biodegradación de las cloroacetanilidas en aguas

Biodegradación de las cloroacetanilidas en aguas utilizando consorcios bacterianos mesofílicos

Ing. Boris Guzmán Martínez

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

Escuela Superior de Ingeniería Química e Industrias Extractivas

Sección de Estudios de Posgrado e Investigación

Departamento de Ingeniería Química

Ciudad de México, México

2017

II Biodegradación de las cloroacetanilidas en aguas utilizando consorcios bacterianos mesofílicos

Ing. Boris Guzmán Martínez

Tesis de investigación presentada como requisito parcial para optar al título de:

Maestro en Ciencias en Ingeniería Química

Director:

Dr. José Javier Castro Arellano Jefe Laboratorio Operaciones Unitarias SEPI-ESIQIE

Codirector:

Dr. Enrique Rico Arzate Profesor Externo Asociado, Linea de Ingeniería Química Ambiental, ESIQIE

Línea de Investigación: Ingeniería Química Ambiental

Grupo de Investigación: Laboratorio de Operaciones Unitarias SEPI Posgrado

INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL Escuela Superior de Ingeniería Química e Industrias Extractivas

Sección de Estudios de Posgrado e Investigación Departamento de Ingeniería Química

Ciudad de México, México 2017

Biodegradación de las cloroacetanilidas en aguas utilizando consorcios

bacterianos mesofílicos


III

IV Biodegradación de las cloroacetanilidas en aguas utilizando consorcios bacterianos mesofílicos


V

La investigación presentada en esta tesis ha sido financiada por la Beca otorgada

por CONACYT 715493/590910 y el proyecto BEIFI 20171222.

VI Biodegradación de las cloroacetanilidas en aguas utilizando consorcios bacterianos mesofílicos

Dedicatoria

Quisiera dedicar la finalización de esta tesis a todas aquellas personas que me han acompañado y facilitado su apoyo, consejo y ánimo a lo largo de este proceso, sin las cuales no hubiera sido posible lograr este objetivo. Hago extensivos estos agradecimientos a los profesores de la sección de estudios de Posgrado de la Escuela Superior de Ingeniería Química por facilitarme la integración en el Departamento y hacerme sentir una compañero más durante estos años de desarrollo de mi beca. A todos y cada uno de los investigadores estudiantes que han colaborado en los diversos paneles de expertos, seminarios, por el interés que han puesto en esta investigación y las valiosas sugerencias aportadas. Igualmente, a los alumnos que integran el Laboratorio de Termodinámica Avanzada, por su valiosa colaboración. Gracias por vuestro entusiasmo y buena disposición. Un recuerdo especial a mis padres por su eterna entrega y capacidad para mantener la ilusión por una meta alcanzable y porque han sido una indudable referencia y guía durante estos años. Espero continuar sus pasos. Tampoco puedo dejar de agradecer a mi hermano, cuñados, a mis segundos padres Don Gustavo y Sra Zenaida porque aún desde la distancia he recibido incondicional apoyo y cariño. En este mundo global, las relaciones no se miden por la distancia física sino por la cercanía emocional. A todos los amigos y compañeros de México y Colombia que en algún momento han sufrido los efectos de escribir una tesis, por su apoyo y escucha en los momentos de estrés. Dedico también esta tesis a todos aquellos que no creyeron en mí, a aquellos que esperaban mi fracaso en cada paso que daba hacia la culminación de mis estudios, a aquellos que nunca esperaban que lograra terminar esta etapa de mi vida, a todos aquellos que aposaban a que me rendiría a medio camino, a todos los que supusieron que no lo lograría, a todos ellos les dedico esta tesis Por último, a Margarita y María Fernanda, mis dos amores, por la incomparable mezcla de paciencia, amor, comprensión, cariño y sentido del humor desde fuera y en México. Confío en poder acompañarlas en sus proyectos futuros tal y como ustedes lo han hecho conmigo. Seguimos caminando juntos como familia. Desde estas páginas, un recuerdo muy especial para todos y todas. “La preocupación por el hombre y su destino siempre debe ser el interés primordial de todo esfuerzo técnico. Nunca olvides esto entre tus diagramas y ecuaciones.”Albert Einstein

«Llegará una época en la que una investigación diligente y prolongada sacará a la luz cosas que

hoy están ocultas. La vida de una sola persona, aunque estuviera toda ella dedicada al cielo, sería

insuficiente para investigar una materia tan vasta [...]. Por lo tanto este conocimiento sólo se podrá

desarrollar a lo largo de sucesivas edades. Llegará una época en la que nuestros descendientes se

asombrarán de que ignoramos cosas que para ellos son tan claras... Muchos son los

descubrimientos reservados para las épocas futuras, cuando se haya borrado el recuerdo de

nosotros. Nuestro universo sería una cosa muy limitada si no ofreciera a cada época algo que

investigar... La naturaleza no revela sus misterios de una vez para siempre.»

Séneca. Cuestiones naturales, libro 7, siglo I


VII

Agradecimientos

Al finalizar un trabajo de investigación tan arduo y lleno de dificultades como el desarrollo

de una tesis, es inevitable que te asalte un muy humano egocentrismo que te lleva a

concentrar la mayor parte del mérito en el aporte que has hecho. Sin embargo, análisis

objetivo te muestra inmediatamente que la magnitud de ese aporte hubiese sido imposible

sin la participación de personas e instituciones que han facilitado las cosas para que este

trabajo llegue a un feliz término. Por ello, es para mí un verdadero placer utilizar este

espacio para ser justo y consecuente con ellas, expresándoles mis agradecimientos.

Debo agradecer de manera especial y sincera al Profesor José Javier Castro

Arellano, por aceptarme para realizar esta tesis bajo su dirección. Su apoyo y confianza en

mi trabajo y su capacidad para guiar mis ideas han sido un aporte invaluable, no solamente

en el desarrollo de esta tesis, sino también en mi formación como investigador. Las ideas

propias, siempre enmarcadas en su orientación y rigurosidad, han sido la clave del buen

trabajo que hemos realizado juntos, el cual no se puede concebir sin su siempre oportuna

participación. Le agradezco también el haberme facilitado los medios suficientes para llevar

a cabo todas las actividades propuestas durante el desarrollo de esta tesis. Muchas gracias

profesor y espero verlo pronto en Medellín.

Quiero expresar también mi sincero agradecimiento al Dr. Luis Alejandro Galicia

Luna, por su importante aporte y participación activa en desarrollo de esta tesis. Debo

destacar, por encima de todo, su disponibilidad y paciencia que hizo que nuestras siempre

acaloradas discusiones redundaran benéficamente tanto a nivel científico como personal.

No cabe duda que su participación ha enriquecido el trabajo realizado y además. Ha

significado el surgimiento de una amistad. A ti también espero verte en mi ciudad,

VIII Biodegradación de las cloroacetanilidas en aguas utilizando consorcios bacterianos mesofílicos

Por último y no menos importante, agradecer a CONACYT, a los directivos y funcionarios

administrativos y cuerpo docente de la gloriosa ESIQIE, al Ingeniero Gerardo de los

Santos, y de las entidades: Organismo Descentralizado de Tlalnepantla, Procuraduría

General de Justicia de la ciudad de México, al Instituto Mexicano de Tecnología del Agua,

a Perkin Elmer, a los profesores que integran el Laboratorio Mario Molina, de la Facultad

de Química de la UNAM.

Contenido IX

Resumen

En este trabajo se presenta la biodegradación de cloroacetanilidas: alaclor (2-cloro-N- (2,6-

dietilfenil) -N- (metoximetil) acetamida) y metolacloro (2-cloro-2 ', 6'-dietil-

Metoximetilacetanilida); y carboxiamidas cloradas; Estos herbicidas son pre-emergentes y

los más restringidos en la legislación ambiental vigente, y desgraciadamente los más

utilizados en el mundo. El problema ambiental con los xenobióticos clorados es que se

acumulan tanto en suelos como en aguas, especialmente en las aguas lénticas, y por sus

efectos sobre la salud, siendo disruptores endocrinos y mutagénicos, los ubican

normativamente dentro de los contaminantes emergentes prioritarios para ser degradados.

Por esta razón, existe la necesidad de buscar alternativas para la degradación de estos

compuestos entre los que, de acuerdo con la bibliografía abierta, se obtuvieron procesos

de degradación fisicoquímica y microbiológica. La investigación se realizó a escala de

laboratorio, utilizando agregados bacterianos (Px y Mx) para tratar agua tipo sintética (300

ppm organoclorado). A partir de los resultados encontrados, se proponen posibles

mecanismos de degradación utilizados por estos consorcios y se verifica la mineralización

del agente químico. Se obtuvo la selección de los consorcios bacterianos (entre 60 a través

Bioquímica y Proteómica), Se identificaron los principales grupos bacterianos participantes

que mostraron propiedades competitivas sinérgicas en la biodegradación, y en

comparación con los reportados en la literatura abierta en sistemas similares (Degradación

superior al 95% a los 10 días) , Las pruebas de ecotoxicidad del agua se llevaron a cabo

bajo normas internacionales (Vibrio fisherii) confirmaron la remediación lograda, resultados

que servirán de base para el desarrollo de la solución del problema planteado.

Palabras Claves: Cloroacetanilida, consorcio, xenobiótico, Vibrio, DQO, COT

X Biodegradación de las cloroacetanilidas en aguas

utilizando consorcios bacterianos mesofílicos

Abstract

. This work presents the biodegradation of chloroacetanilides: alachlor (2-chloro-N- (2,6-

diethylphenyl) -N- (methoxymethyl) acetamide) and metolachlor (2-chloro-2 ', 6'-diethyl-

methoxymethylacetanilide) ; And chlorinated carboxyamides; These herbicides are pre-

emergent and the most restricted in current legislation, and unfortunately the most widely

used in the world. The environmental problem with chlorinated xenobiotics is that they

accumulate both in soils and waters, especially in lentic waters, and because their effects

on health, being endocrine and mutagenic disruptors, place them normatively within the

priority emerging pollutants to be degraded. For this reason, there is a need to search for

alternatives for the degradation of these compounds among which, according to the open

literature, processes of physicochemical and microbiological degradation were obtained.

The research was carried out on a laboratory scale, using bacterial aggregates (Px and Mx)

to treat contaminated oligotrophic water (300 ppm organochlorine). From the results found,

possible mechanisms of degradation are proposed by these consortia and the

mineralization of the chemical agent is verified. Selection of bacterial consortia (between

60 via biochemistry and Proteomics) was obtained. We identified the main bacterial

participant groups that showed competitive synergistic properties in biodegradation, and in

comparison with those reported in the open literature in similar systems (Degradation over

95% at 10 days). Ecotoxicity tests were carried out under international standards (Vibrio

fisherii) that validate the remediation achieved, results that will serve as a basis for the

development of the solution to the problem.

Keywords: Chloroacetanilide, consortium, xenobiotic, Vibrio, COD, COT


XI

Resumo

Neste trabalho biodegradação ocorre cloroacetanilidas: alaclor (2-cloro-N- (2,6-dietilfenil) -

N- (metoximetil) acetamida) e metolacloro (2-cloro-2', 6'-dietil Metoximetilacetanilida); e

você carboxamidas clorada; Estes são herbicidas pré-emergentes e mais restrita na

legislação em vigor, e, infelizmente, o mais utilizado no mundo. O problema ambiental com

xenobióticos clorados é que se acumulam tanto em solos e águas, especialmente em

águas lênticos, e seus efeitos sobre a saúde, sendo endócrino e disruptores mutagénicos,

localizado normativamente dentro de poluentes prioritários emergentes para ser

degradado. Por esta razão, existe uma necessidade de encontrar alternativas para a

degradação destes compostos entre os quais, de acordo com a literatura aberta, processa

foram obtidos físico-química e degradação microbiológica. A pesquisa foi realizada numa

escala de laboratório usando agregados bacterianos para o tratamento de água

contaminada lentic oligotrófica (organoclorado 300 ppm). A partir dos resultados, possíveis

mecanismos de degradação utilizados por estes consórcio são propostos e mineralização

químico verificadas. Obteve-se a selecção de um consórcio bacteriana (entre 60 através

de PCR de ARN 16s / Proteomics), os grupos bacterianos principais participantes

apresentaram sinérgica propriedades competitivas biodegradação foram identificadas e

comparadas com os relatados na literatura aberta em sistemas similares (maior do que

95% de degradação após 10 dias), os testes de ecotoxicidade foram realizadas de acordo

com padrões internacionais (Vibrio fisherii) validando reparação alcançada, os resultados

como uma base para o desenvolvimento da solução do problema.

Palavras-chave: cloroacetanilida consórcio, xenobióticos, Vibrio, DQO, COT

XII Biodegradación de las cloroacetanilidas en aguas


Tabla de Contenido

Pág.

Resumen ......................................................................................................................... IX

Lista de Figuras ........................................................................................................... XV

Lista de Tablas ............................................................................................................ XIX

Lista de Símbolos y abreviaturas ............................................................................. XXII

Introducción .................................................................................................................... 1

1. Generalidades .......................................................................................................... 7 1.1 Contaminación del agua .................................................................................. 7

1.1.1 Plaguicidas ........................................................................................... 8 1.2 Efectos por contaminación con Plaguicidas ................................................... 11

1.2.1 Efectos indeseados para la salud humana .......................................... 11 1.2.2 Efectos en el ambiente acuático ......................................................... 13 1.2.2.1 Factores que influyen en la toxicidad de los herbicidas en los sistemas acuáticos .......................................................................................................... 24 1.2.3 Mecanismos de adsorción de los herbicidas en sistemas acuáticos ... 28 1.2.4 Efectos por solubilidad de herbicidas en agua .................................... 31 1.2.5 Volatilización y Presión de Vapor ........................................................ 32 1.2.6 Coeficiente de partición aire /agua (Hc) .............................................. 33 1.2.7 Constante de la ley de Henry (H) ........................................................ 34 1.2.8 Persistencia, Biodegradación y Bioacumulación de los herbicidas...... 35 1.2.9 Indicadores de contaminación de los herbicidas en sistemas lénticos 39

1.3 Panorama frente a los COP´s clorados ......................................................... 40 1.4 Clasificación de los plaguicidas ..................................................................... 42

1.4.1 Plaguicidas del tipo herbicida amida ................................................... 44 1.4.2 Cloroacetanilidas ................................................................................ 45 1.4.3 Alacloro............................................................................................... 46 1.4.4 Metolacloro ......................................................................................... 51 1.4.5 Carboxiamidas clorados con imidazoles ............................................. 55

1.5 Importancia de la remoción de las cloroacetanilidas como contaminante. Estado actual y su relación con moléculas orgánicas emergentes ........................... 61 1.6 Formas de controlar las cloroacetanilidas ...................................................... 63

1.6.1 Procesos de oxidación avanzada (POAs) ........................................... 63 1.6.2 Procesos Físicos ................................................................................ 65 1.6.3 Procesos que emplean membranas .................................................... 67 1.6.4 Procesos de Lixiviación y sonodegradación ........................................ 67 1.6.5 Procesos que involucran procesos biológicos ..................................... 69

1.7 Degradación Bacteriana (Biorremediación) ................................................... 71 1.7.1 Tipos de consorcios bacterianos ......................................................... 72 1.7.2 Géneros Bacterianos implicados en procesos biorremediativos ......... 74 1.7.3 Crecimiento bacteriano ....................................................................... 77 1.7.4 Fuentes nutricionales para las Bacterias............................................. 79

1.8 Modelos para el crecimiento microbiano........................................................ 82 1.8.1 Factores que afectan la biorremediación ............................................ 86


XIII

1.9 Antecedentes de investigación ...................................................................... 89

2. Metodología Experimental ..................................................................................... 92 2.1 Etapa Experimental 1..................................................................................... 94

2.1.1 Activación y Selección Bacteriana ....................................................... 94 2.1.2 Enriquecimiento (mantenimiento celular)............................................ 97 2.1.3 Adaptación ........................................................................................ 100 5.1.3.1 Adaptación inicial bacteriana ............................................................... 100 5.1.3.2 Adaptación bacteriana en cloroacetanilidas ......................................... 100

2.2 Etapa Experimental II.................................................................................. 101 2.2.1 Análisis Termogravimétrico ............................................................... 101 2.2.2 Medios de Crecimiento empleados en aislamiento bacteriano .......... 102 2.2.3 Medio sintético oligotrófico contaminado con cloroacetanilidas ......... 102 2.2.4 Pruebas bioquímicas empleadas para fenotipicación bacteriana consorcial ........................................................................................................ 103 2.2.5 Técnicas analíticas empleadas en la caracterización física del agua 104 2.2.6 Técnicas analíiicas empleadas en la caracterizaci+on química del agua sintética 105

2.3 Etapa Experimental III.................................................................................. 106 2.3.1 Caracterización Microbiológica .......................................................... 106 2.3.2 Espectrofotometría UV-vis de las cloroacetanilidas .......................... 107 2.3.3 Metodología de cuantificación microbiológica por espectrofotometría UV-vis, 112 2.3.3.1 Técnica de McFarland ...................................................................... 112 2.3.4 Caracterización de las cloroacetanilidas por FTIR-ATR .................... 114 2.3.5 Cuantificación de las cloroacetanilidas por HPLC ............................. 117 2.3.6 Cualificación de las cloroacetanilidas por GC-MS ............................. 120

2.4 Etapa Experimental IV ................................................................................. 123 2.4.1 Análisis Ecotoxicológicos .................................................................. 123

3. Análisis de Resultados ........................................................................................ 126 3.1 Resultados Etapa Experimental 1 ............................................................... 126

3.1.1 Resultados de Selección ................................................................... 127 3.2 Resultados Etapa Experimental 2 ................................................................ 130

3.2.1 Resultados Mc Farland (Crecimiento Bacteriano) ............................. 130 3.2.2 Resultados de análisis TGA .............................................................. 134 3.2.3 Caracterización fisico-quimica agua inicial ........................................ 135 3.2.4 Caracterización de los consorcios bacterianos evaluados bajo Crio-MET 138 3.2.5 Aislamiento de cepas y análisis preliminares. ................................... 142

3.3 Resultados Etapa Experimental III ............................................................... 146 3.3.1 Resultados de Espectrofotometría UV –vis ....................................... 146 3.3.2 Cálculos para simular las estructuras más estables de reactantes y productos ........................................................................................................ 149 3.3.3 Identificación de grupos funcionales por FTIR-ATR en las cloroacetanilidas ............................................................................................. 151 3.3.4 Degradación de las Cloroacetanilidas y Carboxiamidas cloradas ...... 159 3.3.5 Comportamiento del Oxígeno Disuelto .............................................. 163 3.3.6 Comportamiento del Fósforo Total y Reactivo (PO4-P y PO4) .......... 165 3.3.7 Comportamiento del Nitrógeno Total ................................................. 167

XIV Biodegradación de las cloroacetanilidas en aguas


3.3.8 Comportamiento de CO2 ................................................................... 169 3.3.9 Resultados de seguimiento e identificación de compuestos degradados via GC-MS ...................................................................................................... 171 3.3.10 Caracterización fisico-quimica agua final .......................................... 182 3.3.11 Resultados de Biodegradación –DQO .............................................. 185 3.3.12 Resultados de Biodegradación – Mineralización COT ...................... 186 3.3.13 Resultados de Biodegradación – Mineralización CI .......................... 187 3.3.14 Resultados de Biodegradación – Mineralización CT ......................... 188 3.3.15 Resultados de Remoción Alacloro .................................................... 189

3.4 Resultados Experimentales Etapa IV .......................................................... 191 3.4.1 Resultados Experimentales Vibrio Fischeri ....................................... 191

3.5 Cinética de biodegradación ......................................................................... 197 3.6 Estequiometria ............................................................................................ 200 3.1 Balance del sustrato .................................................................................... 202 3.2 Balance de masa ......................................................................................... 202

3.2.1 Cálculo de peso seco, masa de CO2 y de sustrato ........................... 203

Conclusiones y recomendaciones ............................................................................ 205 Conclusiones ......................................................................................................... 205

Aportaciones de la tesis ............................................................................................. 206

Glosario ....................................................................................................................... 207

A. Anexo: Caracterización inicial del agua sintética y procedimiento de muestreo ...................................................................................................................... 210

B. Anexo: Procedimientos de Identificación Microbiológica ................................... 213 Protocolo para la tinción de Gram. ......................................................................... 213

C. Anexo: Resultados Probit Valoración Ecotoxicológica IMTA ............................. 214

D. Anexo: Cálculo de Incertidumbres ........................................................................ 221

E. Otros anexos .......................................................................................................... 231

Bibliografía .................................................................................................................. 233


XV

Lista de Figuras

Pág.

