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FREPLATA

Proyecto GEF-PNUD RLA/99/G31

Protección Ambiental del Río de la Plata y su Frente Marítimo: Prevención y Control de la Contaminación y Restauración de

Hábitats

Informe de Avance sobre “Evaluación y estudio de Vibrio Cholerae, bacterias biodegradadoras de contaminantes y bacterioplancton

heterotrófico”

Integrantes del Proyecto: • Farm. Marcela Costagliola - responsable • Vet. Verónica Jurquiza • Lic. Constanza Hozbor • Dra. Silvia Peressutti • Téc.Analía García

COFREMAR C.A.R.P.

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INDICE 1- Evaluación y estudio de Vibrio cholerae en el Area del Tratado del Río de la Plata y su Frente

Marítimo

1.1- Introducción ............................................................................................................................. 3 1.1.1 Epidemiología ............................................................................................................ 3 1.1.2 Patogenia y factores de virulencia ............................................................................... 3 1.1.3 Ecología del cólera ...................................................................................................... 4 1.1.4 Vibrio cholerae viable no cultivable ........................................................................... 4 1.1.5 Vibrio cholerae no-O1 ................................................................................................ 5 1.1.6. Cólera en Latinoamérica y Argentina ........................................................................ 6

1.2- Antecedentes sobre la presencia de V cholerae en el Area del Tratado del Rio de la Plata y su Frente Marítimo ......................................................................................................................... 6

1.2.1 Hallazgos de V. cholerae no-O1 ................................................................................. 7 1.2.2 Reservorios de V. cholerae O1 .................................................................................... 8

1.3 - Informe de avance de los hallazgos de Vibrio cholerae, Campaña de prospección ambiental 9 1.3.1 Objetivo ....................................................................................................................... 9 1.3.2 Materiales y Métodos .................................................................................................. 9

1.3.2.1 Procesamiento de las muestras ...................................................................... 9 a- Agua .......................................................................................................... 9 b- Plancton ................................................................................................... 10

1.3.2.2 Aislamiento e identificación de V. cholerae viable cultivable ................... 10 1.3.2.3 Identificación de V. cholerae viable no cultivable ....................................... 10

1.3.3 Resultados preliminares ............................................................................................. 10 a- Vibrio cholerae viable cultivable ......................................................................... 10 b- Vibrio cholerae viable no cultivable .................................................................. 11

1.4- Muestras pendientes de estudio ................................................................................................11 1.4.1 Río de la Plata ............................................................................................................ 11 1.4.2 Area del Tratado del Río de la Plata y Frente Marítimo ............................................ 12

1.5 BIBLIOGRAFIA ...................................................................................................................... 13 Tablas y Figuras 1 ........................................................................................................................... 15

2. Estudio de bacterias degradadoras de hidrocarburos y surfactantes en el área del tratado del Río de la Plata

2.1 Introducción .............................................................................................................................. 23

2.1.1 Hidrocarburos y surfactantes aniónicos como contaminantes del Río de la Plata ..... 23 2.1.2 Biodegradación como mecanismo de decontaminación ............................................ 24 2.1.3 Antecedentes en el Río de la Plata ............................................................................. 25 2.1.4 Finalidad .................................................................................................................... 26

2.2 Informe de avance del estudio de bacterias degradadoras. campaña de prospección ambiental del río de la plata y su frente marítimo ................................................................... 27

2.2.1 Objetivos .................................................................................................................... 27 2.2.2 Materiales y métodos ................................................................................................. 27 2.2.2.1 Recolección de la muestra ....................................................................................... 27 2.2.2.2 Análisis las bacterias degradadoras de hidrocarburos ............................................. 27

Enumeración de bacterias ....................................................................................... 27 Enriquecimiento selectivo ........................................................................................ 28 Ensayo de degradación de hidrocarburos ............................................................... 28 Análisis estadístico ................................................................................................... 28

2.2.2.3 Análisis de biodegradación de surfactantes ............................................................ 29 Enriquecimiento selectivo y selección de cepas degradadoras ............................... 29 Capacidad degradativa de las cepas ....................................................................... 29 Degradación del surfactante .................................................................................... 29

2.2.3 Resultados y discusión ........................................................................................................... 30 2.2.3.1 Bacterias degradadoras de hidrocarburos ................................................................ 30

Distribución cuantitativa ......................................................................................... 30 Estudio de las bacterias aisladas ............................................................................. 30

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2.2.3.2 Biodegradación de surfactantes ............................................................................... 30 Selección y caracterización de las cepas ................................................................. 30 Potencialidad metabólica de las cepas .................................................................... 31 Degradación de DBS ............................................................................................... 31

2.2.4 Desarrollo actual del trabajo y perspectivas futuras .............................................................. 31 2.2.5 BIBLIOGRAFIA ................................................................................................................... 32 Tablas y Figuras 2 ........................................................................................................................... 35

3. Abundancia, distribución espacial y papel en las cadenas tróficas del bacterioplancton heterotrófico en ambientes estuariales y su relación con el área de desove de especies costeras

3.1 Introducción .............................................................................................................................. 41 3.2 Materiales y métodos ................................................................................................................ 42

3.2.1 Muestras examinadas ................................................................................................. 42 3.2.2 Metodología Empleada .............................................................................................. 42

3.2.2.1 Recuento de bacterias totales por microscopía de epifluorescencia ............ 42 3.2.2.2 Recuento y aislamiento de bacterias heterótrofas mesófilas viables del

estuario del Río de la Plata ................................................................... 42 3.3 Resultados preliminares ............................................................................................................ 43

