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PROYECTO: Biodegradación de mezclas de clorofenoles por una
comunidad microbiana, en un reactor de lecho empacado, con
posibilidades de escalamiento.
RESUMEN.
En este trabajo se estudió la degradación cometabólica de clorofenoles en agua
sintética usando un reactor de lecho empacado con roca volcánica (tezontle),
empleando una comunidad microbiana mixta aislada del pantano de Santa
Alejandrina en el estado de Veracruz, dicha comunidad había mostrado, en estudios
previos, tener capacidad para remover clorofenoles en sistemas con células en
suspensión. La comunidad microbiana estuvo compuesta por una levadura, Candida
tropicalis y dos bacterias: Microbacterium phillosphaerae y Bacillus sp. Durante la
operación del sistema en continuo, se obtuvieron eficiencias de remoción de fenol del
100% para todos los valores de velocidad de dilución (D) probados, mientras que la
mayor eficiencia de remoción del 2,6-diclorofenol
(100%) se obtuvo a una velocidad
de dilución baja (0.035 h-1
), en estas condiciones se obtuvo el 96.4% de remoción de
contaminantes medidos como Demanda Química de Oxígeno (DQO) y la eficiencia de
remoción del 2,6-diclorofenol disminuyó con el aumento de D.
INTRODUCCCION.
En México, así como en diversos países del mundo, se ha llevado a cabo una intensa y
exhaustiva investigación para remover compuestos presentes en los efluentes industriales,
como los clorofenoles que contaminan ampliamente el aire, agua y suelo, ya que son usados
durante la elaboración de pesticidas, conservadores de madera y desinfectantes, entre otros,
además de que pueden formarse durante el proceso de blanqueado del papel con cloro. Las
investigaciones han abarcado diversos métodos de remoción, entre los que se encuentran
los métodos físicos (fotooxidación, adsorción); métodos químicos (peróxido de hidrógeno,
ozono, en general sustancias altamente oxidantes) y los métodos biológicos (degradación
aerobia y anaerobia). Cada método presenta ventajas y desventajas, por lo que su aplicación
ha sido llevada a cabo de manera individual o en combinación, sin embargo los método
biológicos presentan la ventaja de ser relativamente económicos y con menor generación de
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subproductos, por lo que el propósito de esta investigación es realizar un estudio cinético de
la degradación cometabólica de 2,6-diclorofenol por una comunidad microbiana obtenida
en el Laboratorio de Bioingeniería de la Escuela Nacional de Ciencias Biológicas que
demostró capacidad para remover clorofenoles en un sistema con células en suspensión, sin
embargo este tipo de procesos presenta dificultades para su escalamiento, mientras que un
sistema con células inmovilizadas como el que se empleó en este estudio presenta mayor
factibilidad de escalamiento.
El sistema con células inmovilizadas en un soporte (tezontle) o también llamado de lecho
empacado que se empleó para la remoción de la mezcla fenol-2,6diclorofenol, operó en
forma continua variando la velocidad de de dilución (D) de 0.018 a 0.0060 h-1
, el aire se
suministró 0.05 L min-1
, la alimentación de la mezcla se realizó por la parte inferior de
lecho empacado y se mantuvo en la mayoría de los experimentos a una concentración
aproximadamente constante de 300 and 50 mg L-1
respectivamente, el bioproceso se llevó a
temperatura ambiente sin control de pH.
Para estudiar el proceso de degradación de la mezcla se tomaron muestras de la fase líquida
a tres diferente alturas del lecho empacado y se les determinó la concentración del fenol y
2,6-diclorofenol por HPLC y la demanda química de oxígeno (DQO) por el método de
Hach. Finalmente la riqueza de especies de la comunidad microbiana tanto en la biopelícula
adherida en el soporte como en la fase líquida, fue determinada por morfología colonial
empleando técnicas de microbiología clásica. El crecimiento celular fue medido en
Unidades Formadoras de Colonias (UFC*ml-1
).
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MATERIALES Y MÉTODOS
Medios de cultivo
El medio mínimo mineral libre de cloruros usado para el crecimiento de los cultivos puros
en suspensión y en los experimentos realizados con el reactor de lecho empacado; tiene la
siguiente composición: 0.25g/L (NH4)2 SO4; 0.35 g/L KNO3; 0.20 g/L KH2PO4; 0.10 g/L
MgSO4; 0.04 g/L Ca(NO3)2.4H2O; 4 mL*L-1
Na2MoO4a; 4mL*L
-1 MnSO4
b.
a = Sol. Stock 0.2 g/L
b = Sol. Stock 0.45 g/L
El medio de cultivo fue esterilizado a 15 lb/in2 durante 15 minutos. Después de esterilizado
el medio se agregó el 2,6-DCF (50-100 mg*L-1
) y fenol (300 mg*L-1
) y se dejó en agitación
durante 48 hrs.
El pH del medio mínimo mineral adicionado con fenol y 2,6-diclorofenol disminuyó hasta
5.05 cuando se le adicionó el fenol y el 2,6-DCF. Cabe mencionar que no se ajustó ni
controló el pH durante las cinéticas de estudio.
Para la realización de la cuenta viable, se utilizó agar cuenta estándar, que presenta la
siguiente composición: peptona de caseína 5 g/L; extracto de levadura 2.5 g/L; dextrosa 1.0
g/L y Agar 20.0g/L
Para la propagación de células con el objeto de extraer su DNA se utilizó el medio Luria-
Bertani, el cual tiene la siguiente composición: triptona 10 g/L; extracto de levadura 5 g/L y
cloruro de sodio 10 g/L.
Compuestos químicos.
Los compuestos químicos utilizados en este estudio fueron de grado analítico. El fenol y
2,6-diclorofenol fueron obtenidos por Aldrich-Europe.
Cultivos microbianos
Se utilizaron dos microorganismos con capacidad comprobada de degradación de
clorofenoles, obtenidos del Banco de Cepas del Laboratorio de Bioingeniería de la Escuela
Nacional de Ciencias Biológicas (ENCB) las cuales son: Microbacterium phyllosphareae, y
Candida tropicalis, previamente aisladas e identificadas por Santoyo (2002) y Salmerón
(2007) respectivamente. El tercer microorganismo utilizado en la degradación del 2,6-DCF,
identificado en este trabajo mediante técnicas de biología molecular reveló que se trataba
de Bacillus sp.
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Preparación del Inóculo.
Los integrantes de la comunidad microbiana se cultivaron por separado, en matraces de 50
mL con 20 mL de medio mínimo mineral cada uno; el medio contenía 100 ppm de fenol y
25 ppm de 2,6-DCF, se cultivó cada cepa en un matraz diferente y se incubaron por 48 hs a
28°C y a una velocidad de agitación de 40 rpm, se obtuvieron los paquetes celulares por
centrifugación a 3500 rpm x 10 min, se lavaron dos veces con agua estéril y finalmente se
resuspendieron en 10 mL de medio mineral adicionado con fenol a 300 ppm y 2,6-DCF a
50 ppm.