Figura 1-1 Aplicación de plaguicidas de la familia cloroacetanilidas (alacloro) año 2013. 17

Figura 1-2 Estado de diseminación y rango de contaminación con cloroacetanilidas

(alacloro) año 2013. ....................................................................................................... 17

Figura 1-3 Uso de suelo y tipos de vegetación que caracterizan la porción Norte del

Estado de Sinaloa .......................................................................................................... 20

Figura 1-4 Aspersión aérea de herbicidas clorados y cultivos de coca en Colombia 2013

....................................................................................................................................... 22

Figura 1-5 Ubicación General del Lago de Tota ............................................................. 23

Figura 1-6 Estructura del 2-cloro-2’,6’dietilo-N-(metoximetilo)-acetanilida (alaclor) ......... 46

Figura 1-7 Estructura del Metolacloro (2-cloro N-(2-etil 6-metilfenil) N-(2-metoxi 1-

metiletil) acetamida) ....................................................................................................... 52

Figura 1-8 Estructura del N-propil-N-[2-(2,4, 6-triclorofenoxi) etil] imidazol-1-carboxamida

(Procloraz) ...................................................................................................................... 55

Figura 1-9 Curva de crecimiento bacteriano ................................................................... 78

Figura 2-1 Equipo empleado en Análisis TGA ...............................................................102

Figura 2-2 Equipo TEM -Criogenia ................................................................................107

Figura 2-3 Equipo empleado en los análisis UV Mc-Farland..........................................108

Figura 2-4 Calibración del Equipo UV-vis (Barrido de Aire/ Selección de Celda) ...........109

Figura 2-5 Calibración del Equipo UV-Lámpara de Ultravioleta-Visible .........................110

Figura 2-7 Corrección por Linea Base ...........................................................................112

Figura 2-8 Equipo FTIR-ATR empleado ........................................................................114

Figura 2-9 Ajuste de Fuerza para ña medición FTIR-ATR (Cloroacetanilidas) ..............116

Figura 2-10 Cámara de Microextracción en Fase Solida ...............................................117

Figura 2-11 Montaje técnica HPLC alacloro ..................................................................118

Figura 2-12 Cromatograma alacloro ..............................................................................118

Figura 2-13 Cromatograma Procloraz ...........................................................................119

Figura 2-14 Técnica MSFE aplicada GC-MS para las cloroacetanilidas ........................120

Figura 2-15 Método Instrumental GC-MS empleado .....................................................121

Figura 2-16 GC-MS del estándar de calibración realizado .............................................122

Figura 2-17 Equipo de Microtox empleado en la prueba ecotoxicológica del IMTA .......123

XVI Biodegradación de las cloroacetanilidas en aguas


Figura 3-1 Agregado Bacteriano Px en Microscopio óptico a 40 X, en fase de adaptación

en medio (alacloro) ....................................................................................................... 129

Figura 3-2 Crecimiento Bacteriano en Alacloro ............................................................. 130

Figura 3-3 Crecimiento Bacteriano en Procloraz ........................................................... 131

Figura 3-4 Crecimiento bacteriano en metolacloro ........................................................ 132

Figura 3-5 Resultados TGA alacloro ............................................................................. 134

Figura 3-6 Cinética Degradación térmica TGA del alacloro ........................................... 134

Figura 3-7 Blanco observado en MET-Criogenico a 200X ............................................ 138

Figura 3-8 Maya -magic observado en MET-Criogenia a 200X .................................... 138

Figura 3-9 Bio CII observado en MET-Criogenico a 200X ............................................ 139

Figura 3-10 Bio CII observado en MET-Criogenico a 500X .......................................... 139

Figura 3-11 Consorcio Bacillus subtillis observado en MET-Criogénico a 300X ........... 140

Figura 3-12 Consorcio Pseudomona sp. observado en MET-Criogénico a 500X .......... 140

Figura 3-13 Agregados Bacterianos Mx en alacloro visto en MET-Criogenia a 11056 X

..................................................................................................................................... 141

Figura 3-14 Crecimiento bacteriano medio selectivo ..................................................... 142

Figura 3-15 Crecimiento bacteriano medio selectivo Plate count .................................. 143

Figura 3-16 Resultados de Evaluación UV-VIS Procloraz ............................................. 147

Figura 3-17 Evaluación UV-vis Metolacloro ................................................................... 148

Figura 3-18 Estructura molecular del alaclor calculadas por: a) MM3, b) CONFLEX, c)

MOPAC/PM5/COSMO. ................................................................................................. 150

Figura 3-19 Infrarrojo del alacloro estado inicial sin tratamiento con sus grupos

funcionales característicos ............................................................................................ 152

Figura 3-20 Corroboración del compuesto alacloro con base de datos NIST Herbicidas

..................................................................................................................................... 154

Figura 3-21 Análisis de grupos funcional de compuestos orto sustituidos .................... 154

Figura 3-22 Análisis Estructurales de grupos funcionales de carácter tóxico del alacloro

(Carbonilo). ................................................................................................................... 155

Figura 3-23 Identificación del grupo funcional éter en el alacloro .................................. 155

Figura 3-24 Espectro FTIR -ATR Metolacloro ............................................................... 156

Figura 3-25 Comparativo FTIR entre las cloroacetanilidas evaluadas (alacloro-

metolacloro) .................................................................................................................. 157

Figura 3-26 Seguimiento Degradación Alacloro FTIR ................................................... 158

Figura 3-27 Seguimiento Degradación FTIR Metolacloro .............................................. 158

Figura 3-28 Cromatograma Alacloro ............................................................................. 159

Figura 3-29 Cromatograma metolacloro ........................................................................ 160

Figura 3-30 Cinética de remoción del alacloro .............................................................. 161

Figura 3-31 Cinética de remoción metolacloro .............................................................. 161

Figura 3-32 Cinética de remoción procloraz .................................................................. 162

Figura 3-33 Comportamiento Fosforo en matriz con alacloro ........................................ 165

Figura 3-34 Comportamiento Fósforo en matriz acuosa con metolacloro ...................... 166

Figura 3-35 Comportamiento del Nitrógeno total en Matriz Alacloro .............................. 167

Figura 3-36 Comportamiento del Nitrógeno total en Matriz Metolacloro ........................ 168

Figura 3-37 Comportamiento del Nitrógeno total en Matriz Procloraz ........................... 168


XVII

Figura 3-38 Comportamiento del CO2 total en Matriz Alacloro ......................................169

Figura 3-39 Comportamiento del CO2 total en Matriz Metolacloro .................................170

Figura 3-40 Comportamiento del CO2 total en Matriz Procloraz ....................................170

Figura 3-41 Cromatograma de gases y espectro de masas de alacloro ......................171

Figura 3-42 Espectro de masas obtenido de alacloro ....................................................172

Figura 3-43 Búsqueda de compuesto por medio del espectro de masas, comparando con

la base de datos NIST 2014, de 273,000 componentes ...............................................172

Figura 3-44 Probabilidad de la identificación del componente alacloro > 800. ...............173

Figura 3-45 GC-MS de la biodegradación del alacloro a los 10 dias ..............................174

Figura 3-46 Espectro de masas del Ac. Benzoico, intermediario alacloro 10 dias .........174

Figura 3-47 Espectro de masas de subproductos biodegradación alacloro 10 dias .......175

Figura 3-48 Cromatograma y Espectro de masas del Dodecanal ..................................175

Figura 3-49 Cromatograma completo perfil de biodegradación de alacloro a los 10 dias

......................................................................................................................................176

Figura 3-50 Producto Final degradación Alacloro, cromatograma de gases ..................177

Figura 3-51 Espectro de masas subproducto final del alacloro (ácido propiónico) .........177

Figura 3-52 GC-Ms Metolacloro ....................................................................................178

Figura 3-53 Espectro de Masas del Metolacloro inicial ..................................................178

Figura 3-54 Cromatograma de gases biodegradación metolacloro (15 dias) .................179

Figura 3-55 Espectro de masas subproductos intermediarios (Ác. Benzoico) a 15 dias 179

Figura 3-56 Espectro de masas subproducto intermediario (Ácido Benzodioico) a 15 dias

......................................................................................................................................179

Figura 3-57 Cromatograma de gases biodegradaciión metolacloro a 15 dias ................180

Figura 3-58 Espectro de masas Procloraz estado inicial ...............................................180

Figura 3-59 Cromatograma del proceso biodegradativo del procloraz a los 10 dias ......181

Figura 3-60 Espectro de masas de subproductos a los 10 dias en procloraz (Ácido

Pentanedioico) ..............................................................................................................181

Figura 3-61 Espectro de masas de subproductos a los 10 dias en procloraz (Ácido

Propanoico) ...................................................................................................................181

Figura 3-62 Comportamiento de la DQO en biodegradación desarrollada por Mx ........185

Figura 3-63 Comportamiento de la DQO en biodegradación desarrollada por Px .........185

Figura 3-64 Comportamiento del COT en biodegradación desarrollada por Px .............186

Figura 3-65 Comportamiento del COT en biodegradación desarrollada por Mx ............186

Figura 3-66 Comportamiento del CI en biodegradación desarrollada por Px .................187

Figura 3-67 Comportamiento del CI en biodegradación desarrollada por Mx ................187

Figura 3-68 Comportamiento CT Mineralización Consorcio Px .....................................188

Figura 3-69 Comportamiento CT Mineralización Consorcio Mx ....................................188

Figura 3-70 Cinética de remoción de Alacloro (comparación entre consorcios) .............189

Figura 3-71 Cinética de remoción de metolacloro (comparación entre consorcios) .......189

Figura 3-72 Cinética de remoción de procloraz (comparación entre consorcios) ...........190

Figura 3-73 Reporte de Resultados IMTA frente al proceso biorremediativo .................196

Figura A0-1 Curva de Calibración DQO Metolacloro .....................................................210

Figura A0-2 Curva de Calibración DQO Procloraz .........................................................211

XVIII Biodegradación de las cloroacetanilidas en aguas


Figura A0-3 Curva de Calibración DQO alacloro ........................................................... 212

Figura D0-1 Cromatograma obtenido de la inyección de alacloro estándar RT 11.33 min.

As =1.002 ..................................................................................................................... 222

Figura D0-2 expresión gráfica de la recta obtenida para la determinación de la linealidad

de la metodología analítica para cuantificación de alacloro ........................................... 224

Contenido XIX

Lista de Tablas

Pág.

Tabla 1-1 Medios de contacto plaguicidas ...................................................................... 13

Tabla 1-2 Reacciones Involucradas en el proceso de degradación de los herbicidas

(Kogan, 2001) ................................................................................................................ 36

Tabla 1-3 Clasificación de herbicidas por su toxicidad (Ware, 1983) .............................. 42

Tabla 1-4 Clasificación de los plaguicidas por su uso y aplicación ................................. 43

Tabla 1-5 Clasificación de los plaguicidas por su persistencia y procesos de degradación

más comunes ................................................................................................................. 43

Tabla 1-6 . Características del alaclor ............................................................................ 47

Tabla 1-7 Características toxicológicas del alaclor ......................................................... 47

Tabla 1-8 Destino Ambiental del Alacloro ....................................................................... 49

Tabla 1-9 Degrdación del Alacloro.................................................................................. 49

Tabla 1-10 Valores de Adsorción de suelo a agua –Movilidad ........................................ 50

Tabla 1-11 Valores Ecotoxicológicos reportados para alacloro ....................................... 50

Tabla 1-12 Destino Ambiental del Metolacloro ............................................................... 52

Tabla 1-13 Degradación del Metolacloro ........................................................................ 53

Tabla 1-14 Mecanismo de absorción del suelo y la movilidad del metolacloro ............... 53

Tabla 1-15 Valores Ecotoxicológicos reportados para metolacloro ................................. 54

Tabla 1-16 Datos generales del procloraz (University of Hertfordshire, 2013) ................ 56

Tabla 1-17 Destino ambiental para el procloraz (University of Hertfordshire, 2013) ........ 56

Tabla 1-18 Degradación del Procloraz (University of Hertfordshire, 2013) ...................... 57

Tabla 1-19 Movilidad del Procloraz (University of Hertfordshire, 2013) ........................... 58

Tabla 1-20 Metabolitos intermediarios del Procloraz (University of Hertfordshire, 2013) 58

Tabla 1-21 Valores ecotoxicológicos para el Procloraz (University of Hertfordshire, 2013)

....................................................................................................................................... 59

Tabla 1-22 Perspectivas de representación de los modelos cinéticos del crecimiento

microbiano. ..................................................................................................................... 84

Tabla 1-23 Modelos cinéticos no estructurados más comúnmente utilizados. ................ 85

Tabla 1-24 Principales factores que afectan la biorremediación ..................................... 87

Tabla 1-25 Etapa 1 Biodegradación-cepas empleadas y condiciones mínimas .............. 89

Tabla 1-26 Etapa II Caracterización del agua, Condiciones de Cinética Bacteriana ....... 90

Tabla 2-1 Diseño Metodología Experimental desarrollada ............................................ 93

XX Biodegradación de las cloroacetanilidas en aguas


Tabla 2-2 Consorcios definidos Laboratorio de Operaciones Unitarias SEPI-ESIQIE ..... 96

Tabla 2-3 Consorcios definidos empleados –CINVESTAV ............................................. 96

Tabla 2-4 Consorcios no definidos –Zona Industrial Minatitllan y Tlalnepantla ............... 97

Tabla 2-5 Equipos empleados en la selección del agregado .......................................... 97

Tabla 2-6 Especificaciones de enriquecimiento empleadas ............................................ 98

Tabla 2-7 Especificaciones del Agua desionizada empleada .......................................... 98

Tabla 2-8 Medio mínimo estandarizado de crecimiento bacteriano................................. 98

Tabla 2-9 Solución de Elementos Traza empleada ......................................................... 99

Tabla 2-10 Agentes xenobióticos empleados ................................................................ 99

Tabla 2-11 Metodología de adaptación inicial bacteriana .............................................. 100

Tabla 2-12 Método general TGA para alacloro ............................................................. 101

Tabla 2-13 Medios de crecimiento selectivos empleados .............................................. 102

.Tabla 2-14 Pruebas Bioquímicas empleadas en el estudio .......................................... 104

Tabla 2-15 Técnicas de análisis físico empleada en el agua sintética .......................... 105

Tabla 2-16 Técnicas de análisis químico empleada en el agua sintética ...................... 105

Tabla 2-17 Detalles del equipo empleado UV-VIS ........................................................ 107

Tabla 2-18 Pruebas de rendimiento adelantas en el equipo UV-vis previo análisis ....... 109

Tabla 2-19 Señales vapor de benceno .......................................................................... 111

Tabla 2-20 Corrección UV por línea base empleada ..................................................... 112

Tabla 2-21 Tabla Mc-Farland empleada ...................................................................... 113

Tabla 2-22 Montaje técnica HPLC para alacloro ........................................................... 118

Tabla 2-23 Montaje técnica HPLC para metolacloro ..................................................... 119

Tabla 2-24 Montaje técnica HPLC Procloraz ................................................................. 119

Tabla 2-25 Estándar de Calibración empleada en GC-MS ............................................ 121

Tabla 2-26 Especificaciones del equipo y Sustrato prueba Vibrio fisherii ...................... 124

Tabla 3-1 Resultados de Selección de agregados bacterianos IPN-ESIQIE ................. 127

Tabla 3-2 Consorcios definidos –CINVESTAV ............................................................. 128

Tabla 3-3 Consorcios no definidos –Zona Industrial Minatitllan y Tlalnepantla ............. 128

Tabla 3-4 Caracterización fisicoquímica Agua Sintética oligotrófica con alacloro .......... 136

Tabla 3-5 Caracterización fisicoquímica Agua Sintética oligotrófica con metolacloro .... 136

Tabla 3-6 Caracterización fisicoquímica Agua Sintética oligotrófica con procloraz ........ 137

Tabla 3-7 Resultados de los análisis preliminares bioquímicos de las cepas aisladas del

consorcio Mx. ................................................................................................................ 143


consorcio Px ................................................................................................................. 144


consorcio Bacillus subtilis ............................................................................................. 144

Tabla 3-10 Pruebas Bioquímicas a consorcios en alacloro ........................................... 145

Tabla 3-11 Datos de cálculo de degradación alacloro ................................................... 150

Tabla 3-12 Datos Infrarrojo alacloro .............................................................................. 152

Tabla 3-13 Comportamiento Oxígeno disuelto .............................................................. 164

Tabla 3-14 Caracterización Fisicoquímica Agua biodegradada Alacloro px .................. 182

Tabla 3-15 Caracterización Fisicoquímica Agua biodegradada Metolacloro px ............. 183


XXI

Tabla 3-16 Caracterización Fisicoquímica Agua biodegradada procloraz con el consorcio

px ..................................................................................................................................184

Tabla 3-17 Tiempos experimentales obtenidos en prueba Vibrio fisherii ......................191

Tabla 3-18 Resultados de Luminiscencia -Probit del proceso biodegradativo ..............192

Tabla 3-19 Parámetros cinéticos degradación cloroacetanilidas ...................................200

Tabla A-0-1 Datos de Calibración DQO Alacloro ...........................................................210

Tabla A-0-2 Datos de Calibración DQO Procloraz .........................................................211

Tabla A-0-3 Datos de Calibración DQO Alacloro ...........................................................212

Tabla E-0-1 Degradación forzada para alacloro ............................................................223

Tabla E-0-2 Resultados obtenidos del ensayo de linealidad para alacloro ....................224

Tabla E-0-3 : Características de la curva de calibración para alacloro ...........................225

Tabla E-0-4 Cuadro resumen de criterios estadísticos (t de Student) para evaluación de la

linealidad de la metodología analítica ............................................................................225

Tabla 0-5 Resultados de ensayo de exactitud para Alacloro .........................................226

Tabla E-0-6 Resultados de ensayo de exactitud para Alacloro ......................................227

Tabla E-0-7 Resultados de evaluación de estabilidad para alacloro valores 24 hrs T º

ambiente 25ºC y 24 hrs refrigerador 4ºC. ......................................................................228

Tabla E-0-8 Serie de experimentos repetidos diferentes días y en diferentes equipos. .229

Contenido XXII

Lista de Símbolos y abreviaturas

Símbolos con letras latinas Símbolo Término

T Temperatura

H Constante de la Ley de Henry

mL mililitros

DO (T) Densidad Óptica (Transmitancia)

DO (A) Densidad óptica (Absorbancia )

Símbolos con letras griegas Símbolo Término

µmax Velocidad máxima especifica de crecimiento de la biomasa

[dias-1]

λ Longitud de onda

η mittlere Bettneigunswinkel (Stürzen)

Subíndices Subíndice Término

kow Coeficiente Partición Octanol-agua

Nt Nitrógeno Total

POx Compuestos de Fósforo (Fósforo Total)


XXIII

Subíndice Término

CO2 Dióxido de Carbono

O2 Oxígeno

KM Constante de Michaelis-Menten

CL50 Concentración Letal media

CI50 Concentración de Inhibición media

KD Coeficiente de adsorción

Koc Coeficiente de adsorción carbono orgánico

Hc Coeficiente de partición aire/agua

Abreviaturas Abreviatura Término

DQO Demanda Química de Oxigeno

pH Potencial de Hidrógeno

SST Sólidos Suspendidos Totales

DBO Demanda Bioquímica de Oxígeno

TGA Análisis Termogravimétrico

HPLC Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución

COT Carbono Orgánico Total

CI Carbono Inorgánico

CT Carbono total

Mx Consorcio Bacteriano MX

Px Consorcio Bacteriano PX

UFC Unidades Formadoras de Colonias

UV-VIs Espectrofotometría Ultravioleta-Visible

XXI

V

Biodegradación de las cloroacetanilidas en aguas


Abreviatura Término

FTIR Infrarrojo por Transformada de Fourier

DO Densidad Óptica

GC-MS Cromatografía de Gases acoplado a espectrometría de masas

m/z Relación masa-carga

USEPA US Enviromental Protection Agency (Agencia de Protección

Ambiental de los EUA)

IMTA Instituto Mexicano de Tecnología del Agua

S Sustrato

E Enzima

PNUMA Programa de las Naciones Unidas para el Medio Ambiente

ADN Ácido Desoxirribonucleico

OMS Organización Mundial de la Salud

FAO Organización de las Naciones Unidas para la alimentación y la

agricultura

ARN Ácido Ribonucleico

SEMARNAT Secretaria de Medio Ambiente y Recursos Naturales –México

MINAMBIENTE Ministerio de Ambiente, Colombia

IDA Ingesta Diaria Admisible

OECD Organismo de Cooperación Económica

ppm Partes por millón (expresada en mg/L)

COP´s Contaminantes Orgánicos persistentes

TGA Análisis termogravimétrico

MET Microscopía electronica de transmisión

Introducción

Actualmente existe un interés creciente por las repercusiones que tendrán los compuestos

orgánicos de origen antropogénico en el ambiente. El agua es una fuente importante de

estos compuestos para los seres vivos. La regulación de estos contaminantes es escasa,

debido al desconocimiento de sus efectos, además de que no se tiene un inventario de

“todas” las especies químicas presentes en una muestra ambiental, por limitaciones

analíticas. Los contaminantes emergentes presentan altas tasas de

transformación/remoción, que pueden compensar su introducción continua en el ambiente.

