prueba de patogenecidad en pestalotia

UNIVERSIDAD MICHOACANA DE

S LGO

URUAPAN, MICHOACN

F ACULTAD

PRES

ETIOLOGA Y CONTRCAUSAL DE LA MANCde burro Oncidium

de muerto

JOS LUIS

EFITO

Como requisito pa

INGENIAN NICOLAS DE HIDAS

DE AGROBIOLOGA

IDENTE JUAREZ

OL QUMICO in vitro DEL AGENTE HA FOLIAR EN ORQUDEA, Oreja cavendishianum Bateman Y Flor Laelia autumnalis Lindl.

S

sM

r

E

PTESI ENERO DEL 2008

NCHEZ LPEZ

pecialidad en: EJORAMIENTO

cial para obtener el titulo de:

RO AGRNOMO

resenta:

DEDICATORIA A mis padres, Mariano Snchez y Candelaria Lpez, por todo el amor que me han dado, y por creer siempre en m. A mis abuelos Martn, Rosa y Petronila, por que son para mi el ejemplo a seguir. A mis hermanos Lety y Oscar, por todos sus apoyos y cario. A mi esposa Mariela, por su apoyo y comprensin para la realizacin de este trabajo. A mi hijo ALAN, por ser la fuerza, el motivo para seguir adelante y la alegra de mi corazn Por ti mi hijo todo, Te AMO. A mi todos mis Tos y tas, en especial al to Jorge, por que lo admiro y respeto mucho. A m cuada deli. A mis sobrinas Anazhuri y Beln, por que son la alegra de la familia. A mis primos y primas

AGRADECIMIENTOS A DIOS por darme la vida y por que nunca me dejas solo cuando ms te necesito. A la Universidad Michoacana y a la Facultad de Agrobiologa, por ser la cuna de mi formacin profesional. A la Ing. Teresita del Carmen vila, por ser una gran persona y asesor de este trabajo y por todo su apoyo y paciencia, mil Gracias. A una gran mujer, que admiro y respeto mucho, por confiar en m, por motivarme a seguir adelante. A la Dra. Martha Elena Pedraza, gracias por su confianza. A mis sinodales, Dr. J. Luciano Morales Garca, M.C., Jorge Campos vila, Ing, Salvador Aguirre Paleo, Ing. Romn Negrete Nolasco, gracias por su valiossimo tiempo para la revisin de este trabajo. Al Ing. Pedro Garca, viverista del Parque Nacional, por las plantas facilitadas para poder realizar este trabajo, Gracias. A todos los compaeros del Laboratorio de Cultivo de tejidos, por sus apoyos directos e indirectos para la realizacin de este trabajo.

NDICE GENERAL

Pgina

NDICE DE CUADROS DEL APNDICE...

NDICE DE CUADROS Y FIGURAS...

RESUMEN...

i

ii

iv I. INTRODUCCIN..

1

II. REVISIN DE LITERATURA......................................... 3

2.1 Importancia econmica de las orqudeas.... 3

2.2 Descripcin botnica de Oncidium cavendishianum Bateman

2.2.1 Clasificacin Taxonmica de Oncidium cavendishianum...

3

5

2.3 Descripcin botnica de Laelia autumnalis Lindl

2.3.1 Clasificacin Taxonmica de Laelia autumnalis...

6

8

2.4 Enfermedades fungosas en Orqudeas....... 8

2.5 Sntomas causados por Pestalotia sp.................... 11

2.6 Caractersticas morfolgicas de Pestalotia sp.... 12

2.6.1 Clasificacin taxonmica de Pestalotia sp

2.6.2 Ciclo biolgico de Pestalotia sp..

13

14

III.

MATERIALES Y MTODOS.........

15

3.1 Localizacin del rea de muestreo.......... 15

3.2 Ubicacin del experimento.... 17

3.3 Siembra e identificacin del agente causal .... 17

3.4

3.5

Medio de cultivo Papa-Dextrosa-Agar..

Prueba de patogenicidad...................

18

19

3.6 Bioensayo con fungicidas para el control de Pestalotia sp en

condiciones in vitro..

19

3.7 Medios de cultivo.................................................................. 21

IV. RESULTADOS Y DISCUSIN.. 25

4.1 Identificacin del agente causal 25

4.2

4.3

Prueba de patogenicidad.........

Efecto de fungicidas para el control de Pestalotia sp bajo

condiciones in vitro.....

26

28

4.4

V.

VI.

VII

Evaluacin de medios de cultivo...

CONCLUSIONES

LITERATURA CITADA

APNDICE

30

34

35

39

NDICE DE CUADROS Cuadro Pgina 1 Medio de cultivo Papa-Dextrosa-Agar....... 18

2

3

4

5

6

Producto e ingrediente activo de los fungicidas utilizados para el

control in vitro de Pestalotia sp agente causal de manchas

necroticas

Medio de cultivo Jugo de Verduras V8-Agar.....

Medio de cultivo Jugo de tomate-Agar...

Efecto de fungicida para el control de Pestalotia sp in vitro..........

Efecto del medio de cultivo para el desarrollo micelial in vitro de

Pestalotia sp...

20

22

23

29

32

NDICE DE FIGURAS Figura Pgina

1

2

3

4

5

6

Inflorescencia de la Oreja de burro Oncidium cavendishianum..

Inflorescencia de la Flor de muerto Laelia autumnalis..

Ciclo biolgico de Pestalotia sp en varias plantas.............................

Lugar de la colecta y especies o ejemplares de orqudeas del

Parque Nacional Barranca del Cupatitzio

Sntomas de la enfermedad en hojas de Orqudea.....

Bioensayo de control qumico in vitro para Pestalotia sp

5

7

14

15

16

20

7

8

9

Micelio y b) conidios de Pestalotia sp. en medio de PDA...

Plantas de Laelia autumnalis con sntomas de la

enfermedad.....

Plantas de Oncidium cavendishianum con sntomas de la

enfermedad.......................................................................................

25

27

27

10 Grafica del efecto del tipo de fungicida para inhibir el crecimiento

micelial in vitro de Pestalotia sp

29

11 Inhibicin de Pestalotia sp por fungicidas a dosis medias

comparadas a los 5 das de establecido el experimento.

30

12

Grafica del efecto del medio de cultivo para el crecimiento micelial

in vitro de Pestalotia sp

32

13 Crecimiento de Pestalotia sp. en diferentes medios de cultivo a los

5 das de establecido el experimento.