3.3.1 Estación marina .......................................................................................................... 43 3.3.2 Región estuarial del Río de la Plata y área del Rincón , Pcia. de Buenos Aires ........ 43

3.3.2.1 Abundancia del bacterioplancton ................................................................. 43 3.3.2.2 Bacterias heterótrofas mesófilas viables ...................................................... 44

3.4 Desarrollo actual del trabajo y perspectivas futuras ................................................................. 44 3.4.1 Estación marina .......................................................................................................... 44 3.4.2 Región estuarial del Río de la Plata y área del Rincón , Pcia. de Buenos Aires ........ 44

3.5 BIBLIOGRAFIA ...................................................................................................................... 45 Tablas y Figuras 3 ........................................................................................................................... 47

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1- Evaluación y estudio de Vibrio cholerae en el Area del Tratado del Río de la Plata y su Frente Marítimo

1.1- Introducción

La primera descripción de una epidemia de cólera que afectó varios países se remonta a principios del siglo XIX, más precisamente a 1817. Sin embargo, manifestaciones clínicas semejantes se conocen desde 500 a 400 años A. C. (Colwell, 1996). El agente etiológico del cólera es Vibrio cholerae. Este bacilo Gram negativo, anaerobio facultativo y móvil, fue descripto por primera vez en 1854 por Pacini en Italia y en 1883 por Robert Koch (Kapter et al., 1995).

La infección por V. cholerae es adquirida por la ingestión de agua o alimentos contaminados. La dosis infectiva es variable, dentro del rango de 103 a 109 UFC, dependiendo de la acidez gástrica, del alimento, y de factores del huésped como el estado inmunitario y el grupo sanguíneo, siendo los individuos del grupo O los más susceptibles y los del AB los más resistentes (Kapter et al., 1995). 1.1.1 Epidemiología

Las enfermedades diarreicas constituyen una de las más importantes causas de morbilidad y mortalidad en países en desarrollo. V. cholerae es uno de los principales agentes etiológicos de diarrea en niños y adultos, particularmente en áreas donde el cólera es endémico. A pesar de haber sido común en India desde los primeros registros, la enfermedad se diseminó, causando hasta la actualidad siete pandemias. La séptima y última comenzó en 1961 y se expandió desde el Sudeste de Asia a la región central y a Europa, alcanzando Africa en 1970 y Sudamérica en 1991 (Gangarosa & Tauxe, 1992). 1.1.2 Patogenia y factores de virulencia

V. cholerae produce una variedad de productos extracelulares que tienen efectos deletéreos sobre las células eucariotas. La diarrea masiva inducida por esta bacteria es causada por la toxina de cólera (CT), que pertenece al grupo de toxinas de sub-unidad A-B, y cuyo blanco intracelular es la adenilato ciclasa. La activación de dicha enzima dentro de las células del epitelio intestinal lleva finalmente a una alteración en el transporte de iones y consecuentemente a la diarrea. Estudios en los que se seleccionaron los genes que codifican para esta toxina, mostraron que las mutantes obtenidas podían causar diarreas leves o moderadas en voluntarios (Levine et al., 1988). Estos resultados condujeron al descubrimiento de toxinas adicionales producidas por V.cholerae, que se denominaron Zot, por zonula occludens toxin (Fasano et al., 1991) y Ace, por accesory cholera enterotoxin, (Trucksis et al., 1993). Tanto los genes que codifican para CT (ctxA y ctxB), como aquellos que codifican para Zot y Ace se encuentran agrupados dentro de un elemento de tipo transposón, junto con los genes correspondientes al cep (core-encoded pilus) y a un marco de lectura abierto denominado orfU, conformando lo que se ha llamado, el “cassette de virulencia” de V. cholerae. Recientemente se comprobó que en realidad este cassette de virulencia corresponde al profago ctxf, que en condiciones adecuadas puede transferirse a otras cepas de V. cholerae susceptibles. Además de las toxinas, V. cholerae sintetiza organelas filamentosas de superficie, denominadas pili o fimbrias, que median la adherencia específica y la colonización de la célula huésped. La fimbria mejor

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caracterizada es TCP (toxin coregulated pilus), que actúa además como receptor para el fago ctxf (Waldor & Mekalanos, 1996). 1.1.3 Ecología del cólera

En el siglo XIX fue descripta la asociación del cólera con el agua de bebida, pero las fuentes y reservorios del cólera han sido objeto de especulaciones. Estudios del microorganismo en el medio ambiente han demostrado que es capaz de sobrevivir por extensos períodos en áreas marinas y estuariales.

En regiones endémicas de Bangladesh, el cólera epidémico aparece dos veces al año y responde a un modelo estacional (Glass et al., 1982).

Durante una epidemia, Vibrio cholerae O1 es aislado de pacientes infectados y de muestras ambientales. Así se ha determinado la presencia del microorganismo en aguas superficiales de ríos, estanques y pozos (Tamplin & Carrillo, 1991). Sin embargo en los períodos interepidémicos no es posible su recuperaciónj del ambiente empleando los métodos de cultivo tradicionales.

Tanto en áreas endémicas como epidémicas de India y aún de Latinoamérica, los brotes de cólera aparecen de forma explosiva en varios focos simultáneamente, indicando un posible rol de factores ambientales en la aparición de las epidemias.

El medio acuático ha sido reconocido, en numerosos estudios, como reservorio y vehículo para la transmisión de V. cholerae (Colwell, 1996).

El florecimiento de las distintas especies de plancton, relacionado a su vez con cambios climáticos, explicaría la estacionalidad de los brotes de cólera (Colwell, 1996).