Es necesario incrementar el conocimiento sobre el origen, la transformación y los efectos

de esta nueva generación de contaminantes, para proponer los mecanismos de

tratamiento del agua y de remediación de la misma, con el fin de garantizar una calidad

idónea y sin efectos para la salud humana y los organismos acuáticos(Becerril, 2012).

En los años más recientes, se reconoce (Ramos, 2005; Arslan-Alaton y Caglayan, 2006)

que la presencia y el destino de los compuestos organoclorados activos en el ambiente

acuático constituye uno de los eventos emergentes y de interés en el campo de la

ingeniería química ambiental.

Aspectos más significativos son: la variación de la composición de los vertimientos, su

identificación como fuentes de contaminación orgánica, y la afectación del óptimo

funcionamiento de procesos biológicos de tratamiento por el uso indiscriminado de

herbicidas (Ramos, 2006; Ramos 2005). Estos a su vez, generan efectos tóxicos crónicos

tales como: disrupción endocrina, genotóxicidad, mutagenicidad y teratogénicidad, así

como resistencia y adaptación biótica positiva y negativa.

2 Introducción

Además, se detectan xenobióticos clorados y se cuantifican indicadores de

contaminación en las corrientes de aguas residuales, aguas superficiales (tanto lóticas

como lénticas) y subterráneas, donde descargan los efluentes, tratados o no. (Ternes,

1998; Heberer, 2002; Kummerer, 2001; Kümmerer et al, 2000; Zuccato et al, 2006).

Muchos organoclorados, y dentro de ellos los que pertenecen a los declarados como

contaminantes emergentes, son constantemente detectados en las aguas lénticas por

descargas industriales, agrícolas y domésticas), también en aguas subterráneas, plantas

de tratamiento de aguas residuales y en bocatomas de suministro de agua (Molina et al,

2006), sin embargo la ineficiencia de los métodos convencionales utilizados en plantas de

tratamiento de agua (PTA) para eliminar el contaminante, sus intermediarios con toxicidad

potencial, y los costos operacionales de inversión y mantenimientos de las mismas motiva

el desarrollo de métodos eficaces para tratar la contaminación del efluente (Bila y Dezotti,

2007) y de afluentes, caso de zonas con niveles declaradas como pasivos ambientales.

Dentro de los contaminantes emergentes, los que probablemente suscitan mayor

preocupación y estudio en los últimos años son los fármacos y los herbicidas declarados

como persistentes (COP´s) y, en particular dentro de los herbicidas, los organoclorados

con actividad disruptora. Según las propiedades fisicoquímicas de estos, sus metabolitos,

productos de degradación, y las características de los suelos que permiten la infiltración,

adsorción, absorción, y lixiviación, pueden llegar a alcanzar las aguas subterráneas y

contaminar los acuíferos o bien quedar retenidas en el suelo, y en sistemas lénticos y

acumularse pudiendo afectar al ecosistema y a los humanos a través de la cadena trófica

(Barceló y López, 2012).

Estos contaminantes corresponden, en la mayoría de los casos, a contaminantes

no regulados, que pueden ser candidatos a regulación futura, dependiendo de

investigaciones sobre sus efectos potenciales en la salud y los datos de monitoreo de

comparación internacional con respecto a su incidencia (Becerril, 2012). La característica

de este grupo de contaminantes xenobióticos clorados es que son persistentes en el

ambiente y sus intermediarios generan efectos negativos aún mayores, de

transformación/remoción los cuales no pueden compensar por su introducción continua en

el ambiente los parámetros de autorecuperación hídrica y la asimilación ambiental del

Introducción 3

cuerpo de agua afectado. Para la mayoría de estos contaminantes emergentes

organoclorados, la incidencia, la contribución de riesgo y los datos eco-toxicológicos, no

están disponibles, o los que están reportados en literatura abierta, son propios y no se

pueden generalizar, por el tipo de biomarcador eco-toxicológico empleado y por las

características medibles en cada afluente/efluente. Así que es difícil predecir qué efectos

de salud pueden tener en seres humanos y organismos acuáticos (Barceló, 2003).

Los plaguicidas son sustancias o mezclas de sustancias destinadas a prevenir,

destruir, repeler o mitigar las plagas. Debido a la regulación de la cual han sido objeto, se

han estudiado durante décadas y, en consecuencia, se tiene un razonable conocimiento

sobre su presencia y destino en el medio acuático. En los últimos años la preocupación en

torno a estos productos se centra en los metabolitos, productos de degradación, que han

sido en su mayor parte ignorados hasta la fecha y que se ha visto que pueden ser más

tóxicos que los compuestos a partir de los cuales se generan. Los estudios han demostrado

que los metabolitos de plaguicidas a menudo se detectan en aguas tanto subterráneas

como lénticas en concentraciones más altas en comparación con los compuestos

precursores (Kolpin et al ,2004; Lapworth, 2006)

No obstante el uso de estos compuestos químicos ha beneficiado sustancialmente

la producción agrícola. Gracias al empleo de estos herbicidas organoclorados, las

cosechas se han incrementado significativamente y las pérdidas en la producción se han

reducido en forma espectacular (Hotchkiss, 1992).

Además, es indudable el gran beneficio derivado del empleo de plaguicidas en los

programas de salud y en la lucha contra enfermedades transmitidas por plagas (Maroni y

Fait, 1993). Sin embargo, el uso desmedido e irracional de estos productos químicos en

agricultura ha traído serias consecuencias como son: a) la contaminación de las aguas, b)

la persistencia en los suelos y c) la resistencia de las plagas a los plaguicidas. Por todo

esto ha sido necesario definir la dosificación, la regulación y control del uso de los mismos.

Los efectos nocivos de los herbicidas pueden ocurrir a corto y a largo plazo, aun cuando

su producción y uso disminuyan o cesen por completo. Como la presencia de estos

4 Introducción

plaguicidas en el ambiente no disminuirá en un corto plazo, sus graves efectos sobre el

ambiente y la salud humana, los convierte en un importante problema de contaminación

de alcance mundial (Rivero et al., 2001).

Recordemos que los herbicidas son un tipo de herbicida, los cuales son agentes

químicos que matan plantas o inhiben su crecimiento normal (National Academy of

Sciences, 1989). Las cloroacetanilidas y las carboxiamidas son plaguicidas del tipo

herbicida, útil en el control de gramíneas y algunas malezas anuales de hojas anchas que

crecen en cultivos de maíz, cacahuate y frijol de soya (Smith y Helmick, 1993). Debido a

sus características químicas y fisicoquímicas principalmente, los plaguicidas persistentes

resisten a la degradación fotoquímica, química y bioquímica natural, por lo que se buscan

alternativas que permitan separarlos de agua, tierra y plantas eficientemente.

El presente escrito de investigación está estructurado en cuatro capítulos: En el

Capítulo 1 se describe las generalidades y conceptos de aquellos trabajos que anteceden

y sustentan la importancia de realizar esta tesis. Para iniciar, se plantea el problema de la

contaminación del agua por plaguicidas específicamente cuando éste es del tipo herbicida

de la familia de las cloroacetanilidas, se informan las regulaciones y las propiedades físico-

químicas de los compuestos objeto de estudio (alaclor, metolacloro y procloraz), los

métodos que se han empleado en el tratamiento de contaminación por este herbicida. Se

continúa con la presentación de las características generales de los consorcios

bacterianos, sus características y propiedades que permiten la degradación como una

alternativa para biodegradar herbicidas.

Se termina con una discusión sobre el estado actual de la importancia y necesidad

de continuar con la búsqueda de alternativas para monitorear y separar el herbicida alaclor,

metolacloro y procloraz, y su vinculación metabólica con los consorcios bacterianos.

Posteriormente se realiza una revisión sobre la literatura más reciente que aborda esta

problemática de acuerdo al abordaje interdisciplinario del mismo (teórico-práctico), con lo

cual se llega a la justificación técnica integral de este trabajo y a los objetivos buscados.

Introducción 5

Se presenta un panorama de la utilización de microorganismos capaces de utilizar

hidrocarburos clorados, sus limitaciones experimentales, sus derivados y se resaltan las

características de los que más utilizados. Se aborda el crecimiento bacteriano y los

factores que afectan su desarrollo. También se trata el tema de la degradación de las

cloroacetanilidas, haciendo énfasis en las rutas metabólicas principales. Se analiza el

modelo de crecimiento de microorganismos y se hace hincapié en el modelo de Monod,

que relaciona la biomasa y el consumo de sustrato.

En el Capítulo 2 se detalla la experimentación realizada sobre el agua sintética

empleada (léntica oligotrófica), la selección de los agregados bacterianos (Px y Mx) la

caracterización microbiológica realizada en los procesos de identificación fenotípica,

bioquímica en las fases de activación, adaptación, y de cinética microbiana, así como de

la caracterización fisicoquímica, instrumental, ambiental y ecotoxicológica de los de los

compuestos clorados trabajados (alaclor, metolacloro y procloraz) y de los productos

finales observados en la investigación.

En este capítulo, también se da la metodología establecida para la separación de

cada una de las cloroacetanilida en medios acuosos isotérmicos, por medio de la

Extracción por membrana, usando el criterio de extracción en fase sólida (SPE). Se

describe la metodología establecida para aislar compuestos químicos y para la

caracterización y estudios de reactivos y productos por técnicas analíticas instrumentales

de análisis microelemental y técnicas espectroscópicas y espectrométricas se describen

también en este capítulo, así como los equipos utilizados. Los resultados más importantes

obtenidos en esta investigación así como su discusión, se presentan en el Capítulo 3.

La metodología que se siguió para realizar las experiencias, dividiéndola en 4

etapas fundamentales: la activación, identificación, selección y acondicionamiento del

consorcio bacteriano (1- Métodos experimentales de análisis microbiológico) y el

seguimiento de la matriz acuosa inicial, final y la biodegradación de cada sustrato

hidrocarbonado clorado empleado (alacloro, metolacloro, procloraz) mediante Métodos de

análisis físico-químico (2), métodos de análisis instrumental (3), métodos de análisis

ambiental (4) y métodos de análisis toxicológicos.

6 Introducción

El capítulo 3 se discuten los resultados obtenidos de cada una de las cuatro etapas,

su análisis e interpretación y se proponen los modelos cinéticos. Se relaciona cada uno de

los resultados obtenidos con la literatura abierta, mostrando la concordancia,

diferenciación y aportando una interpretación técnica de dichos resultados. En base a estos

resultados, se calculan las constantes necesarias para modelar el proceso de

biorremediación de los sustratos clorados utilizados a través de la cinética de Monod. En

este capítulo igualmente se informa los resultados que avalan la biorremediación

adelantada, sometidos bajo normatividad internacional (Vibrio fisherii) , así como de

posibles mecanismos de reacción soportados en literatura y en resultados experimentales.

Finalmente, a partir de los resultados interdisciplinarios descritos y de sus análisis se

llega al capítulo 4, que aborda las conclusiones de este trabajo y se presenta una

perspectiva de los puntos que se pueden abordar en trabajos futuros de biorremediación

de aguas

El objetivo de este trabajo de investigación a escala laboratorio fue degradar

selectivamente los herbicidas tipo cloroacetanilidas (alaclor: C14H20NO2Cl, metolacloro

C14H20NO2Cl, y procloraz C14H20NO2Cl) de medios acuosos sintético (lénticos oligotróficos)

usando consorcios bacterianos mesofílicos.

1. Generalidades

1.1 Contaminación del agua

La contaminación de cuerpos de agua tanto lóticos (ríos, arroyos, océanos), lénticos (lagos,

lagunas, pantanos) y freáticos (aguas subterráneas) ocurre cuando los contaminantes son

descargados directamente o indirectamente en cuerpos de agua sin un adecuado

tratamiento que remueva los componentes dañinos y por el tipo de heterogeneidad

limnológica espacial y temporal de cada uno de estos. La contaminación del agua afecta

plantas y organismos que viven en estos cuerpos de agua, y en la mayoría de los casos

afecta dañando no solamente a las especies individuales y las poblaciones así como en

las comunidades biológicas. El agua de dichos cuerpos, se ha contaminado mediante

sustancias tóxicas como ácidas, solventes orgánicas, pinturas, metales, plaguicidas y

demás, derivados de actividades industriales, agrícolas, ganaderas, domésticas, dicha

agua ya no es apta para el consumo. La descarga de contaminantes específicos no es la

única causa de contaminación del agua, también la construcción de presas, embalses y

desviaciones de ríos pueden degradar seriamente su calidad (Heinke et al., 1999).

La contaminación de agua por plaguicidas ocasiona gran preocupación social por

las implicaciones toxicológicas que conlleva. Son motivo de especial atención las aguas

subterráneas y lénticas, ya que se utilizan generalmente para el suministro de agua potable

en numerosas poblaciones. Este tipo de contaminación se puede originar por alguna o

varias de las siguientes actividades: la descarga de residuos domésticos e industriales, la

acción directa de cargas nitrogenadas, que ocasionan procesos de eutrofización, el lavado

de equipos industriales, el arrastre de estos compuestos químicos (plaguicidas) por las

lluvias hacia los cuerpos de agua, las aplicaciones aéreas cercanas a ríos y lagos, y la

infiltración de xenobióticos a través del suelo que pueden alcanzar las aguas subterráneas.

8 Biodegradación de las cloroacetanilidas en aguas utilizando consorcios bacterianos mesofílicos

Título de la tesis o trabajo de investigación

El movimiento de los plaguicidas hacia el agua es un fenómeno complejo en el que

influyen numerosos factores y procesos que tienen lugar antes de que el plaguicida alcance

el agua léntica y freática, sin menospreciar las aguas lóticas (superficiales) que por su

capacidad y alimentación de corrientes hídricas de forma continua, generan diluciones de

los mismos, De modo general, se puede resumir como: adsorción/desorción, degradación,

volatilización, arrastre por escorrentía superficial, absorción por las plantas (Hernández,

1993), filtración, permeación y difusión.

1.1.1 Plaguicidas

Los plaguicidas son sustancias químicas destinadas a matar, repeler, atraer, regular o

interrumpir el crecimiento de plagas en su sentido más amplio (Morell y Candela, 1998).

Consideramos como plaga a aquellos organismos nocivos que transmiten enfermedades,

que compiten por alimentos y/o dañan bienes económicos y culturales.

El hombre ha intentado desde la antigüedad controlar por distintos medios los

microorganismos, plantas, vertebrados e invertebrados que ponían en peligro los alimentos

cultivados o almacenados, así como la salud de las personas. Uno de los primeros agentes

químicos utilizados con este propósito fue el azufre, empleado como fumigante en China

hace tres mil años. En Japón, en el siglo XVI, se utilizaba como larvicida el aceite de ballena

de baja calidad mezclado con vinagre, rociando esta mezcla sobre los arrozales. El uso de

compuestos de arsénico como insecticidas se introdujo en China en la misma época.

Los primeros usos de derivados de plantas como insecticidas datan de finales del

siglo XVII, cuando se aplicaron extractos acuosos de la hoja de tabaco a los cultivos.

Durante el siglo XIX se extrajo por primera vez el piretro de las flores de crisantemo y

comenzó a usarse el trióxido de arsénico, como herbicida, y el sulfato de cobre, como

fungicida en los viñedos europeos. A comienzos del siglo XX se usó mucho las sales de

INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL 9

arsénico, especialmente del verde París (arsenito de cobre), sustituido posteriormente por

los arseniatos de cobre y plomo.

En los años inmediatamente anteriores a la Segunda Guerra Mundial, se lograron

grandes avances en la síntesis química de compuestos plaguicidas. Los ditiocarbamatos

comenzaron a utilizarse a finales de la década de 1930. Otros plaguicidas, como el DDT

(1, 1,1-tricloro-2,2-bis (4-clorofenil)-etano), el dinitrocresol y el ácido 2,4-diclorofenoxiacético,

se encontraban en fase experimental en los mismos años. Tras el fin de la guerra, se

originó una auténtica explosión en el número y variedad de agentes químicos plaguicidas

que se sintetizaron y emplearon por primera vez.

El uso de plaguicidas no sólo ha contribuido al aumento de la producción agrícola,

sino que es directamente responsable de grandes avances en la salud pública como lo es,

el papel desempeñado por los primeros insecticidas clorados, por ejemplo como el DDT,

en la lucha contra el paludismo, la filariosis en África, Asia, Indonesia y América Central

(Moreno, 2003).

Los plaguicidas son el resultado de investigaciones realizadas en insectos entre

1930 y 1940, para la formulación de armas químicas (Ramírez y Lascaña, 2001), sin

embargo es después de la II Guerra Mundial que la elaboración de plaguicidas incrementó

su producción para el control de plagas a nivel agrícola, veterinario, salud pública y en el

hogar, por lo que su consumo se extendió a escala global. Esta industria tuvo su auge en

la agricultura entre los años 60 y 70 del siglo anterior y se llegó a conocer como la

Revolución Verde.

Durante los últimos 50 años la producción agrícola a nivel mundial ha ido en

aumento, basada en la utilización excesiva de sustancias químicas, y es así que la

agricultura convencional se convirtió en una de las actividades humanas que ocasionan

mayores efectos negativos sobre el medio ambiente, porque prioriza el crecimiento



económico, sin tomar en cuenta la distribución de recursos, ni los costos sociales y

ambientales (Altieri, 1995).

Los impactos ambientales más importantes de la agricultura moderna repercuten

sobre: la calidad del suelo, provocando su erosión, salinización y pérdida de biodiversidad;

sobre la calidad del agua, contaminando y agotando los cuerpos de agua lénticos

acuitardos y acuíferos; sobre los hábitats de vida silvestre y el paisaje debido a una

deforestación sin control y un incorrecto uso del suelo; y sobre el aire a causa de la

generación de gases de efecto invernadero (OECD, 2003).