33

NDICE DE CUADROS DEL APNDICE

Cuadros Pgina 1A Claves para identificacin de hongos imperfectos....... 39

2A

3A

4A

5A

6A

7A

8A

9A

10A

Anlisis de varianza para el efecto del tipo de fungicida sobre el

crecimiento in vitro de Pestalotia sp durante el primer da de

cultivo...


crecimiento in vitro de Pestalotia sp durante el segundo da de

cultivo...


crecimiento in vitro de Pestalotia sp durante el tercer da de

cultivo...


crecimiento in vitro de Pestalotia sp durante el cuarto da de

cultivo...


crecimiento in vitro de Pestalotia sp durante el quinto da de

cultivo...

Anlisis de varianza para el crecimiento in vitro de Pestalotia sp

durante primer da de evaluacin


durante segundo da de evaluacin


durante tercer da de evaluacin.


durante cuarto da de evaluacin

39

39

40

40

40

40

41

41

41

11A


durante quinto da de evaluacin

41

RESUMEN

Las orqudeas componen un grupo numeroso de gneros y especies

botnicas adaptadas a diferentes tipos de climas tropicales y subtropicales que

desde la antiguedad han sido preferidas como plantas de ornato por su forma,

colores y fragancias.

En Michoacn gran cantidad de poblaciones de orqudeas se han visto

drsticamente afectadas, por la destruccin de bosques, en donde la tala de los

mismos para incorporar terrenos a la agricultura y los incendios modifican su

hbitat, poniendo a las especies endmicas sobre todo en peligro de extincin;

de igual forma, la depredacin reduce las poblaciones de orqudeas

significativamente.

El material enfermo se colect en el Parque Nacional Barranca del

Cupatitzio el sntoma de la enfermedad en campo se observ en hojas de

orqudeas que inician con una mancha circular central en hojas de color negro

al centro y caf oscuro alrededor, cubriendo por completo la hoja. Bajo

condiciones de laboratorio se llevaron a cabo aislamientos de material enfermo

de hojas de orqudea Laelia autumnalis y Oncidium cavendishianum en medio

de cultivo PDA, de secciones de stas hojas se obtuvieron colonias fungosas

que se observaron al microscopio, el micelio puro se coloc en portaobjetos

para obtener preparaciones fijas. El hongo aislado se identific como Pestalotia

sp siguiendo las claves de Barnett y Hunter (1998). A partir de colonias puras

se prepar una solucin que contena 54200 conidios por mL-1, y con la cual se

inocularon plantas sanas para llevar a cabo las pruebas de patogenicidad, bajo

condiciones de laboratorio. A los 120 y 75 das en donde se reprodujeron

sobre las hojas de las plantas inoculadas los sntomas de la enfermedad

observados en campo, de estas plantas se reaisl nuevamente a Pestalotia sp,

confirmando as su patogenicidad en hojas de Oncidium cavendishianum y

Laelia autumnalis.

Se hizo un bioensayo de control in vitro con cinco fungicidas (Cupravit

PH, Benomyl 50, Tecto 60, Interceptan 50 y Manzate 200) para

determinar sus efectos en el desarrollo del patgeno, Tecto 60 inhibi de mejor

forma el crecimiento del hongo desde el cuarto da del establecimiento del

experimento.

El mejor medio de cultivo para el desarrollo del hongo fue Jugo de

tomate-Agar ya que mostr un crecimiento abundante y rpido con gran

cantidad de acrvulos a los 11 das de la incubacin.

I. INTRODUCCIN

Las orqudeas componen un grupo numeroso de gneros y especies

botnicas adaptadas a diferentes tipos de climas tropicales y subtropicales

(Cabrera et al., 2007). La familia de las orqudeas es una de las ms diversas

morfolgicamente, se estima que existen alrededor de 25, 000 especies. En

Mxico se cuenta con 1106 especies de orqudeas y subespecies distribuidas

en 159 gneros (Laguna et al., 2005).

En el estado de Michoacn gran cantidad de poblaciones de orqudeas

se han visto drsticamente afectadas, principalmente por la extraccin masiva,

as como tambin por la destruccin de bosques y otros hbitats en donde

viven (ngel y ngel, 2003). La mayora de las orqudeas que son extradas de

los bosques son vendidas a personas que desconocen de los cuidados que

requieren provocando as su muerte en poco tiempo (Mrida, 2007).

Al existir poco conocimiento sobre el manejo adecuado para las

orqudeas silvestres se ponen en riesgo las plantaciones de las mismas, ya que

al no desarrollar de manera adecuada y perder su valor esttico son

rechazadas, lo que provoca prdidas econmicas (Mrida, 2007).

En el Parque Nacional Barranca del Cupatitzio de Uruapan, Michoacn

se encuentran diversas especies de plantas de ornato, entre ellas las

orqudeas, reportando Salgado (2007) 28 especies. Las orqudeas Oncidium

cavendishianum (oreja de burro) y Laelia autumnalis (flor de muerto) son de

las especies de orqudeas ms comunes.

En fechas recientes estas especies han mostrado sntomas de

decaimiento de la planta y manchas foliares que disminuyen la calidad de su

floracin razones por las cuales se plantearon los siguientes objetivos:

1.- Determinar la etiologa de la mancha foliar en la Oreja de burro Oncidium

cavendishianum y en Flor de muerto Laelia autumnalis.

2.- Evaluar fungicidas in vitro mediante un bioensayo para el control del

patgeno.

3.- Determinar el mejor medio de cultivo para el crecimiento del patgeno.

1.2 Hiptesis

Es posible que el agente causal de la mancha foliar de Oncidium cavendishianum y Laelia autumnalis sea de origen fungoso.

Con las pruebas de bioensayo es posible determinar la efectividad de los fungicidas para el control in vitro del patgeno.

II. REVISIN DE LITERATURA

2.1 Importancia econmica de las orqudeas

Las orqudeas son plantas cuya belleza y relativa facilidad de cultivo las

han convertido en objeto de gran demanda comercial en muchos pases del

mundo (Malagn y Salgado, 2005).

La creciente comercializacin legal de especies de orqudeas, que se

reproducen en lugares especializados a travs de cultivo de tejidos y/o

germinacin de microsemillas, ha favorecido la expansin de su mercado

(Navarro et al., 2001).