Determinación de la concentración celular
Esta determinación se realizó espectrofotométricamente, midiendo la absorbencia obtenida
a 600 nm, empleando un Espectronic-20 Bausch & Lomb. Esta determinación es
cualitativa, ya que sólo nos indica si está aumentando la biomasa.
Cuenta viable
La toma de muestras se llevó a cabo cuando el sistema alcanzó el estado de equilibrio
dinámico, esto fue cuando las concentraciones de 2,6-DCF a la salida del reactor de lecho
empacado fueron prácticamente constantes. Se tomó una muestra a la salida del reactor, la
cual contenía células libres, la muestra fue diluida serialmente en forma decimal y
sembradas por espatulado (500 L) en placas de agar cuanta estándar (de la marca Bioxon),
las cuales se incubaron a temperatura ambiente. El conteo de las colonias se realizó 48
horas después, utilizando un cuentacolonias.
Esta metodología fue utilizada también para cuantificar las células inmovilizadas en el
lecho del reactor, esta cuantificación se realizó antes de desmontar el biorreactor.
Peso seco
Cuando el sistema llegó al estado de equilibrio dinámico, se tomaron 10 mL de muestra a
cuatro alturas del lecho empacado (base del reactor, 10, 20 y 30 cm) y a cada velocidad de
dilución, cada muestra fue filtrada a través de una membrana de fibra de vidrio Whatman
GF/F de 0.7 m a peso constante, empleando un dispositivo de filtración al vacío. La
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membrana fue secada nuevamente hasta peso constante en una estufa a 100°C. La biomasa
celular fue calculada por diferencia de pesos.
Determinación del nitrógeno total soluble
Para la determinación se empleó un kit (Método 10071, Hach 1999), en el que una
digestión alcalina convierte al nitrógeno en cualquiera de sus formas a nitrato; en
condiciones fuertemente ácidas, el nitrato formado reacciona con el ácido cromotrópico y
forma un complejo amarillo con una absorbencia máxima a 410 nm. El metabisulfito de
sodio se adiciona después de la digestión para eliminar las interferencias por óxidos de
halógeno.
Determinación de proteínas en el soporte por el método de Lowry
La determinación de proteínas por el método de Lowry se basa en el desarrollo de color,
mediante una reacción que se efectúa en dos etapas. La primera consiste en la formación de
un complejo colorido, entre los enlaces peptídicos (al menos 4) y el cobre cúprico en medio
alcalino (ácido fosfomolíbtico-fosfotúngstico) por el complejo que es proporcional a la
concentración de proteína. La totalidad del color producido depende del contenido de
tirosina y triptófano que tenga la proteína (Lowry y col., 1951)
Cuantificación de fenol y 2,6-DCF
Las muestras obtenidas a las diferentes alturas del lecho empacado se centrifugaron a
13000 rpm en una ultracentrífuga (Biofuge pico, Heraus), el sobrenadante libre de células
se empleó para determinar concentración de fenol y clorofenoles por cromatografía de
líquidos de alta resolución HPLC (Beckman HPLC System).
Método
Las muestras fueron inyectadas en una columna Econosphere C8 (tamaño de partícula 5
µm; 150x4.6 mm), con detector de diodo (UV 280 nm), para la separación de clorofenoles,
las condiciones de operación fueron las siguientes:
Fase móvil: A: H2O + 3% Ácido acético;
B: Metanol + 3% ácido acético
Flujo: 1.5 mL/min. (Método isocrático 50:50)
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Determinación de la Demanda Química de Oxígeno (DQO)
Los filtrados obtenidos de la determinación de concentración celular por peso seco se
utilizaron para la determinación de la DQO, que corresponde a la cantidad de oxígeno
requerido para oxidar la fracción orgánica e inorgánica de una muestra. Esta reacción se
lleva a cabo en medio ácido y utilizando dicromato de potasio como agente oxidante fuerte.
El método usado fue el 8000 de HACH (2002).
Parámetros cinéticos a evaluar
Para analizar los resultados obtenidos en los experimentos de remoción, se determinó:
Eficiencia de remoción de fenol ( Fe) y 2,6-DCF ( 2,6-DCF)
= [(Ser – Ssr)/ Ser]*100
Donde:
= Eficiencia de remoción (%)
Ser= Concentración de fenol ó 2,6-DCF a la entrada del reactor
Ssr= Concentración de fenol ó 2,6-DCF a la salida del reactor
Velocidad volumétrica de consumo de fenol (RFe) y 2,6-DCF (R2,6-DCF)
R = (Ser – Ssr)*D
Donde:
R = velocidad volumétrica de consumo, en mg*L-1
*h-1
)
D = Velocidad de dilución, en h-1
Rendimiento celular global (Yx/s)
Yx/s= D/ qs
Donde:
Yx/s= Rendimiento celular global, en mg células*mg sustratos-1
Eficiencia de remoción de DQO ( DQO)
DQO= [(SDQOin – SDQOout)/ SDQOin]*100
Donde:
DQO= Eficiencia de remoción de DQO (%)
SDQOin= Concentración de DQO a la entrada del reactor, en mg*L-1
SDQOout= Concentración de DQO a la salida del reactor, en mg*L-1
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Técnica de extracción de DNA
Para la extracción de DNA de la cepa de interés, se requiere necesariamente que se
encuentre pura para evitar interferencias. La extracción se llevó a cabo haciendo uso del kit
Ultraclean de MoBio Laboratories.
El principio de este método es lisar a los microorganismos por una combinación de calor,
detergente y fuerza mecánica. Los componentes celulares son lisados por acción mecánica
utilizando un vórtex estándar. El DNA obtenido de las células lisadas, es adsorbido en un
filtro de sílica. El filtro es lavado y el DNA es recobrado por elución en un Buffer Tris
certificado que está libre de DNA.
Purificación y concentración del DNA
El DNA es purificado con el fin de eliminar impurezas como lo es el RNA, proteínas,
nucleótidos, primers, polimerasas y sales empleadas durante la PCR. Se utilizó un kit de
reactivos PCR Purification kit, el cual consta de la siguiente metodología:
Selección y caracterización del soporte.
La selección es realizada en base a las propiedades que se deseen de este, como son, una
alta porosidad y resistencia, además de ser económico y fácil de obtener, teniendo
finalmente un proceso factible de escalamiento.
Caracterización del tezontle
La caracterización se realizó para garantizar la reproducibilidad del proceso, bajo las
mismas condiciones de operación como velocidad de dilución (D) y gasto de aire
suministrado.