Actualmente, además de los insecticidas, integran los plaguicidas compuestos de

acciones muy variadas, como los herbicidas, fungicidas, rodenticidas y reguladores de

crecimiento, entre otros. Aunque resulta innegable que los plaguicidas han beneficiado la

producción agrícola y el combate de enfermedades humanas y animales, el uso continuo

y despreocupado de estos agrotóxicos ha ocasionado la aparición de problemas que

inciden sobre la salud humana y la supervivencia de numerosas especies (Olivera y

Rodríguez, 2002).

Los plaguicidas no solo alteran el balance de la naturaleza desequilibrando los

sistemas de vida (agua y suelo), además su uso indiscriminado constituye un peligro para

la salud de los agricultores al momento de su aplicación. Los consumidores también

pueden verse afectados en la cadena alimentaria ya que se producen alimentos

contaminados con trazas de plaguicidas excediendo los límites permisibles.

Sin embargo el intenso e inadecuado uso de sustancias químicas como los

herbicidas, fungicidas y fertilizantes de origen sintético por parte de los agricultores a lo

largo de las últimos años con el fin de mejorar la producción y combatir problemas

fitosanitarios en los cultivos, se ha convertido en una amenaza para la protección de la

biodiversidad en los agro-ecosistemas y la sostenibilidad agrícola (Yang et al., 2002)

debido a las características de persistencia, vida media y toxicidad de estos compuestos,


acelerando el deterioro de los suelos, disminuyendo su actividad microbiana, contenido de

materia orgánica y fertilidad.

Son diversos los tipos de plaguicidas que en períodos prolongados, desde múltiples

fuentes y a dosis bajas, penetran al organismo utilizando distintas vías. Las principales

fuentes de exposición en la población son los alimentos de origen vegetal (frutas, verduras,

cereales, leguminosas) o animal (carne bovina, porcina y sus derivados, pescado,

productos lácteos, huevo, etc. (, y en menor grado el agua, el aire, la tierra, la fauna y la

flora contaminados. También lo son los productos industrializados de uso cotidiano que

contienen o son plaguicidas en sí mismos y que afectan de manera directa o indirecta al

ser humano. Se afirma que no hay segmento alguno de la población general exento de la

exposición a estos compuestos y a sus potenciales efectos nocivos sobre la salud.

1.2 Efectos por contaminación con Plaguicidas

1.2.1 Efectos indeseados para la salud humana

Con el aumento del uso de plaguicidas, simultáneamente crecieron los accidentes y

enfermedades asociadas a éstos. Los datos de la OMS (Organización Mundial de la

Salud), indican que anualmente se intoxican dos millones de personas por exposición

directa o indirecta a plaguicidas. De ese total, las 3/4 partes de los afectados pertenecen

a los países subdesarrollados, en los cuales se utiliza el 25 % de la producción mundial de

plaguicidas.

Aunque es difícil obtener registros y estadísticas confiables, en nuestro país se

acepta por consenso que el grado de accidentes asociados al trabajo agrícola es similar o

ligeramente superior al registrado en la construcción (Olivera y Rodríguez, 2002).



El contacto con plaguicidas y su entrada al organismo a través de la piel, la

respiración y/o por ingestión resulta de la exposición laboral y en el hogar debido a usos y

aplicaciones incorrectos, falta de medidas preventivas y de protección, almacenamiento

inadecuado, reutilización de envases (comederos de animales, almacenamiento y traslado

de agua) y fumigaciones aéreas. Se han detectado residuos de plaguicidas organoclorados

y organofosforados en personas en las que la única probabilidad de encuentro con

plaguicidas es por ingestión. Las preparaciones acaricidas o insecticidas, como las

lociones piojicidas de lindano utilizadas en humanos, son una vía adicional de

contaminación y pueden además potenciar otros agentes nocivos

Los efectos indeseados dependen del plaguicida, la dosis, la vía y el tiempo de

exposición (Ver tabla 1-1). Los efectos agudos (vómitos, diarrea, aborto, cefalea,

somnolencia, alteraciones en el comportamiento, convulsiones, coma y hasta la muerte)

están asociados a accidentes donde una única dosis alta es suficiente para provocar estos

efectos que se manifiestan tempranamente. Los efectos crónicos (cáncer, leucemia,

necrosis de hígado, malformaciones congénitas, neuropatías periféricas, a veces sólo

malestar general, cefaleas persistentes, dolores vagos) se deben a exposiciones repetidas

y los síntomas o signos aparecen después de un largo tiempo (hasta años) de contacto

con el plaguicida, dificultando su detección. Los plaguicidas provocan efectos acumulativos

en las personas expuestas porque su biotransformación es muy lenta (Olivera y Rodríguez,

2002).

Quizá el ejemplo regional de mayor alcance de contaminación por plaguicidas y su

repercusión en la salud humana es el de la región del Mar Aral. El PNUMA (1993) vinculó

los efectos de los herbicidas al "nivel de morbilidad oncológica (cáncer), pulmonar y

hematológica, así como a las deformidades congénitas... y deficiencias del sistema

inmunitario".


Los efectos en la salud humana son provocados por los siguientes medios:

Tabla 1-1 Medios de contacto plaguicidas

Medio de contacto Mecanismo

Piel Manipulación de productos agrícolas

Inhalación Respiración

Ingestión Plaguicidas consumidos como contaminantes en los

alimentos o en el agua

Los trabajadores agrícolas están sometidos a especiales riesgos asociados a la

inhalación y contacto a través de la piel durante la preparación y aplicación de plaguicidas

a los cultivos. No obstante, para la mayoría de la población, un vehículo importante es la

ingestión de alimentos contaminados por plaguicidas. La degradación de la calidad del

agua por la escorrentía de herbicidas tiene dos efectos principales en la salud humana. El

primero es el consumo de pescado y mariscos contaminados por plaguicidas

(bioacumulación); este problema puede revestir especial importancia en las economías

pesqueras de subsistencia que se encuentran aguas abajo de importantes zonas

agrícolas. El segundo es el consumo directo de agua contaminada con herbicidas. La OMS

(1993) ha establecido directrices para el agua potable en relación con 33 plaguicidas.

Muchos organismos encargados de la protección de la salud y el medio ambiente han

establecido valores de "ingesta diaria admisible" (IDA), que indican la ingestión máxima

diaria admisible durante la vida de una persona sin riesgo apreciable para su salud. Por

ejemplo, en un estudio reciente de Wang y Lin (1995) sobre fenoles clorados sustituidos,

se comprobó que la tetraclorohidroquinona, metabolito tóxico del biocida pentaclorofeno,

producía en el "DNA daños significativos y dependientes de la dosis".

1.2.2 Efectos en el ambiente acuático

Aunque los plaguicidas han sido diseñados para tener una alta especificidad de acción, su

uso genera innumerables efectos tales como la generación de organismos resistentes, la

persistencia ambiental de residuos tóxicos y la contaminación de recursos hídricos así



como la degradación de suelos, de la flora y fauna. Cuando la especie objetivo se resiste

a un plaguicida en particular, se requiere incrementar las cantidades de éste o sustituirlo

por agentes más tóxicos para lograr controles efectivos.

Los organoclorados son un ejemplo de persistencia ambiental ya que permanecen

en los suelos sin degradación significativa hasta 30 años después de ser aplicados. Esa

permanencia favorece la incorporación a las cadenas tróficas y la acumulación en los

tejidos grasos humanos y animales.

Los plaguicidas organoclorados se utilizan desde los años ochenta pero en diversos

países (EEUU, México, Colombia, entre otros), sus residuos aún se detectan en tejidos

biológicos. Las aguas contaminadas expanden el tóxico (agente xenobiótico) a la flora y

fauna produciendo la muerte de especies nativas, endémicas, además del aumento de la

muertes generadas vía intoxicación humana crónica, la pérdida del curso de agua como

recurso utilizable y la probable contaminación de las reservas hídricas (acuíferos,

acuitardos).

Los plaguicidas se incluyen en una gran variedad de microcontaminantes orgánicos

que tienen efectos ecológicos, llamados a su vez contaminantes orgánicos persistentes

(COP´s). Las distintas categorías de herbicidas tienen diferentes tipos de repercusión en

los organismos vivos, por lo que es difícil hacer afirmaciones generales que abarque un

tipo de toxicocinética y toxico dinámica específica.

Aunque los herbicidas tienen sin duda efectos en la superficie terrestre (Matriz

suelo), el principal medio de daños ecológicos es el agua contaminada por la escorrentía

de los mismos. Los dos mecanismos más importantes son la bioconcentración y la

bioampliación.


Bioconcentración: Se trata del movimiento de un producto químico desde el

medio circundante hasta el interior de un organismo. El principal "sumidero" de

algunos plaguicidas es el tejido graso ("lípidos"). Algunos plaguicidas, como el DDT,

son "lipofílicos", lo que quiere decir que son solubles y se acumulan en el tejido

graso, como el tejido comestible de los peces y el tejido graso humano. Otros

plaguicidas, como el glifosato, se metabolizan y eliminan a través de las

excreciones (hidrofílicos).

Bioampliación: Con este término se designa la concentración creciente de un

producto químico a medida que la energía alimentaria se transforma dentro de la

cadena trófica. En la medida en que los organismos pequeños son devorados por

los mayores, la concentración de plaguicidas y otros productos químicos se amplía

de forma considerable en el tejido del órgano blanco, y por ende en sistemas.

Pueden observarse concentraciones muy elevadas en los depredadores que se

encuentran en el ápice de esa cadena, incluido el ser humano.

Los efectos ecológicos de los plaguicidas (y otros contaminantes orgánicos

persistentes) son muy variados y están con frecuencia interrelacionados. Se considera que

los efectos producidos en los organismos y en el medio ambiente constituyen una

advertencia de las posibles repercusiones en la salud humana. Los principales tipos de

efectos son los que se enumeran a continuación y varían según el organismo sometido a

investigación y el tipo de plaguicida. Los distintos plaguicidas provocan efectos muy

diferentes en la vida acuática, por lo que es difícil formular afirmaciones de alcance general.

Lo importante es que muchos de estos efectos son crónicos (no letales en tiempos

cortos), pasan con frecuencia desapercibidos al observador superficial, y sin embargo,

tienen consecuencia en toda la cadena trófica. Esos efectos son los siguientes (FAO,

2005):

Muerte del organismo.

Cánceres, tumores y lesiones en peces y animales.



Inhibición o fracaso reproductivo (disrupción endocrina).

Supresión del sistema inmunitario.

Perturbación del sistema endocrino (hormonal).

Daños celulares, en el ARN y ADN.

Efectos teratogénicos (deformidades físicas, como las que se observan en el pico

de algunas aves).

Problemas de salud en los peces revelados por el bajo coeficiente entre células

rojas y blancas, el exceso de mucílago en las escamas y agallas de los peces, etc.

Efectos intergeneracionales (que sólo se observarán en las generaciones futuras

del organismo).

Otros efectos fisiológicos, como disminución del grosor de la cascara de los huevos,

de especies superiores de la cadena.

El uso agrícola extensivo e intensivo de estos herbicidas es un subconjunto del

espectro más amplio de productos químicos industriales utilizados en la sociedad moderna.

Según la base de datos de la American Chemical Society, en 2013 se habían identificado

más de 13 millones de productos químicos, a los que se sumaban cada año unos 500 000

nuevos compuestos.

A continuación se citan algunos ejemplos de contaminación por este tipo de

agentes xenobióticos, en los Grandes Lagos de América del Norte, la International Joint

Commission ha estimado, que hay más de 200 productos químicos que pueden provocar

problemas en el agua y en los sedimentos del ecosistema de los Grandes Lagos, entre

ellos como prioridad las cloroacetanilidas. (Ver figura 1-1 y Figura 1-2) (USEPA, 2013)


Figura 1-1 Aplicación de plaguicidas de la familia cloroacetanilidas (alacloro) año 2013.

Figura 1-2 Estado de diseminación y rango de contaminación con cloroacetanilidas (alacloro) año 2013.

Aunque el número de plaguicidas utilizados es muy elevado, la utilización más abundante

suele estar asociada a un pequeño número de productos. En un estudio reciente efectuado

en las provincias agrícolas occidentales del Canadá, donde se utilizan habitualmente unos

50 plaguicidas, por tener una normatividad mucho más exigente y acatan lo establecido en



el Convenio de Róterdam del 20041, el 95 por ciento del total de la aplicación de éstos

corresponde a nueve herbicidas concretos (Bikholz, comunicación personal, 1995).

Aunque el uso de plaguicidas es entre escaso y nulo en la agricultura tradicional y

de subsistencia de África y Asia, la mayoría de los países del continente Americano con

excepción de Canadá y Chile, siguen usando los plaguicidas vetados por dicho Convenio

Internacional Ambiental. Los efectos en el medio ambiente, la salud pública y calidad del

agua debidos a una utilización inadecuada y excesiva de plaguicidas están ampliamente

documentados.

En Lituania (FAO, 1994b), si bien la contaminación debida a plaguicidas ha

disminuido debido a factores económicos, se dan casos frecuentes de contaminación del

agua por plaguicidas como consecuencia del almacenamiento y distribución inadecuados

de los productos agroquímicos.

En los Estados Unidos, en el Estudio Nacional de Plaguicidas de US-EPA se

comprobó que el 10,4 por ciento de los pozos comunitarios y el 4,2 por ciento de los pozos

rurales contenían niveles detectables de uno o más plaguicidas (US-EPA, 2002). En un

estudio sobre los pozos de agua subterránea en el Ontario sudoccidental agrícola

(Canadá), el 35 por ciento de los pozos dieron positivo en las pruebas de plaguicidas al

menos en una ocasión (Lampman, 1995).

En México, el crecimiento poblacional y económico (soberanía alimentaria) ha

ejercido mayor presión sobre las reservas de agua, lo que ocasiona conflictos entre

poblaciones por problemas de baja distribución. En este sentido, la escasez y la mala

calidad del agua parecen ser los principales retos a resolver, aunado a la superficie

1 El Convenio de Rotterdam sobre el procedimiento de consentimiento fundamentado previo aplicable a ciertos plaguicidas y productos químicos peligrosos

objeto de comercio internacional es un Tratado Multilateral Ambiental que tiene como principales objetivos:

http://www.pic.int/


agrícola cultivada en los últimos 20 años, es de 20 millones de hectáreas, de las que el

mayor uso es en el sistema de temporal, después se redujo a 15.5 mill. de ha, mientras

que la agricultura de riego se ha mantenido durante este periodo en 5; en total, esto

corresponde al 75% de la superficie sembrada en el país (SEMARNAT, 2005).

Se calcula que existen alrededor de 900 plaguicidas y los cultivos en los que se usa

el mayor volumen de insecticidas químicos son: maíz, algodón, papa, chile, tomate, frijol,

trigo, aguacate, café y tabaco, en cantidades que van desde 395 hasta 13,163 ton de

plaguicidas al año (AMIPFAC, 1995), mientras que los estados con mayor uso de

plaguicidas son Sinaloa, Veracruz, Jalisco-Nayarit-Colima, Sonora-Baja California,

Tamaulipas, Michoacán, Tabasco, Estado de México, Puebla y Oaxaca, con el 80% de los

plaguicidas totales (Albert, 2005). Se emplean 260 marcas de productos químicos de las

cuales 24 están prohibidas y 13 restringidas, siendo las principales causas de intoxicación

debido a las deficientes medidas de control y previsión (CICLOPLAFEST, 2008).

La información disponible en cuanto al volumen y tipos de pesticidas aplicados

anualmente en los campos agrícolas y el grado de contaminación orgánica con productos

tóxico en los cuerpos de agua es prácticamente inexistente. Hasta el año 2008, los estados

con mayor producción agrícola a nivel nacional fueron Guanajuato, Sinaloa, Tamaulipas,

Zacatecas y otros (SAGARPA, 2008), en donde destaca el uso intensivo de los

agroquímicos. Al respecto, Cortinas de Nava (2007) señala que las zonas con mayor uso

de plaguicidas en la agricultura o con fines sanitarios durante el 2000, fueron: Sinaloa,

Chiapas, Veracruz, Jalisco, Nayarit, Colima, Sonora-Baja California y Tamaulipas. Estos

Estados representaron alrededor del 70% del consumo de los plaguicidas.

En el Estado de Sinaloa, la aplicación de estos compuestos organoclorados ha sido una

de las principales fuentes de contaminación ambiental, generando varios casos de

intoxicación y otros problemas de salud pública (Karam-Quiñones, 2002). Sobre esto,

Albert (2005) menciona un mayor uso de los herbicidas (paraquat, glifosato, alacloro),



seguidos de insecticidas (organofosforados: paratión metílico, metamidofos, malatión) y

fungicidas (mancozeb, clorotalonil, procloraz, etc) (CONAFUR, 2005)

Figura 1-3 Uso de suelo y tipos de vegetación que caracterizan la porción Norte del Estado de Sinaloa

En Sinaloa, se reconoce que no hay un registro de las descargas agrícolas y su

efecto en las corrientes superficiales y las bahías, además de incluir la contaminación de

carácter físico-químico, bacteriológico y de nutrientes (Consejo de cuenca de los ríos

Fuerte y Sinaloa, 2005).

Endréu (2011) señala que la cantidad de plaguicidas que se emplea en Costa Rica

es de 51.2 kg ha-1 cultivable, país de mayor consumo de estos agroquímicos en la región,

en Colombia y Ecuador son 16.7 kg ha-1 y 6.0 kg ha--1, respectivamente. Por otro lado,

durante el 2000 al 2005 en México se observó un incremento en el volumen de producción

de plaguicidas (herbicidas y defoliantes), así como de insecticidas que se emplean

primordialmente en los campos (INEGI, 2006).

Al conocer los problemas a la salud y el ambiente por estas sustancias, en México

fue creada la comisión intersecretarial para el control del proceso y uso de plaguicidas,


fertilizantes y sustancias tóxicas (CICOPLAFEST), ahora COFEPRIS (Comisión Federal

para la Protección Contra Riesgos Sanitarios). Sin embargo, se reconoce el uso

indiscriminado de estos compuestos, ya que constituyen una amenaza para la salud y al

ambiente (Cortinas de Nava, 2007). Datos de INEGI (2009) indican que la tecnología

aplicada en la superficie agrícola se basa en la fertilización, uso de herbicidas e insecticidas

químico.

A pesar de la relevancia de estos al ambiente, en los sedimentos de la Laguna

Santa María se reporta la presencia de 14 plaguicidas y moléculas de heptacloro epóxido,

alacloro, metolacloro, p,p-DDE, endrín y aldrín, cuyos contenidos son menores a otros

sistemas costeros de la región, a excepción del alacloro y heptacloro epóxido que

sobrepasó el límite máximo recomendado en la Norma Ambiental FAO/WHO (Díaz-

Arredondo, 1998). En peces de interés comercial, como Lutjanus colorado y Mugil curema

(Reyes-Montiel, 2011), se encontraron estos compuestos por el proceso de

bioacumulación, considerando que las zonas de distribución son afectadas por diferentes

contaminantes que se relacionan a la presencia de drenes agrícolas, canales de riego,

forma de riego, aplicación de los plaguicidas y mal manejo de los desechos (envases u

contenedores), entre otros. Hay que añadir los lixiviados de los campos agrícolas que

pueden llegar a los mantos freáticos producto de la aplicación en exceso de los

agroquímicos (Garrido et al., 1998).

Colombia por ser un país tropical, presenta condiciones muy variadas en sus climas

y amplia diversidad biológica, reflejadas de muchas maneras en la presencia de

microorganismos que afectan a los cultivos agrícolas y forestales, a la producción animal

y a la salud, pero igualmente brindan la oportunidad de disponer de agentes naturales para

el control biológico, Sin embargo el desconocimiento de la agroecología y el sistema

sociopolítico imperante, lleva a este país a continuar produciendo dentro de las

concepciones de la revolución verde.