De las especies mexicanas el 80 % se pueden aprovechar en el mbito

ornamental ya sea como plantas completas, flor de corte, follaje, o en

colecciones especiales. La enorme diversidad gentica, morfolgica, de

ecotipos y formas de las orqudeas mexicanas presentan una gran demanda a

nivel nacional y en el extranjero (Menchaca y Moreno, 2005).

2.2 Descripcin botnica de Oncidium cavendishianum Bateman

Oncidium cavendishianum es conocida con el nombre de Oreja de burro

amarilla. Se distribuye en Centroamrica (Honduras y Guatemala); y en

Mxico en los estados de Puebla, Oaxaca y Veracruz; crece en bosques de

encino y pino, en rboles de sombra a una altura de 1000 a 2800 msnm; su

poca de floracin va de diciembre a mayo (Navarro et al., 2001).

Es una especie epifita, aunque puede adaptarse como semiterrestre en

macetas; se desarrolla sobre ramas y troncos de los rboles.

El tipo de crecimiento de esta especie es simpodial, es decir que existe

un rizoma que crece de manera horizontal, carece de pseudobulbos, con hojas

muy carnosas aproximadamente de ocho mm de espesor, de 12 cm de ancho

en su parte mayor y de 30 a 50 cm de largo (Navarro et al., 2001).

Las races son areas y pueden estar libres o colgantes; alrededor de la

raz presenta una capa de tejido esponjoso llamado velamen. Las races son de

color gris a blanco y tienen un pice meristemtico que absorbe humedad y

nutrientes que la planta necesita, el pice cumple con la funcin de realizar

parte de la fotosntesis (Navarro et al., 2001).

Su inflorescencia es terminal con 15 a 30 flores aromticas de

consistencia cerosa, el Spalo y Ptalo son de color amarillo verdoso, con

manchas caf, el lpalo de color amarillo; miden de 3 a 3.5 cm de dimetro

(Navarro et al., 2001).

Figura 1. Inflorescencia de la Oreja de burro Oncidium cavendishianum

2.2.1 Clasificacin taxonmica de Oncidium cavendishianum

De acuerdo con Navarro et al., (2001) esta especie se clasifica de la

siguiente manera:

Reino: Plantae

Divisin: Spermatophyta

Subdivisin: Angiospermae

Clase: Monocotyledoneae

Orden: Microspermae

Familia. Orchideaceae

Subfamilia: Orchidiideae (Neottideae)

Tribu: Epindendreae

Subtribu: Oncidiinae

Genero: Oncidium

Especie: O. cavendishianum

2.3 Descripcin botnica de Laelia autumnalis Lindl

En Mxico se le conoce con los nombres de flor de muerto, calavera,

catarinas, lirio, tzauhtli (Navarro et al., 2001).

Laelia autumnalis es una especie endmica de Mxico (Arriaga, 2005),

su distribucin se encuentra en los estados de Sonora, Durango, Jalisco,

Michoacn, Morelos, Guerrero y Puebla; crece en bosques de pino-encino a

una altura de 1500 a 2600 msnm., su poca de floracin es durante los meses

de octubre a noviembre (Navarro, et al., 2001).

Es una especie epfita o rupcola aunque puede adaptarse como

semiterrestre en macetas. Se desarrolla sobre ramas y troncos de los rboles,

sus races no penetran en el tallo de sus hospedantes, el rbol cumple con la

funcin de soporte, solo crecen en su corteza (Arriaga, 2005).

El tipo de crecimiento es simpodial, es decir que existe un rizoma que

crece de manera horizontal, del cual van surgiendo los pseudobulbos que

tienen un crecimiento vertical. A medida que crece el rizoma surgen nuevos

pseudobulbos, que dan origen a nuevas plantas (Arriaga, 2005).

Las races son areas y pueden estar libres o colgantes; alrededor de la

raz presenta una capa de tejido esponjoso llamado velamen. Las races son de

color gris a blanco y tienen un pice meristemtico que absorbe humedad y

nutrientes que la planta necesita (Navarro et al., 2001).

El tallo de esta especie es un pseudobulbo de tipo claviforme,

semicilndrico, de 2 cm de dimetro en su parte ms ancha y de 15 a 20 cm de

largo, con 2 a 3 hojas coriceas de 3 cm de ancho y de 25 a 30 cm de largo

(Navarro et al., 2001). La funcin primordial de los pseudobulbos es la de

almacenar nutrientes, que son la fuente de reserva para la planta en temporada

de sequa (Arriaga, 2005).

La inflorescencia es apical en forma de racimo con cinco a ocho flores

aromticas; los spalos y ptalos son de color rosa y magenta en la punta con

la parte del centro de color blanco, el labelo es de color blanco con el centro

amarillo y magenta en la punta; con un dimetro de 8 a 10 cm (Navarro et al.,

2001).

Las semillas pueden germinar en condiciones naturales, con ayuda de

unas micorrizas en proceso de simbiosis, donde las hifas del hongo pasan a

formar parte de la estructura de las races, desempeando la funcin de races

secundarias que ayudan en la captacin de agua y nutrientes (Arriaga, 2005).

Figura 2. Inflorescencia de la Flor de muerto Laelia autumnalis

2.3.1 Clasificacin taxonmica de Laelia autumnalis

De acuerdo con Navarro et al., (2001) esta especie se clasifica de la

siguiente manera:

Reino: Plantae

Divisin: Spermatophyta

Subdivisin: Angiospermae

Clase: Monocotyledoneae

Orden: Microspermae

Familia. Orchideaceae

Subfamilia: Orchidiideae (Neottideae)

Tribu: Epindendreae

Subtribu: Laeliinae

Genero: Laelia

Especie: L. autumnalis

2.4 Enfermedades fungosas en orqudeas

En la actualidad la economa agrcola sufre prdidas econmicas debido

a diversas causas del medio ambiente, entre ellas, son las enfermedades

ocasionadas por; hongos, bacterias, virus y nemtodos. El grupo principal de

organismos fitopatogenos es el de los hongos, se conocen actualmente mas de

8,000 especies capaz de provocar alrededor de 80,000 enfermedades

(Romero, 1993).

El cultivo de las orqudeas, tambin se ve afectado por diversos tipos de

enfermedades ocasionados por hongos.

El tizn de los ptalos causada por Botrytis cinerea ataca a las flores de

una gran variedad de orqudeas (Cattleya, Phalaenopsis, Dendrobium,

Oncidium y Vanda). Es ms comn durante el clima fresco y hmedo. Se

reconoce por unos puntos pequeos, cafs y circulares en los ptalos y

spalos de las flores; en etapas avanzadas la flor entera puede estar cubierta

con masas de esporas (Sheehan, 1988).