Estudios a lo largo de la costa del Golfo de EEUU, Australia e Inglaterra han demostrado que V. cholerae 01 es residente de algunas áreas acuáticas y que su presencia no está asociada con contaminación por enfermos de cólera. 1.1.4 Vibrio cholerae viable no cultivable

Se ha descrito que, en condiciones ambientales desfavorables, ciertas bacterias tienen la capacidad de entrar en un estado de “latencia” que les permite sobrevivir. Dicho estadío se conoce como “viable no cultivable” (VNC) y se caracteriza por presentar actividad metabólica basal y conservar la información genética que codifica para los factores de virulencia. Sin embargo, en este estado las bacterias no pueden multiplicarse en las condiciones de cultivo habituales (Colwell & Grimes, 2000). Las formas VNC han sido descriptas en distintas especies bacterianas incluyendo Campylobacter jejuni, Salmonella enteritidis, Shigella spp., Vibrio vulnificus y Vibrio cholerae entre otras (Oliver, 2000), habiéndose asociado a la inducción del estadío VNC distintos factores ambientales, tales como: baja concentración de nutrientes, temperatura, pH o salinidad distintos a los óptimos (Colwell & Huq, 1994). Se ha reportado en V. cholerae actividad quitinasa (Dastidar & Narayanaswami, 1968) que permitiría adherencia a los copépodos y sobrevivir en períodos inter-epidémicos. Este microorganismo puede sobrevivir durante largos períodos en condiciones desfavorables en forma VNC (Colwell et al., 1985).

Distintas técnicas han sido utilizadas para detectar estas formas VNC de V. cholerae en ambientes acuáticos. Estas incluyen: hibridación, reacción en cadena de la polimerasa, o PCR (Knight, 2000), y recuento directo por marcación con fluoresceína, o DFA (Brayton et al., 1987). Estas técnicas deben realizarse en paralelo con métodos de cultivo tradicionales, a fin de descartar la presencia de formas cultivables. Por otra parte se ha desarrollado un método para recuento de viables, o DVC (Kogure, 1979) que

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induce la elongación de las formas VNC (normalmente cocoides) por el agregado de extracto de levadura en presencia de ácido nalidíxico. Mediante la combinación de esta técnica con el uso de anticuerpos monoclonales contra el antígeno somático O1 marcados con fluorescencia, o DFA-DVC, se pueden identificar formas VNC de V. cholerae O1 (Hasan et al., 1994). Por medio de estas técnicas ha sido identificado en muestras de agua, zooplancton y fitoplancton (Huq et al., 1994), en un amplio rango de la vida marina incluyendo cianobacterias, diatomeas (Skeletonemacostatum spp), macroalgas (Ascophyllum nodosum), plantas acuáticas vasculares, y copépodos (Huq et al., 1990).

En condiciones adecuadas, las formas VNC pueden revertir al estado cultivable, manifestando plenamente su capacidad de infección, patogenicidad y transmisibilidad. Se han inoculado células de V. cholerae en estado VNC en asa ligada de intestino delgado de conejo, observándose reacción positiva (distensión y acumulación de fluidos) y pudiendo recuperarse bacterias cultivables a partir del fluido contenido en las asas. También se empleó una cepa atenuada de V. cholerae O1 no toxigénica en estado VNC para un estudio con voluntarios humanos. Después de 48 hs. de ingerir una suspensión de las bacterias VNC se recuperaron formas cultivables a partir de muestras de materia fecal (Colwell et al., 1996). Otros investigadores lograron la reversión del estadío VNC, por inoculación en asa ligada de conejo, de extractos de plancton conteniendo V. cholerae O1 VNC (Shulka et al., 1995).

Varios trabajos documentan brotes de cólera por la ingesta de pescado y moluscos, debidos a V. cholerae O1 viable y cultivable. Sin embargo, no hay publicaciones de hallazgos de V. cholerae viable no cultivable en eslabones de la cadena alimenticia, como mejillones y peces, que podrían explicar y ayudar a prever la aparición de brotes. 1.1.5 Vibrio cholerae no-O1

V. cholerae se puede clasificar en más de 206 serogrupos, de acuerdo a las características del lipopolisacárido O presente en la membrana externa. El serogrupo O1 ha sido el responsable de las siete pandemias ocurridas hasta el presente. Las cepas O1 pueden ser del serotipo Ogawa o Inaba y de acuerdo a sus propiedades bioquímicas se clasifican en biotipo Clásico, o biotipo El Tor. El biotipo Clásico fue el primero en ser identificado, pero a partir de 1961 hasta la actualidad el biotipo El Tor ha sido predominante.

Hasta 1992, V. cholerae no-O1 sólo se aisló de casos esporádicos de diarrea y de infecciones invasivas, pero raramente producía CT y por lo tanto no se le atribuía potencial epidémico (Janda et al., 1988, Morris, et al., 1990). Sin embargo, en octubre de 1992 comenzó un brote importante de cólera en India y Bangladesh causado por una cepa de V. cholerae no-O1, perteneciente a un serogrupo desconocido hasta ese momento, que luego se denominó O139 Bengal, por su dispersión alrededor de la Bahía de Bengala. V. cholerae O139, considerado un patógeno emergente, parece estar íntimamente relacionado a V. cholerae O1 biotipo El Tor, aunque existen varias características que los diferencian (Morris, 1994, Jonson et al., 1992).

Se ha comunicado que este nuevo serogrupo se debió a la recombinación del serogrupo O1 y O22 ó O155 (Shimada et al., 1994) y que la diferencia entre O1 y O139 está en una región específica de 13 kb (Comstock, 1995). Este hecho, junto a la posibilidad de sero-conversión de no-O1 a O1 (Colwell et al., 1995), permite reconsiderar el interés del estudio de Vibrio cholerae no-O1.