Actualmente se usa en gran parte para la aspersión aérea contra los cultivos de cuya

producción se hace un uso ilícito (Figura 1-4) y que simplemente para la opinión pública

se denomina herbicida “GLIFOSATO”, el cual es una mezcla de muchos otros herbicidas

entre los que predominan las cloroacetanilidas (SEMANA, 2013) y los imidazoles (IDEA,



2005), que afecta los ecosistemas de dichas regiones afectadas. Adicionalmente existe un

pasivo ambiental particular relevante para el Gobierno de Colombia llamado Lago de Tota

(Ver Figura 1-5) detallado en el Documento CONPES 3801 (Minambiente, 2014) , el cual

es un cuerpo de agua natural situado en el departamento de Boyacá, con una superficie

cercana a los 70 km² es el lago más grande y contaminado por organoclorados de

Colombia (Guerrero. 2014 y Nieves-Cuervo, 2016), el tercero más grande de

Latinoamérica y el único afectado por exceso de herbicidas, de fósforo y nitrógeno

producto de los cultivos de cebolla y trucha dentro de otras actividades antrópicas

(Minambiente, 2014), tiene modificación en su dinámica natural de este cuerpo de agua,

al punto de declararse como uno de los 10 ecositemas lenticos mas amenzados por

contaminación del mundo. (Red Mundial de Humedales, 2015)

Figura 1-4 Aspersión aérea de herbicidas clorados y cultivos de coca en Colombia 2013

https://es.wikipedia.org/wiki/Kil%C3%B3metro_cuadrado


Figura 1-5 Ubicación General del Lago de Tota

En estos casos descritos anteriormente, como en la carga ambiental de productos

químicos tóxicos figuran compuestos tanto agrícolas como no agrícolas, es difícil separar

los efectos ecológicos y sanitarios de los plaguicidas y los debidos a compuestos

industriales que de forma intencionada o accidental se liberan en el medio ambiente. No

obstante, hay pruebas abrumadoras de que el uso agrícola de los plaguicidas tiene

importantes efectos en la calidad del agua y provoca serias consecuencias ambientales.

Los efectos de los herbicidas en la calidad del agua están asociados a los siguientes

factores:

Ingrediente activo en la formulación del herbicida.

Contaminantes que existen como impurezas en el ingrediente activo.

Aditivos que se mezclan con el ingrediente activo (humectantes, diluyentes o

solventes, aprestos, adhesivos, soluciones reguladoras, conservantes y

emulsionantes).

Producto degradado que se forma durante la degradación química, microbiana

o fotoquímica del ingrediente activo.



Los herbicidas e insecticidas se utilizan también abundantemente en la silvicultura. En

algunos países, como el Canadá, donde uno de cada diez empleos está relacionado con

la industria forestal, la lucha contra las plagas forestales, especialmente los insectos, se

considera una actividad fundamental. Los insecticidas se aplican con frecuencia en

grandes superficies mediante pulverizaciones aéreas cercanas a los grandes lagos.

1.2.2.1 Factores que influyen en la toxicidad de los herbicidas en

los sistemas acuáticos

Los efectos ecológicos de los herbicidas en el agua están determinados por los siguientes

criterios:

Toxicidad: Toxicidad para mamíferos y no mamíferos, expresada en forma de

DL50 ("Dosis letal": concentración del plaguicida que provoca la muerte de la mitad

de los organismos de prueba durante un período especificado de prueba). Cuanto

más baja es la DL50, mayor es la toxicidad; los valores de 0 a 10 son extremamente

tóxicos (OMAF, 1991).

Las directrices sobre los alimentos y el agua potable se determinan utilizando una

evaluación basada en el riesgo (Ecuación 1-1). Por lo general,

𝐫𝐢𝐞𝐬𝐠𝐨 = 𝐞𝐱𝐩𝐨𝐬𝐢𝐜𝐢𝐨𝐧 (𝐜𝐚𝐧𝐭𝐢𝐝𝐚𝐝 𝐲/𝐨 𝐝𝐮𝐫𝐚𝐜𝐢𝐨𝐧) 𝐱 𝐭𝐨𝐱𝐢𝐜𝐢𝐝𝐚𝐝. (Ec 1-1)

La respuesta tóxica (efecto) puede ser aguda (muerte) o crónica (efecto que quizá

no provoque la muerte durante el período de prueba pero cause en el organismo

sometido a prueba efectos observables, como cánceres y tumores, deficiencias

reproductivas, inhibición del crecimiento, efectos teratogénicos, etc.).


Persistencia: Medida en términos de vida media (tiempo necesario para que la

concentración ambiental disminuya un 50 por ciento). La persistencia está

determinada por procesos bióticos y abióticos de degradación. Los procesos

bióticos son la biodegradación y el metabolismo; los procesos abióticos son

fundamentalmente la hidrólisis, fotolisis y oxidación (Calamari y Barg, 1993).

Los herbicidas modernos suelen tener vidas medias breves, que reflejan el período

durante el cual la plaga debe ser controlada.

Productos degradados: El proceso de degradación puede llevar a la formación

de "productos degradados", cuya toxicidad puede ser mayor, igual o menor que la

del compuesto original.

Destino (ambiental): El destino ambiental (comportamiento) de un plaguicida

depende de la afinidad natural del producto químico con respecto de uno de los

cuatro compartimentos ambientales (Calamari y Barg, 1993): materia sólida

(materia mineral y carbono orgánico en partículas), líquido (solubilidad en aguas

superficiales y aguas lénticas), forma gaseosa (volatilización) y biota.

Este comportamiento recibe con frecuencia el nombre de "compartimentación" y

comprende, respectivamente, la determinación de los siguientes aspectos: coeficiente de

absorción del suelo (KOC); solubilidad; Constante de Henry (H), y el coeficiente de partición

octanol/agua (KOW). Estos parámetros son bien conocidos en el caso de los plaguicidas y

se utilizan para prever su evolución ambiental.

En química ambiental se utiliza el coeficiente octanol-agua (Kow) definido como la

relación de concentraciones de un compuesto entre el octanol y el agua, como un indicador

del grado de hidrofobicidad de cada compuesto, que nos advierte de su capacidad para

acumularse en los organismos vivos y su potencial de absorción sobre la materia orgánica

de los suelos (compuestos húmicos y fúlvicos).



Los herbicidas con valores de Kow elevados (superiores a 4) tienen un potencial de

bioacumulación muy alto, y por tanto, se trata de compuestos que si se aplican en

cantidades elevadas pueden llegar a transferirse a lo largo de las cadenas tróficas.

En cambio, se utiliza el coeficiente de reparto (KD) como indicador del grado de

atracción y retención de los herbicidas en la superficie del suelo. La retención depende

básicamente del tipo de suelo, y afectará al comportamiento del herbicida en el ambiente

ya que una molécula absorbida no es solubilizada en el agua y por tanto deja de ser

biodisponible. Esto tiene como principales consecuencias que se reducen los efectos

biológicos y por otra disminuye la probabilidad de biodegradación, lo que hace que

aumente su persistencia. El término “vida media” se utiliza para evaluar la persistencia de

un herbicida en el ambiente. La vida media (t1/2) se define como el tiempo necesario para

reducir a la mitad la concentración de un determinado compuesto.

Diversos autores (Goss, 1992; Hornsby, 1992) demostraron que el coeficiente de

partición en carbono orgánico (Koc) y la vida media de los plaguicidas (t1/2) pueden

utilizarse para comparar sus potenciales de lixiviar a través de la matriz del suelo. A su

vez, Goss (1992) estableció que la materia orgánica del suelo es la característica edáfica

que más influye sobre el movimiento de los plaguicidas. La distribución en profundidad de

la materia orgánica del suelo por lo general indica la zona en la cual los herbicidas son

más fuertemente adsorbidos (Sonon 1992). Por tal razón, los herbicidas por lo general se

adsorben más fuertemente a las capas superficiales del suelo. Los horizontes del suelo

más profundos contienen menos materia orgánica y poblaciones microbianas, y por lo tanto

los herbicidas son menos adsorbidos o degradados (Comfort, 1994; Skipper et al., 1996).

Las variaciones en las propiedades del suelo con la profundidad influyen en la sorción,

degradación y movimiento de los herbicidas (Jenks et al, 1998). La comprensión de cómo

las propiedades del suelo dentro de un perfil afectan la retención y degradación de los

herbicidas resultará en una mejor predicción de su comportamiento y contaminación

potencial del agua subterránea y lénticas. En general puede establecerse que los factores

más importantes que controlan la degradación y por tanto la persistencia, varían

drásticamente con la profundidad del perfil de suelo. Los horizontes más profundos poseen


menor capacidad de degradación de los plaguicidas y por lo tanto la persistencia de los

mismos suele incrementarse en gran medida con la profundidad (Barriuso, 2000). La

retención y degradación de un plaguicida en el suelo son fenómenos relacionados que

condicionan su potencialidad de contaminación del agua subterránea y superficial (caso

de las lénticas). Por tanto, ambos procesos deben integrarse para poder interpretar mejor

las observaciones globales sobre el estado de contaminación del agua (Barriuso, 2000).

El movimiento del agua en el suelo es el principal mecanismo para la transferencia

de contaminantes a las aguas superficiales (lóticas y lénticas) y subterráneas (Leeds-

Harrison, 1995). La física del agua en el suelo y el movimiento de solutos pueden utilizarse

para determinar el comportamiento de estos materiales. El movimiento de solutos a través

de la zona insaturada, también llamada vadosa, es particularmente importante en lo

referente a la contaminación ambiental y agronómica (Costa et al., 1994). El transporte de

solutos está afectado por procesos químicos y físicos de no equilibrio. El no-equilibrio

químico está dado por una cinética de adsorción ya que coexisten sitios de adsorción

instantánea (equilibrio) y sitios de adsorción en función del tiempo (no-equilibrio) (Cameron

y Klute 1977). El no-equilibrio físico puede ser producto de un régimen de flujo heterogéneo

debido a la presencia de un medio poroso de diversos tamaños. Existe una fase líquida

móvil en los macroporos y una fase líquida inmóvil en los microporos (Bejat et al. 2000).

Los suelos bajo de siembra directa presentarían mayor macroporosidad, inclusive

macroporos continuos que ofrecen un flujo preferencial (by-pass), que facilitaría el

transporte de solutos en estado inicial de aplicación como de intermediarios.

La predicción del comportamiento de los plaguicidas liberados en el ambiente es

necesaria para anticipar, y por ende minimizar, impactos adversos fuera del punto de

aplicación (Wagenet y Rao, 1990). Esto significa que se debe comprender qué le sucede

a un pesticida que ha sido aplicado en el campo, y predecir su destino en el ambiente a

partir del entendimiento de sus propiedades. Utilizando esta información, pueden

estimarse los probables impactos adversos sobre el agua superficial o subterránea y/o

sobre la salud humana. Existen modelos con distinto nivel de complejidad para una



variedad de aplicaciones. Sin embargo, en la actualidad una limitada disponibilidad de

datos obtenidos de estudios a campo representa la principal limitante para evaluar la

validez de estos modelos, a fin de que puedan utilizarse con confianza para los propósitos

para los que fueron creados.

1.2.3 Mecanismos de adsorción de los herbicidas en sistemas acuáticos

Existen diferentes mecanismos por los cuales los herbicidas se adhieren a la fracción

orgánica del suelo y estos se citan a continuación:

1.2.3.1 Enlaces de Puentes de Hidrógeno o Puentes de Agua

Este es el principal mecanismo utilizado por aquellos herbicidas cuyas moléculas son no

iónicas y polares como por ejemplo Glifosato y MSMA entre otros, estos se adsorben a los

minerales arcillosos y a la materia orgánica. En este tipo de enlace los átomos de

hidrogeno forman puentes entre dos átomos electronegativos, sin embargo estos puentes

se consideran débiles. También se pueden establecer puentes de agua entre las moléculas

de compuestos orgánicos y la partícula mineral, tal como sucede en los suelos húmedos

(García de Vinuesa 1986).

1.2.3.2 Enlaces por Cambio Iónico

Este tipo de enlace ocurre cuando las moléculas de los herbicidas tienen un

comportamiento catiónico y pueden intercambiarse con los cationes inorgánicos que

saturan las arcillas o la materia orgánica quedando retenidas por fuerzas electrostáticas,

entre estos herbicidas destacan el Paraquat y Atrazina entre otros. Este mecanismo

dependerá del pH del suelo, ya que este influye tanto en la carga de los minerales de la

arcilla y de la materia orgánica, como en la carga de las moléculas de los herbicidas. Por

ejemplo las Triazinas se protonan cuando el pH del suelo es bajo (García de Vinuesa1986).


1.2.3.3 Cambios de Ligando

Este mecanismo se da por un emplazamiento de uno o más ligandos en los complejos

entre iones metálicos y el suelo. En este caso el plaguicida actúa de agente quelatante

fuerte desplazando los ligandos que estaban previamente como por ejemplo el agua. El

metal en esta ocasión actúa de puente en la adsorción del plaguicida.

1.2.3.4 Coeficiente de adsorción 𝑲𝑫

El coeficiente de adsorción 𝐾𝐷 se obtiene aplicando la siguiente ecuación (Ec. 1-2):

𝐾𝐷 = 𝐶𝐸

𝐶𝑊 (Ec. 1-2)

La 𝐾𝐷 es la relación entre la cantidad agregada (CW) de un herbicida a un

determinado suelo y la cantidad retenida (CE) por ese suelo Cada tipo de suelo tiene

diferente capacidad de adsorción de los herbicidas, por ejemplo cuando las

concentraciones de los herbicidas son bajos la constante de adsorción 𝐾𝐷 en los suelos y

sedimentos es lineal y es reversible. Un 𝐾𝐷 alto indica que hay una alta adsorción y poco

herbicida disuelto en la solución del suelo, contrariamente un 𝐾𝐷medio como (0,50) sugiere

que por cada molécula de herbicida presente en el suelo hay dos moléculas en la solución

del suelo. Un 𝐾𝐷 bajo por su parte indica que hay mucho herbicida presente en la solución

del suelo. Existen diversos métodos para obtener constantes de adsorción de los

plaguicidas, algunas generales y otras que se pueden emplear en trabajos más específicos

que involucren algún tipo de suelo y plaguicida en especial, para ello se puede emplear las

isotermas de adsorción y desorción de Freundlih. Para obtener las diferentes isotermas de

Freundlih (kf) se apela a la obtención de diferentes ecuaciones de regresión lineal definidas

por: la siguiente formula Y = a + bx, o sea que sustituyendo los valores Cw = Y y Ce = x,

donde a es la coordenada del origen y, y b la pendiente de la recta.

La ecuación quedará definida por (Ecuación 1-3):

𝐿𝑜𝑔 𝐶𝑤 = 𝐿𝑜𝑔 𝐾𝑓 +1

𝑛 𝐿𝑜𝑔 𝐶𝐸 (Ec. 1.3)



Donde:

Cw = Cantidad herbicida adsorbido

Kf = valor constante adsorción de Freundlih ( a = y – bx )

1/n = valor de la pendiente (b)

CE = Cantidad de herbicida agregado al suelo

1.2.3.5 Coeficiente de Adsorción Carbono Orgánico (KOC)

La materia orgánica es sobre todo un material amorfo compuesto

predominantemente de polifenoles con una alta superficie de contacto y por lo general con

exposición de grupos favorables para realizar interacciones organolíficas con herbicidas

ligados de carga neutra, positiva y negativa.

La materia orgánica es el más importante factor del suelo que influye sobre la

adsorción de la mayoría de los herbicidas en dirección al agua, porque provee de un largo

número de sitios de amarre o anclaje para muchas moléculas de agroquímicos entre ellos

los herbicidas, por tal motivo se podría expresar que presentan una mayor capacidad de

retención por unidad de peso influyendo directamente entre el herbicida aplicado al suelo

y la cantidad retenida de este. El contenido de materia orgánica en los suelos es variable

y determina una nueva constante de adsorción llamada Constante de Partición Orgánica

o adsorción del carbono orgánico (KOC) y será la constante más importante para definir la

adsorción de un herbicida en un determinado suelo con un determinado contenido de

materia orgánica.

En suelos con constante de adsorción Suelo/agua (Kd) similares la cantidad

retenida de los herbicidas fue directamente proporcional al contenido de la materia

orgánica en el suelo (Gonzalez 2010). La fórmula para obtener esta nueva constante se

obtiene aplicando la constante Kd y el contenido de Materia Orgánica presente en el suelo

y expresado por el porcentaje de Carbono orgánico (%OC) o Fracción del carbono orgánico

del suelo (FOC). (Arauz 2010).

𝐾𝑂𝐶 = 𝐾𝑑 𝑥 100 (Ec. 1-4)


Donde el

%𝐹𝑂𝐶 =𝑀𝑎𝑡𝑒𝑟𝑖𝑎 𝑂𝑟𝑔á𝑛𝑖𝑐𝑎

1.72 (Ec. 1-5)

Un KOC elevado indica que el herbicida se fija con firmeza al suelo, Sedimento, Biota

y Materia Orgánica por lo que poca cantidad se moverá a las aguas superficiales o mantos

acuíferos, sin embargo estos herbicidas son mayoritariamente solubles en agua por lo que

la vía de exposición podría ser también por medio de la cadena alimenticia. Con un KOC

bajo el plaguicida podría distribuirse en cuerpos de agua o aire al ser estos muy volátiles y

poca adherencia al suelo y Materia Orgánica. La vía de exposición de estos productos por

su alta volatilización también podría ser por vía de la inhalación en los animales y humanos.

El KOC por lo tanto es específico para cada herbicida pero independiente de las

propiedades del suelo, sus valores oscilan entre 1 y 10.000. Al ser el herbicida poco o muy

retenido en el suelo, la implicación es que se podrá prever entonces su grado de movilidad

en el suelo y con ello su capacidad de contaminar cuerpos de agua.

1.2.4 Efectos por solubilidad de herbicidas en agua

La solubilidad de un herbicida es una medida que determina la máxima

concentración del producto a disolverse en un litro de agua y por lo general tiene un rango

de 1 a 100 000 mg /litro. Las unidades de concentración son mg por litro (mg/L) que es

aproximadamente igual a una parte por millón (ppm) y también expresadas en un

microgramo por litro (μg/L).

Los plaguicidas muy solubles en agua se adsorben con baja afinidad a los suelos y

por lo tanto son fácilmente transportados del lugar de la aplicación por una fuerte lluvia,

riego o escurrimiento hasta los cuerpos de agua superficiales o subterráneos. El posible

efecto o consecuencias de la solubilidad de un plaguicida sobre el medio ambiente se

resume de la siguiente forma: (Cops 2009)



Herbicidas baja solubilidad

El herbicida puede tener afinidad por el suelo y acumularse en este.

El plaguicida puede sedimentarse en el suelo en la base de los acuíferos

Herbicidas alta solubilidad

El herbicida puede tener afinidad por el agua y puede solubilizarse

El herbicida puede transportarse a mantos acuíferos

Puede facilitarse la biodegradación del herbicida.

El departamento de regulación de plaguicidas en California de los Estados Unidos

de América, determinó que los plaguicidas con una solubilidad mayor a 3 mg/l tiene

potencial para contaminar aguas subterráneas y lénticas, Sin embargo en los estados

Unidos se han encontrado valores inferiores a 3 mg/L en aguas subterráneas lo cual

indica que el parámetro antes mencionado no es del todo confiable. (Instituto Nacional

Ecología 2010) y (Cops 2009).

1.2.5 Volatilización y Presión de Vapor

La dinámica de los residuos de herbicidas en la atmósfera está íntimamente ligados a

las características climáticas de un determinado lugar y a las características físicas

químicas del suelo y el herbicida.

