon 3 µg de perlas con Ld/106 biotiniladas; la tinción se realizó usando anticuerpos anti-Ld marcados con fluoresceína30.5.7. El Panel D muestra histogramas de fluorescencia verde (FL1) de perlas magnéticas recubiertas con avidina trasla incubación con 3 µg de perlas con Ld/106 no biotiniladas; la tinción se realizó usando anticuerpos anti-Ld marcadoscon fluoresceína 30.5.7.

Figura 2, Paneles A, B, C, D, E y F: Evaluación de la formación de complejos perlas con Ld-células T 2C enpresencia de péptidos antigénicos usando gráficos de puntos de fluorescencia verde (FL1) frente a fluorescencia roja(FL2). Las células se tiñeron de verde con fluoresceína; las perlas se tiñeron de rojo con ficoeritrina. Las perlasmagnéticas son autofluorescentes; se estableció la compensación de manera que las perlas teñidas con ficoeritrinaexhibieran la misma intensidad de fluorescencia verde que las perlas sin teñir. El Panel A muestra perlas solas. El PanelB muestra células T 2C solas. El Panel C muestra perlas recubiertas con Ld y células T 2C incubadas en presencia deQL9. El panel D muestra perlas recubiertas con Ld y células T 2C incubadas en presencia de p2Ca. El Panel E muestraperlas recubiertas con Ld y células T 2C incubadas en presencia de SL9. El Panel F muestra perlas recubiertas con Ld

y células T 2C incubadas en presencia de péptido LCMV.

Figura 3, Paneles A, B, C, D, E, F, G y H: Evaluación de la formación de complejos perlas recubiertas con CMH-células T 2C en presencia de péptidos antigénicos usando gráficos de puntos de dispersión lateral (SSC) frente adis-persión frontal (FSC). El Panel A muestra los límites de las regiones que contienen células, perlas y complejos perlas-células. El Panel B muestra perlas solas. El Panel C muestra células T 2C solas. El Panel D muestra perlas recu-biertas con Ld y células T 2C incubadas en presencia de QL9. EL panel E muestra perlas recubiertas con Ld ycélulas T 2C incubadas en presencia de p2Ca. El Panel F muestra perlas recubiertas con Ld y células T 2C incu-badas en presencia de péptido LCMV. El Panel G muestra perlas recubiertas con Kbm3 y células T 2C incubadasen presencia de dEV-8. El Panel H muestra perlas recubiertas con Kbm3 y células T 2C incubadas en presencia deE1.

Figura 4, Paneles A, B y C: Efecto de diversos parámetros en la adsorción de células T 2C sobre perlas magnéti-cas recubiertas con CMH. El Panel A muestra la dependencia del tiempo: se mezclaron células T 2C purificadas conperlas recubiertas con CMH y péptido y se incubaron a temperatura ambiente durante diversos intervalos de tiempo;posteriormente se cuantificó la unión de las células por citofluorometría de flujo. El Panel B muestra la dependenciade la temperatura: se mezclaron células T 2C purificadas con perlas recubiertas con CMH y se incubaron a diversastemperaturas y durante diversos intervalos de tiempo; posteriormente se cuantificó la unión de las células por citofluo-rometría de flujo. El Panel C muestra la dependencia de CD8: se mezclaron células T 2C purificadas o células T 2C

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CD8+ purificadas con perlas recubiertas con CMH y péptido y se incubaron a temperatura ambiente durante 3 horas;posteriormente se cuantificó la unión de las células por citofluorometría de flujo.

Figura 5 Paneles A, B, C, D y E: enriquecimiento en células 2C T usando captura en perlas magnéticas recubiertascon Kbm3, comenzando con una mezcla de células T 2C y células T CD8+ en una proporción 1:3000. El Panel Amuestra el histograma de fluorescencia verde (FL1) de células T 2C purificadas marcadas con fluoresceína. El PanelB muestra el histograma de fluorescencia verde (FL1) de células T CD8+ purificadas de ratón C57BL/6. El Panel Cmuestra el histograma de fluorescencia verde (FL1) de células T 2C purificadas marcadas con fluoresceína mezcladascon células T CD8+ de ratón C57BL/6 en una proporción 1:3000. El Panel D muestra el histograma de fluorescenciaverde (FL1) de células eluidas tras la incubación con perlas magnéticas recubiertas con Kbm3 en presencia de dEV-8. ElPanel E muestra el histograma de fluorescencia verde (FL1) de células eluidas tras incubación con perlas magnéticasrecubiertas con Kbm3 en presencia de E1.

Figura 6: Actividad funcional in vitro de CTL derivadas de ratón no expuestos C57BL/6 usando adsorción sobreperlas magnéticas recubiertas con Kb-OVA-8 o Kb-VSV-8. Se probaron las células T cultivadas para evaluar citotoxi-cidad por el ensayo de liberación de cromo como se indica en el Ejemplo 4. Se usaron como diana células EL4. Lospéptidos se usaron en una concentración final de 1 µM.

Figura 7: Actividad funcional in vitro de CTL derivadas de ratón no expuestos BALB/c usando adsorción sobreperlas magnéticas recubiertas con Ld-LCMV. Se probaron in vitro las células T cultivadas para evaluar citotoxicidadpor el ensayo de liberación de cromo como se indica en el Ejemplo 4. Se usaron como diana, RMA-S con expresiónde Ld (panel A), CL-7 de BALB/c (panel B), MC57 (panel C) o YAC-1 (panel D). Los péptidos se usaron en unaconcentración final de 1 µM.

Figura 8: Actividad funcional in vitro de CTL derivadas de ratón no expuesto BALB/c usando adsorción sobreperlas magnéticas recubiertas con Ld-LCMV. Se ensayó la actividad in vivo en ratones con infección aguda con LCMVcomo se indica en el Ejemplo 4. Se inyectaron ratones BALB/c infectados con LCMV con 107 CTL anti-LCMV NP118-126 en el día 1, mientras 4 ratones BALB/c recibieron sólo PBS. Se usaron como control ratones C57BL/6-LCMVinyectados con 107 CTL anti-LCMV NP 118-126 o PBS.