Tres parámetros fueron determinados en la caracterización del soporte, estos son: densidad
aparente g, la densidad de la partícula r, y porosidad e
La forma en que se llevó a cabo la determinación se explica a continuación:
1. Utilizar una probeta de 100 mL a peso constante (ProC), llenar con fragmentos de
tezontle (libres de humedad) hasta alcanzar un volumen (VTezontle) de 50 mL.
2. Pesar la probeta con los fragmentos de tezontle (ProC+Tezontle), para así obtener la
densidad volumétrica, por una diferencia de pesos entre la probeta con fragmentos
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de tezontle y la probeta a peso constante, entre el volumen utilizado (en este caso 50
mL)
3. g = (ProC+Tezontle - ProC)/VTezontle
4. Aforar con agua a la ProC+Tezontle hasta llegar a un volumen final de 60 mL, (anotar
la cantidad de agua adicionada) y conectar esta a una bomba de vacío (sellar
perfectamente).
5. Encender la bomba por intervalos de 1 minuto a 2 minutos, repetir esta acción 5
veces aproximadamente, se observa la extracción de burbujas de aire, conforme el
vacío aumenta, hasta un punto en el que éstas casi se agotan. (este paso es a
consideración, ya que el tezontle tiene una porosidad entre 0.2-0.8, por lo que puede
requerir más tiempo).
Tratamiento del soporte
Con el fin de eliminar basura, partículas de polvo, insectos y pequeñas partículas de
tezontle (finos de tezontle) se procedió a realizar una serie de lavados al tezontle, una vez
que ya ha sido seleccionado en base a sus dimensiones, color y porosidad aparente.
Los lavados consisten en tres lavados con agua fría, con agitación moderada,
aproximadamente de 5 minutos cada uno, con el fin de retirar las partículas más grandes de
impurezas presentes.
El siguiente paso es realizar una serie de lavados con agua caliente intercalados con lavados
con agua fría. El lavado con agua caliente, se realizó sumergiendo y agitando
constantemente un lote de piedras de tezontle en agua a punto de ebullición por alrededor
de 20 minutos, después de este tiempo se procedió a retirar el agua caliente y se lavaron tres
veces más con agua fría agitando suavemente por tiempos de un minuto.
El ciclo anterior de lavado con agua caliente, se repitió dos veces más; se consideró que el
tezontle estaba limpio, cuando el agua de enjugue en ebullición ya no presentó “finos de
tezontle”, ni tampoco presente ningún tipo de coloración.
El tezontle lavado debe ser secado antes de su incorporación como soporte al biorreactor.
La esterilización del tezontle se realiza dentro del biorreactor.
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Biorreactor y condiciones de operación.
El reactor de lecho empacado consiste en una columna de vidrio con un diámetro interno de
3.6 cm, y un volumen total de 305 mL,, el cual se llenó con 150 mL de tezontle. El reactor
cuenta con una base y cabezal construidos de acero inoxidable tipo 304 y aluminio
comercial (Ver rediseño y construcción del reactor de lecho empacado en Resultados y
discusiones). Las conexiones entre el biorreactor, la botella de alimentación y la trampa de
aire, son de manguera de silicón aisladas con parafilm, para minimizar las pérdidas por
volatilización.
La alimentación de aire se realizó por la parte inferior del reactor, en flujo ascendente, el
aire fue previamente esterilizado por un filtro de membrana de 0.5 µm; y se mantuvo a un
flujo constante de 0.05 L aire*min-1
durante la saturación y las cinéticas de degradación. El
sistema se operó sin control de pH y a temperatura ambiente.
La alimentación de sustratos se realizó igualmente por la parte inferior del reactor. Las
tomas de muestra se encuentran, una a la entrada de alimentación del reactor, dos a lo largo
del cuerpo del reactor y una más a la salida del efluente del reactor.
Observación microscópica del tezontle con y sin biopelícula.
El tezontle utilizado como soporte para el crecimiento de la comunidad microbiana, fue
observado mediante un microscopio electrónico de barrido, con el fin de apreciar la
presencia y distribución de la levadura y bacterias fijadas al soporte.
Determinación del coeficiente global de transferencia de oxígeno (kla) en el biorreactor
con y sin soporte.
Para que un microorganismo aerobio pueda consumir oxígeno, se requiere que éste se
encuentre disuelto en la fase acuosa, donde las células se encuentran suspendidas. Debido a
su baja solubilidad y a su elevada demanda por una población celular en expansión, es
necesario que sea alta su velocidad de transferencia. La solubilidad máxima del O2 en agua
destilada bajo condiciones de la ciudad de México es de 5-5.5 mg O2/L.
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RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Caracterización del soporte
El reactor de lecho empacado (PBR por sus siglas en inglés) consiste en una columna de
vidrio Pirex, que se llena con aproximadamente 150 mL de fragmentos de tezontle el cual
tiene un volumen promedio de 0.88±0.43 cm3. Este valor fue estimado midiendo los tres
radios característicos (a,b,c) de 100 piedras y calculando sus volúmenes como si estos
fueran de una forma elipsoidal. Vs = 4(abc)/3. Los resultados se muestran en la Tabla 1.
Dimensiones promedio de las piedras de
tezontle
a (cm) b(cm) c(cm) Volumen
(cm3)
1.4519±0.2 0.8385±0.15 1.0927±0.22 0.88±0.43
Así también, se determinó la densidad aparente g, la densidad de partícula r, y la
porosidad e de los fragmentos de tezontle. Esta prueba se repitió un total de 18 veces,
obteniéndose los valores promedio, representados en la tabla 2.
Valores promedio g (g/cm3) r(g/cm
3) e
0.9002 ± 0.12 2.5276 ± 0.3 0.2216 ± 0.08
La importancia de tener las piedras del mismo tamaño es para garantizar la porosidad y
aireación parcialmente homogénea en todo el soporte y no se formen zonas de alta o baja
concentración de oxígeno y biomasa.
Pérdidas por volatilización
Es importante en cualquier experimento de remoción de compuestos volátiles, determinar
las pérdidas ocasionadas por la volatilización de los compuestos, para evitar falsos
positivos en el % de remoción.
Así en el sistema de degradación, se cuantificaron las pérdidas por volatilización
dividiéndolas en las pérdidas por volatilización en la botella de alimentación y pérdidas por
Tabla 2.- Valores promedio de la densidad aparente ( g); densidad de la partícula ( r) y porosidad (e).
Tabla 1.- Dimensiones promedio de las piedras de tezontle.
.
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volatilización en manguera de alimentación, las primeras se cuantificaron tomando
constantemente muestras en la botella y las segundas por las diferencias de concentración
entre la botella de alimentación y la entrada del reactor.