La pudricin negra, prevalece en clima fri Phytophthora cactorum y el

otro en el clima hmedo y clido Pythium ultimum pueden aparecer en

cualquier poca del ao. Pythium es el ms peligroso, ya que se disemina por

toda la planta rpidamente. Los sntomas de ambos hongos son similares,

afectan a las hojas pero pueden atacar a los pseudobulbos y tambin a los

tallos (Sheehan, 1988).

La pudricin del cogollo en Cymbidium, causada por el hongo

Phytophthora erythroseptica, el sntoma de la enfermedad empieza en la raz,

con una pudricin que avanza hasta la parte area, destruyendo toda la planta.

La enfermedad puede notarse claramente en las hojas interiores por un cambio

de color de los tejidos infectados, el cual primero es verde obscuro y despus

caf grisceo. Las hojas externas generalmente se amarillan luego de que su

base es podrida. La pudricin tiene apariencia hmeda, pero es firme e inodora

(Romero, 1996).

Murgua (2006) seala que el hongo Colletotrichum gloeosporioides

causa sntomas de enfermedad en orqudeas con manchas circulares y

hundidas en las hojas, pseudobulbos, flores y brotes tiernos de color oscuro, a

veces con un halo alrededor, puntos oscuros en el centro de la mancha que en

periodos prolongados adquieren un color salmn rosado. En los botones

florales, inflorescencias y brotes nuevos, se forman reas marrn oscuro o

negro que se hunden causando un doblamiento y la muerte del rgano

afectado.

Cercospora y Rhizoctonia, en hojas y tallos de orqudeas causan

sntomas de lesiones redondeadas y alargadas, algunos con bordes definidos,

en el cual algunos tejidos se tornan de color marrn oscuro. Cuando el ataque

es severo puede afectar a todas las hojas (Murgua, 2006).

Glomerella cincta conocido como antracnosis americana, los sntomas

de esta enfermedad empiezan en la punta de las hojas y avanza hacia la base.

La parte enferma es de color obscuro y se pudren (Romero, 1996).

Physalospora cattleyae y Gloeosporium sp, causan antracnosis,

apareciendo principalmente en las hojas de orqudea que comienza con

manchas de color amarillo a caf claro, son suaves, ms o menos circulares y

algo hundidas, En casos de infeccin severa las hojas llegan a morir (Romero,

1996).

2.5 Sintomas causados por Pestalotia sp

Sosa et al. (2003), reportan que Pestalotia sp. causa lesiones necrticas

en plantas de Jazmn del cabo Gardenia augusta; los sntomas se caracterizan

por manchas foliares de centro castao claro, rodeado por reas concntricas

de color castao oscuro donde se observan acrvulos. La enfermedad produce

decaimiento de la planta, notable reduccin de las hojas, escasa y baja calidad

de la floracin.

Gonzlez et al. (2002) encontraron en Cipres lambertiana que Pestalotia

sp es el agente causal del tizn, observndose muerte de acculas y ramas

jvenes que quedan adheridas al tallo tomando una coloracin pardo grisceo,

a veces con presencia de inflorescencias de color negro producidas por las

fructificaciones del hongo

Esquivel (2004) en campo encontr hojas de guayaba con manchas

caf-plateadas, las cuales al ser aisladas encontr a Pestalotia sp.

Por su parte, lvarez et al. (1998), reportan a Pestalotia guepinii,

provocando manchas foliares en Hortensias (Hydrangea sp.) identificndose en

forma preliminar como antracnosis.

Romero (1993), reporta a Pestalotia palmarum, que en plantaciones

jvenes de palmas de coco, los sntomas de esta enfermedad inician con unas

manchas transparentes y claras sobre las hojas, que mas tarde cambian a

verde amarillento, el tejido se seca y las hojas se desprenden.

Bigre et al. (1990), reportan que Pestalotia guepini, provoca manchas

amarillas a pardas sobre las hojas de Camelia y Rododendro, estas manchas

tienen un desarrollo en crculos concntricos.

Campos et al. (2005), en trabajos de investigacin en ave de paraso

encontraron al genero Pestalotia causante del tizn foliar y follaje, en un 20 %

de los casos.

2.6 Caractersticas morfolgicas de Pestalotia sp

Romero (1993) menciona que este hongo se caracteriza, al igual que

todos los que forman este orden, por la produccin de conidios en cuerpos

fructferos llamados acrvulos, los acrvulos son negros, discoides o

pulvinados, subepidrmicos; conidiforos cortos y simples. Bigre et al. (1990)

cita que forman conidios pluricelulares fusiformes. Montiel y Avelar (2001) y

Bigre et al. (1990) mencionan que los conidios son alargados y multiseptados,

presentan de 5 clulas y las de ambos extremos son hialinas en tanto que las

del centro son de color oscuro el conidio presenta dos a tres apndices en uno

de los extremos y tambin son hialinos.

Romero (1993) seala que estos hongos penetran principalmente a

travs de heridas, varias especies de este hongo son causantes de manchas

foliares o lesiones cancrosas en frutos de plantas tropicales.

2.6.1 Clasificacin taxonmica de Pestalotia sp

De acuerdo con Romero (1993) este hongo se clasifica de la siguiente

manera.

Reino: Fung

Clase: Deuteromycetes

Orden: Melanconiales

Familia: Melanconiaceae

Genero: Pestalotia

Especie: sp

2.6.2 Ciclo biolgico de Pestalotia sp.

Germinacin del conidio y penetracin en el tejido

Infeccin primaria e invasin del tejido

Micelio

Infeccin de varias plantas

Hoja de Oncidium

Hoja de Laelia

Hoja de Jazmin

Hoja de Hortensia

Hoja de Guayaba

Sntomas de manchas foliares en varias plantas

Conidio de Pestalotia sp.

Acervulo de Pestalotia sp.

Los tejidos infectados mueren y se colapsan para formar una zona hendida

Los acrvulos con masas de conidios oscuros se desarrollan en la zona infectada

Avrvulos en grandes zonas circulares y hundidas que han sido infectadas

Figura 3. Ciclo biolgico de Pestalotia sp en varias plantas (Adaptado de

Agrios, 2002).