Descripción detallada de la invención

La presente invención provee un procedimiento nuevo para derivar in vitro líneas de células T específicas deantígeno a partir de poblaciones de células mixtas, incluyendo células T totales de individuos no expuestos. Derivarin vitro líneas de células T a partir de poblaciones de células T no expuestos tiene varios tipos de problemas: primero,las frecuencias de los precursores son típicamente muy bajas, frecuentemente menores que 10−5; segundo, las célulasT no expuestas tienen requerimientos especiales para su activación, necesitando generalmente estímulos más fuertesque las células T previamente activadas.

El procedimiento de la presente invención comprende dos etapas: una etapa de aislamiento para enriquecer la pre-paración celular en células T específicas de antígeno y una etapa de expansión in vitro para derivar líneas celularesespecíficas de antígeno a partir de la preparación celular enriquecida. Resulta fácilmente evidente para aquellos exper-tos en la técnica que estas etapas pueden repetirse, como se necesite. La etapa de aislamiento de células T específicasde antígeno usa sustratos recubiertos con CMH, que tras la incubación con péptido antigénico y células T, permitenel aislamiento de células T específicas para el complejo péptido antigénico-CMH. Resultará fácilmente evidente paraaquellos expertos en la técnica que son adecuadas para uso en el procedimiento de la presente invención una grandiversidad de moléculas del CMH, incluyendo, pero no limitado a proteínas del CMH clásicas y no clásicas de cual-quier mamífero o especie aviar, resultando de preferencia las proteínas HLA humanas y las proteínas H-2 murinas.También será fácilmente evidente para los expertos en la técnica que las moléculas del CMH de una diversidad defuentes son adecuadas para uso en la presente invención, incluyendo, pero no limitado a CMH derivado de fuentesque se presentan en la naturaleza y fuentes recombinantes tales como proteínas del CMH expresadas en bacterias,células de insectos o células de mamíferos, siendo las células de insecto las de preferencia. Además, será fácilmenteevidente para aquellos expertos en la técnica que son adecuados para uso en la presente invención una gran diversidadde sustratos recubiertos de CMH, incluyendo, pero no limitado a perlas de vidrio, perlas de látex y perlas magnéti-cas, siendo las perlas magnéticas las de preferencia. Finalmente, resultará fácilmente evidente para los expertos en latécnica que podrían usarse una diversidad de procedimientos para unir moléculas del CMH en sustratos para uso enel procedimiento de la presente invención, incluyendo, pero no limitado a adsorción pasiva, uso de entrecruzadores,biotinilado de moléculas del CMH para adsorción sobre sustrato recubierto con avidina, introducción de un sitio dereconocimiento por ingeniería genética de moléculas del CMH o uso de un sitio natural de reconocimiento para laadsorción sobre un sustrato recubierto con anticuerpos, siendo el reconocimiento con anticuerpos y avidina-biotina losde preferencia.

Para establecer el procedimiento, se usó una combinación de varios recursos: primero, se usaron moléculas recom-binantes del CMH vacías producidas en células de Drosophila melanogaster (Jackson y col., 1992), que permiten eluso de proteína de CMH cargada de manera homogénea con el mismo péptido; secundo, se usaron células T no expues-tas purificadas de nódulos linfáticos de ratones transgénicos para 2C TCR (Sha y col., 1988), estas células expresan demanera homogénea el mismo TCR al mismo nivel. Esto permitió el análisis a un único nivel celular. También se usaronvarios complejos péptido-CMH diferentes cuyas afinidades para 2C TCR se ha determinado recientemente (Sykulev

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y col., 1994a, b). Esto permitió investigar el procedimiento usando complejos con diversas afinidades. Las moléculasdel CMH clase I que se incluyeron fueron Ld, Kb and Kbm3. Dado que el clon de células T citotóxicas 2C derivó deratones BALB.B (H-2b) (Sha y col, 1988), Ld y Kbm3 son elementos de restricción alogénicos para 2C TCR mientrasque Kb es singénico. Se usaron Ld, Kb y Kbm3 biotiniladas inmovilizadas en perlas magnéticas recubiertas con avidina.Se adsorbieron células 2C T sobre tales perlas en presencia de varios péptidos antigénicos. Se observó la adsorciónen presencia de complejos péptido-CMH con una afinidad para 2C TCR en un intervalo de 10−4 a 10−7 M, usandoLd, Kbm3 o Kb como elemento de restricción. Finalmente la adsorción fue específica, dado que los péptidos control nocausaron interacción entre la perlas recubiertas con CMH y las células T 2C. Además se estudiaron las característicasde adsorción de células T sobre perlas recubiertas con CMH: la adsorción fue dependiente del tiempo, alcanzando unameseta entre 1 y 4 horas cuando se realizó a temperatura ambiente. La adsorción comenzó a disminuir cerca despuésde ese tiempo, lo que podría reflejar el inicio de un proceso de desadhesión. La adsorción también fue dependiente dela temperatura: fue ligeramente más baja a 37ºC que a temperatura ambiente para 3 de los complejos péptido-CMHexaminados, y fue dramáticamente más baja que a temperatura ambiente para otro complejo. Esto es debido a la dis-minución de estabilidad de las moléculas del CMH a temperaturas más altas. La adsorción a 4ºC fue mucho más bajaque a temperatura ambiente lo que probablemente fue una consecuencia de los cambios en la fluidez de la membranacelular a bajas temperaturas, que reduce las asociaciones moleculares. Además, algunos acontecimientos de señales,que se producen sólo a temperatura más elevada, podrían contribuir a la adsorción, como puede notarse en un informeprevio acerca del papel de CD8 en la adhesión inducida por la interacción antígeno-TCR (Kane and Mescher, 1993).Resulta interesante destacar que la dependencia de CD8 de la formación de complejos célula-perla varió de acuerdocon el antígeno usado. Entre los péptidos probados, los más dependientes de CD8 fueron p2Ca y dEV-8, que se aisla-ron como péptidos que se presentan naturalmente en la superficie de células presentadoras de antígenos; QL9 y STYR,que no se han encontrado en la superficie celular, fueron independientes de CD8. En cualquier caso, la dependenciade CD8 de la captura de células T sobre perlas recubiertas con CMH no tuvo correlación completa con la afinidadTCR-ligando. Finalmente, la captura no tuvo correlación completa con la afinidad TCR-ligando, ya que se observóconstantemente una captura con Kbm3-dEV-8 (1,8 x 104 M−1), K6-SIYR (3,1 x 104 M−1) o Kbm3-SIYR (3,4 x 104 M−1),pero no con Ld-p2Ca-A3 (2 x 104 M−1) o Kb-dEV8 (1,2 x 104 M−1). Se observó captura o no se observó captura con Ld-SL9 (1,4 x 104 M−1), de acuerdo con lotes de Ld. Esto es coherente con la predicción de que conociendo la afinidad deun único TCR para un complejo péptido-CMH dado probablemente no es suficiente para realizar predicciones acercade interacciones a nivel celular total (Agrawal y Linderman, 1996). Se anticipa que las perlas recubiertas con CMHserán útiles como sondas para estudiar las reglas de reconocimiento de antígenos por las células T.