D (h-1
); concentración
sustratos (ppm) aprox. % Volatilización de Fenol
1 % Volatilización 2,6-DCF
1
Botella de
alimentación Manguera de
alimentación Botella de
alimentación Manguera de
alimentación 0.03516 (50 ppm 2,6-DCF;
300 ppm Fenol)
Saturación Sistema
- 10.10 - 32.65
0.03516 (50 ppm 2,6-DCF;
300 ppm Fenol)
0.47 9.93 1.94 20.28
0.07981 (50 ppm 2,6-DCF;
300 ppm Fenol)
1.54 8.82 5.05 26.02
0.11613 (50 ppm 2,6-DCF;
300 ppm Fenol)
- 9.38 -
23.04
0.03516 (50 ppm 2,6-DCF) NP NP 3.58 25.18
0.03516 (100 ppm 2,6-
DCF; 300 ppm Fenol)
- 10.4 - 16.78
1 Los valores de volatilización presentados fueron calculados en base a un tiempo de 12 a 14 días desde el
comienzo de la cinética en estudio.NP (compuesto No Presente); - (Datos no disponibles)
En la tabla 3 se muestran las pérdidas por volatilización en la botella de alimentación, que
se pueden considerar despreciables; en cambio, las pérdidas por volatilización en la
manguera de alimentación, son en la mayoría de los casos mayores al 20% para el 2,6-DCF
y del 10% para el fenol. La volatilización reportada en los experimentos de Steinle y col.,
2000; para sus determinaciones en matraces con 2,6-DCF únicamente fue del 12%, a los 9
días de la cinética, con una mineralización del 61% a los 5 días de la cinética (experimentos
con suelo contaminado e inoculado con Ralstonia brasilensis RK1).
El material del que está construido la manguera de alimentación, juega un papel muy
importante en la volatilización del 2,6-DCF, la manguera está elaborada con silicón, lo que
nos indica que no es el material adecuado para el transporte de este compuesto, ya que al
Tabla 3.- Perdidas por volatilización de fenol y 2,6-DCF en la botella y manguera de alimentación.
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parecer la volatilización, es debida a la alta permeabilidad que presenta la manguera al
compuesto.
Rediseño y construcción del Reactor de Lecho Empacado
El reactor de lecho empacado, fue rediseñado y construido para llevar a cabo la
degradación del 2,6-DCF en cometabolismo con fenol, por el Ing. Valentín Gómez Cruz, a
partir de un diseño previamente elaborado por el Dr. C. J. Juvencio Galíndez Mayer
Este reactor, con capacidad a nivel de laboratorio, tiene cinco tomas de muestra a lo largo
del cuerpo del reactor, realizadas mediante perforaciones circulares sobre el vidrio Pirex y
selladas por tapones de caucho, donde por medio de jeringas insertadas a través de los
tapones, es posible tomar las muestras.
El reactor está ensamblado de tal manera que se minimicen las fugas del medio de cultivo
en la base y tapa del reactor, así como para que pueda operarse sin necesidad de montarlo
completamente, (solo base y cuerpo del reactor) ya que el cierre hermético esta dado por un
doble sello mecánico (colocado tanto en la base como en la tapa del reactor); en vez de por
la presión ejercida por el peso del cabezal y la sujeción de tornillos aplicada en el anterior
reactor construido. Con esta modificación además, se puede tener la opción de destaparlo
para una toma de muestra sólida en una cinética de degradación, para una reinoculación,
chequeo del cabezal, etc.; sin peligro de fugas en su manipulación.
Las características del reactor se presentan en la siguiente tabla:
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Parámetro Dimensión/Característica
Diámetro interno (Di) 36 mm
Diámetro externo (De) 40 mm
Altura total del reactor (At) 450 mm
Altura del cuerpo del reactor (Ac) 300 mm
Relación Ac/Di 8.33
Volumen del reactor 305 mL
Volumen de operación 155 mL
Tipo de difusor Malla metálica
Tamaño de poro del difusor 1 mm2
Para su construcción se empleó acero inoxidable tipo 303, vidrio pirex y aluminio, este
último debido a que abarata los costos, es más ligero y maquinable.
La unión entre el cabezal y su base es roscada, así como la de las patas y las espigas; el tipo
de rosca es fina de 14 y 18 hilos por pulgada respectivamente, debido a que este tipo de
rosca ofrece un mejor cierre.
Saturación del soporte
Se llevó a cabo mediante la alimentación de una mezcla binaria, conteniendo
aproximadamente 300 ppm de fenol y 50 ppm de 2,6-DCF, a una velocidad de dilución
(D)= 0.03516 h-1
, se monitoreo la concentración a la entrada y a la salida del reactor,
cuando la concentración a la entrada y a la salida fueron iguales se consideró que el sistema
con tezontle estaba saturado.
Tabla 4.- Ficha técnica del biorreactor de lecho empacado.
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Figura 1.- Saturación del soporte. Se aprecia que a partir del día 10 la concentración de fenol y 2,6-DCF a la
entrada es igual que a la salida, llevándose a cabo la saturación del sistema.
En la figura 1 puede observarse como se comportó el sistema durante la saturación del
tezontle; en la parte superior de la figura se presenta la saturación del tezontle con fenol y
en la inferior con 2,6-DCF. La saturación del soporte para ambos compuestos se alcanzó
en el mismo periodo de tiempo (10 días). En la gráfica también se muestran las
concentraciones de fenol y 2,6-DCF a la entrada del reactor, que fueron del orden de 270
ppm y 37 ppm respectivamente, que son menores a la concentración determinada en la
botella de alimentación (290 ppm fenol y 50 ppm 2,6-DCF) debido a las pérdidas por
volatilización.
Las cinéticas de degradación de 2,6-DCF en cometabolismo con fenol se iniciaron una vez
que el tezontle estuvo saturado e inoculado en lote por 72 h con el cultivo microbiano
seleccionado, después se inició la alimentación de los sustratos (300 ppm fenol; 50 ppm
2,6-DCF pH 5.05, la alimentación fue en flujo ascendente, se tomaron muestras
periódicamente a la entrada del reactor (h0); salida del reactor (h3) y en la botella de
0
50
100
150
200
250
300
0 2 4 6 8 10 12 14
PP
M
DIAS
Saturación del tezontle a D = 0.03516 h^-1
Fenol entrada (ho) 2,6-DCF entrada (ho)
Concentración de fenol
constante
Concentración de 2,6-DCF
constante
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alimentación que fueron analizadas para determinar las concentraciones de fenol y 2,6-
DCF. La determinación de biomasa celular libre (cuenta viable, peso seco y absorbencia a
600 nm) se determinó a la muestra obtenida a la salida del reactor.