III. MATERIALES Y MTODOS

3.1 Localizacin del rea de muestro

La colecta del material enfermo se hizo en el Parque Nacional Barranca

del Cupatitzio municipio de Uruapan, Michoacn, Mxico, mediante un

muestreo visual de las plantas de Laelia autumnalis y Oncidium

cavendishianum con sntomas caractersticos de estas enfermedades se

seleccionaron hojas con manchas circulares, colocndose en bolsas de plstico

y etiquetndolas para su posterior procesamiento en laboratorio.

Figura 4. Lugar de la colecta y especies o ejemplares de orqudeas del Parque

Nacional Barranca del Cupatitzio.

El Parque Nacional "Barranca del Cupatitzio" tiene una superficie de

19.8 hectreas de rea de recreacin y 452 hectreas de rea de

conservacin, es el segundo Parque ms visitado de la Repblica; se le conoce

como Barranca del Cupatitzio, ya que es en este lugar nace el Ro Cupatitzio

que suministra agua a la ciudad de Uruapan, dicho nombre proviene de la

composicin de dos vocablos del origen Purpecha, de kupatzini "zambullirse"

e itzio "en el agua", cuenta con una gran variedad de vegetacin, diversas y

exuberantes fuentes, conocido por su leyenda de la rodilla del diablo (www.wp-

m.com/uruapanturistico/index/uruapan /parque nacional .html).

En campo, los sntomas de esta enfermedad inician con una pequea

mancha circular central en las hojas de color negro al centro y caf-oscuro

alrededor, bordeada por un halo clortico, la cual desarrolla hasta cubrir por

completo la hoja dejndola con un aspecto deshidratado de color caf oscuro.

a b

Figura 5. Sntomas de la enfermedad en hojas de Orqudea a) Oncidium

cavendishianum y b) Laelia autumnalis.

3.2 Ubicacin del experimento

El estudio se realiz en el laboratorio de Cultivo de Tejidos de la Facultad

de Agrobiologia Presidente Jurez dependiente de la Universidad Michoacana

de San Nicols de Hidalgo, ubicado en el municipio de Uruapan, Michoacn.

3.3 Siembra e identificacin del agente causal

Bajo condiciones aspticas las muestras de hojas fueron lavadas

previamente, se cortaron en trozos pequeos de aproximadamente 2 mm y

desinfectaron con hipoclorito de sodio 2 % durante 1.5 minutos, se enjuagaron

tres veces con agua destilada estril para eliminar la presencia de cloro en los

tejidos. En cada caja de Petri con medio de PDA se colocaron cinco secciones

de muestra dispuestas en cinco de oro; posteriormente se sellaron las cajas

con Kleen Pack y etiquetaron debidamente, y se mantuvieron bajo condiciones

de laboratorio desarrollndose colonias fungosas de todas las muestras en

forma uniforme, en cuales fueron transferidos a cajas de Petri con medio de

cultivo PDA para su purificacin. Para esto se cort una seccin del medio con

crecimiento fungoso y se coloc en el centro de una caja de Petri con el fin de

obtener colonias puras.

Purificado el hongo se hicieron preparaciones fijas con lactofenol blanco en

portaobjetos del micelio y estructuras reproductivas del hongo y a travs de sus

caractersticas morfolgicas se hizo la identificacin siguiendo las claves de

Barnett y Hunter (1998).

3.4 Medio de cultivo Papa-Dextrosa-Agar

Para el aislamiento in vitro del patgeno, se prepar medio de cultivo

Papa-dextrosa-agar (Lpez, 1978), (Cuadro 1).

Cuadro 1 Medio de cultivo Papa-Dextrosa-Agar

Ingrediente Cantidad (gL-1)

Papa

Dextrosa

Agar

200

20

15

Para la elaboracin se cocieron 200 g de papa en 500 mL-1 de agua

destilada, luego se filtr a travs de una manta de cielo y embudo. Aparte se

disolvi el agar junto con la dextrosa en 400 mL-1 de agua destilada en un vaso

precipitado, calentndolos ligeramente para disolverlos. Posteriormente se hizo

un vaciado en un matraz Erlenmeyer, el filtrado de papa, el agar y la dextrosa

disueltas se afor con agua destilada a un litro y se tap con una torunda

(tapn de algodn y gasa).

El medio de cultivo se esteriliz en una olla de presin de 21 litros de

capacidad de 15 Lbs/pulg2 durante 15 minutos. Bajo condiciones aspticas se

vaciaron 10 mL-1 de medio de cultivo a cada caja de petri. Una vez solidificado

el medio se sell con papel kleen Pack y se etiquetaron debidamente, y se

mantuvieron en refrigeracin para su posterior uso.

3.5 Prueba de patogenicidad

Se escogieron seis cajas de Petri que mostraron abundante esporulacin y

sobre cada caja se adicion agua y posteriormente con una aguja se removi la

mayora de acrvulos formados en la superficie del medio para que liberaran

las esporas; se tamizaron a travs de una gasa para solo obtener esporas.

Hecha la suspensin de esporas; se utiliz un hematocimetro para calcular el

numero de esporas por mL siendo de 54,200 por mL-1. De esta suspensin de

esporas se tomaron 150 mL-1 y se procedi a la inoculacin de plantas de

orqudeas sanas de ambas especies, utilizando un atomizador manual; las

plantas se cubrieron con una bolsa de plstico para formar una cmara

hmeda que favoreciera la penetracin del hongo.

3.7 Bioensayo con fungicidas para el control de Pestalotia sp en

condiciones in vitro

El hongo se cultiv en cajas de Petri con medio de cultivo de PDA (Papa-

Dextrosa-Agar), a temperatura ambiente por dos das.

Se seleccionaron los productos fungicidas; Tecto 60, Intercaptan 50,

Manzate 200, Benomyl 50 y Cupravit PH para realizar el bioensayo. stos

fueron pesados en una balanza analtica a la dosis media recomendada por el

fabricante para manchas foliares en ornamentales y disolvieron en 10 mL-1 de

agua destilada estril en tubos de ensaye (Cuadro 2).

Cuadro 2. Producto e ingrediente activo de los fungicidas utilizados para el

control in vitro de Pestalotia sp agente causal de manchas necroticas.

Fungicida

Ingrediente activo

Dosis media

g/10 mL agua

Benomyl 50 PH Benomilo: Metil-1-(butil carbamoil) bencimidazol-2-il carbamato

0.0325

Cupravit PH Oxicloruro de cobre 0.03

Intercaptan 50 PH Captan: Cis-N-(triclometil)tio)-4ciclohexen-1,2-dicarboximida

0.025

Manzate 200 PH Mancozeb (producto de coordinacin del ion zinc y etilen bis ditiocarbamato de manganeso).