Para investigar la conveniencia de esta técnica para recuperar una población con baja frecuencia de precursores deCTL específicas de antígeno, se intentó recuperar células T 2C mezcladas con células T irrelevantes de un animal noexpuestos. Se demostró que el procedimiento de la presente invención permitió la purificación de células T específicasde antígeno aproximadamente 800 a 1600 veces en una etapa de purificación, comenzando a partir de una frecuencia decélulas T 2C tan baja como 0,03%. La recuperación celular fue de aproximadamente 50% cuando se usaron complejospéptido-CMH de baja afinidad para 2C TCR tales como Kbm3-dEV-8 y Kb-SIYR, y alcanzó una recuperación de 90-100% con el complejo de alta afinidad Ld-QL9. La pureza final de células T 2C fue de 47,6 ± 2,1% al usar Kb, elelemento de restricción singénico para 2C TCR, y 24,8 ± 6,9% al usar Ld, un elemento de restricción alogénico. Estosugiere que esta diferencia podría explicarse por células T alogénicas anti-Ld capturadas usando perlas recubiertas conLd. Esto podría significar que algunas de las células diferentes a las células 2C eluidas de las perlas fueron capturadasespecíficamente. Considerados conjuntamente, estos resultados mostraron que este procedimiento fue convenientepara purificar precursores de células T con baja frecuencia a partir de un animal no expuestos, incluyendo célulascuyos TCR podrían tener baja afinidad por un complejo CMH-péptido.

Se demostró también que el procedimiento de aislamiento de la presente invención, cuando se usó en combinacióncon una etapa nueva de expansión de células T in vitro, fue útil para el enriquecimiento de precursores de CTL a partirde ratones no expuestos. La etapa de expansión celular se basó en el cultivo de células aisladas en placas de cultivotisular recubiertas con complejos CMH-péptido y anticuerpo anti-CD28. Resultará fácilmente evidente para aquellosexpertos en la técnica que otras moléculas coestimulantes son adecuadas para uso en el procedimiento de la presenteinvención, incluyendo, pero no limitando a, anticuerpo anti-CD28, otros ligandos de CD28 tales como B7-1 y B7-2,o ligandos o anticuerpos para otras moléculas coestimulantes de células T tales como integrinas y otras moléculas deadhesión celular, o citoquinas tales como interleuquina 2 o interleuquina 4, o cualquier combinación de las mismas.Es digno de mención que otros protocolos de expansión clásicos, incluyendo la estimulación con concanavalina A ocon anticuerpos anti-TCR, no permitirían derivar CTL específicas de antígeno a partir de poblaciones de linfocitos noexpuestos. Probablemente esto es porque las células no son 100% puras tras el aislamiento y por ello necesitan algúnestímulo específico para poder recuperarlas. Además, es necesaria una alta densidad de ligandos homogéneos para ac-tivar células T no cebadas, lo que es provisto por un procedimiento de la presente invención, así como usando célulasde insecto que expresan CMH como células presentadoras de antígenos (Cai y col., 1996), pero no usando célulaspresentadoras de antígenos clásicas que presentan un población heterogénea de antígenos en su superficie. Además,este sistema de expansión totalmente sintético de la presente invención no requiere el uso de células presentadorasde antígenos exógenas, lo que elimina complicaciones potenciales tales como contaminación y cebado cruzado. Esinteresante destacar que no fue necesario separar las células de las perlas magnéticas recubiertas con CMH usadaspara el aislamiento previamente a la expansión, lo que reduce el tiempo de manipulación. Sin embargo, los linfocitosT específicos de antígeno pueden eluirse o eliminarse del sustrato para cultivo o para otros objetivos, si se desea.Pueden eluirse los linfocitos T usando una diversidad de técnicas conocidas por los expertos en la técnica, tales comola incubación prolongada y/o el agregado de un anticuerpo anti-CMH. Usando este procedimiento, CTL específicasde virus LCM podrían derivarse de ratones BALB/c no infectados usando perlas magnéticas recubiertas con Ld y