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En Argentina fue descrito el aislamiento de V. cholerae O139 no patogénico y genéticamente diferente del O139 Bengal. En Perú fue dectectado V. cholerae O22 que origina al serogrupo O139.

Por la velocidad a la que se ha diseminado, actualmente se lo considera iniciador de la octava pandemia de cólera. La mayor tasa de ataque se produjo en la población adulta, indicando que la exposición previa a V. cholerae O1 no protege contra la infección por V. cholerae O139.

El surgimiento de esta nueva cepa como agente causal de epidemias, sumado a la posibilidad de transmisión de los genes responsables de la virulencia entre aislamientos de V. cholerae, subraya la necesidad de caracterizar no sólo V. cholerae O1, sino también no-O1, con el fin de detectar cepas potencialmente epidémicas. 1.1.6. Cólera en Latinoamérica y Argentina

En América Latina, el cólera se puede considerar una enfermedad re-emergente a partir de enero de 1991, cuando provocó una epidemia en Perú luego de cien años de haber sido erradicada del continente. Desde allí se diseminó al resto de América a una tasa de un país por mes, afectando también a viajeros que visitaban estos países (C.D.C., 1991). Es improbable que esta rápida diseminación a lo largo de la costa se haya debido a la descarga de un solo barco en Lima, como se postuló originalmente. En cambio, el florecimiento del plancton que se produce por cambios climáticos importantes como la corriente del Niño, aparece como una hipótesis más probable (Colwell, 1996).

Según datos de la Organización Mundial de la Salud (O.M.S.), hasta el año 2000 se registraron 1.235.000 casos en América Latina y 12.476 muertes, afectando todos los países del continente excepto Uruguay (W.H.O., 2000).

En Argentina, el primer caso de cólera, notificado el 4 de febrero de 1992, correspondió a V. cholerae O1 biotipo El Tor, serotipo Ogawa, productor de CT. Desde entonces hasta el año 2000 ocurrieron 7 brotes epidémicos, que afectaron a 4835 personas con una letalidad del 1,5%. El primer brote epidémico comenzó en la provincia de Salta y se extendió a Formosa y Jujuy, apareciendo casos esporádicos en otras regiones, a raíz del traslado de personas desde y hacia áreas infectadas. La tasa de incidencia varió según la región. En la provincia de Buenos Aires, los casos registrados desde 1992 hasta el presente se concentran en ciudades localizadas en las costas del Río Paraná y el Río de la Plata, así como en la costa Atlántica.

Desde 1992 el Instituto Nacional de Microbiología "Dr. Carlos G. Malbrán" (actualmente Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas, INEI) ha recibido cepas de V. cholerae O1 provenientes de pacientes con cólera y ambientales correspondientes a los distintos brotes y cepas de V. cholerae no-O1 aisladas de casos esporádicos de diarrea. Todos estos aislamientos fueron caracterizados bioquímica y serológicamente y se determinó si eran productores de enterotoxina de cólera. En 1993, se aisló una cepa de V. cholerae perteneciente al serogrupo O139 de un paciente con diarrea en Salta. Sin embargo esta cepa, no productora de toxina CT, resultó ser distinta a la responsable de los brotes epidémicos ocurridos en Asia (Makino et al., 1995). 1.2- Antecedentes sobre la presencia de V cholerae en el Area del Tratado del Rio

de la Plata y su Frente Marítimo

A partir del año 1992, en el marco de las acciones propuestas por el Comité de Emergencia de Lucha contra el Cólera desde el ingreso de esta enfermedad en la Argentina, se llevaron a cabo diversos estudios tendientes a relevar la presencia de

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Vibrio cholerae en el ambiente acuático y en su biota. Organismos nacionales e internacionales, miembros de la Cuenca del Plata, realizaron acciones tendientes a prevenir y minimizar la posibilidad de la transmisión de la enfermedad por la vía hídrica.

Ese mismo año, investigadores del INALI- Santa Fé y del INIDEP realizaron una campaña de detección del vibrión colérico en aguas de la desembocadura de los ríos Bermejo y Pilcomayo, así como en un tramo de los ríos Paraguay y Paraná medio. También se investigó su presencia en peces capturados en la zona.(Corrales & Costagliola, 1992).

En 1992 la Comisión Administradora del Río Uruguay (CARU) estableció un Plan de vigilancia en el río homónimo, llevado a cabo por investigadores del INIDEP y del Servicio de Hidrografia Naval, SIHN (Costagliola, 1995). Los muestreos se extendieron hasta el año 1998 con una frecuencia estacional, intensificándose en verano debido a las altas temperaturas registradas en el agua que posibilitarían el desarrollo del microorganismo. En todos los casos positivos se aisló V. Cholerae no O1 no toxigénico (Costagliola et al. 1995).

Muy pocos son los estudios realizados sobre la presencia de V. cholerae en el Area Tratado del Río de la Plata y su Frente Marítimo. Se limitan a la vigilancia ejercida por autoridades sanitarias argentinas en los vertidos cloacales de la franja costera de la Provincia de Buenos Aires y de la Dirección Nacional de Recursos Acuáticos (DINARA) de la República Oriental del Uruguay, en la costa uruguaya, desde Colonia hasta La Paloma (Odizzio,.com. per.).