0.025

Tecto 60 PH Tiabendazol: 2-(4-tiazolil)-1H-benzimidazol

0.01

MANZATE 200 BENOMYL 50 CUPRAVIT PH TECTO 60 INTERCAPTAN 50 TESTIGO

Figura 6. Establecimiento del bioensayo para el control qumico in vitro de

Pestalotia sp.

Se colocaron discos de papel filtro estril en tubos de ensaye con el

producto, para que se impregnara de ste durante tres minutos, se colocaron

cuatro discos de papel filtro a cada caja en forma de cruz procurando que

tuvieran la misma distancia.

Se establecieron seis tratamientos conformados por cinco fungicidas y

un testigo (agua destilada), con siete repeticiones distribuidas bajo un diseo

experimental completamente al azar. Para analizar el crecimiento del hongo, se

registr la variable dimetro de crecimiento de la colonia en centmetros a partir

del segundo da de inicio del experimento, la medicin se interrumpi al

momento en que el hongo del tratamiento testigo coloniz por completo la caja

de Petri.

3.6 Evaluacin de medios de cultivo

Debido a que en medio de cultivo PDA la presencia de acrvulos fue

escasa, se decidi establecer este experimento para incrementar el desarrollo

de estructuras. Para esto se hizo la siembra del patgeno en los diferentes

medios de cultivo, Avena-Agar, Jugo de verdura V8-Agar, Harina de Maz-Agar,

jugo de tomate Agar, Orqudea-Agar y Papa-Dextrosa-Agar, se coloc el disco

de micelio en el centro de la caja de Petri para un crecimiento uniforme. Las

cajas se cubrieron con peridico y se guardaron en una caja de cartn.

Medio de cultivo Avena-Agar (A-A)

Durante 24 horas se dej en remojo 60 g de avena en 600 mL-1 de agua,

luego se hirvi la mezcla durante 30 minutos y se filtr a travs de una manta

cielo, para clarificar la solucin filtrada se centrifug la solucin a 2000 rpm

durante 5 minutos se decant y colect el lquido obtenido. Aparte se disolvi

12 g de agar en 400 mL-1 con agua caliente. Posteriormente se vaciaron en un

Matraz Erlenmeyer el lquido obtenido y el agar, se afor con agua destilada a

un litro y se tap con una torunda. El medio de cultivo se esteriliz a 15

lbs/pulg2 durante 15 minutos (Lpez, 1978).

Medio de cultivo Jugo V8-Agar (V8-A)

Al jugo de verduras V8 se agreg carbonato de calcio, y se agit hasta

disolverlos. Se dej reposar la solucin durante 10 minutos; para clarificarla se

centrifug durante 5 minutos a 2000 rpm. se colect el lquido claro

centrifugado hasta reunir la cantidad requerida. Despus al jugo de V8

centrifugado se agreg la solucin de agar y se afor con agua a 1000 mL-1

(Lpez, 1978).

Cuadro 3. Medio de cultivo Jugo V8-Agar (V8-A)

Ingredientes Cantidad (gL-1)

Jugo V8 centrifugado

Agar

Carbonato de calcio

200 mL

15 g

4.5 g

Medio de cultivo Harina de Maz-Agar (HM-A)

En 500 mL-1 de agua destilada a 70 C de temperatura se agreg la

harina de maz 20 gL-1 y se calent por una hora a 80 C, la infusin fue filtrada

a travs de una manta de cielo; posteriormente se centrifugo el lquido obtenido

a 2000 rpm durante 5 minutos. El lquido centrifugado fue decantado y

colectado. Aparte se disolvi el agar 20 gL-1 en 300 mL-1 de agua destilada

calentndolo ligeramente, se aadi el liquido centrifugado a la solucin de

agar y se afor con agua destilada a 1000 mL-1 (Lpez, 1978).

Medio de cultivo Jugo de Tomate-Agar (T-A)

Al jugo de tomate se le agreg el carbonato de calcio agitndolos hasta

disolverlos y se dej reposar durante 10 minutos. Para clarificar, se centrifug

durante 5 minutos a 2000 rpm, se decant y colect el lquido centrifugado

hasta la cantidad requerida. Despus se disolvi el agar en 450 mL-1 de agua

destilada, se aadi la solucin centrifugada, se vaci en un matraz Erlenmeyer

y se tap con torunda (Lpez, 1978).

Cuadro4. Medio de cultivo Jugo de Tomate-Agar (T-A)

Ingredientes Cantidad (gL-1)

Jugo de tomate centrifugado

Carbonato de Calcio

Agar

60 mL

0.6 g

14 g

Medio de cultivo Orqudea-Agar (O-A)

Para su elaboracin se cocieron 52 g de hojas de Orqudea en 500 mL

de agua destilada, se filtr a travs de una manta cielo. Aparte se disolvi 14.4

g de agar en 250 mL de agua destilada, calentndolos ligeramente para

disolverlos. Posteriormente se hizo un vaciado en un matraz Erlenmeyer, el

filtrado de orqudea y el agar disuelto, se aforo con agua destilada a 1 L-1 y tap

con una torunda.

Todos los medios fueron esterilizados en una olla de presin de 21 litros

de capacidad a una presin de 15 lbs/pulg2 durante 15 minutos (Tuite, 1969).

Se establecieron seis tratamientos (medios de cultivo) con cuatro

repeticiones, la variable a evaluar fue la velocidad del crecimiento de la colonia

(llenado de caja) expresado en centmetros. Todos los tratamientos o medios a

evaluar se mantuvieron bajo condiciones de laboratorio (18 a 24 C).

IV. RESULTADOS Y DISCUSIN

4.1 Identificacin del agente causal

Del material vegetativo enfermo se aisl el hongo Pestalotia sp en 85 %

de los casos, con un patrn de crecimiento radial en sus colonias, de micelio

extenso y algonodoso blanco, con fructificaciones de color negro brillante

llamados acrvulos de apariencia aceitosa, que en algunas ocasiones solo

aparecen cuando el hongo a cubierto por completo la caja de Petri (Fig. 7).

a b

Figura 7. a) micelio y b) conidio de Pestalotia sp. en medio de PDA

Estos acrvulos son grupos de conidios de forma alargadas y

multiseptados, de 3-5 clulas, las de los extremos son hialinas y las centrales

oscuras (Romero, 1993), con dos a tres sedas en uno de los extremos y

tambin son hialinos (Bigre et al., 1990).