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LCMV-péptido de nucleoproteína. El enriquecimiento se produjo ciertamente ya que al menos una célula entre las104 células recuperadas fue específica de antígeno en comparación con una frecuencia del precursor de menos de 10−5

en un animal no expuestos. (Oehen y col 1992, Lau y col, 1994). Además, las células T CD8+ totales no separadasdel mismo animal cultivadas en las mismas condiciones de cultivo no dieron actividad específica de CTL. Finalmente,la actividad específica de CTL se midió tras sólo una reestimulación, lo que indica claramente una alta frecuencia deprecursores específicos de células T tras el procedimiento de enriquecimiento. También se usó el procedimiento deenriquecimiento de la presente invención para recuperar CTL específica de OVA-8 así como CTL específica de VSV-8 de ratones C57BL/6. El enriquecimiento fue específico ya que no pudieron cultivarse CTL específicas de VSV-8a partir de células capturadas usando perlas recubiertas con Kb-OVA-8, y no pudieron cultivarse CTL específicas deOVA-8 a partir de células capturadas usando perlas recubiertas con Kb-VSV-8. La frecuencia de precursores de CTLde CTL específica de OVA-8 en la población enriquecida tras la captura en perlas recubiertas con Kb-OVA-8 fue deaproximadamente 1/3.500. El enriquecimiento se produjo ciertamente ya que la frecuencia de precursores para CTLanti-OVA-8 en ratones C57BL/6 no expuestos es 1/30.000 (Dillon y col., 1994). Sin embargo, el enriquecimiento pa-reció ser más bajo de lo esperado según los experimentos usando células T 2C (Tabla II). Esto no resulta sorprendenteporque las mediciones con células T 2C reflejan directamente la capacidad de la etapa de enriquecimiento, mientrasque, en experimentos que comienzan con células T CD8+ totales, el enriquecimiento probablemente se sobreestimó:algunas células CD8+ podrían haber sido capturadas y expandidas sin exhibir una actividad citotóxica, o podrían habersido capturadas pero no crecerán en cultivo, o podrían haber tenido una interacción muy débil con las perlas recubier-tas con CMH para ser “capturables”. Es poco probable que la captura transforme a las células T en no respondedorasporque las células T 2C pueden expandirse en CTL tras la captura.

La separación magnética probó ser el procedimiento de elección para purificar poblaciones celulares raras. Éstasincluyen células progenitoras hemopoyéticas de sangre periférica humanas (purificación desde 0,18% hasta 54,4%,enriquecimiento de 300 veces, recuperación >39%) (Kato y Radbruch, 1993), unidades formadoras de estallido eri-troide de sangre periférica humana (purificación desde 0,04% hasta 56,6%, enriquecimiento 1.400 veces, recuperación13%) (Sawada y col, 1990) y linfocitos B que expresan IgA1 de sangre periférica (purificación desde 0,1-1,5% hasta80%, más del 80% de recuperación) (Irsch y col, 1994). El procedimiento de la presente invención para enriqueci-miento de células T específicas de antígeno es sustancialmente mejor que estos procedimientos, al juzgarlos a la vistade los valores de enriquecimiento y recuperación. Esto es especialmente significativo ya que los procedimientos depurificación mencionados anteriormente usan anticuerpos como ligandos para las células específicas; los anticuerpostienen afinidades para antígenos que son mucho más altas que aquellas de los complejos CMH-péptido para los TCR.El procedimiento de la presente invención es también útil para la purificación celular por medio de otros ligandos conbaja afinidad por moléculas de la superficie celular, por ligandos con baja afinidad se entiende moléculas que tienenuna afinidad demasiado baja para permanecer unidas de manera estable a la superficie celular cuando se usan en formasoluble. Por contraste, los ligandos con alta afinidad, tales como anticuerpos, permanecen unidos de manera estableen la superficie celular cuando se usan en forma soluble. Resulta interesante mencionar que aunque es posible marcarfluorescentemente las células T específicas de antígeno (Altman y col., 1996), la clasificación celular por citometríade flujo no podría ser un sustituto para la separación magnética porque los precursores de células T son usualmentedemasiado raros para detectarlos con citometría de flujo, y la velocidad de análisis y clasificación sigue siendo unfactor limitante. Por contraste, la separación magnética puede usarse para separar poblaciones raras de células T espe-cíficas de antígeno, así como para clasificar una gran cantidad de células rápidamente. Estas características hacen delaislamiento magnético un procedimiento atractivo par derivar células T específicas de antígeno para uso clínico.

En conclusión, este es el primer informe de un procedimiento de purificación de células T específicas de antígenoque es aplicable a individuos no expuestos. Se ha mostrado que podría aplicarse a varias moléculas del CMH diferentesy a una diversidad de péptidos. El procedimiento de la presente invención es adecuado en una diversidad de situaciones,incluyendo, pero no limitado a el uso para derivar líneas de células T citotóxicas específicas de virus o específicas detumor a partir de sangre periférica humana. Las células derivadas usando el procedimiento de la presente invención sonútiles por sí mismas para una diversidad de fines incluyendo, pero no limitando a, expansión en cultivo y reinfusión enun paciente, análisis de diagnóstico y otras aplicaciones terapéuticas.

Se proveen los siguientes Ejemplos con el fin de ilustrar la presente invención sin limitar el alcance de la invencióna los ejemplos a continuación.