En 1992, a través de la Comisión Técnica Mixta del Frente Marítimo (COFREMAR) se estableció un plan de vigilancia de Vibrio cholerae en la Zona Común de Pesca argentino-uruguaya que tuvo como objetivo asegurar la calidad sanitaria de sus productos pesqueros, con la participación del INIDEP y la DINARA. Este programa se extendió hasta el año 1999. Durante este período se extrajeron muestras de 17 campañas de investigación pesquera a bordo de los BIP ‘Dr. Eduardo Holmberg’, “Cap. Oca Balda” y “Cap. Cánepa” (INIDEP), y ‘Aldebarán’ (DINARA). Se analizaron muestras de agua superficial y de agallas e intestino de las especies corvina rubia, Micropogonias furnieri; castañeta, Cheilodactylus bergi; pescadilla, Cynoscion guatucupa; pez palo, Percophis brasiliensis y pargo blanco, Umbrina canosai. La Figura 1.1 indica la ubicación de las estaciones muestreadas. No se detectaron Vibrio cholerae 01, ni O139 toxigénico. 1.2.1 Hallazgos de V. cholerae no-O1

Como resultado de estos trabajos se cuenta con una colección de cultivos de

1.770 aislamientos de V. cholerae no-O1, los cuales fueron caracterizados fenotípicamente en cuanto al serotipo, biotipo, antibiotipo y producción de toxina de cólera, esta última determinada por el INEI. Se analizaron 340 cepas provenientes de aguas continentales y 1430 provenientes de aguas estuariales, marinas y de peces capturados en la zona. Fue notoria la influencia de los factores ambientales tales como la temperatura y salinidad en la aparición de V. cholerae no-O1. El 80 % de las cepas aisladas en el río fueron obtenidas a temperaturas entre 25º y 28°C, mientras que la frecuencia de aislamiento en el ambiente marino y estuarial fue mayor entre 20º y 23°C, siendo sólo del 8% a temperaturas menores de 15°C. En cuanto a la salinidad, el 80% de los aislamientos se produjo entre 0 y 20 ups (ups= unidades prácticas de salinidad; siendo 1 ups= 1g ClNa.lt-1), resultando muy escasos cuando la salinidad alcanzó valores entre 25 y 30 ups. El microorganismo no se detectó en aguas con salinidades superiores

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a 30 ups, posiblemente debido a encontrarse en formas viables pero no cultivables (Costagliola et al., 2000).

A consecuencia de los resultados obtenidos con las técnicas microbiológicas de rutina y considerando la existencia de formas viables no cultivables, se buscaron reservorios de este microorganismo en el ambiente acuático, con el fin de establecer un nuevo plan de vigilancia ampliando las técnicas de detección.

1.2.2 Reservorios de V. cholerae O1

En el marco de un Proyecto financiado por la Agencia Nacional de Promoción

Científica y Tecnológica (PICT Nº 05-00083-01943), en colaboración con el INEI – ANLIS “Dr. Carlos G. Malbrán”, para la búsqueda de reservorios de V. cholerae O1 en muestras de agua y plancton, se establecieron las condiciones óptimas para el ensayo de tinción con anticuerpos monoclonales contra el antígeno somático O1 (DFA-DVC). Mediante esta técnica se pudieron observar formas bacterianas fluorescentes correspondientes a V. cholerae O1 VNC.

Desde febrero de 1999 hasta diciembre de 2000 se realizaron 19 campañas a la estación EPEA (38°28’S, 57°41’W) y 7 campañas a la zona del Tratado del Río de la Plata, en las que se recolectaron muestras de agua, fito y zooplancton. Se probaron ambas técnicas paralelamente. Por la técnica convencional se aisló V. cholerae no-O1 viable cultivable en los tres tipos de muestras, pero no se recuperaron formas cultivables de V. cholerae O1, ni O139. Sin embargo mediante la técnica de DFA-DVC se determinó la presencia de V. cholerae O1 VNC en muestras de agua, fitoplancton y zooplancton del Area del Tratado del Río de la Plata y en la estación EPEA correspondiente al Frente Marítimo. Estos resultados fueron confirmados con la técnica de PCR “multiplex” que corroboró la presencia de V. cholerae O1. Además, y de gran importancia para posibles rebrotes de cólera, la utilización de la PCR “heminested” demostró la presencia en estas formas bacterianas VNC de los genes que codifican la toxina CT. También se identificó el gen tcpA que codifica el factor de colonización TCP. Esto significa que las formas viables no cultivables que se encuentran en dichos ambientes poseen toda la información genética relacionada con su poder patogénico. Los resultados obtenidos fueron validados en el Center of Marine Biotechnology, University of Maryland Biotechnology Institute, Baltimore, EEUU de América.

Entre las especies de zooplancton asociadas a V. cholerae O1 VNC se identificaron las siguientes: Acartia tonsa, Diaptomus sp., Paracalanus crassirostris, Paracalanus parvus, Corycaeus amazonicus, Centropages furcatus, Ctenocalanus vanus. En el espectro de tamaño del microplancton se identificó al dinoflagelado heterótrofo Diplopelta asymmetrica como portador de V. cholerae O1 VNC en la cubierta celular.

Con estos estudios se demostró la presencia de reservorios ambientales de V. cholerae O1 VNC tanto en agua como asociado al plancton, portador de los genes ctxAB y tcpA en la zona del Tratado del Río de la Plata y Frente Marítimo. Estas formas bacterianas podrían revertir al estado cultivable en condiciones adecuadas. Con los resultados obtenidos se está preparando un manuscrito para su publicación (Binsztein et al. , en preparación).

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1.3 - Informe de avance de los hallazgos de Vibrio cholerae.