Los principales procesos por los que un plaguicida puede llegar a la atmósfera son

los siguientes:

1. Deriva durante la aplicación

2. Vaporización

3. Erosión eólica con residuos del herbicida


La volatibilidad es la medida de la tendencia de un herbicida a pasar del estado

sólido o liquido al estado gaseoso. Todas las sustancias orgánicas son volátiles en

algún grado dependiendo de su presión de vapor, del estado físico en que se

encuentren y de la temperatura ambiental. La vaporización de un herbicida puede

alterarse, hasta cierto grado, mediante la modificación de la formulación y el uso de

coadyuvantes en su formulación. La presión de vapor es una propiedad característica

de cualquier compuesto químico y se utiliza como un índice de la tendencia de una

sustancia a evaporarse. Cuando aumenta la temperatura la presión de vapor también

aumenta y con ello la velocidad de vaporización. Si el compuesto ha sido adsorbido o

se ha mezclado con el suelo la velocidad de vaporización se reduce en forma

significativa debido a que el compuesto está retenido por las fuerzas de adsorción y a

la vez el suelo impide el escape del vapor. En esto casos el contenido de humedad del

suelo influye fuertemente sobre la vaporización, se sabe de qué algunos herbicidas

aplicados sobre suelos secos se adsorben fuertemente a sus partículas bajando de

manera significativa la presión de vapor inhibiendo sustancialmente la vaporización de

estos.

La volatibilidad se mide a partir de la constante de Henry que depende de la

interacción de la presión de vapor del herbicida en estado líquido y de su solubilidad

(Instituto Nacional Ecología 2010). En síntesis la evaporización depende de la

velocidad del viento, la temperatura, tipo de suelo y humedad relativa. (García 1997).

La presión de vapor varia incrementándose con la temperatura y se mide en unidades

como: Pascales (Pa), milímetros de mercurio (mmHg), libras por pulgada cuadrada

(Lbs Psi) y atmósferas (atm), sin embargo la unidad del sistema internacional de

presión de vapor es en Pascales ( Newton /m2 ) o en mili Pascales ( 10-3 Pa ).

1.2.6 Coeficiente de partición aire /agua (Hc)

El coeficiente de partición aire – agua es la medida de la afinidad del plaguicida con el

agua o el aire dependiendo de la relación de la presión de vapor y la solubilidad (Ec. 1-6),

con esta medida es posible determinar proporcionalmente donde se ubica este.



𝐻𝐶 =𝑃

𝑆 (Ec. 1-6)

Donde

P = Presión vapor ( Pa)

S = Solubilidad (moles / m3)

1.2.7 Constante de la ley de Henry (H)

La relación entre la presión y la solubilidad de un gas se expresa con una sencilla ecuación

llamada ley de Henry (Ec. 1-7)

𝐻 =𝑃𝑟𝑒𝑠𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝑉𝑎𝑝𝑜𝑟 (𝑚𝑃𝑎)𝑥 𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑀𝑜𝑙𝑒𝑐𝑢𝑙𝑎𝑟 𝑥 10−3

𝑆𝑜𝑙𝑢𝑏𝑖𝑙𝑖𝑑𝑎𝑑 𝑒𝑛 𝑎𝑔𝑢𝑎 (𝑝𝑝𝑚) (Ec. 1-7)

Está claro de que no es suficiente considerar un solo parámetro para señalar a un

herbicida su posibilidad de contaminar aguas subterráneas y lénticas. Una vez que el

herbicida se encuentra en el suelo, los procesos que tienen lugar comienzan a actuar

de manera simultánea .Estos procesos se pueden dividir en dos 6 grandes grupos:

Procesos de transferencia y de transformación, donde por su parte los procesos de

transferencia, son aquellos en los que la naturaleza química del plaguicida no se ve

afectada, e implican mecanismos físico químicos o biológicos que dan lugar a

transferencias entre los sistemas, suelo – agua, suelo – aire, etc.

Entre los mecanismos de transferencia al agua se pueden destacar: adsorción-

desorción, lixiviación, escorrentía, volatilización y absorción. Por el contrario, los

procesos que implican cambios en la estructura del plaguicida se denominan como

procesos de transformación (degradación química, biodegradación y foto

degradación). En estos procesos de transformación, el plaguicida se modifica o

degrada en otros compuestos que pueden presentar al final, mayor o menor toxicidad.


(Gonzalez 2010). Cuando se asperja un herbicida en el medio ambiente, este se

distribuirá en función de sus propiedades físico químicas y las del suelo, comenzando

de inmediato los procesos de contaminación remota por movilidad, y acumulación. La

contaminación remota tiene lugar por dos vías: el aire y el agua, la primera por un

proceso de volatilización y difusión del producto y su posterior transporte por el viento

(contaminación atmosférica) caso de las aspersiones aéreas. Por medio del agua el

herbicida se distribuye sobre la superficie tratada (suelo- planta) movilizándose

inicialmente por lavado (lluvia, Riego), luego por percolación y adsorción a los coloides

del suelo , pasando luego posiblemente a contaminar aguas subterráneas (CEPIS –

OPS/OMS 2009).

1.2.8 Persistencia, Biodegradación y Bioacumulación de los herbicidas

La persistencia de un herbicida en el ambiente (aguas o suelos) se define como el

tiempo necesario para que pierda el 95 % de su actividad ambiental o mediante el concepto

de vida media, siendo esta el tiempo que tarda en degradarse la mitad de la cantidad del

herbicida aplicado, sin embargo este tiempo puede variar considerablemente entre unos y

otros productos.

Todas las sustancias químicas aplicadas al medio ambiente sufren de “partición

ambiental” o sea son desplazadas entre los diversos componentes ambientales como son:

el aire, el agua, el suelo y la biota (plantas, animales y microorganismos). Los plaguicidas

en general se desplazan desde su punto de entrada en el ambiente hasta el

compartimiento ambiental con el que tiene una mayor afinidad, a partir de allí las sustancias

pueden ser trasladadas nuevamente a otros compartimientos o sitios del medio ambiente

(Cops 2009)

El conocimiento de las propiedades físico químicas de los herbicidas permite

predecir la partición ambiental. Los parámetros más útiles para esto son solubilidad en

agua presión de vapor (VP), coeficiente de partición octanol agua (Kow) coeficiente de

partición octanol aire (Koa) y Pka o constante de acidez del producto. Para evaluar la

distribución ambiental de las sustancias orgánicas, los parámetros importantes son:

Constante de Henry (H), solubilidad en agua (S), coeficiente de adsorción al suelo (Koc) y



coeficiente de partición octanol agua (Kow) .El valor numérico de cada parámetro

dependerá del grado de afinidad con los cuatro compartimientos ecológicos básicos: aire,

agua, suelo y biota (Cops 2009).

Al igual que los demás plaguicidas los herbicidas se degradan en el ambiente por

la influencia de factores bióticos y abióticos mediante diversas reacciones. Los procesos

de degradación más importantes son de tipo bioquímico (biodegradación), así como de

carácter químico (oxidación, hidrólisis) y fotoquímicos. En la tabla 1-2, se citan los más

importantes.

Tabla 1-2 Reacciones Involucradas en el proceso de degradación de los herbicidas (Kogan, 2001)

Reacción Química Acción Principal del Herbicida

Fotólisis Acción de la Energía Lumínica

Oxidación Adición del Oxígeno a la molécula de Herbicida

Reducción Adición de Hidrógeno

Hidrólisis Partición del agua en grupos hidroxilos (OH*)

Isomerización Cambios en el orden espacial de los átomos

Conjugación Adición de la molécula de otra sustancia

Los factores más importantes que afectan la velocidad de biodegradación, son:

Estructura molecular: los compuestos aromáticos y halogenados son más

resistentes y la velocidad de biodegradación disminuye ya sea por aumentar el

peso molecular y por disminuir la solubilidad en agua.

La temperatura, pH del medio y la concentración de microorganismos en el suelo

La degradación de sustancias orgánicas en el medio ambiente se efectúa sobre todo

en medios acuáticos y en las fases acuosas del suelo o de los sedimentos. La hidrólisis

por ejemplo requiere la presencia de agua, de la que depende por lo demás la actividad

de los microorganismos. Asimismo, para que la biodegradación se realice requiere que


tanto los microorganismos como el plaguicida en general estén directamente en contacto

ya que su disolución en la fase acuosa va a depender de que este sea lo más directo

posible entre las bacterias, hongos y el sustrato (Labrada 1996).

Se ha sostenido que para muchas sustancias no adsorbentes (no lipofílicas), se

encuentran tasas de degradación más o menos idénticas en el suelo y en las aguas. En

los herbicidas lipofílicos como, Pendimetalina, Oxifluorfen, Terbutrina, Terbutilazina y

cloroacetanilidas como Acetoclor, la tasa de degradación será por lo general más baja en

el suelo que en el agua, por causa de la inmovilización parcial provocada por la adsorción.

Así, cuando un estudio de simulación haya demostrado que una sustancia se degrada

rápidamente en el suelo, es muy probable que eso mismo ocurra en el medio ambiente

acuático. Se admite que cuando se observa una degradación rápida en el suelo por vía

experimental, se tendrá también una degradación rápida en las aguas superficiales

(Labrada 1996).

La bioacumulación es un serio problema de contaminación porque involucra

directamente a los organismos vivos en general desde el hombre hasta los

microorganismos, y muchos de ellos vitales en la cadena alimenticia.

Si se realiza una correcta aplicación de los herbicidas, no debe haber residuos en

alimentos y si los hay estos deben estar presentes en cantidades limitadas y no dañinas

para el organismo que lo ingirió.

La concentración de estos residuos debe ser inferior a la ingesta diaria admisible (IDA)

definida por los grupos de expertos en residuos de plaguicidas de la FAO /OMS. Sin

embargo, algunas sustancias pueden bioacumularse en los organismos comestibles, hasta

un punto en que estos son inapropiados para el consumo humano.



La bioacumulación puede evaluarse en los diferentes herbicidas con base en las

propiedades fisicoquímicas de sus moléculas, como son los coeficientes de partición

octanol agua (KOW) y la constante de Henry. El factor de bioconcentración (BCF) es un

coeficiente de partición estimado por el cociente entre la concentración de la sustancia en

el organismo y la concentración de la sustancia en el medio, dentro de un sistema en

estado de equilibrio químico. Este coeficiente puede ser usado para estimar la ingesta

diaria de una determinada sustancia o compuesto químico por medio del consumo de un

organismo, permitiendo establecer límites seguros de la sustancia en el medio, señalando

el destino ambiental de la sustancia.

Por lo general, el potencial de bioconcentración de una sustancia orgánica guarda

relación sobre todo con el carácter lipofílico de esa sustancia. Ese carácter se mide como

se mencionó con el coeficiente de reparto octanol agua (Kow), que para las sustancias

orgánicas, lipofílicas y no iónicas que registran una transformación mínima en el interior

del organismo, esta correlacionado directamente con el factor de bioconcentración (BCF).

.Por tal motivo se usa a menudo Kow para estimar la bioconcentración de sustancias

orgánicas basándose en la relación empírica entre log BCF y log Kow.

La clasificación de una sustancia se basa principalmente en sus propiedades

intrínsecas. Sin embargo, el grado de bioconcentración dependerá también de factores

tales como el grado de biodisponibilidad, la fisiología del organismo expuesto a la

sustancia, si la exposición es constante u ocasional, la duración de la exposición, el

metabolismo del organismo y la capacidad de excreción. Por tanto la interpretación del

potencial de bioconcentración a efectos de clasificación requiere de una evaluación de las

propiedades intrínsecas de la sustancia, así como condiciones experimentales en las que

se haya determinado el factor de bioconcentración (BCF).


1.2.9 Indicadores de contaminación de los herbicidas en sistemas lénticos

Para conocer el comportamiento final de un herbicida en sistemas lénticos donde

fue aplicado es necesario utilizar indicadores o modelos matemáticos de simulación

basados en la definición de índices o indicadores .A estos modelos se les llaman “ screen

models “ dado que son una aproximación del transporte de un contaminante. (Morell 1998).

De la discusión anterior se deduce que los parámetros como Koc y T 1/2 constituyen

un criterio más o menos simplificado de los efectos de tiempo de residencia y degradación

sobre los procesos de transporte de los herbicidas a los acuíferos o aguas subterráneas y

a los sistemas lénticos (lagos).

Con el objeto de valorar el poder contaminante de los plaguicidas en general se

han establecido diversos índices de riesgo potencial de contaminación y de ellos se han

categorizado en dos grupos : Lixiviables y no lixiviables , utilizando para ello dos tipos de

índices ,los basados en aproximaciones empíricas como el potencial de lixiviación (LP) y

el Groundwater Ubiquity Score conocido con las siglas GUS, y los basados en modelos de

transporte como : Factor de retardo ( RF) y Factor de Atenuación (AF). Es importante

remarcar que estos índices solo son herramientas para clasificar los herbicidas en función

de su relativo potencial contaminante.

Los índices solo proporcionan datos relativos con el objeto de “screening”, y no

predicen el tiempo de tránsito o la atenuación de un herbicida en una determinada zona

del cuerpo hídrico freático o léntico.

Valores del índice de GUS inferiores a 1,8 indican poco riesgo de contaminación

por lixiviación, aquellos herbicidas con valores entre 1.8 y 2.8 se consideran medios en su

riesgo de contaminación y por otro lado valores superiores a 2,8 tienen gran probabilidad

de contaminación del cuerpo hídrico. (Monquero 2008)(Instituto Nacional ecología 2010)



El índice de LIX no trata de simular el transporte de los herbicidas en una situación

de campo, más bien trata de evaluar el potencial de lixiviación de un compuesto,

comparándolos con otros herbicidas en un mismo escenario ambiental esto es válido para

los valores GUS obtenidos con anterioridad.

La aplicación del modelo RF (Factor de Retardo) se utiliza como un parámetros

para evaluar la capacidad de un determinado herbicida de contaminar fuentes de agua

subterránea por lo que demandan del levantamiento de datos podológicos, climáticos e

hidrológicos, también de las propiedades fisicoquímicas de los herbicidas (Lorencetti

2005).

El factor de atenuación (AF) también es un parámetro para medir el potencial de

contaminación de los plaguicidas y requiere de datos de suelo y del herbicida como se

planteó en el factor de retardo.

Un factor adicional que también influye en los indicadores, puede ser la presencia

de impurezas en la formulación del plaguicida (tensoactivos, conocidos como adyuvantes),

que no forman parte del ingrediente activo. Un ejemplo reciente es el caso del TFM,

lampricida utilizado en los afluentes de los 'Grandes Lagos durante muchos años para

combatir la lamprea de mar. Aunque el destino ambiental del TFM se conoce

perfectamente desde hace muchos años, investigaciones recientes de Munkittrick et al.

(2014) han comprobado que la formulación del TFM incluye una o más impurezas muy

potentes que influyen en el sistema hormonal de los peces y provocan enfermedades

hepáticas.

1.3 Panorama frente a los COP´s clorados

La situación general en torno a los organoclorados se ha deteriorado hasta el punto

de que muchos países han solicitado la aprobación de una convención mundial sobre los

contaminantes orgánicos persistentes (COP´s), que son en su mayor parte compuestos


clorados con altos niveles de toxicidad, muy persistentes y bioacumulativos. La lista no

está todavía terminada; no obstante, entre los "candidatos" figuran varios plaguicidas

utilizados ampliamente en los países en desarrollo.

Un número importante de pesticidas organoclorados pertenecen al grupo de los

contaminantes orgánicos persistentes (COP’s), los cuales han sido y son un motivo de

preocupación importante debido a su existencia a elevadas concentraciones, incluso en

ecosistemas remotos, y a pesar de las prohibiciones de su producción y uso (Guruge, K.S.;

Tanabe 2001)

Son compuestos con una toxicidad de amplio espectro y persistentes, por lo que se

acumulan en la cadena alimentaria, implicando altos riesgos tanto para el ecosistema como

para la salud humana. [Colborn, T. et al, 1996].

La inquietud medioambiental provocada por el uso generalizado de sustancias

tóxicas, como son los pesticidas organoclorados persistentes, ha incrementado las

restricciones en su producción y uso, primero en los países desarrollados y, más

recientemente, también en los países en vías de desarrollo. Así, los pesticidas

organoclorados están controlados y regulados por numerosas normatividades

internacionales entre las que destaca el Convenio de Estocolmo sobre Contaminantes

Orgánicos Persistentes (Stockholm Convention on Persistent Organic Pollutants), firmado

en 2001 por cerca de 120 países. Este Convenio entró en vigor el 17 de Mayo de 2004 y

su objetivo es el de conseguir la continua minimización y, de ser factible, la completa

eliminación de los COP´s. Actualmente, ya son 162 los Estados que forman parte de dicho

convenio. En esta primera fase se han fijado como objetivo sólo doce POPs, conocidos

como la docena sucia. La docena sucia incluye, además de PCBs, dioxinas y furanos, los

principales pesticidas organoclorados: aldrina, clordano, DDT, dieldrina, endrina,

heptacloro, hexaclorobenceno (HCB), alacloro y toxafeno. El Convenio de Estocolmo

requiere de todos los estados miembros el cese en la producción de los pesticidas aldrina,

dieldrina y heptacloro.



Los países con exenciones deberán restringir el uso de estos pesticidas a

propósitos concretos y por períodos de tiempo limitados. En cuanto a la producción y uso

de clordano, HCB y mirex, se han limitado a fines prescritos y en países en los que se

hayan registrado para determinadas exenciones. Por lo que al DDT se refiere, su

producción y uso está confinado al control de enfermedades como la malaria.

La mayoría de los pesticidas organoclorados son extremadamente estables,

presentan una baja solubilidad en agua y una elevada solubilidad en medios orgánicos.

Alguna de estas propiedades es la base de su peligrosidad, y es que su persistencia en el

medioambiente y su potencial de bioacumulación en tejidos animales y humanos a través

de la cadena alimentaria influyen de manera importante en los riesgos asociados con estos

pesticidas

1.4 Clasificación de los plaguicidas

Todos los plaguicidas, por definición son sustancias tóxicas, diseñadas para interferir

o modificar mecanismos fisiológicos y se clasifican en función de su toxicidad (Tabla

1.3), su aplicación (Tabla 1.4) y su persistencia y degradación (Tabla 1.5).

Tabla 1-3 Clasificación de herbicidas por su toxicidad (Ware, 1983)

Toxicidad DL50 orala (mg/kg)

DL50 dérmicoa

(mg/kg) Dosis letala(mL)

Supertóxico < 5 < 20 Unas gotas

Extremadamente

tóxico 5-50 20-200 1-2

Muy tóxico 50-500 200-1000 2-10

Moderadamente

tóxico 500-5000 1000-2000 Hasta 500

Dosis letal para ratas blancas de laboratorio


DL50 indica la toxicidad relativa de los plaguicidas y corresponde a la dosis letal media, la

cual equivale a la cantidad de plaguicida capaz de causar la muerte al 50% de los

individuos que constituyen el lote del ensayo (Ware, 1983).

Tabla 1-4 Clasificación de los plaguicidas por su uso y aplicación

Campo de aplicación Tipo de plaguicidas Compuestos químicos utilizados

Invertebrados Insecticidas Organoclorados, Carbamatos, Organoestánicos, Organofosforados, Tiocinatos, Piretroides Piretrinas, Organosulforados, Formamidinas, Dinitrofenoles

Molusquicidas Hidrocarburos, Halogenados, Isocianatos, Nematocidas Carbamatos, Organofosforados

Vertebrados Rodecidas, Avicidas, Coumarinos, Indanonas, Organoclorados Piscicidas, Repelentes

Plantas Herbicidas Derivado arsenicales, Tiocarbamatos, Nitrilos, Fenoxiacéticos, Carbamatos, Nitroanilinas, Amidas sustituidas, Derivados fenólicos, Ureas sustituidas, Heterociclos nitrogenados, Derivados Arilalifáticos,

Microorganismos Fungicidas, Bactericidas, Ditiocarbamatos, Tiazoles, Dicarboximidas,

Alguicidas, Derivados aromáticos sustituidos, Quinonas, Desinfectantes Dinitrofenoles, Organoestánicos

Tabla 1-5 Clasificación de los plaguicidas por su persistencia y procesos de degradación más comunes

Tipo de plaguicida Acción Persistencia Proceso posible inicial de degradación

Organoclorados Insecticida 2-5 años Deshidrohalogenación o epoxidación

Ureas Herbicida 4-10 meses Desalquilación

Ácidos benzoicos Herbicida 3-12 meses Deshalogenación o descarboxilación

Amidas Herbicida 2-18 meses Desalquilación

Carbamatos Herbicida, Fungicida 2-8 semanas Hidrólisis de ésteres Insecticida

Ácidos alifáticos Herbicida 3-10 Deshalogenación semanas



1.4.1 Plaguicidas del tipo herbicida amida

Los herbicidas son agentes químicos que matan plantas o inhiben su crecimiento normal.