El hongo Pestalotia sp present un crecimiento vigoroso, ya que coloniz

por completo la caja de Petri con medio de cultivo de PDA en 6 das a 25 C, lo

que coincide con Montiel y Avelar (2001) quienes mencionan que Pestalotia se

desarrolla bien de 22 a 26 C en 15 das y que en temperaturas mayores a 30

C su crecimiento es lento.

4.2 Prueba de patogenicidad

De acuerdo a las pruebas de patogenicidad realizadas en las plantas de

orqudeas de Laelia autumnalis, stas presentaron los sntomas propios de la

enfermedad a los 2 meses y medio de ser inoculadas con la solucin de

esporas de Pestalotia sp. Las hojas nuevas de las plantas inoculadas

desarrollaron los sntomas de manera virulenta ya que en tres das las

manchas cubran por completo la lamina foliar para desprenderse del

pseudobulbo finalmente.

Las hojas adultas de las plantas inoculadas mostraron en el centro de la

misma una mancha circular de color negro y color caf-oscuro, rodeada por un

fino halo clortico, la cual en pocos das cubri por completo la hoja, dejndola

con un aspecto deshidratado de color caf-oscuro para posteriormente

desprenderse del pseudobulbo (Figura 8). Probablemente por la ineficiencia

generada para la realizacin de la fotosntesis por las hojas, lo que provoca la

deshidratacin del tejido como lo reporta Romero (1996) en plantas jvenes de

palmas de coco.

a b

Figura 8. Plantas de Laelia autumnalis con sntomas de las enfermedad a)

inicio del sntoma, b) desarrollo de la enfermedad.

En la prueba de patogenicidad realizada en plantas de Oncidium

cavendishianum los sntomas se presentaron a los 4 meses de ser inoculadas

con la solucin de esporas de Pestalotia sp probablemente por el tipo de hoja

que presenta esta especie, ya que posee una cubierta cerosa que la cubre

totalmente que limita el avance del patgeno, y la manifestacin del sntoma la

infeccin empez a partir de la base de la planta, avanzando poco a poco hasta

cubrir por completo la hoja la cual se desprendi de su base (Fig. 9).

a b

Figura 9. Plantas de Oncidium cavendishianum con sntomas de la

enfermedad a) inicio del sntoma y b) desarrollo de le enfermedad.

De las plantas inoculadas se pudo reaislar el hongo Pestalotia sp que

present las mismas caractersticas morfolgicas, que las observadas en su

aislamiento inicial de esta manera se cumplieron con los postulados de Koch.

4.3 Efecto de fungicidas para el control de Pestalotia sp bajo condiciones

in vitro

La adicin de Cupravit, Manzate 200 e Interceptan 50 estimularon el

desarrollo del hongo, registrndose valores de crecimiento de micelio de (6.00,

5.44 y 5.60 cm) con respecto al de Benomyl 50 y Tecto 60 que tuvieron valores

de (3.69 y 3.61 cm) respectivamente al tercer da de iniciado el experimento

(Cuadro 5) y (Fig. 10)

Despus del cuarto da de evaluacin los fungicidas Tecto 60 y Benomyl

50 inhibieron el crecimiento de Pestalotia sp (3.61 y 3.69 cm) con respecto al

testigo (5.16 cm) (Cuadro 5).

Estos resultados, coinciden con los obtenidos en los trabajos de

investigacin de Jimnez (2007) y Negrete (2007), quienes trabajaron

enfermedades en plantas tropicales y encontraron que Tecto 60 y Benomyl 50

fueron los mejores fungicidas, ya que inhibieron el crecimiento in vitro de

Fusarium sp a partir del quinto da de establecido sus experimentos.

Los fungicidas Tecto 60 y Benomyl son productos de accin sistmica,

que requieren de un tiempo de reentrada a la planta de 24 y 12 horas

respectivamente.

Cuadro 5. Efecto de fungicida para el control de Pestalotia sp in vitro

Crecimiento (cm)

Fungicida 1 da 2 da 3da 4 da 5 da Cupravit 3.89 a 4.93 a 6.00 a 7.00 a 7.39 a

Benomyl 50 3.56 a 3.66 ab 3.69 b 3.69 b 3.69 b

Tecto 60 3.54 a 3.59 b 3.61 b 3.66 b 3.66 b

Manzate 200 3.80 a 4.64 ab 5.44 a 6.70 a 7.08 a

Intercaptan 50 3.80 a 4.66 ab 5.60 a 6.40 a 6.93 a

Testigo 3.36 a 4.23 ab 5.16 ab 6.00 a 6.69 a

0

1

2

3

4

5

6

7

8

1 2 3 4 5

Dias despus de la siembra

Cre

cim

ient

o (c

m)

CUPRAVIT PHBENOMYL 50TECTO 60MANZATE 200INTERCAPTAN 50TESTIGO

Figura 10. Efecto del tipo de fungicida para inhibir el crecimiento micelial in vitro

de Pestalotia sp

Los fungicidas Cupravit PH, Manzate 200 e Intercaptan 50 no inhibieron

el desarrollo in vitro del hongo Pestalotia sp, incluso algunas veces el micelio

tratado con estos fungicidas creci mas rpido (4.93, 4.64 y 4.66 cm) que el

tratamiento Testigo (4.23 cm).

TESTIGO CUPRAVIT PH BENOMYL 50

MANZATE 200TECTO 60 INTERCAPTAN 50

Figura 11. Inhibicin de Pestalotia sp por fungicidas a dosis medias

comparadas a los 5 das de establecido el experimento.

4.4 Evaluacin de medios de cultivo

El mximo desarrollo micelial del hongo Pestalotia sp (1.71 cm) se logr

en el medio Jugo de tomate-Agar a partir del primer da de establecido el

experimento, tendencia que mantuvo hasta el quinto da de la evaluacin

(Cuadro 6) momento en que se suspendi la medicin por haber llenado el

hongo la caja Petri con medio de cultivo. El hongo tuvo un crecimiento

estadsticamente similar en el medio PDA (1.55 cm) y en los medios Jugo de

tomate V8-Agar (1.62 cm), Avena-Agar (1.44 cm).