Ejemplo 1

Unión de moléculas del CMH clase I biotiniladas sobre perlas magnéticas recubiertas con avidina

Se expresaron las moléculas solubles del CMH clase I, Ld, Kb y Kbm3 en células de Drosophila melanogaster(Jackson y col., 1992) y se purificaron como se describió previamente (Sykulev y col., 1994a). La biotinilación serealizó usando biotina-BMCC (Pierce, Rockford, IL) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Se recubrieron Dynabeads M500 (Dynal, Lake Success, NY) con neutravidina (Pierce, Rockford, IL) y se incu-baron posteriormente con moléculas del CMH clase I biotiniladas diluidas en PBS conteniendo FCS al 3% durante2 horas a 4ºC con agitación suave. Las perlas entonces se lavaron 3 veces en DMEM que contiene FCS al 10% yse incubaron durante 1 hora con péptido 20 µM. Posteriormente se usaron las perlas inmediatamente para adsorcióncelular. Se usó Ld biotinilada como un modelo de prueba para estudiar la unión de moléculas del CMH clase I bio-

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tiniladas a perlas magnéticas recubiertas con avidina. Se incubaron diversas cantidades de esta molécula con perlas.Posteriormente se tiñeron las perlas usando anticuerpo monoclonal anti-Ld 30.5.7 marcado con fluoresceína sensiblea la conformación. Se evaluó la unión de Ld por medio de análisis por citofluorometría de flujo. El valor medio defluorescencia aumentó linealmente con la cantidad de Ld entre 0 y 1,5 µg de Ld/106 perlas, y alcanzó una meseta en 3µg de Ld/106 perlas como se muestra en la Figura 1A. La cantidad necesaria de Ld para alcanzar la saturación fue lamisma con varios lotes de perlas y de Ld biotinilada. Para cuantificar el número de moléculas del CMH inmovilizadaspor perla, se midió las concentraciones de moléculas del CMH clase I en solución previamente y tras la unión usan-do el siguiente inmunoensayo en fase sólida: se adsorbieron moléculas del CMH clase I, Ld sobre perlas de sulfatode látex de poliestireno de 6,8 µm (Interfacial Dynamics Corporation, Portland, OR) recubiertas con anti-Ld 28-14-8S (ATCC, Rockville, MD); posteriormente se tiñeron las perlas usando anti-Ld 30-5-7 marcado con fluoresceína;se midieron los valores medios de fluorescencia (VMF) por citofluorometría de flujo. Se estableció una curva patróncon concentraciones conocidas de Ld y se representó gráficamente VMF frente a concentraciones. Se encontró que lacantidad de Ld inmovilizada en condiciones de saturación fue 1,23 ± 0,10 x 106 moléculas por perla. Los histogramasde fluorescencia muestran la fluorescencia de las perlas sin teñir (figura 1B) y de las perlas adsorbidas con cantidadessaturantes de Ld (figura 1C). Se produjo la unión a través de la interacción avidina-biotina ya que las moléculas nobiotiniladas no se unieron a las perlas (figura 1D). Se prepararon perlas recubiertas con Kb y Kbm3 y se probaron usandola misma técnica. Se alcanzó la saturación usando el mismo intervalo de concentraciones que se uso para Ld.

Ejemplo 2

Captura de células T específicas de antígeno sobre perlas magnéticas recubiertas con CMH clase I en presencia depéptidos antigénicos

Ratones y líneas celulares

Los ratones BALB/c (H-2d) y C57BL/6 (H-2b) eran de Harlan Sprague Dawley (San Diego, CA). Se criaronratones transgénicos 2C (Sha y col, 1988) en el vivero de R. W. Johnson P.R.I.. Se mantuvo a todos los ratones bajocondiciones específicas libres de patógenos. Se usaron células RMAS expresando Ld (Cai y Spent, 1996) y célulasEL4 (H-2b, obtenidas de ATCC, Rockville, MD) como células diana en ensayos de CTL. El hibridoma anticlonotípico1B2 se describió previamente (Kranz y col., 1994).

Purificación de células T CD8+ de ratones normales

La purificación se realizó a 4ºC bajo condiciones estériles. Se diseccionaron ganglios linfáticos inguinales, axilares,cervicales, ilíacos y mesentéricos de los ratones y se separaron en una única suspensión de células individuales.Se recubrieron perlas magnéticas recubiertas con avidina (Dynal, Lake Success, NY) con Ig de anti-ratón de cabrabiotinilado (Southern Biotechnology, Birmingham, AL) y posteriormente se incubaron con la suspensión celular paraadsorber las células que expresan Ig. Posteriormente se incubaron las células no adsorbidas con H129.19 2 µg/ml (anti-CD4, Gibco BRL, Gaithersburg, MD), AF6-120.1 1 µg/ml (anti-I-Ab, Pharmingen, San Diego, CA), KH74 1 µg/ml(anti-I-Ab, Pharmingen, San Diego, CA) y 34-5-3 1 µg/ml (anti-I-Ad,b, Pharmingen, San Diego, CA) para ratón con unfondo de H-2b; o con H129.19 2 µg/ml y 34-5-3 1 µg/ml para ratón con un fondo de H-2d. Posteriormente se lavaronlas células 3 veces y se eliminaron las células que expresan CD4 o CMH-clase II por adsorción en perlas magnéticasrecubiertas con Ig anti-rata de oveja (Dynal, Lake Success, NY). La pureza alcanzó 90 a 94% de células CD8+ loindican los resultados mediante tinción con anticuerpos y citofluorometría de flujo.

Purificación de células T 2C de ratones transgénicos

Se purificaron células T 2C de ganglios linfáticos de ratón de acuerdo con el procedimiento descrito anterior-mente. Las células purificadas fueron un 97-98% reactivas con el anticuerpo anticlonotípico 1B2. Además, pudierontambién prepararse células CD8− (CD4−) eliminando las células CD8+ con el anticuerpo anti-CD8a 53-6.7 (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD) y perlas magnéticas recubiertas con Ig anti-rata de oveja.