Actúan de maneras diversas, desconocidas en muchos casos, y en teoría, tan numerosas

como los procesos vitales esenciales (National Academy of Sciences, 1989).

Aunque los herbicidas se pueden utilizar en lugar de la labranza casi siempre se

emplean juntos con ella y con otras prácticas agronómicas. La elección de la mejor

combinación varía de acuerdo con los factores agronómicos, ecológicos y económicos.

Con respecto a los últimos, se consideran diferentes aspectos dependiendo del tipo de

agroquímico, por ejemplo, el costo del uso de herbicidas no debe rebasar el valor ganado,

y los resultados reproducibles.

No existe un solo sistema de clasificación de los herbicidas. Los diferentes sistemas

se basan en criterios muy dispares, como su naturaleza química, su mecanismo de acción

o su toxicidad. No obstante, podemos dividirlos:

En función de sus efectos sobre las plantas, los herbicidas se pueden clasificar en

selectivos y no selectivos. Los herbicidas selectivos destruyen o impiden el

crecimiento de las plantas nocivas que se encuentran en un cultivo en germinación o

en crecimiento, sin dañar el cultivo. Los herbicidas no selectivos son productos

químicos tóxicos que, cuando se aplican en proporción adecuada, destruyen a todas

las plantas. No existe un herbicida que pertenezca a uno u otro grupo en particular.

En determinados casos, algunos herbicidas no selectivos actúan en forma selectiva y

si la dosificación es bastante alta, hasta un herbicida selectivo se puede convertir en

destructor general de la vegetación. Por lo tanto, la selectividad es una propiedad que

depende tanto del tipo de tratamiento como del agente químico y está regulada por

factores tales como la temporada y el método de aplicación, la formulación química y

la dosificación, las condiciones ambientales y la fase de crecimiento de la planta

cultivada o de la nociva (National Academy of Sciences, 1989).


Según su persistencia, se clasifican en residuales y no residuales; Los residuales se

aplican al suelo, sobre la tierra desnuda y forman una película tóxica que controla la

proliferación de las malas hierbas al atravesarla durante su germinación. Dos

aplicaciones al año de herbicidas residuales pueden ser suficientes para mantener un

suelo limpio de malas hierbas anuales que nacen de semilla. Normalmente no son

activos sobre especies perennes que rebrotan a partir de rizomas, estolones o

bulbillos; sí lo son en cambio si la mala hierba nace de semillas (p. ej., Terbutilazina),

No residuales: se degradan normalmente en poco tiempo por lo que solo actúan sobre

las plantas sobre las que caen cuando se aplican. A parte de esto su clasificación se

diferencian de acuerdo a la planta

1.4.2 Cloroacetanilidas

El uso extendido de herbicidas amida ha contribuido de manera importante al incremento

de la producción agrícola. Sin embargo, sus residuos también suponen cierto riesgo

desde el punto de vista de la contaminación del medioambiente. Una gran variedad de

compuestos forma parte de este grupo de herbicidas, que siguen la siguiente fórmula

general: R1-CO-N-(R2, R3). Los componentes principales de este grupo son las

cloroacetamidas N-sustituidas y las anilidas sustituidas. Tanto el acetocloro como el

alacloro pertenecen al grupo de las anilidas, más concretamente al de las

cloroacetanilidas.

Las cloroacetanilidas se utilizan para el control de malas hierbas en varios cultivos.

El alacloro y metolacloro se usa especialmente en cultivos de maíz, sorgo y semilla de

soja [EPA 2009]. Por otra parte, el acetocloro se emplea sobre todo en cultivos de maíz,

aunque también de col, cítricos, café, algodón, etc. (EXTOXNET 2009). Tanto el alacloro

como el metolacloro han sido clasificados por la EPA como carcinógenos del grupo B2

(Altamente probable carcinógeno en humanos) (EPA 1991). Además, se ha comprobado

que el alacloro y el acetocloro es un disruptor endocrino potente (EPA 1988). Por otro

lado, se ha observado que el alacloro posee genotóxicidad y también se sospecha que

pueda afectar al sistema hormonal.

https://es.wikipedia.org/wiki/Semilla

https://es.wikipedia.org/wiki/Rizoma

https://es.wikipedia.org/wiki/Estol%C3%B3n



Dentro de las cloroacetanilidas objeto de este estudio se encuentran: El alaclor y el

metolacloro; El alaclor se utiliza principalmente como tratamiento de pre-emergencia en el

control de gramíneas y algunas malezas anuales de hojas anchas, que generalmente

crecen en cultivos de maíz, cacahuates y frijol de soya (Klingman, 1980). Su mecanismo

de acción consiste en la interferencia de la síntesis de proteínas en las raíces y yemas de

las plantas (Moreno, 2003).

1.4.3 Alacloro

En la Figura 1-6, se muestra la estructura química del alaclor, el cual está

clasificado como un herbicida del tipo cloroacetanilida (Moreno, 2003) no obstante

también se considera como un herbicida de tipo clorado debido al cloro que posee en su

estructura aunque no se encuentre como tal en la clasificación dada en la Tabla 1-6, y su

respectivo destino ambiental en la tabla 1-8.

Figura 1-6 Estructura del 2-cloro-2’,6’dietilo-N-(metoximetilo)-acetanilida (alaclor)

Las características físicas y químicas más importantes de este herbicida se presentan en

la Tabla 1-6 y en la Tabla 1-7 las características ecotoxicológicas.

El contacto con el producto ocasiona irritación de piel y ojos. Si la sustancia ha sido

ingerida ocasiona los siguientes efectos: Espasmos mioclónicos, incontinencia urinaria,

cianosis, disnea y colapso (Rivero et al., 2001). Además este herbicida es considerado

como un cancerígeno del Grupo B-2 (Badriyha et al., 2003). Para su tratamiento en caso

de contaminación en la piel, se debe frotar la zona contaminada con abundante agua y

jabón. Si entra en contacto con los ojos, enjuagarlos con agua durante 15 minutos.


Cuando se ingiera hay que administrar jarabe de ipecacuana, con una dosis para

adultos de 30 mL y para niños de 15 mL, y después tomar de 1 a 2 vasos con agua. El

lavado gástrico se realiza con carbón activado con una dosis para adultos de 50-100 g en

300-800 mL y para niños de 15-30 g en 100-300 mL de agua.

Además, hay que vigilar la respiración (Rivero et al., 2001). La toxicidad de sus

productos de degradación aún no ha sido claramente establecida (Badriyha et al., 2003).

Tabla 1-6 . Características del alaclor

Característica Valor Fórmula C14H20NO2Cl

Nombre químico 2-cloro-2’,6’dietilo-N-(metoximetilo)-acetanilida

Nombre común Alaclor, Alagam, alagan, alanex, alanex 48 CE, alanex (comerciales) 90 % técnico, alanex técnico, alanox*, alaxine 30/18 LM, chimiclor, cropstar, lasso*, laso microtech, lazo*, lazzo WGD, micro-tech, partner, pilarzo, ralchlor y sanachlor

Peso molecular 269.77 g/mol

Estado físico Sólido de color crema

Punto de ebullición 100-135 °C**

Punto de fusión 40-44 °C

Densidad relativa 1.133 a 25 °C

Solubilidad en agua 140 mg/L a 23 °C, 148 mg/L**

Disolventes en que es soluble Éter, acetona, benceno, etanol y etil acetato

Presión de vapor 2.9 mPa a 25 °C

Constante de la Ley de Henry 1.3 X 10-6 **

Log octanol/coeficiente de partición del agua 2.63**

Tabla 1-7 Características toxicológicas del alaclor

Características Valor

Olor umbral 110 mg/L

Dosis de umbral 33 mg/L

Factor de bioconcentración 42.52 mg/L carne de pescado / mg/L de agua

Toxicidad en mamíferos DL50 Oral en ratas 1200 mg/kg*; 930 mg/kg

Dérmica en conejos 13,000 mg/kg

Inhalación en conejos > 5.1 mg/L *indicado únicamente en el catálogo Merck.



La Agencia de Protección Ambiental de los Estados Unidos (EPA siglas en inglés,

1990) y la Organización Mundial de la Salud (WHO siglas en inglés, 1996) consideran al

alaclor como uno de los compuestos químicos que puede causar efectos nocivos a la salud

humana por lo que su nivel máximo permisible en agua para beber establecido por la EPA

es 2 µg/L y por la WHO 20 µg/L. Se ha encontrado este herbicidas y sus metabolitos en

aguas lénticas y en aguas subterráneas en varios países debido a sus elevados valores

de movilidad en el suelo (Ahmad y Rahman, 2009; Peter y Weber, 2005).

En México, La norma oficial mexicana NOM-127-SSA1-1994 de salud ambiental,

establece para agua de uso y consumo humano los límites permisibles en función de sus

características microbiológicas, físicas, organolépticas, químicas y radiactivas, con el fin

de asegurar y preservar la calidad del agua en los sistemas de abastecimiento hasta la

entrega al consumidor. Aunque esta norma fue modificada en noviembre del 2000 por la

Secretaría de Salud, con el propósito de establecer un eficaz control sanitario del agua

para potabilizarla, con la finalidad de hacerla apta para su uso y consumo humano, no

considera actualmente a este herbicida como un contaminante químico que pueda causar

efectos nocivos a la salud.

Por otra parte existe un proyecto de norma “Agua para uso y consumo humano:

Límites máximos permisibles de la calidad del agua, control y vigilancia de los sistemas de

abastecimiento” (ANEAS 2007), que estima un mayor número de plaguicidas entre ellos el

alacloro que no está en la norma actual, sin embargo dicho proyecto aún no se ha

aprobado. (IMTA- Anne M. HANSEN, 2013).

En Colombia no existe norma que establezca límites permisibles y/o nivel de riesgo

por calidad del agua asociadas a este tipo de herbicidas, únicamente mediante Decreto

1843 de 1991, se reglamentan parcialmente los títulos III, V,VI, VII y XI de la ley 09 de

1979, sobre uso y manejo de plaguicidas.

Aunque cabe aclarar que no se cuenta estudios zonificados de cloroacetanilidas sobre los

destinos ambientales que incluya el transporte, la distribución y la degradación en los

diferentes compartimientos: agua, aire, suelo, sedimento, biota y en sus interfaces. A

continuación en la tabla 1-8, 1-9, 1-10, se detalla las propiedades ambientales medidas

para el alaclor en su valoración de destino ambiental (University of Hertfordshire, 2013)


Tabla 1-8 Destino Ambiental del Alacloro

Tabla 1-9 Degrdación del Alacloro

Propiedad Valor Interpretación

Degradación de suelo (días) (aerobic)

DT50 (típico)

14 No persistente

DT50 (laboratorio en 20oC)

35 Persistente moderado

DT50 (campo)

14 No persistente


- -

Matriz de la planta DT50 (días)

Valor 3 -

Nota -

Fotólisis DT50 (días) en pH 7

Valor 0.5 Rápido

Nota Estable a UV

Hidrólisis DT50 (días) en 20oC y pH 7

Valor 0.5 No persistente

Nota -

Aqua-Sedimento DT50 (días) 2 Rápido

Fase de agua sola DT50 (días)

- -


Solubilidad - En aqua a 20oC (mg l-1) 240 Moderado

Punto de ebullición (oC) 100 -

Punto de degradación (oC) 105 -

Punto de inflamación (oC) 137 -

Coeficiente de Octanol-aqua p en pH 7, 20oC

P 1.23 X 1003 -

Log P 3.09 Alto

Masa densidad (g ml-1)/Peso específico 1.13 -

Constante de disociación (pKa) at 25oC 0.62 -

Nota: Ácido fuerte

Presión de vapor en 25oC (mPa) 2.9 Baja volatilidad

Constante de Henry a 25oC (Pa m3 mol-1) 3.20 X 10-03 No volátil

Constante de Henry a 20oC (dimensionless) 1.31 X 10-06 Volátil moderado

Índice de potencial de lixiviación GUS 1.08 Bajo posibilidad de lixiviación

Potencial de transporte de partículas - Mediano



Tabla 1-10 Valores de Adsorción de suelo a agua –Movilidad

Propiedad Valor Fuente/Cuenta

de

Cualidad/Otra

Información

Interpretación

Lineal Kd - R3 Móvil moderado

Koc 335

Freundlich Kf 16.5 R4 Móvil un poco

Kfoc 1994

1/n 0.81

Notas y

rango

reportados

Kf : 11.8-20.5 mL/g;

Kfoc 339-4214 mL/g,

1/n 0.70-0.91,

Tabla 1-11 Valores Ecotoxicológicos reportados para alacloro

Propiedad Valo

r

Información Interpretación

Factor de la bio-

concentración

BCF (l kg-1) 39 P4 Bajo potencial

CT50 (días) No

dispo

ne

-

Mamíferos - Agudos oral LD50 (mg kg-1) 930 F4 Rata Moderado

Mamíferos - a

corto plazo

NOEL

(mg kg-1) 10 B5 Rata Alto

(ppm dieta) 200 -

Pájaros/aves - Agudos LD50 (mg kg-1) 1536 B5 Colinus virginianus Moderado

Birds - Short term dietary (LC50/LD50) - - -

Pez - agudo 96 hora LC50 (mg l-1) 1.8 B5 Oncorhynchus

mykiss

Moderado

Pez - Crónico 21 días NOEC (mg l-1) 0.19 P3 Unknown species Moderado


Invertebrados acuáticos - Agudos 48

hora EC50 (mg l-1)

10 F4 Daphnia magna Moderado

Invertebrados acuáticos - Crónicos 21

días NOEC (mg l-1)

0.22 P3 Unknown species Moderado

Plantas acuáticas - Agudos 7 día EC50,

biomasa (mg l-1)

0.01 F3 Lemna minor Moderado

Algas - Agudos 72 hora EC50,

crecimiento (mg l-1)

0.96

6

F4 Scenedesmus

quadricauda

Moderado

Algas - Crónicos 96 hora NOEC,


0.02 J3 Chlorella

pyrenoidosa

Moderado

Abejas mielíferas Contacto aguda 48

hora LD50 (μg abeja-

1)

16 K4 Moderado

Oral aguda 48 hora

LD50 (μg abeja-1)

- - -

Modo desconocido

aguda 48 hora

LD50 (μg abeja-1)

- - -

Lombrices - Agudos 14 día LC50 (mg kg-

1)

386.

8

B5 Moderado

1.4.4 Metolacloro

El metolacloro (número CAS 51218-45-2) es un herbicida selectivo de preemergencia que

se utiliza en varios cultivos. Puede desaparecer del suelo mediante biodegradación,

fotodegradación y volatilización. Es bastante móvil y puede contaminar las aguas

subterráneas y lénticas en determinadas condiciones, pero se encuentra sobre todo en

aguas superficiales lénticas (Documento WHO/SDE/WSH/03.04/39, 2003). Actúa como

inhibidor de la germinación. Se utiliza en el control de gramíneas en cultivos de algodón,

girasol, maíz, patata, remolacha. Con el fin de complementar su campo de acción, suele

formularse con atrazina y prometrina. En la Figura 1-7, se muestra la estructura química



del metolacloro, el cual está clasificado como un herbicida del tipo cloroacetanilida

(Moreno, 2003)

Figura 1-7 Estructura del Metolacloro (2-cloro N-(2-etil 6-metilfenil) N-(2-metoxi 1-

metiletil) acetamida)

Con el objeto de conocer las propiedades de destino ambiental, se relacionan las tablas 1-

12, 1-13, 1-14, donde se detallan las características del metolacloro (University of

Hertfordshire, 2013)

Tabla 1-12 Destino Ambiental del Metolacloro

Propiedad Valor Fuente/Cuenta de Cualidad/Otra Información

Interpretación

Solubilidad - En aqua en 20oC (mg l-1)

530

Alto

Solubilidad - en solventes orgánicos en 20oC (mg l-1)

Miscible Benceno -

Miscible Acetona -

Miscible Hexano -

Miscible Xileno -

Punto de fusión (oC) -62.1

-

Punto de ebullición (oC) - - -

El punto de degradación (oC) - - -

Punto de inflamación (oC) 190

-

Coeficiente de Partición Octanol-Agua en pH 7, 20oC

P 2.51 X 1003 Calculado -

Log P 3.4 Alto

Masa densidad (g ml-1)/Peso específico

1.12 -

Constante de Disociación (pKa) at 25oC

No aplicable R4 -

Nota: Ninguna disociación


Presión de vapor en 25oC (mPa)

1.7 Baja volatilidad

Constante de Henry a 25oC (Pa m3 mol-1)

2.40 X 10-03 No volátil

Constante de Henry a 20oC (dimensionless)

4.13 X 10-07 Volátil moderado

Índice de potencial de lixiviación GUS

2.10 Calculado Estado de transición

Tabla 1-13 Degradación del Metolacloro


Degradación de suelo (días) (aerobic)

DT50 (típico) 90 Persistente moderado


15 No persistente

DT50 (campo)

21 No persistente


- -

DT90 (campo)

- -


Valor 13.8 -

Nota DT50 range 8.5 - 24.4 days, 2 crops/plants, various matrices

Acuoso fotólisis DT50 (días) en pH 7

Valor Estable -

Acuoso hidrólisis DT50 (días) en 20oC y pH 7

Valor Estable -

Tabla 1-14 Mecanismo de absorción del suelo y la movilidad del metolacloro


Lineal Kd 0.67 Móvil moderado

Koc 120

Notas y rango Kd rango 0.33-1.64 mL/g, Koc rango 50.0-540 mL/g,

Freundlich Kf 0.93 Móvil moderado

Kfoc 163 1/n 0.888



Notas y rango Kf range 0.07-2.57 mL/g, Kfoc range 51.7-600 mL/g, 1/n range 0.55-1.35,

Tabla 1-15 Valores Ecotoxicológicos reportados para metolacloro


Interpretación

Factor de la bio-concentración

BCF (l kg-1) 68.8 Q3 Whole fish Bajo potencial

CT50 (días) 1.5 -

Mamíferos - Agudos oral LD50 (mg kg-1)

1200 G4 Rata Moderado

Mamíferos - a corto plazo NOEL

(mg kg-1) 90 G4 Rata Alto

(ppm dieta) - -

Pájaros/aves - Agudos LD50 (mg kg-1)

2000 G4 Anas platyrhynchos

Moderado

Birds - Short term dietary (LC50/LD50)

- - -

Pez - agudo 96 hora LC50 (mg l-1)

3.9 G4 Oncorhynchus mykiss

Moderado

Pez - Crónico 21 días NOEC (mg l-1)

- - -

Invertebrados acuáticos - Agudos 48 hora EC50 (mg l-1)

23.5 G4 Daphnia magna Moderado

Invertebrados acuáticos - Crónicos 21 días NOEC (mg l-1)

0.707 F3 Daphnia magna, LOEC

Moderado

Crustáceos acuáticos - Agudos 96 hora LC50 (mg l-1)

4.2 F3 Americamysis bahia

Moderado

Plantas acuáticas - Agudos 7 día EC50, biomasa (mg l-1)

0.043 F3 Lemna gibba Moderado

Non-target plants - - -

- - -

Algas - Agudos 72 hora EC50, crecimiento (mg l-1)

57.1 F4 Pseudokirchneriella subcapitata

Bajo

Algas - Crónicos 96 hora NOEC, crecimiento (mg l-1)

- - -

Oral aguda 48 hora LD50 (μg abeja-1)

110 F4 Bajo

Lombrices - Agudos 14 día LC50 (mg kg-1)

140 G4 Moderado


1.4.5 Carboxiamidas clorados con imidazoles

El N-propil-N-[2-(2,4,6-triclorofenoxi)etil]imidazol-1-carboxamida (Procloraz) , es

propiamente un fungicida sistémico pero muestra cierta acción traslaminar de herbicida

Actúa impidiendo la síntesis del ergosterol, componente esencial de la membrana celular,

bloqueando la desmetilación en posición C14. Particularmente adecuado para controlar

Ascomicetos y Deuteromicetos en muchos cultivos.