Al segundo da de la evaluacin en los medios de Harina de maz-Agar y

Orqudea-Agar se observ un crecimiento menor (2.30 y 2.10 cm), en

comparacin con el PDA. Este efecto se mantuvo hasta el quinto da en el caso

del medio de Orqudea-Agar (5.46 cm).

En el medio de cultivo Jugo tomate-Agar se obtuvo el mayor nmero de

acrvulos formados, los cuales se observaron desde los 11 das despus de la

inoculacin con el disco de micelio, mientras que en el medio de PDA no se

observ la formacin de estas estructuras.

Montiel y Avelar (2001), en sus trabajos de investigacin en guayabo

obtuvieron como resultado que el hongo Pestalotia sp cubre una caja Petri por

completo con medio de cultivo PDA en un tiempo de 15 das cuando stas se

incubaron a una temperatura de 22-26 C y que a temperaturas mayores de 30

C su crecimiento es muy lento.

Cuadro 6. Efecto del medio de cultivo para el crecimiento micelial in vitro de Pestalotia sp

Crecimiento (cm)

Medio cultivo

1 da 2 da 3da 4 da 5 da

Papa Dextrosa Agar 1.55ab 2.76b 3.60abc 4.88bc 6.40b

Jugo de verduras V8 Agar 1.63ab 3.05ab 4.38a 5.36ab 7.26a

Harina de Maiz Agar 1.41b 2.30c 3.40bc 4.55cd 6 .28b

Orquidea Agar 1.38b 2.10c 3.13c 4.04d 5.46c

Avena Agar 1.44ab 2.70b 4.15ab 5.73a 7.30a

Jugo de Tomate Agar 1.71a 3.33a 3.98abc 5.79a 7.08a

0

1

2

3

4

5

6

7

8

1 2 3 4 5

Dias despues de la siembra

Cre

cim

ient

o (c

m)

PDAV8HARINA DE MAIZORQUIDEAAVENAJUGO TOMATE

Figura 12. Efecto del medio de cultivo para el crecimiento micelial in vitro de

Pestalotia sp.

JUGO DE VERDURAS V8 PDA HARINA DE MAIZ

JUGO DE TOMATE ORQUIDEA AGAR AVENA AGAR

Figura 13. Crecimiento de Pestalotia sp en diferentes medios de cultivo a los 5

das de establecido el experimento.

V. CONCLUCIONES

El hongo Pestalotia sp es el agente causal de la mancha foliar en Oncidium cavendishianum y Laelia autumnalis.

Los conidios son de forma alargadas y multiseptados, de 3-5 clulas, la de los extremos son hialinas y las centrales oscuras, con dos a tres

apndices hialinas.

En pruebas de patogenicidad realizada en Laelia autumnalis esta present los sntomas propios de la enfermedad observados en campo y

en Oncidium cavendishianum el sntoma empez a partir de la base de

la planta, pero logrndose rescatar el hongo Pestalotia sp.

El fungicida Tecto 60 inhibi el desarrollo in vitro del hongo a partir del cuarto da de establecido el experimento.

El mejor medio de cultivo para el desarrollo del patgeno fue Jugo de tomate-Agar que a partir del primer da de establecido el experimento el

hongo Pestalotia sp desarroll mas rpido tendencia que se mantuvo

hasta el quinto da de la evaluacin, adems produjo gran cantidad de

estructuras reproductivas (acrvulos).

VI. LITERATURA CITADA

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VII. APNDICE

Cuadro 1A. Claves para identificacin de hongos imperfectos

Melanconiales

1b Conidios de 2 a varias clulas con septas transversales, no

filiformes

7b Conidios de tres a varias clulas

9a Conidios oscuros.

10a Conidios con apndices en clulas hialinas terminales.

11b 2 a 3 apndices apicales en el pice del conidio.Pestalotia

7

9

10

11

204

Cuadro 2A. Anlisis de varianza para el efecto del tipo de fungicida sobre el

crecimiento in vitro de Pestalotia sp durante el primer da de cultivo.

Fuente de variacin

GL SC CM F. CAL. P>F

Tratamiento Error Total r2CV

5 36 41 0.079747 18.59576

1.44285714 16.6500000018.09285714

0.288571430.46250000

0.62 0.6825


crecimiento in vitro de Pestalotia sp durante el segundo da de cultivo.

Fuente de variacin

GL SC CM F. CAL P>F


5 36 41 0.310069 19.16378

10.9074404824.2700000035.17744048

2.181488100.67416667

3.24 0.0163


crecimiento in vitro de Pestalotia sp durante el tercer da de cultivo.

Fuente de variacin

GL SC CM F. CAL P>F


5 36 41 0.518812 19.71103

36.4374404833.7950000070.23244048

7.287488100.93875000

7.76 < .0001


crecimiento in vitro de Pestalotia sp durante el cuarto da de cultivo.

Fuente de variacin

GL SC CM F. CAL P>F


5 36 41 0.634922 20.23231

79.6897619 45.8214286 125.5111905

15.93795241.2728175

12.52 < .0001


crecimiento in vitro de Pestalotia sp durante el quinto da de cultivo.

Fuente de variacin

GL SC CM F. CAL P>F


5 36 41 0.657764 20.96899

106.167583355.2392286 161.4068119

21.23351671.5344230

13.84 < .0001

Cuadro 7A. Anlisis de varianza para el crecimiento in vitro de Pestalotia sp

durante primer da de evaluacin.

Fuente de variacin

GL SC CM F. CAL P>F


5 17 22

0.353437500.280625000.63406250

0.070687500.01559028

4.53 0.0075


durante segundo da de evaluacin.

Fuente de variacin

GL SC CM F. CAL P>F


5 17 22 0.901255 6.040477

4.147146740.454375004.60152174

0.829429350.02672794

31.03 < .0001


durante tercer da de evaluacin.

Fuente de variacin

GL SC CM F. CAL P>F


5 17 22 0.624977 10.48154

4.387065222.632500007.01956522

0.877413040.15485294

5.67 0.0030


durante cuarto da de evaluacin.

Fuente de variacin

GL SC CM F. CAL P>F


5 17 22 0.900895 4.847007

9.17933877 1.00979167 10.18913043

1.835867750.05939951

30.91 < .0001


durante quinto da de evaluacin.

Fuente de variacin

GL SC CM F. CAL P>F


5 17 22 0.906580 3.709073

9.88625000 1.01875000 10.90500000

1.977250000.05992647

32.99 < .0001

Yg=/sdVOa\-I6c

prueba de patogenecidad en pestalotia

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