El reactor se operó a 5 diferentes velocidades de dilución para determinar la más apropiada
para remover el 2,6-DCF con mayor eficiencia. La primera velocidad de dilución (D=
0.03516 h-1
), así como la concentración de los sustratos de alimentación (300 ppm fenol; 50
ppm 2,6-DCF) fue fijada en base a trabajos previos (Salmerón, y col., 2007; De los Cobos-
Vasconcelos y col., 2005).
Cuando se trabajó a una D= 0.03516 h-1
, el cultivo mixto removió totalmente el fenol,
desde el primer día de la cinética de remoción. Se determinó que las pérdidas por
volatilización en la botella son prácticamente despreciables, mientras que las pérdidas por
volatilización ocasionadas por el transporte del medio de cultivo desde la botella de
alimentación hasta la entrada del reactor, son relativamente altas y son consideradas en los
cálculos de los parámetros cinéticos.
El tiempo necesario para que la concentración del 2,6-DCF a la salida del reactor fuera
constante, fue usado para calcular el número de cambios del volumen líquido para llegar al
estado de equilibrio dinámico en un sistema trifásico (líquido- sólido- gas).
La concentración de células libres medida en el estado de equilibrio dinamico, fue
considerablemente alta, de 4.03 x E9 CFU*mL
-1.
A partir del análisis de las muestras tomadas a diferentes alturas del reactor (h1, h2, h3), se
determinó la formación de un gradiente de concentración de fenol dentro del reactor, en el
que la concentración disminuye conforme aumenta la altura del lecho empacado.
Degradación de 2,6-DCF cuando se utilizó como única fuente de carbono y energía a
D = 0.03516 h-1
Se realizó una cinética de degradación alimentando 2,6-DCF como única fuente de carbono
y energía, para determinar la capacidad de la comunidad microbiana de trabajar en ausencia
de fenol (sustrato primario). El sistema previamente estuvo operando a una D= 0.07981 h-1
.
Se observó que al retirar el fenol del sistema de degradación, el 2,6-DCF residual va
acercándose gradualmente al valor del 2,6-DCF a la entrada del reactor. De acuerdo al
análisis realizado a muestras tomadas a diferentes alturas del reactor, en el primer tercio del
16
reactor (h1= 10 cm) el sistema es incapaz de removerlo y la concentración se incrementa,
hasta el día 8 en que las concentraciones en la entrada (h=0 y en primera altura (h=10 cm)
se igualan, llevándose a cabo sólo una remoción parcial del 2,6-DCF en las dos últimas
partes del reactor. Posteriomente el sistema llegó a un punto tal (día 12) donde se colapsa y
las concentraciones a la entrada y a la salida del sistema se igualan.
Comparación de los parámetros cinéticos evaluados a diferentes velocidades de
dilución en el reactor de lecho empacado con tezontle.
Con la finalidad de visualizar de forma global los parámetros cinéticos evaluados a cada
velocidad de dilución probada, se muestran de manera resumida datos como Tiempo de
Retención Hidráulica (HRT), Eficiencia (ε) de remoción y Velocidad volumétrica de
Remoción (R) para fenol y 2,6-DCF, así como recuento de Unidades Formadoras de
Colonias (UFC /mL) en células libres, Eficiencia global de remoción de DQO y Número de
cambios para llegar al estado de equilibrio dinámico (Css) (Tabla 5).
D
Velocidad
de
dilución
h-1
HRT
Tiempo de
Retención
Hidráulica
h
Fe Eficiencia
de
Remoción
de fenol
(%)
2,6-DCF Eficiencia
de
remoción
de 2,6-
DCF (%)
RFe Velocidad
volumétrica
de remoción
de fenol
mg Fe*L-1*h-
1
R2,6-DCF Velocidad
volumétrica
de remoción
de 2,6-DCF
mg 2,6-
DCF*L-1*h-1
DQO
Eficiencia
global de
remoción
de DQO
(%)
UFC*
mL-1 Css Número de
cambios
para llegar
al estado de
equilibrio
dinámico
0.035161
28.44 100 100 8.94 1.44 96.49 4.03E9 9.28
0.079811
12.53 100 55.86 22.01 1.64 94.81 4.52E7 15.32
0.11611
8.61 100 16.28 31.88 0.68 90.91 1.92E7 13.93
0.035163 28.44 - 3.494 - 0.047 4.02 - 10.12
0.035162
28.44 100 46.44 10.10 1.52 92.802 3.48E7 21.09
1Concentración de alimentación, 300 ppm fenol; 50 ppm 2,6-DCF
2Concentración de alimentación, 300 ppm fenol; 100 ppm 2,6-DCF
3Concentración de alimentación, 0 ppm fenol; 50 ppm 2,6-DCF
La disminución de la eficiencia de remoción del 2,6-DCF ( 2,6-DCF ) cuando las velocidades
de dilución se incrementaron, puede atribuirse a sus efectos inhibitorios, ya que éste puede
afectar la producción de energía de las células por inhibición del transporte de electrones o
colapsando el gradiente electroquímico de protones construido a través de las membranas.
Tabla 5.- Comparación de los parámetros cinéticos evaluados a cada velocidad de dilución.
17
Este último modo de acción tóxica es comúnmente referido como un desacoplante de la
fosforilación oxidativa o fotofosforilación (Escher, y col.. 1996,Steinle, y col., 2000). El
decaimiento en la producción de energía también afecta el rendimiento celular, como se
observa en los resultados de conteo celular, éste efecto fue reportado anteriormente por
Salmerón y col (2007).
Otra causa que pudo provocar la disminución en la eficiencia de remoción 2,6-DCF es que
la comunidad no está sujeta a una efectiva presión de selección, ya que velocidad de
suministro de fenol es muy alta al aumentar D, debido a esto el cultivo mixto no necesita
degradar el 2,6-DCF como fuente de carbono y energía y usa el sustrato menos inhibitorio
(fenol). Este hecho es congruente con lo encontrado por Pal, y col. (1995), quienes usaron a
Phanerochaete chrysosporium para degradar cometabólicamente 2,4,6-TCF en presencia de
glucosa y sus resultados muestran que una fuente de carbono de fácil asimilación (glucosa)
suprime la actividad metabólica microbiana y su capacidad sobre la degradación del 2,4,6-
TCF (mencionado por Leyva,2007).
Por otro lado, debido al análisis que se realizó a diferentes alturas del lecho empacado, se
puede concluir que ésta última no es la causa que provocó la disminución en la eficiencia
de remoción del 2,6-DCF, ya que el fenol fue consumido prácticamente en la primera parte
del lecho empacado (primeros 10 cm de altura), por lo que en los dos últimos tercios del
reactor la única fuente de carbono y energía fue el 2,6-DCF y los intermediarios formados
en la degradación del fenol y del mismo 2,6-DCF, por lo que puede concluirse que son los
efectos inhibitorio y descoplante del 2,6-DCF los que provocan una disminución en la
degradación por la comunidad microbiana.