Péptidos

Los péptidos de unión de Ld y Kb usados en estos estudios se sintetizaron en los instrumentos Applied Biosystem430A y 431 A mediante un procedimiento convencional de síntesis de péptidos en fase sólida (química tBoc). Lassecuencias de péptidos fueron las siguientes:

QL9: QLSPFPFDL [SEQ. ID. Nº: 1]

p2Ca: LSPFPFDL [SEQ. ID. Nº: 2]

SL9: SPFPFDLLL [SEQ. ID. Nº:3]

p2Ca-A3: LSAFPFDL [SEQ. ID. Nº: 4]

dEV-8: EQYKFYSV [SEQ. ID. Nº: 5]

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SIYR: SIYRYYGL [SEQ. ID. Nº: 6]

LCMV: RPQASGVYM [SEQ. ID. Nº: 7]

MCMV: YPHFMPTNL [SEQ. ID. Nº: 8]

OVA-8: SIINFEKL [SEQ. ID. Nº: 9]

VSV-8: RGYVYQGL [SEQ. ID. Nº: 10]

E1: EIINFEKL [SEQ. ID. Nº: 11].

Adsorción de células T 2C sobre perlas magnéticas recubiertas con CMH

Para probar la capacidad de las perlas recubiertas con moléculas del CMH clase I de capturar células T específicasde antígeno, se usaron perlas magnéticas recubiertas con Ld, Kbm3 o Kb, y células T purificadas de ratones transgénicosTCR 2C. El TCR 2C ha sido caracterizado extensivamente y se han informado varios péptidos antigénicos, reconocidoscon diversas afinidades en asociación con Ld (Tabla I), (Sykulev y col, 1994 a, b). Más aún, Kbm3 y Kb demostraronrecientemente servir como elementos de restricción para el TCR 2C en asociación con los péptidos dEV-8 y SIYR(Tallquist y Pease, 1995; Ukada y col, 1996; Tallquist y col., 1996). Se determinó recientemente que las afinidades delos complejos Kbm3-dEV-8 y Kb-SIYR para el TCR 2C fueron de 1,8 x 104 M−1 y 3,1 x 104 M−1 respectivamente. Amenos que se establezca de otra manera, las perlas se recubrieron con cantidades saturantes de moléculas Ld, Kbm3 oKb biotiniladas.

Se suspendieron células con perlas hasta alcanzar una concentración final de 107 perlas/ml. Las concentracionesde las células fueron 106/ml en las Figuras 2, 3 y 4 y 107/ml en las Figuras 5, 6 y 7. Los péptidos se agregaronen una concentración de 20 µM. La adsorción se realizó bajo agitación suave durante los tiempos indicados y a lastemperaturas indicadas en el texto. Posteriormente se contaron las células adsorbidas a perlas bajo el microscopio.En los casos en los que no se observó una roseta definida (3 perlas o más por célula), se probó la unión golpeandoligeramente el cubreobjetos. Tras incubación a temperatura ambiente en presencia del péptido de alta afinidad QL9,péptido de afinidad intermedia p2Ca y péptido de baja afinidad SL9, la mayoría de las células T 2C se unieron alas perlas recubiertas con Ld, tal como lo indica el examen microscópico tras 4 horas de incubación (Tabla I). Seobtuvieron resultados similares (60-80% de células capturadas) en 5 experimentos independientes. La unión celularfue específica ya que no se produjo en presencia de complejos Ld-LCMV y Ld-MCMV no reactivos para 2C.

La adsorción también se cuantificó por citofluorometría de flujo usando un FACSscan® (Becton Dickinson & Co.,Mountain View, CA) registrando gráficos de puntos de fluorescencia verde frente a roja, o de dispersión frontal frentea dispersión lateral. Para evaluar la formación de complejos célula-perla usando gráficos de fluorescencia verde frentea roja, se marcaron las perlas en rojo con ficoeritrina (Figura 2A: perlas solas) y se marcaron las células en verde conNHS-fluoresceína (Pierce, Rockford, IL) (Figura 2B: células solas). Se evaluó la formación de complejos célula-perlamediante la aparición de acontecimientos verdes (V) y rojos (R). Se calculó el porcentaje de células complejadas conperlas como la relación RV/V+RV, donde V es la cantidad de acontecimientos en el cuadrante inferior derecho y RVes la cantidad de acontecimientos en el cuadrante superior derecho. Se descubrió que en tales gráficos de puntos defluorescencia verde frente a roja (Figura 2), la formación de complejos célula-perla fue bastante evidente en presenciade péptidos antigénicos QL9 (Figura 2C), p2Ca (Figura 2D) y SL9 (Figura 2E), con más de 85% de las célulascambiando a un valor alto de fluorescencia roja. Se detectaron algunos acontecimientos coloreados de rojo y verde(2,2%) en la muestra incubada con un péptido control (LCMV) (Figura 2F). Esto se debió con mayor probabilidad ala adsorción no específica de una pequeña cantidad de detritus celulares marcados con fluoresceína a las perlas.

Se dispuso también de gráficos de puntos de dispersión lateral frente a dispersión frontal para esta cuantificación,gracias al hecho de que las células (Figura 3C) y las perlas (Figura 3B) tuvieron difracciones laterales y frontales muydiferentes, lo que hizo fácil marcar regiones diferentes de manera clara (Figura 3A) conteniendo las poblaciones deacontecimientos que representan a las células y a las perlas respectivamente. La aparición de una población adicionalde acontecimientos con una difracción frontal más alta que las perlas y una difracción lateral más alta que las células,reflejó la formación de complejos célula-perla; esto permitió definir una región de complejos, distinta de las regionesde células y de perlas. Se calculó el porcentaje de células adsorbidas a perlas como la relación CO/CO+CE, donde COfue la cantidad de acontecimientos en la región de complejos y CE fue la cantidad de acontecimientos en la región decélulas. Tales mediciones de difracción frontal y lateral mostró la adsorción específica de antígeno de células T 2C a lasperlas: en el experimento mostrado en la Figura 3, 91,0% y 78,9% de las células estaban adsorbidas a perlas recubiertascon Ld en presencia de QL9 (Figura 3D) y p2Ca (Figura 3E) respectivamente y 63,8% de las células estaban adsorbidasa perlas recubiertas con Kbm3 en presencia de dEV-8 (Figura 3G) y 75,7% de las células estaban adsorbidas a perlasrecubiertas con Kb en presencia de SIYR (no mostrado) tras 4 horas de incubación. Varias poblaciones, que diferían ensus valores de difracción lateral, estaban visibles en la región de complejos; representaban probablemente complejosconteniendo diferente cantidad de perlas. En presencia de complejos Ld-LCMV (Figura 3F), Kbm3-E1 (Figura 3H) yKb-E1 no reactivos para 2C, se encontró el 2,6%, 1,1% y 0,2% de los acontecimientos en la región de complejos,respectivamente.

