Utilidad de las nuevas herramientas moleculares en el diagnóstico

microbiológico de la sepsis

Mercedes Marín Serv. Microbiología Clínica-Enfermedades Infecciosas

Necesidad de nuevos métodos para el diagnóstico etiológico de sepsis/bacteriemia

• Infección grave • Infección frecuente • Elevada morbi-mortalidad • Importantes costes sanitarios

El tratamiento antibiótico adecuado y precoz condiciona la evolución y la mortalidad

Puede estar causada por numerosos microorganismos diferentes que requieren tratamientos distintos

Se basa en el hemocultivo

Diagnóstico microbiológico de bacteriemia

+ 1d

Cultivo y antibiograma “previo”

~7h-5d

HC + T. Gram

G- 8,8h ; G+ 11 h

+1-2d

Identificación y sensibilidad

Tiempo de crecimiento e identificación: demora diagnóstica

% importante de HC negativos en pacientes con sepsis

??

Tratamiento antibiótico previo

m.os exigentes

Hemocultivos

Ventajas

Tecnología muy conocida y eficaz

Establece etiología y sensibilidad antibiótica. Permite el archivo de m.os

Laboratorios y adaptados a su procesamiento. (24h/7d)

Limitaciones

¿Pueden ser útiles las técnicas moleculares?

Rapidez

Evitar la inhibición por tto.antibiótico Detectar m.os de cultivo difícil

Objetivo

Detectan “ADNemia”

Instalaciones adecuadas y personal entrenado

Caras

Limitada información de resistencia a antibióticos*

No disponibles 24h/7d

No archivo de cepas

Limitaciones Rápida obtención de resultados Teórica alta sensibilidad Dx. pacientes en tratamiento Detección de m.os exigentes Diagnóstico muestra directa o en hemocultivo crecido o en cultivos

Ventajas

PCR universal genes rARN + secuenciación (bacterias y hongos)

PCR’s específicas m.os especiales (Brucella, Coxiella,…)

Aplicaciones de los métodos moleculares

Detección de diferentes m.os Detección de genes de resistencia* Detección de m.os crec. difícil PCR

Tipado Molecular

Identificación

Genes de Resistencia*

Identificación Rápida Genes de Resistencia*

Detección e identificación de ADN en sangre/HC

Desarrollo de sistemas comerciales de amplificación y detección de ADN bacteriano o fúngico en sangre

Extracción ADN Amplificación Análisis post-PCR

PCR

Indetectable Detectable

ADN Copias

Sucesivas

“cultivo molecular”

Muestra Clínica

Menor volúmen de sangre analizado Baja [ADN] bacteriano o fúngico Inhibiciones (ADN humano, hemoglobina) Detección de diferentes m.os “Rapidez”

Hemocultivo

0.1 cfu/ml

Hemocultivo

0.1 cfu/ml

>10-100 cfu/ml

Métodos

Moleculares

>10-100 cfu/ml

Métodos

Moleculares

PCR

Septifast® (Roche)

SepsiTest® (Molzym)

VYOO® (Sirslab)

Plex-ID® (Abbott)

Técnica Método M.os

detectados Genes resist

Tiempo respuesta

Tiempo trabajo

Bibliog

Septifast PCR universal ITS rARN TR y sondas FRET

16 bacterias 6 hongos

mecA 5h Medio Sí. Util Clínica

Septitest PCR universal 16S rARN TR y secuenciación

54 Bacterias y 5 hongos

No 24h Alto Escasa

VYOO PCR multiplex 16S y 18S rARN Detección con geles

33 Bacterias (anaerobios) y 6 hongos

mecA blaSHV VanA, B

6-8h Media-Alto

Escasa

Plex-ID PCR universal rARN y multiplex-ESI MS

Bacterias y hongos

Sí 5-6h Medio Moderada

PCR específicas

Distintas dianas específicas del m.o

Bacterias y hongos

No Variable Variable Sí (*)

Detección en sangre periférica

Septifast (Roche)

Detecta infecciones polimicrobianas

Útil primeras dosis de tratamiento

Persistencia de ADN puede indicar mal pronóstico/bacteriemia complicada??

mecA

Menos sensible que el hemocultivo (*)

No excluye bacteriemia

Septifast: estudios de Utilidad Clínica

Útil adecuación precoz de tratamiento

Coste beneficio en pacientes más graves

Reducción mortalidad relacionada con tratamiento inadecuado

No consideran resultados PCR-

Detección en HC +

Técnica Método m.os detectados Tiempo * respuesta

Tiempo trabajo

Resultados Bibliog

GeneExpert PCR tiempo real SAMS/SAMR 1h Bajo S 98%, E 99,4% Sí, Util Clin

GenomEra PCR hibridación-microarray

SAMS/SARM 1h Bajo S y E 100% 223 HC# Escasa

Genotype PCR convencional + hibridación

15G+, 17G-, mecA, VanA-B

4h Medio-alto

---- Escasa

Prove-it PCR distintos genes hibridación-microarray

50 bacterias mecA gyrB parE

3h Medio Sens 95%, Esp 99%

Moderada

Maldi-TOF Perfil proteínas y detección MS

Bacterias, hongos….

1,5h Medio Sens 95% Exac 90%, G->G+

Sí, Util Clin

PNA-FISH Hibridación sondas

Enterococcus sp. Candida sp. S.aureus/SCN E.coli/P.aeruginosa

90 min Medio Sens Esp

Sí, Util Clin

Genexpert MRSA-BC® (Cepheid) GenomEra MRSA/SA HC® (Abacus) Genotype Blood culture® (Hain) Prove-it® (Mobidiag) MALDI-TOF MS PNA-FISH

# Cercenado y cols. ICAAC 2012

Detección Molecular en HC +

GeneXpert MRSA-SA-BC® (Cepheid)

PCR tiempo real con extracción ADN integrada Identificación de S. aureus y S. aureus Met-R en 1h en HC+ Muy sencillo, no necesita personal especializado

Disminuye estancias y costes

Detección Molecular en HC +

MALDI-TOF MS

Bajo Coste Rapidez

Levaduras

+

Identificación

Genes Resistencia MecA Linezolid Quinolonas BLEE’s AmpC Carbapenemasas

Utilidad de los métodos moleculares en cultivos

Tipado Molecular

PCR universal gen 16S rARN +secuenciación PCR ITS hongos+secuenciación MALDI-TOF PCR’s genéricas (sodA: estreptococos, hsp65: micobacterias)

MWMRAF RRB STH

MWMRAF RRB STH

• Los métodos moleculares son complementarios al Hemocultivo

• A pesar de sus resultados, su aplicación al diagnóstico de bacteriemia/sepsis sigue sin ser una realidad en nuestros hospitales

• Varios desarrollos comerciales con resultados prometedores. Pero la información que aportan sobre resistencias es limitada

• La detección de m.os exigentes debe realizarse con PCR’s específicas

• Adaptación de laboratorios y personal entrenado

• ¿A qué pacientes aplicarlos?

• ¿Cuándo?

• ¿Coste-eficaz?