Como se comentó, la remoción del 2,6-DCF llevada a cabo por los dos últimos tercios del
reactor fue mucho menor a la lograda en el primer tercio, por lo que la idea de una carencia
de una verdadera presión de selección para el cultivo microbiano puede eliminarse y más
aún, se puede afirmar que el comunidad microbiana sólo puede degradar el 2,6-DCF en
presencia de un sustrato primario, idea que es apoyada por los resultados arrojados de la
cinética de 2,6-DCF como única fuente de carbono y energía, en donde la eficiencia de
remoción del 2,6-DCF es prácticamente nula provocándose un choque tóxico en el sistema.
Es importante mencionar que el sistema necesitó hasta 15 cambios en el volumen líquido
del reactor en las tres primeras velocidades de dilución mostradas en la tabla 5, para
18
asegurar que éste llegó al estado de equilibrio dinámico. Este resultado es cerca de 5 veces
más grande que de un biorreactor continuo homogéneo común (cerca de tres cambios de
volumen) y 5 días para el primero, segundo y tercera D probada, bajo estas condiciones de
alimentación (300 ppm fenol, 50 ppm 2,6-DCF).
En el caso de las velocidades de dilución 4 y 5, el número de cambios en el volumen
líquido del reactor para llegar al estado de equilibrio dinámico fueron 10 y 21
respectivamente, cabe aclarar que en velocidad de dilución 4 los 10 volúmenes de recambio
fueron los necesarios para colapsar por completo el reactor, impidiendo la remoción del
2,6-DCF. En cuanto a la velocidad de dilución 5, se observa que el número de recambios
fue de 21, poco más del doble de los necesitados para la velocidad de dilución 1, que está a
la mitad de la concentración de 2,6-DCF presente en la velocidad de dilución 5. El carácter
heterogéneo del reactor de lecho empacado puede ser una explicación para este hecho.
Además se observó que el porciento de remoción de DQO disminuye cuando se incrementa
la concentración del 2,6-DCF en la alimentación, debido tal vez a los efectos tóxicos del
2,6-DCF a altas concentraciones, como lo menciona Eker y col. (2008) para su cinética de
degradación de 2,4-DCF, en un reactor de biopelícula de cepillos giratorios.
La velocidad volumétrica de remoción de Fenol (RFe) se incrementa con el incremento de
D, pero en el caso de la velocidad volumétrica de remoción del 2,6-DCF (R2,6-DCF) el
comportamiento es diferente ya que se incrementó con el aumento de D hasta 0.07981 h-1
, y
disminuye cuando aumentó D = 0.1161 h-1
. Estos resultados muestran que puede ser
posible incrementar el valor de D, incrementando el valor de RFe, pero disminuyendo la
2,6-DCF, que no es el objetivo de este trabajo. Debido a ésto, la velocidad de dilución más
apropiada (dentro de las cinco evaluadas) para realizar la degradación cometabólica del 2,6-
DCF en el reactor de lecho empacado, es 0.03516 h-1
a las condiciones de alimentación de
300 ppm fenol, 50 ppm 2,6-DCF.
19
Identificación de la segunda bacteria presente en el reactor de lecho empacado,
mediante técnicas biología molecular.
La extracción de DNA se llevó a cabo utilizando el Ultra Clean Microbial DNA Isolation
kit MO BIO Laboratories, Inc., llevando a cabo los pasos como se menciona en la
metodología general, probando además con una variante sugerida en el mismo kit.
Amplificación del DNA
La amplificación del DNA extraído se realizó mediante la utilización de 3 pares de primers
diferentes, esto con el fin de ver con cual se amplificaba mejor el 16S rDNA y éste sea
utilizado en la posterior purificación. Se colocó un marcador de peso molecular de 2000 kb,
con el fin de comprobar el tamaño de la banda amplificada
Para la amplificación se utilizaron los primers FD1R6, 4FPLMVZ2 y 4FPLM13B
respectivamente.
Clave cepa
aislada
Acceso
GeneBank
% Homología Nombre de la cepa homologa
DQ993325.1 97 Bacillus sp.
939
EU878231.1 97 Pseudomonas sp.
AM088475.1 97 Pseudomonas azelaica
Según diversos reportes se ha encontrado que el género Pseudomonas es el más reconocido
para la biodegradación de compuestos fenólicos como lo menciona El-Sayed (2003), ya que
se encuentra abundantemente en casi todos los suelos, comenzando por los de cultivo; o
como lo menciona Golovleva y col. (1990), que comenta que las Pseudomonas son las
bacterias más eficientes en la degradación de compuestos tóxicos y que la capacidad para
degradar estos compuestos depende del tiempo de contacto con el compuesto, las
condiciones ambientales en las que se desarrollen y su versatilidad fisiológica.
Tabla 6.- Identificación de la bacteria desconocida integrante del cultivo mixto. La tabla muestra las
cepas con más alta homología con los microorganismos desconocidos.
20
Determinación de células libres (desorbidas) en el sistema empacado y su proporción
en la comunidad a diferentes velocidad de dilución.
Por otro lado se determinó el crecimiento celular determinando el número de Unidades
Formadoras de Colonias por mililitro de efluente (células libres), a cada velocidad de
dilución probada (Tabla 7), con el fin de monitorear el crecimiento poblacional de la
comunidad microbiana utilizada. Esta determinación además sirvió para obtener
información respecto a la presencia y proporción de cada cepa en el efluente del reactor,
considerando la morfología colonial de los microorganismos (en agar cuenta estándar) que
integran el cultivo mixto empleado para la degradación del fenol y los clorofenoles. (nota:
los datos mostrados son aproximados).
Velocidad de dilución
(D[=] h-1
)
UFC/mL %
Microbacterium
phillosphareae
%
Candida
tropicalis
%
Bacillus
sp.
0.03516 (50 ppm 2,6-DCF; 300 ppm Fenol) 4.03E9 84.90 8.00 7.10
0.07981 (50 ppm 2,6-DCF; 300 ppm Fenol) 4.52E7 86.19 6.70 7.11
0.11613 (50 ppm 2,6-DCF; 300 ppm Fenol) 1.92E7 91.66 6.25 2.08
La cepa que predominó en el efluente durante la remoción del 2,6-DCF en todas las
velocidades de dilución probadas fue la M. phyllosphaerae presente en porcentajes
superiores al 84% incrementándose su porcentaje cuando se aumentó la velocidad de
dilución.
Tabla 7.- Recuento de las Unidades Formadoras de Colonias por mililitro (UFC/mL) y proporción de
cada cepa en el cultivo mixto, calculadas en estado de equilibrio dinámico a cada velocidad de dilución
(D). Pruebas realizadas por triplicado.