Campaña de prospección ambiental

Sobre la base del análisis de la información existente y con el objeto de cubrir un área geográfica con vacíos críticos para realizar un diagnótico mas completo de la situación en la región, se planificó un estudio de V. cholerae con muestras obtenidas durante la campaña de Prospección Ambiental del Río de la Plata y el Frente Marítimo. 1.3.1 Objetivo

Detección de Vibrio cholerae viable cultivable y viable no cultivable en muestras de agua , fito y zooplancton. 1.3.2 Materiales y Métodos

El material fue recolectado durante la etapas 1ra . y 2da. de la Campaña de

Prospección Ambiental EH-09/01, a bordo del BIP “E. Holmberg” en profundidades mayores a los 6 metros, y de la embarcación pesquero-comercial “Vázquez hermanos” en profundidades menores a los 6 metros. Se muestrearon 21 estaciones ubicadas en el Río de la Plata desde la línea Colonia - Buenos Aires, en la zona interior del río, hasta la línea Piriápolis - Punta Rasa, en la zona exterior, y 10 estaciones ubicadas en la región fluvio-marítima del Río de la Plata y Frente Común de Pesca Argentino-Uruguayo. La ubicación de las estaciones está indicada en la Figura 1.2.

Se colectaron 5 litros de agua de superficie en envase aséptico desde la proa, para evitar la contaminación originada por el propio buque. Las muestras de zooplancton se obtuvieron con una red tipo bongo equipada con malla de 200 µm, arrastrada horizontalmente a 3 metros de profundidad durante 10 minutos. Las muestras de fitoplancton se obtuvieron mediante barridos verticales con una red de 25µm de apertura.

1.3.2.1 Procesamiento de las muestras a- Agua

La detección de V. cholerae viable cultivable se realizó mediante la técnica de filtración con membranas de 0,22 micrones de porosidad. Se filtraron volúmenes entre 1000 y 2000 ml de agua. Los filtros fueron colocados en APA (agua de peptona alcalina) e incubados durante 10 hs a 37ºC. Luego se tomaron con asa calibrada 0,05 ml de la membrana superficial y se sembraron por estría en agar TCBS (tiosulfato citrato bilis sacarosa). Se dejaron incubar por 24 hs. a 37°C. Las colonias con morfología típica de V. cholerae se conservaron en agar T1N1 semiblando (triptona 1%, cloruro de sodio 1%, agar 0,75 %) y se transportaron al laboratorio del INIDEP para su identificación.

Para la detección de V. cholerae viable no cultivable se filtraron 3000 ml de agua por muestra. Las células bacterianas retenidas en los filtros se resuspendieron en 6 ml de PBS (solución buffer fosfatos). Una alícuota de 1 ml fue incubada en un medio con extracto de levadura 0,025% y ácido nalidíxico 0,002% a 37°C por 6 hs. y luego fijada con formaldehído al 3% para realizar la técnica de tinción con anticuerpos monoclonales (DFA-DVC ). Otra alícuota de 1 ml (por duplicado) se mantuvo a –20ºC para la realización de técnicas moleculares.

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b- Plancton

La detección de V. cholerae viable cultivable se realizó incubando 10 ml de la

muestra concentrada de plancton en APA durante 8 hs a 37ºC siguiendo luego el mismo procedimiento que para las muestras de agua. Para V. cholerae viable no cultivable se incubó 1 ml de muestra en extracto de levadura 0,025% y ácido nalidíxico 0,002% siguiendo también idéntico procedimiento que para las muestras de agua. Una alícuota de 1 ml (por duplicado) se mantuvo a –20ºC para la realización de técnicas moleculares.

1.3.2.2 Aislamiento e identificación de V. cholerae viable cultivable

En el laboratorio de microbiología del INIDEP se procedió a la purificación de las cepas sospechosas obtenidas, mediante sucesivos pasajes en T1N1 (Tripona 1 %, Cloruro de Sodio 1%) y a su identificación mediante las siguientes pruebas fisiológicas y bioquímicas: Oxidación / fermentación de la glucosa (Hügh y Leifson); gas de la glucosa (Hügh y Leifson), presencia de la enzima lisina y ornitina decarboxilasa (Moeller), presencia de la enzima arginina dehidrolasa (Thornley), producción de ácido de manitol, crecimiento en ausencia de Cloruro de sodio y pruebas con tiras de identificación API 20E. Todas las cepas que respondieron a las características bioquímicas de V. cholerae se sometieron a una prueba de aglutinación con antisuero polivalente anti Vibrio cholerae O1. También se efectuaron las siguientes pruebas complementarias: movilidad, producción de Indol, producción de H2S, coloración de Gram, crecimiento en ClNa al 3, 6 y 8% y sensibilidad al vibriostático 0/129 (150 µg). 1.3.2.3 Identificación de V. cholerae viable no cultivable

La técnica de DFA-DVC se realizó utilizando anticuerpos monoclonales

específicos marcados con fluoresceína a partir de las muestras tratadas con ANY (extracto de levadura y ácido nalidíxico). 1.3.3 Resultados preliminares a- Vibrio cholerae viable cultivable

Se aislaron un total de 421 cepas con características típicas de V. cholerae, 146 cepas provenientes de agua, 132 de fitoplancton y 143 de zooplancton.

Hasta el momento se han analizado 334 cepas (81%), según el siguiente detalle: 122 provenientes de agua, 100 de fitoplacton y 112 de zooplancton. Los resultados parciales están expuestos en la Tabla 1.1 y en la Figura 1.3.

Sólo el 5% de las cepas analizadas fueron identificadas como V. cholerae no-O1, las cuales fueron aisladas en aguas del Río de la Plata.

Para completar este estudio se necesita analizar las cepas restantes y estudiar las características genéticas de las cepas de Vibrio cholerae no-O1 aisladas, para evaluar la presencia de posibles factores de virulencia.