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Se usó un análisis de citofluorometría de flujo para cuantificar la influencia de diversos parámetros en la formaciónde complejos célula-perla. La unión de células a perlas fue dependiente del tiempo. Se detectó unión tras 5 min. deincubación, aumentó posteriormente hasta alcanzar una meseta entre 1 y 4 horas y disminuyó notablemente tras 6horas (Figura 4A). Las cinéticas de adsorción fueron marcadamente paralelas para diversos complejos péptido-CMH.La unión fue también dependiente de la temperatura, como se muestra en la Figura 4B. A 4ºC, se capturó sólo unpequeño porcentaje de células en las perlas, incluso tras incubación prolongada. La adsorción a temperatura ambientefue muy similar a la adsorción a 37ºC con la excepción de Ld-p2Ca, para el que los niveles de unión a 37ºC fueronaproximadamente el 25% de los valores medidos a temperatura ambiente, consistentes con la incapacidad de p2Capara estabilizar Ld a 37ºC (Cai y Sprent, 1996). Finalmente, la dependencia de CD8 de la captura de células varió conel complejo péptido-CMH: por ejemplo, las capturas con Ld-QL9 y Kbm3-SIYR fueron muy independientes de CD8,mientras que Ld-p2Ca y Kbm3-dEV-8 exhibieron dependencia de CD8 (Figura 4C).

Ejemplo 3

Recuperación de células T específicas de antígeno mezcladas con células T irrelevantes

Las frecuencias de precursores de células T en animales no expuestos son típicamente bajas. Se vio que las perlasmagnéticas resultaron adecuadas en otros sistemas para enriquecer poblaciones celulares con baja frecuencia (Sawaday col., 1990; Kato y Radbruch, 1993). Para evaluar si las perlas magnéticas recubiertas con CMH clase I podían usarsepara enriquecimiento de precursores de células T, se mezclaron células T 2C marcadas con fluoresceína con célulasT CD8+ purificadas de ratones C57BI/6 no expuestos. Tras incubar con perlas magnéticas recubiertas con CMH enpresencia de péptido, se eluyeron las células adsorbidas y se contaron, y se determinó el porcentaje de células T 2Cpor citofluorometría de flujo. En el experimento mostrado en la Figura 5, las células T 2C fueron no detectables enla frecuencia inicial de 0,03%. Tras la adsorción usando perlas recubiertas con Kbm3 y péptido dEV-8, se observóun pico definido de fluorescencia verde, exhibiendo la misma intensidad que la población de células T 2C marcadascon fluoresceína originales. Este pico representó el 65,1% de las células eluidas. No se observó pico cuando se usópéptido control en vez de dEV-8. Se logró un enriquecimiento de 800-1600 veces en experimentos comparables decélulas T 2C usando perlas recubiertas con 3 complejos CMH-péptido diferentes (Tabla II). En todos los casos, lascélulas no fluorescentes en la población eluida representaron sólo una fracción menor de la población celular inicial(aproximadamente 0,2%).

Ejemplo 4

Aislamiento in vitro y expansión de CTL específica de antígeno de ratones no expuestos

Citotoxicidad mediada por células in vitro

Se usaron como células diana: células RMA.S expresando Ld, células EL4 (H-2b), células MC57 (H-2b) infectadascon LCMV Armstrong (48h; multiplicidad de infección: 1 UFP por célula) o células BALB/c CL-7 (H-2d) infectadascon LCMV Armstrong (48h; multiplicidad de infección: 1 UFP por célula). Se cargaron las células diana con 100 µCide Na2

51CrO4 (New England Nuclear, Wilmington, DE) por 106 células a 37ºC durante 60 min., en presencia de FCSal 20%. Se lavaron tres veces y se tomaron alícuotas en placas de 96 pocillos a razón de 4.000 a 10.000 células porpocillo. Posteriormente se agregaron péptidos y células efectoras. El volumen final fue de 200 µl/pocillo. Se incubaronlas placas a 37ºC durante 5 horas. Se recogieron cien µl de sobrenadante y se contaron en un contador gamma. Secalculó el porcentaje de lisis específica como se informó anteriormente (Wunderlich y Shearer, 1991).

Ensayo in vivo para actividad de CTL

Se inyectaron los ratones receptores en el día 0 con 2 x 103 UFP de LCMV Armstrong i.v. y se les transfirieroncélulas por vía i.v. en el día 1. En el día 2 se sacrificaron los ratones, se ensayaron los bazos en busca de valoracionesinfecciosas de virus por ensayo en placa en células Vero como se describió previamente (Byrne y Oldstone, 1984). Seexpresaron las valoraciones de virus como unidades formadoras de placas por gramo de tejido (ufp/g).

Cultivo celular

Se recuperaron células adsorbidas sobre perlas lavando las perlas 3 veces con DMEM conteniendo FCS al 10% yposteriormente se cultivaron en placas de 96 pocillos recubiertas con la molécula del CMH clase I adecuada y anti-cuerpo anti-CD28 en presencia de 10 µM de péptido; estas condiciones son suficientes para activar las células T 2Clatentes. Se usaron placas con fondo plano para asegurar que cada célula esté en contacto con las moléculas estimu-lantes inmovilizadas. Tras 2 días de cultivo a 37ºC bajo atmósfera húmeda conteniendo 8% de CO2, se reemplazó lamitad del volumen del medio por medio fresco conteniendo 20% de sobrenadante del cultivo de esplenocitos de rataactivados con concanavalina A (sobrenadante conA). Tras 8-12 días, se reestimularon las células con células de bazopulsadas con 1 µM de péptido y se cultivaron en presencia de 10% de sobrenadante conA y 2 ng/ml de TGFβ1 (Lee yRich, 1991; Zhang y col, 1995).