21
Determinación del coeficiente global de transferencia de oxígeno (Kla) en el reactor a
diferentes flujos de aire ((Qg).
Parte de la caracterización de un biorreactor es la determinación del coeficiente global de
transferencia de oxígeno (Kla), que es un medida de la velocidad de transferencia de
oxígeno en el reactor. Este parámetro junto con el OTR (Oxygen Transfer Rate) nos sirven
para seleccionar el flujo de alimentación de aire más adecuado para que en el sistema no
presente limitaciones por oxígeno.
Para obtener los Kla en función del suministro de aire, se obtuvieron las curvas de variación
de la concentración de oxígeno disuelto (CL) en el medio líquido contenido en el reactor en
función del el flujo de aire suministrado de aire (Qg).
Las gráficas para cada uno de los gastos de aire, pueden apreciarse a detalle en el anexo A,
al final del documento, donde se especifica el coeficiente de correlación obtenido y la
pendiente de cada gráfica.
Los valores obtenidos del Kla a cada gasto de aire están condensados en la siguiente tabla:
LPM aire Kla (h-1
) Ug (cm*s-1
)
0.05 29.88 0.081
0.15 72 0.245
0.25 72 0.409
0.35 111.6 0.573
0.45 122.4 0.737
0.6 144 0.982
0.8 154.8 1.309
Comparación entre el Kla obtenido en el reactor a) con y sin soporte en medio mineral
y b) sin soporte con agua destilada y medio mineral.
Se determinó el Kla en el reactor con tezontle y sin tezontle ambos en medio mínimo
mineral con la finalidad de determinar la forma en que éste era afectado por el soporte. Para
determinar el efecto de las sales del medio de cultivo se determinó el Kla en el sistema sin
soporte empleando en un caso medio mineral y en otro únicamente agua destilada.
Tabla 8.- Estimación del Kla y el Ug a diferentes gastos de aire. El Kla obtenido al flujo de 0.05 LPM
aire, fue el utilizado durante todas las cinéticas de degradación.
22
En el sistema se encontró que el Kla se incrementó ligeramente con la presencia de las sales
minerales, ésto puede explicarse por la disminución del fenómeno de coalescencia por la
presencia de las sales del medio incrementándose por consiguiente la velocidad de
transferencia de oxígeno.
Gasto de aire =0.05 LPM Kla (h-1)
Biorreactor c/tezontle y medio mineral 29.88 Biorreactor s/tezontle y medio mineral 10.44 Biorreactor s/tezontle y agua destilada 10.8
Formación de la biopelícula en el soporte (tezontle)
La formación de la biopelícula en el biorreactor fue un proceso que empezó a notarse a
partir de dos semanas de operación y depende en gran parte del tamaño del inóculo, la
porosidad del soporte, la velocidad de dilución manejada, concentración de oxígeno
disuelto, la concentración del medio de alimentación y las condiciones óptimas para el
crecimiento de los microorganismos (pH, acidez, temperatura).
En este estudio en particular, se propició la generación de la biopelícula rápidamente al
utilizar un soporte altamente poroso como el tezontle eprom = 0.2216, con el fin de que los
microorganismos se adsorbieran con mayor facilidad al presentar el soporte infinidad de
cavernas (véase fotografías en microscopio de barrido); el tamaño del inóculo fue mayor al
recomendado (> al 10 % del volumen de operación) considerando que se trataba de un
sustrato altamente recalcitrante (2,6-DCF), permitiendo que se adsorbieran los
microorganismos ya que después de la inoculación del reactor empacado éste permaneció
en lote por 72 h.
La velocidad de dilución manejada durante la primera cinética de degradación, fue la más
baja posible dada por la bomba de alimentación y que además es la más cercana a la
utilizada en trabajos previos (Salmerón, 2007; D = 0.018 h-1
), esto para evitar en lo posible
el lavado del biorreactor.
La concentración de los sustratos en la alimentación se seleccionó de acuerdo a los valores
empleados por Salmerón y col. (2007), que fueron de 50 ppm de 2,6-DCF y 300 ppm de
fenol, la degradación fue por cometabolismo debido a que la comunidad microbiana no fue
Tabla 9.- Comparación entre el Kla obtenido en la parte superior del Biorreactor, a una velocidad de
alimentación de aire de 0.05 LPM bajo tres diferentes condiciones.
23
capaz de crecer en un medio con 2,6-DCF como única fuente de carbono y energía (Ver
resultados), además de que el espesor de la biopelícula disminuye drásticamente al
alimentar al sistema únicamente 2,6-diclorofenol.
El espesor de la biopelícula en el biorreactor, disminuyó con el aumento en la altura del
lecho, ésto puede explicarse porque, el fenol alimentado se consumió totalmente en el
primer tercio del reactor, por lo que al segundo y último tercio el único sustrato fue el 2,6-
DCF e intermediarios formados en el primer tercio, por lo que el crecimiento de la
biopelícula no es favorecido bajo esta condiciones.
Cabe notar que una gran cantidad de biomasa creció en toda la superficie del difusor,
pudiendo ser esto un problema para la distribución del oxígeno a lo largo del biorreactor.
Características de la biopelícula
Entre las características de la biopelícula que se pueden apreciar es que el cultivo mixto se
adsorbió tanto en superficies muy porosas (tezontle) como en superficies lisas (vidrio del
cuerpo del biorreactor), que al desprenderse se separa fácilmente por sedimentación, es de
un color grisáceo cuando se alimentan continuamente los sustratos y hay suministro de aire,
pero se torna color café en cuanto se encuentra limitada por sustrato o por oxígeno.
Crecimiento de la biopelícula fijada al soporte
El recuento de unidades formadoras de colonias fijadas al soporte, se realizó a cuatro
alturas del biorreactor ho h1, h2 y h3, que son respectivamente a la altura del difusor, h0=0
cm; h1=10 cm, h2= 20 cm y h3=30 cm o altura final del reactor, respectivamente. Los
resultados son reportados en UFC/g tezontlebase húmeda y UFC/g tezontlebase seca , esta
determinación se llevó a cabo hasta el momento en que se desmontó el reactor.
Se determinó que el Número de Unidades Formadoras de colonias por gramo de soporte,
decrece conforme aumenta la altura del reactor, desde hd hasta h2 (Tabla 10), este
comportamiento es lógico debido a que la concentración de sustratos conforme aumenta la
altura disminuye, por lo que los microorganismos son limitados en su crecimiento. Cabe
mencionar que de la altura h2 a la altura h3 del biorreactor, hay un incremento en las UFC/ g
tezontle, esto coincide con los datos reportados de biomasa libre medida por absorbencia a
600 nm, que nos muestra que a la altura h3, se concentra la mayor parte de las células
24
desorbidas, en comparación con las alturas h1 y h2; esto puede ser debido a que la biomasa
libre es arrastrada por las burbujas de aire, acumulándose en la tapa del reactor, por lo que
no se puede obtener un valor fiable de la concentración celular en el medio líquido de
cultivo, ya que este no es homogéneo.