11

b- Vibrio cholerae viable no cultivable

Los resultados están expresados en la Tabla 1.2. Se analizaron en total 31 estaciones, en 10 de las cuales (32,25%) se detectó la presencia de Vibrio cholerae 01 viable no cultivable.

El 25 % de las detecciones se realizó en muestras de agua, mientras que sólo el 9,6% en fitoplancton y el 3,2% en zooplancton (Figura 1.4). La ubicación de las estaciones positivas está indicada en la Figura 1.5. y las imágenes obtenidas se muestran en la Figura 1.6, 1.7 y 1.8.

Estos estudios deben ser confirmados por las técnicas de PCR “nexted”, que detecta la toxina CT, y de PCR “multiplex”, que permite identificar los genes CT y el antígeno somático O1.

1.4- Muestras pendientes de estudio

Con el objeto de obtener los productos que se esperan de esta investigación en el Río de la Plata y el Frente Marítimo, se continuó con el muestreo de la zona durante diferentes campañas. 1.4.1 Río de la Plata

Con el auspicio de la Organización Panamericana de la Salud (OPS) y de la SECYT (PICT REDES 010) se realizaron tres campañas a bordo de la embarcación SPA1 “Keratella” perteneciente a Prefectura Naval Argentina, nombradas de la siguiente manera:

SPA 1 – 01/03 (27 al 30 de enero de 2003) SPA 1 – 02/03 (19 al 22 de febrero de 2003) SPA 1 – 03/03 (24 al 27 de marzo de 2003) Los objetivos particulares fueron: a) Buscar reservorios de Vibrio cholerae O1 en agua y biota (zooplancton y

fitoplancton) del Río de la Plata; b) investigar la presencia de Vibrio cholerae O1 y no O1 viable cultivable; y c) relacionar las variables ambientales con la presencia o ausencia del

microorganismo en estudio. La posición de las estaciones está indicada en la Figura 1.9 y en la Tabla 1.3. La

metodología empleada fue la misma empleada en la Campaña de Prospección Ambiental. Los parámetros físico-químicos fueron obtenidos a bordo de la embarcación por personal de la PNA con un termosalinómetro y peachímetro. Los datos obtenidos están expuestos en la Tabla 1.4.

Como resultado de estas campañas se cuenta con un total de 240 cepas con características típicas de V. cholerae. Proceden de muestras de agua 120 cepas, de zooplancton 60 cepas y de fitoplancton 60 cepas. También se han obtenido (por duplicado) 72 muestras (12 de cada campaña) para la realización de la técnica de anticuerpos monoclonales (DFA/ DVC) en el laboratorio de microbiología del INIDEP, y 96 muestras (16 de cada campaña) para la realización de técnicas moleculares ( PCR) .

12

1.4.2 Area del Tratado del Río de la Plata y Frente Marítimo Las muestras fueron obtenidas de las siguientes campañas:

OB-04/01: “Reproducción de corvina rubia (Micropogonia furnieri) en la Zona Común de Pesca Argentino-Uruguaya”, 9 a 19 de marzo de 2001.

EH 07/01: “Evaluación de corvina rubia (Micropogonia furnieri) en la Zona Común de Pesca Argentino-Uruguaya”, 3 al 17 de julio de 2001.

EH-03/02: “Evaluación de corvina rubia (Micropogonia furnieri) en la Zona Común de Pesca Argentino-Uruguaya”, 31 de julio al 14 de agosto de 2002.

EH-07/02: “Evaluación de anchoíta bonaerense en la primavera de 2002”, 29 de octubre al 16 de noviembre de 2002.

En la Figura 1.10 se indica la ubicación de las estaciones muestreadas. En todas

las campañas se utilizó la metodología descrita. Como resultado de estas campañas se ha conformado una colección de 372

cepas con características típicas de V. cholerae procedentes de muestras de agua, zooplancton y fitoplancton, que están siendo analizadas. También se conservan 117 muestras para ser estudiadas con anticuerpos monoclonales (DFA/ DVC) y técnicas moleculares (PCR).

Estos estudios se llevarán a cabo en la medida que se cuente con el financiamiento requerido para disponer de los insumos indispensables.

1.5 BIBLIOGRAFIA BINSZTEIN, N., COSTAGLIOLA, M., PICHEL, M., JURQUIZA, V., RAMÍREZ, F.

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15

Tabla 1.1 Resumen de resultados de Vibrio cholerae no-O1 cultivable. Campaña EH-09/01.

Est gral pH T ºC SUP SAL. SUP Vibrio cholerae NO-O1 749 7 22.68 0.133 Positivo 750 7 22.19 0.098 Positivo 753 7 22.29 0.109 - 754 7 21.97 0.091 - 755 7 21.98 0.084 - 757 7 21.34 0.129 - 758 7 20.56 0.169 - 762 7 21.59 0.068 - 763 7 21.62 0.066 - 764 7 22.11 0.085 - 767 7.63 20.78 0.112 - 770 7.35 20.56 0.049 - 771 7.8 20.02 0.113 - 772 7.9 20.39 0.056 Positivo 773 7.65 20.14 0.107 - 774 7.4 20.21 0.075 - 775 7.65 20.39 0.048 Positivo 779 8.06 19.13 7.593 - 782 7.95 18.75 13.4554 - 784 7.85 20.46 6.132 - 785 8.18 19.89 17.552 - 787 8.06 16.91 31.136 - 788 8.15 16.39 31.806 - 796 8.4 15.90 34.339 - 798 8.4 19.89 34.838 - 808 8.12 20.33 14.492 no estudiadas 810 8.47 20.05 3.195 no estudiadas 811 8.01 20.83 1.21 no estudiadas 820 ---- 21.23 36.177 no estudiadas 826 8.27 19.98 28.997 no estudiadas 827 8.35 19.49 29.035 no estudiadas

TºC: temperatura; Sal.: Salinidad; Sup.: Superficie; Fdo.: Fondo

16

Tabla 1.2 . Resumen de los resultados de V. cholerae O1 viable no cultivable. Campaña EH-09/01.