Generación de líneas CTL específicas de antígeno a partir de células T de ratón no expuestos usando adsorciónsobre perlas magnéticas recubiertas con CMH; especificidad de antígeno de la etapa de aislamiento

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Para investigar si el procedimiento de captura podría aplicarse para aislar células T específicas de antígeno a partirde un animal no expuestos, se incubaron dos alícuotas de células T CD8+ purificadas de ganglios linfáticos de ratónC57BL/6 (haplotipo H-2b) con perlas magnéticas recubiertas con Kb en presencia de péptido OVA-8 (alícuota 1) opéptido VSV-8 (alícuota 2) durante 4 horas a temperatura ambiente. Tras 3 lavados, se pusieron las células en cultivoen 12 pocillos de una placa de 96 pocillos recubierta con Kb y mAb anti-CD28, en presencia de 10 µM de péptidoOVA-8 o VSV-8. Se procesaron los cultivos como se indicó en el párrafo anterior. El crecimiento celular se hizovisible tras 7 días en pocillos conteniendo células adsorbidas. Se reestimularon las células en celdas de alimentaciónen el día 9 y se probó la actividad citotóxica en el día 18. Las células de la alícuota 1 cultivada con OVA-8 exhibieronuna actividad CTL específica para péptido OVA-8 (Figura 6A), y las células de la alícuota 2 cultivadas con VSV-8exhibieron una actividad CTL específica para VSV-8 (Figura 6C). Se proveyeron controles mediante la combinacióninversa: las células capturadas usando péptido OVA-8 contenían precursores de CTL anti-VSV-8 no detectables, yaque no generaron CTL anti-VSV-8 cuando se usó VSV-8 más que OVA-8 para activarlas en cultivo (Figura 6B); demanera similar, las células capturadas usando péptido VSV-8 contenían precursores de CTL anti-OVA-8 no detectables(Figura 6D).

Para obtener una estimación de las frecuencias de CTLp tras el enriquecimiento, se repitió el experimento deenriquecimiento usando perlas recubiertas con Kb y péptido OVA-8. En un experimento representativo, se tomaronalícuotas de las 12.000 células recuperadas por adsorción a perlas magnéticas recubiertas con Kb-OVA8 y se culti-varon de manera separada en 12 pocillos de placas de 96 pocillos inmediatamente tras la captura. Se recuperó CTLespecífica de las células capturadas en 3 pocillos, indicando que la frecuencia del precursor tras la captura fue deaproximadamente 1/3.500. Se obtuvieron resultados similares en tres experimentos independientes.

Generación de CTL anti-LCMV a partir de células T de ratón no expuestos; actividad antiviral in vitro e in vivo

Se derivaron CTL anti-LCMV incubando 107 células T CD8+ purificadas de ganglios linfáticos de ratón BALB/c(haplotipo H-2d) junto con perlas magnéticas recubiertas con Ld en presencia de péptido de LCMV durante 4 horasa temperatura ambiente. Tras 3 lavados, se recuperaron aproximadamente 104 células y se cultivaron en 12 pocillosde una placa de 96 pocillos recubierta con Ld y mAb anti-CD28, en presencia de 10 µM de péptido de LCMV. Secultivaron las células como se indicó en el párrafo anterior. Como se muestra en la Figura 7A, se obtuvieron linfocitosT citotóxicos (CTL) específicos para péptido de LCMV. Las células también mataron dianas infectadas con LCMV dehaplotipo H-2d, mientras que exhibieron sólo una actividad de fondo contra dianas no infectadas (Figura 7B). Tambiénestuvo presente una actividad antialotípica (Figura 7C) así como algo de actividad NK/LAK (Figura 7D). Todas lascélulas expresaron CD8, como lo indica la citofluorometría de flujo. El ensayo in vivo mostró que las células fueroncapaces de reducir marcadamente las valoraciones de virus en ratones BALB/c (H-2d) con infección aguda con LCMV(Figura 8). Esta reducción fue específica para CMH ya que no se observó reducción significativa de las valoracionesde virus en ratones C57/BL6 (H-2b) tras la inyección de CTL.

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TABLA I

Captura de células T 2C en perlas magnéticas recubiertas con Ld en presencia de diversos péptidos tal como seevaluó por medio de examen microscópico

TABLA II

Recuperación de células T 2C mezcladas con células T CD8+ de ratón B6 no expuestos por adsorción sobre perlasmagnéticas recubiertas con CMH clase I

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REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento para enriquecer linfocitos T específicos de antígeno que comprende las etapas de:

(a) poner en contacto una población heterogénea de linfocitos T específicos de antígeno con un sustrato paracapturar antígenos, dicho sustrato comprendiendo:

i) un soporte que tiene en su superficie una población homogénea inmovilizada de moléculas del CMHde Clase I vacías, en el que dichas moléculas de Clase I son capaces de unir uno o más antígenos ydichas moléculas de Clase I son moléculas Kbm3 o Ld expresadas por una línea celular recombinantede Drosophila; y

ii) una perla;

a la que se ha unido uno o más antígenos, durante un período de tiempo suficiente para permitir a loslinfocitos T específicos de antígeno interaccionar con el sustrato; y

(b) eluir los linfocitos T específicos de antígeno del sustrato para proveer una población enriquecida de linfo-citos T específicos de antígeno.

2. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que dicha perla es una perla magnética.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 ó 2 en el que el antígeno o antígenos es(son) péptido(s).

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