Altura toma de muestra UFC/g tezontlebase h UFC/g tezontlebase s
hd 7.002E7 8.100E7
h1 3.709E7 4.892E7
h2 1.635E7 2.792E7
h3 2.833E7 3.220E7
Determinación de Nitrógeno Total (NT) y Proteínas de la biopelícula adherida al
soporte en el reactor evaluado a diferentes alturas.
Al igual que la determinación de las UFC/g tezontle, se realizó la determinación del
nitrógeno total en la muestra así como la de proteína presente por gramo de tezontle a las
cuatro alturas mencionadas para las UFC/g tezontle (Tabla 11). El comportamiento
observado en la cuantificación de UFC/ g tezontle, es ratificado con este par de
determinaciones, donde se observa que la concentración de nitrógeno total y proteína,
decrece conforme aumenta la altura del reactor, desde h0 hasta h2, viéndose que en h3 hay
un incremento sustancioso, respecto a h2 que como se mencionó anteriormente se debió a la
acumulación de biomasa en la parte final del reactor.
Altura de la
muestra
mg NT/g tezontle
húmedo
mg NT/g
tezontle seco
mg proteína/g
tezontle húmedo
mg proteína/g
tezontle seco
h0 38.306 44.272 0.126 0.145
h1 22.053 26.027 0.081 0.095
h2 12.918 14.538 0.041 0.047
h3 31.353 41.446 0.103 0.137
Tabla 10.- Cuantificación de las UFC/mL adsorbidas por el tezontle reportadas en base húmeda y en
base seca, la determinación se llevó a cabo a cuatro alturas en el biorreactor a hd (0 cm); h1 (10 cm); h2
(20 cm) y h3 (30 cm).
Tabla 11.- Cuantificación de la concentración de Nitrógeno total y proteína por gramo de tezontle reportadas
en base húmeda y en base seca, la determinación se llevó a cabo a cuatro alturas en el biorreactor a h0 (0 cm);
h1 (10 cm); h2 (20 cm) y h3 (30 cm).
25
Análisis de la fotografías por microscopio electrónico de barrido
Se obtuvieron imágenes de las cepas componentes del cultivo mixto, después de realizar las
cinéticas de degradación, mediante toma de fotografías por un microscopio de barrido, las
fotografías fueron tomadas en muestras de piedras representativas de cada altura del
reactor, con el fin de observar cambios en la composición poblacional, tanto en
concentración como predominio de alguna de las cepas.
Figura 2.- Microfotografía del tezontle a la altura h0, a 2,000 aumentos.
Figura 3 .- Microfotografía del tezontle a la altura h1, a 2,000 aumentos.
26
Las figuras 2 y 3 muestran una claro predominio de las levaduras (Candida tropicalis) en la
superficie de los fragmentos de tezontle, éstas deben de fijarse fuertemente al soporte del
reactor, ya que en la composición poblacional calculada por cuenta viable de las células
libres en las muestras a la salida del reactor, la proporción es baja, de alrededor de un 6 %
comparado con las células desorbidas del tezontle.
Pudo observarse que se presentó una disminución de la comunidad microbiana al ser mayor
la distancia entre la toma de muestra y el punto de alimentación de sustratos al reactor. La
cantidad de levaduras disminuye de la primera altura, ho (0 cm) a h2 (20 cm).
De las fotografías presentadas pudimos concluir que es C. tropicalis es la que predomina en
la biopelícula que se adhiere al tezontle y la proporción en la que se presentan las bacterias
es muy baja, siendo M. phyllosphaerae la que se desorbe casi totalmente 92% (a una
D=0.116 h-1
), este puede ser un hecho de gran importancia en la degradación, ya que fue
esta cepa la que predominó en el sistema continuo con células libre empleado por Salmerón
y col. (2007) obteniéndose eficiencias de remoción elevadas.
La desorción de la M. phyllosphaerae que se incrementó con la velocidad de dilución (de
0.035 a 0.116 h-1
) es una causa probable de la disminución de la eficiencia de remoción del
2,6-DCF, ya que se había reportado como la cepa que predominaba en el proceso de
degradación del 2-6-DCF.
IMPACTO.
La contaminación del ambiente agua, aire y suelos se incrementa de manera alarmante, por
lo que es necesario implementar tecnologías limpias para detener este proceso, el caso del
agua representa un grave problema ya que sabemos que es fundamental para todo ser vivo y
debemos diseñar y evaluar sistemas de tratamiento para remover este tipo de
contaminantes; la aplicación de estos sistemas de tratamiento de efluentes se debe realizar
en las industrias que los generan para evitar en lo posible la contaminación del ambiente
con compuestos potencialmente cancerígenos como los clorofenoles.
Las aportaciones de esta investigación sirven además para crear una educación de los
estudiantes y de la sociedad sobre los cuidados que deberíamos tener para crear un medio
ambiente sano.
27
8. CONCLUSIONES
Las pérdidas por volatilización del fenol y 2,6-DCF en el reactor fueron
despreciables, pero la alta volatilización del 2,6-DCF, a través de las mangueras es
considerable.
El fenol utilizado como sustrato primario fue removido completamente para todas
las velocidades de dilución (D) probadas en este estudio.
La comunidad microbiana fue capaz de remover por cometabolismo el 2,6-DCF con
un 100% de eficiencia únicamente cuando el sistema empacado con tezontle opera a
bajas velocidades de dilución.
La comunidad microbiana formada por Microbacterium phillosphareae, Candida
tropicalis y Bacillus sp. utilizada en este estudio, no fue capaz de utilizar el 2,6-
DCF como única fuente de carbono y energía.
El fenol fue removido completamente en el primer tercio del lecho empacado del
biorreactor y es únicamente en esta parte del sistema donde se removió el 2,6-DCF,
por lo que fue necesaria la presencia del fenol como sustrato primario.
La cepa que presentó una mayor capacidad de adsorción al soporte durante la
degradación fue Candida tropicalis y la que se desorbió en una mayor proporción.
La velocidad de desorción de la bacteria Microbacterium phyllosphaerae fue mayor
cuando se incrementó la velocidad de dilución del 84 al 92% disminuyéndose
también la eficiencia de remoción del 2,6-DCF.
Aunque el gasto de aire utilizado en este estudio, refleja un Kla bajo en el reactor, se
considera que no fue factor determinante en los bajos porcentajes de remoción del
2,6-DCF.