MuestraN° Estación Agua Fitoplancton Zooplancton 1 749 negativo negativo negativo 2 750 negativo negativo negativo 3 753 positiva negativo negativo 4 754 negativo negativo negativo 5 755 positiva negativo negativo 6 757 negativo negativo negativo 7 758 positiva negativo negativo 8 762 negativo negativo negativo 9 763 positiva negativo negativo 10 764 negativo negativo negativo 11 767 negativo negativo negativo 12 770 positiva negativo negativo 13 771 negativo negativo negativo 14 772 positiva negativo negativo 15 773 negativo negativo negativo 16 774 negativo negativo negativo 17 775 negativo negativo negativo 18 779 negativo negativo negativo 19 782 negativo negativo negativo 20 784 negativo positiva negativo 21 785 negativo positiva positiva 22 787 positiva positiva negativo 23 788 negativo negativo negativo 24 796 negativo negativo negativo 25 798 negativo negativo negativo 26 808 positiva negativo negativo 27 810 negativo negativo negativo 28 811 negativo negativo negativo 29 820 negativo negativo negativo 30 826 negativo negativo negativo 31 827 negativo negativo negativo

17

Tabla 1.3. Posición de las estaciones de muestreo. Campañas: SPA1-01/03, SPA1-02/03 y SPA1-03/03.

SPA1-01/03 SPA1-02/03 SPA1-03/03

Estación Latitud Longitud Latitud Longitud Latitud Longitud

Est1 34º32´S 58º10´W 34º34´S 58º17´W 34º34´S 58º17´W

Est2 34º38´S 57º59´W 34º38´S 58º13 W 34º38´S 57º59 W

Est3 34º41´S 57º49´W 34º41´S 58º05´W 34º41´S 57º49´W

Est4 34º43´S 57º45´W 34º 44´S 57º57´ W 34º 46´S 57º39´ W

Tabla 1. 4. Medición de parámetros físico-químicos. Campañas: SPA1-01/03, SPA1-02/03 y SPA1-03/03.

EST.GRAL CAMPAÑAS

PARÁMETROS

MEDIDOS 1 2 3 4

Temp (ºC) S/R S/R 25,9 25,8

pH 7,11 7,1 7,13 7,12 SPA1-01/03

Oxígeno mg/l S/R S/R 7,1 7,3

Temp (ºC) 21,2 20,9 21,2 21,0

pH 7,0 7,0 7,0 7,0

Oxígeno mg/l 8,2 7,7 8,2 7,8 SPA1-02/03

Conductividad µsiemens/cm

250 240 223 197

Temp (ºC) 21,8 21,9 22,0 22,0

PH 7,0 7,0 7,0 7,0

Oxígeno mg/l 6,9 8,4 7,6 8,5 SPA1-03/03

Conductividad µsiemens/cm

220 165 127 176

s/r : Sin registro

18

URUGUAY

ARGENTINA

Montevideo

PuntaPiedras

57 56 55 54

Latitud

38

37

36

35

34

ongi tu

Long

itud

Figura 1. 1 – Vigilancia de Vibrio cholerae. Estaciones muestreadas – Período 92– 96. Ubicación de las estaciones positivas (círculos llenos) y negativas (círculos vacíos) en la detección de V. cholerae no-O1.

��

59 58 57 56 55 54 53 52 5139

38

37

36

35

34

URUGUAY

ARGENTINA

Figura 1.2. Ubicación de las estaciones de muestreo. Campaña EH-09/01.

19

��

59 58 57 56 55 54 53 52 5139

38

37

36

35

34

URUGUAY

ARGENTINA

Figura 1. 3. Ubicación de las estaciones de positivas (triángulos) y negativas (círculos llenos) en la detección de V. cholerae no-01. Los círculos vacios son las estaciones pendientes de estudio.

0

20

40

60

80

100

Agua Fitoplancton Zooplancton

Muestras

F(%)

Figura 1. 4. Frecuencia de detección de Vibrio cholerae 01 viable no cultivable en las muestras analizadas.

20

��

59 58 57 56 55 54 53 52 5139

38

37

36

35

34

URUGUAY

ARGENTINA

Figura 1.5. Ubicación de las estaciones positivas (triángulos) y negativas (círculos). Vibio cholerae 01 viable no cultivable.

Figura 1.6 Microfotografía de una muestra de agua positiva para V. cholerae O1 VNC.

21

Figura 1.7 Microfotografía de una muestra de fitoplancton positiva. V. cholerae O1 VNC.

Figura 1.8 Microfotografía de una muestra de zooplancton positiva V. cholerae O1 VNC.

22

59° 58° 57° 56°Longitud [W]

36°

35°

34°

Latit

ud (S

)

Estaciones muestreadas

EneroFefreroMarzo

Figura 1.9. Ubicación de las estaciones muestreadas. Campañas: SPA1-01/03, SPA1-02/03 y SPA1-03/03.

��

64° 63° 62° 61° 60° 59° 58° 57° 56° 55° 54° 53°

Longitud (W)

41°

40°

39°

38°

37°

36°

35°

34°

33°

Latit

ud (S

)

URUGUAY

ARGENTINA

OB-04/01EH-07/01EH-03/02

EH-07/02

Figura 1.10. Ubicación de las estaciones muestreadas en las campañas OB-04/01, EH-07/01, EH-03/02 y EH-07/02.

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