Se degrada en el suelo y agua a una serie de metabolitos principalmente volátiles;

la degradación no depende del pH pero sí de la flora microbiana. Se adsorbe muy bien a

los coloides del suelo y no se lixivia fácilmente, según tipo de suelo. Su vida media en el

campo es de 15 días en suelos arcillosos y de 37 días en los arenosos. El pH ácido le

propicia estabilidad, la que también está en relación directa con el contenido de materia

orgánica.

Con CAS No. 67747-09-5. CIPAC 407. Su estructura mostrada en la Figura 1-8,

de apariencia sólida cristalino incolora e inodora, es soluble en keroseno, cloroformo,

xileno, dietil éter, tolueno y acetona. En la tabla Esta sustancia se descompone durante el

calentamiento prolongado a temperaturas mayores a 200 °C

Figura 1-8 Estructura del N-propil-N-[2-(2,4, 6-triclorofenoxi) etil] imidazol-1-carboxamida (Procloraz)



Tabla 1-16 Datos generales del procloraz (University of Hertfordshire, 2013)

Parámetros Comentario

Tipo de pesticida Fungicida-Herbicida

Grupo químico Imidazol/Carboxiamidas

Impurezas relevantes Dioxanos y furanos <0.1 mg/kg

Sustancias de origen Sintéticas

CAS RN 67747-09-5

CEE número 266-994-5

Número CIPAC 407

COD EPA 128851

Fórmula química C15H16Cl3N3O2

SMILES CCCN(CCOC1=C(C=C(C=C1Cl)Cl)Cl)C(=O)N2C=CN=C2

International Chemical Identifier Key (InChIKey)

TVLSRXXIMLFWEO-UHFFFAOYSA-N

Masa molecular (g mol-1)

376.7

Nombre IUPAC N-propyl-N-[2-(2,4,6-trichlorophenoxy)ethyl]imidazole-1-

carboxamide

Nombre CAS N-propyl-N-(2-(2,4,6-trichlorophenoxy)ethyl)-1H-imidazole-1-

carboxamide

Herbicide Resistance Classification (HRAC)

No aplicable

Herbicide Resistance Classification (WSSA)

No aplicable

Insecticide Resistance Classification (IRAC)

No aplicable

Fungicide Resistance Classification (FRAC)

3

Examples of recorded resistance

-

En las tablas 1-17 al 1-21 se detallan por componente de valoración de compartimentación

evaluada en el destino ambiental del procloraz.

Tabla 1-17 Destino ambiental para el procloraz (University of Hertfordshire, 2013)


Interpretación

Solubilidad - En aqua en 20oC (mg l-1)

26.5

Bajo

Solubilidad - en solventes organicos en 20oC (mg l-1)

600000 Acetato de etilo -

600000 Acetona -

7500 Hexano -


600000 Metanol -

Punto de fusión (oC)

48.3 -

El punto de degradación (oC)

220 -

Coeficiente de Partición octanol-agua en pH 7, 20oC

P 3.16 X 1003 Calculado -

Log P

3.5 Alto

Masa densidad (g ml-1)/Peso específico

1.42 -

Disociación constante (pKa) at 25oC

3.8 -

Nota: Base débil

Presión de vapor en 25oC (mPa)

0.15 Baja volatilidad

Constante de Henry a 25oC (Pa m3 mol-1)

1.64 X 10-03 No volátil

Constante de Henry a 20oC (dimensionless)

6.74 X 10-07 Volátil moderado

Índice de potencial de lixiviación GUS

1.98 Calculado Estado de transición

SCI-GROW (μg l-1)

Valor 8.10 X 10-02 Calculado -

Tensión superficial (mN m-1)

53.07 A 20°C -

Tabla 1-18 Degradación del Procloraz (University of Hertfordshire, 2013)


Degradación de suelo –agua (días) (aerobico)

DT50 (típico)

120 Persistente


223.6 Persistente

DT50 (campo)

16.7 No persistente


865.0 -



DT90 (campo)

1124 -


Valor 5.2 -

Acuoso fotólisis DT50 (días) en pH 7

Valor 1.5 Moderado rápido

Nota

Acuoso hidrólisis DT50 (días) en 20oC y pH 7

Valor Estable -

Nota Estable a pH 5 and pH 7, DT50 78.9 days at pH 9, all at 22 degC

Aqua-Sedimento DT50 (días)

359 Lento

Fase de agua sola DT50 (días)

2.0 Moderado rápido

Tabla 1-19 Movilidad del Procloraz (University of Hertfordshire, 2013)


Lineal Kd - Móvil un poco

Koc 500

Freundlich Kf 38.0 Móvil un poco

Kfoc 1440

1/n 0.81

Sensibilidad a pH Baja absorción en condiciones

alcalinas

Tabla 1-20 Metabolitos intermediarios del Procloraz (University of Hertfordshire, 2013)

Metabolitos Intermediarios Medio de formación Fracción Ocurrencia

Importancia

N-formyl-N'-propyl-N'-2(2,4,6-trichlorophenoxy)ethylurea (Ref: BTS 44596)

Suelo /Agua 0.128 Relevante

http://sitem.herts.ac.uk/aeru/footprint/es/Reports/1439.htm




Tabla 1-21 Valores ecotoxicológicos para el Procloraz (University of Hertfordshire, 2013)

Propiedad Valor Fuente/Cuenta

de

Cualidad/Otra

Información

Interpretación

Factor de la bio-

concentración

BCF (l kg-1) 371 A5 Umbral de

importancia

CT50 (días) 3.4 -

Mamíferos - Agudos oral LD50 (mg

kg-1)

1023 A5 Rata Moderado

Mamíferos - a corto

plazo NOEL

(mg kg-1) - - -

(ppm dieta) - -

Pájaros/aves - Agudos LD50 (mg kg-

1)

662 A5 Colinus

virginianus

Moderado

Birds - Short term dietary

(LC50/LD50)

> 1580

mg kg-

1 bw/día

A5 Colinus

virginianus

-

Pez - agudo 96 hora LC50 (mg l-1) 1.5 A5 Oncorhynchus

mykiss

Moderado

Pez - Crónico 21 días NOEC (mg l-

1)

0.049 A5 Pimephales

promelas, 36 día

Moderado

Invertebrados acuáticos - Agudos

48 hora EC50 (mg l-1)

4.3 A5 Daphnia

magna

Moderado

Crustáceos acuáticos - Agudos 96

hora LC50 (mg l-1)

0.77 A5 Americamysis

bahia

Moderado

Sediment dwelling organisms -

Crónicos 28 día NOEC, estático,

agua (mg l-1)

>= 0.8 A5 Chironomus

riparius

Moderado

Plantas acuáticas - Agudos 7 día

EC50, biomasa (mg l-1)

0.171 A5 Lemna gibba Moderado

Non-target plants > 1.0 A5 Oats in crop,

Vegetative

-



vigour, ER50,

Vegetative

vigour, ER50, as

L product/ ha

(BAS 590 00F)

Algas - Agudos 72 hora EC50,


> 0.0055 A5 Scenedemus

subspicatus

Alto

Algas - Crónicos 96 hora NOEC,


0.01 Q2 Unknown

species

Moderado

Abejas mielíferas Contacto

aguda 48

hora

LD50 (μg

abeja-1)

141.3 A5 Bajo

Oral aguda

48 hora

LD50 (μg

abeja-1)

> 101 A5 Bajo

Lombrices - Agudos 14 día

LC50 (mg kg-1)

> 500 A5 Eisenia

foetida corr

Moderado

Lombrices - Crónicos 14 día NOEC,

reproducción (mg kg-1)

4.2 A5 Eisenia

foetida corr

Moderado

Other soil macro-

organisms - e.g.

Collembola

LR50 / EC50 /

NOEC / %

Causalidad

> 200 A5 Folsomia

candida, 28 día

NOEC mg kg-1

-

Otro arthropoda (1) LR50 g ha-1 85.1 48 hora

A5 Aphidius

rhopalosiphi,

adult

-

Otro arthropoda (2) LR50 g ha-1 44.3 7 día

A5 Typhlodromus

pyri, adult

-


1.5 Importancia de la remoción de las cloroacetanilidas como contaminante. Estado actual y su relación con moléculas orgánicas emergentes

En la actualidad las amidas cloradas, específicamente las cloroacetanilidas son de los

herbicidas más usados en Europa, Japón y el Norte y Sur del Continente Americano, se

encuentra comúnmente en aguas contaminadas. Sus propiedades tóxicas imponen la

necesidad de conocer su destino y atenuar su presencia en aguas naturales.

En las figuras 1-6 y 1-7, se ven que estos compuestos son derivados de la anilida,

la cual está sustituida tanto con un grupo éter como con cloro y un grupo etilo en posición

orto del bencilo.

A pesar de que este compuesto no está formalmente incluido en los compuestos

clorados se ubica comúnmente dentro de los organoclorados persistentes y emergentes.

Los contaminantes emergentes clorados, corresponden en la mayoría de los casos

a contaminantes no regulados, que en la actualidad generan acción ecotoxicológica en

muchos paises, que pueden ser candidatos a regulación futura (UNAM, 2012)

dependiendo de investigaciones sobre sus efectos potenciales en la salud y los datos de

monitoreo de destino ambiental respecto a su incidencia; El alacloro y metolacloro

mediante resonancia magnética nuclear y de mecánica molecular fueron informados hace

unos 10 años ya que era evidente que también su estructura molecular definía su

comportamiento mecanístico en el ambiente y no únicamente sus propiedades físicas,

químicas y toxicológicas (Schmidt et al., 1995).

La composición química de las cloroacetanilidas, y específicamente del alacloro, le

impone una multifuncionalidad que aunada a su movilidad conformacional provoca su

inestabilidad química y en consecuencia su degradación paulatina en el tiempo y el

ambiente. El alaclor puede degradarse rápidamente en condiciones anaeróbicas en



sistemas acuáticos (Graham et al., 2000). De aquí que varios trabajos se han realizado

enfocando diversos aspectos del herbicida.

Es claro que uno de los mayores retos de la ingeniería química ambiental son los

contaminantes emergentes (a los cuales pertenecen los organoclorados persistentes), ya

que a la fecha existe un conocimiento incipiente sobre los riesgos que suponen para la

salud humana y el medio ambiente asociado con su presencia, frecuencia de aparición,

interacción química entre los diversos elementos que constituyen la matriz acuosa. Por

ello, existen líneas de investigación prioritaria de los principales organismos dedicados a

la protección de la salud pública y medioambiental: OMS, EPA, Comisión Europea.

Actualmente, la Directiva 2013/39/UE es la que regula las sustancias

prioritarias en el ámbito de la política de aguas. Esta directiva modifica la DMA (Directiva

Marco del Agua 2000/60/EC) y la EQSD (Environmental Quality Standards Directive) en

cuanto a las sustancias prioritarias en el ámbito de la política de aguas, y amplía la lista

hasta 45 sustancias prioritarias, de las cuales 21 son identificadas como peligrosas.

Con esta nueva Directiva Europea aprobada en el mes de agosto de 2013, Europa

se encuentra en un punto en la que se requiere capacidad de monitorización y detección

de tales sustancias y un salto tecnológico en el tratamiento de aguas. Ya no es suficiente

tratar las aguas con las tecnologías convencionales se necesita de técnicas de ingeniería

química ambiental que den un paso más y trabajen en el desarrollo de tecnologías

emergentes.

En este viaje a través de las investigaciones en los últimos 10 años de diversos

científicos en busca de una mejor remediación al efecto del uso y mal uso de las

cloroacetanilidas (alacloro y metolacloro) y carboxiamidas cloradas (procloraz) , ya sea

mediante su degradación en agua por diversos métodos o protegiéndolo de ésta en suelos,

encontramos que es importante continuar con la búsqueda de alternativas a los procesos

mencionados que permitan su remoción mediante, descomposición, separación y/o

inmovilización, o mediante técnicas que involucran la interdisciplinariedad de la ingeniería

química ambiental, la microbiología y la bioquímica.

http://www.boe.es/doue/2013/226/L00001-00017.pdf


1.6 Formas de controlar las cloroacetanilidas

Los herbicidas cloroacetanilidicos son instrumentos químicos imprescindibles en la

agricultura de todo el mundo para el control de plagas de cultivos tan esenciales como los

del trigo (Poaceae), maíz (Zea mays), cebolla (Allium cepa), incluidos los de producción

ilícita (Erythroxylum coca), por lo que no resulta una tarea fácil prohibir su uso, por tanto

se debe pensar en alternativas sostenibles para detener, aminorar o remediar la grave

contaminación producida por estos productos. Algunas opciones son: los procesos de

oxidación avanzada (POAs), Procesos físicos que emplean carbón activo, empleo de

membranas, la sonicación, lixiviación, los procesos biodegradativos (plantas, hongos y

bacterias), la mezcla de los mismos, entre otros.

1.6.1 Procesos de oxidación avanzada (POAs)

Los procesos de oxidación avanzada (AOPs por sus siglas en inglés Advanced Oxidation

Processes), emplean procesos químicos, fotoquímicos, sonoquímicos o técnicas

radiolíticas para provocar la degradación química de los contaminantes. El proceso más

comúnmente usado es por medio de H2O2, O3 u O2 como agentes oxidantes. Aquí el radical

oxidrilo (•OH) es el responsable de la degradación química (Legrini et al., 1993; Huston y

Pignatello, 1999; Chiron et al., 2000), la desventaja de estos métodos es que únicamente

son útiles para bajas concentraciones de contaminante xenobiótico.

Las cloroacetanilidas son sustancias complejas generalmente con baja

biodegradabilidad y resistentes a los tratamientos convencionales (valorados en función

de su destino ambiental), por lo cual se propone el uso de procesos de oxidación avanzada

(AOPs) (Dantas et al., 2008)

Los POAS, entre ellos el proceso Fenton y sus modificaciones se caracterizan por

generar radicales hidroxilo (altamente inestables y con un alto potencial de oxidación), que

reaccionan con sustancias orgánicas por abstracción del hidrógeno o adición electrofílica



a dobles enlaces o reaccionan con anillos aromáticos con sustituciones (Collin 2006; Merli

et al., 2003, Von Sonntag y Von Gunten, 2012). Por lo tanto la presencia la presencia de

dobles enlaces y anillos aromáticos en las cloroacetanilidas, permite que sean degradados

al reaccionar con radicales hidroxilos.

El agente Fenton es una mezcla del peróxido de hidrógeno (H2O2) y Fe+2, donde

el hierro inicia y cataliza la reacción de descomposición de H2O2 , para generar radicales

hidroxilo (•OH). El proceso Fenton tradicional es una reacción en cadena.

El estrecho rango de pH de aplicabilidad del Fentón tradicional (2<pH<3) y la

necesidad de un control permanente para evitar la precipitación de oxihidróxidos de hierro,

son una limitación del procedimiento (Kang y Wang, 2000). La modificación del tratamiento

con un agente quelante permite mantener soluble el Fe+3 para poder generar Fe+2 a pH

neutro (Huang et al., 2013), de esta forma el tratamiento puede llevarse a cabo en un

margen más amplio de pH de forma homogénea (Dantas et. Al, 2008).

Estudios como el de Bolobajev et al (2015), donde se degrado cloroacetanilidas

mediante Fenton modificado a pH neutro con ácido ascórbico han demostrado que la

presencia de un agente quelante mejora el proceso sustancialmente. El foto-Fenton usa la

radiación UV para mejorar la reacción de regeneración del Fe+2 a partir del Fe+3 formado.

Además para crear complejos fotoactivos y más radicales hidroxilos. Los complejos

formados tienen típicamente mayores coeficientes de extinción molar en las regiones UV

cercano y visible que los complejos agua-Fe+3. Adicionalmente, la foto excitación a través

de la transferencia de carga de ligando a metal tiende a la producción de Fe+2. (De la Cruz

et al., 2012)

Existen otras técnicas fotolíticas, entre los más importantes están: el estudio de su

fotodegradación con adsorbedores catalíticos como el TiO2 y/o cloruro férrico o fotólisis

directa con fuentes ultravioletas en solución acuosa (Wong y Chu, 2003), estudios

comparativos de su cinética de degradación usando los dos catalizadores ya mencionados

y con un foto-reactor con arco de xenón para el estudio de la cinética de la fotólisis de las

cloroacetanilidas (Peñuela y Barceló, 1996), y las propiedades de lixiviación en suelos de

sus productos de degradación (Fava et al., 2000) que entre los más importantes están el


ácido etano sulfónico y ácido oxanílico, los cuales potencializan la acción tóxica y

disruptora en cuerpos de agua lénticos.

Todos estos son proceso prohibitivos debido a su alto costo por lo que se prefiere

pensar en tratamientos combinados de oxidación catalítica, hasta un cierto grado, seguido

por un proceso biológico. Por lo anterior, es muy importante que el efluente producido

durante la oxidación catalítica no sea tóxico ni inhiba a los microorganismos presentes en

el tratamiento biológico convencional. A pesar de la cantidad de trabajos dedicados al uso

solo unos pocos estudian la biodegradabilidad asociada y la ecotoxicidad, destino

ambiental final e inhibición de los efluentes producidos (Suárez-Ojeda et al., 2007 a,b,c;

Rubalcaba et al., 2007, SuárezOjeda, 2006).

1.6.2 Procesos Físicos

Procesos físicos como es el uso de carbón activado (Campos et al., 2000), arcillas y

zeolitas (Bottero et al., 1994), que permiten la remoción de los plaguicidas del agua

(Martínez, 2001).

Los carbones activados (ACs) son materiales versátiles que poseen no solamente

excelentes cualidades como adsorbentes y soportes de catalizadores sino que también

han mostrado una actividad catalítica importante en la oxidación de diferentes compuestos.

Una revisión de la literatura dedicada demuestra la poca atención que ha recibido la

actividad catalítica de los ACs con respecto al resto de los catalizadores (Fortuny et al.,

1998; Stüber et al., 2001; Nunoura et al., 2002; Suárez-Ojeda et al., 2005, Eftaxias et al.,

2006, Quesada et al., 2008). Los ACs son materiales baratos debido a su fácil obtención a

partir de cualquier fuente carbonácea mediante la activación física o química y la pirólisis

a temperaturas elevadas. Existe una gran variedad de ACs comerciales y dependiendo de

la preparación de los mismos, ellos pueden poseer un área superficial específica que varía

entre 10 y 2500 m2 /g y una distribución del tamaño de poros que incluye microporos (2-50

nm) y macroporos (>50 nm). Estas propiedades estructurales les confieren las excelentes



cualidades como adsorbente, que ellos poseen. Por otro lado los ACs poseen grupos

funcionales en su superficie (ácidos, básicos o neutros) que pueden afectar sus cualidades

como adsorbente (Terzyk y Rychlicki, 2000; Terzyk, 2002; Terzyk et al., 2003; Quesada et

al., 2007), como soporte de catalizador o catalizador (Stüber et al., 2005). Boehm (1994),

Stöhr et al. (1991) y Radovic y Rodríguez-Reinoso (1997) señalan en sus trabajos que los

grupos funcionales de la superficie de los ACs juegan un papel fundamental en el

mecanismo de reacción heterogénea, por lo que la tendencia a relacionar la actividad

catalítica de los ACs con el área superficial debe cambiarse. Los escasos reportes

encontrados sobre la utilización del AC como catalizador, utilizan fenol y fenoles sustituidos

como contaminantes modelos y estudian fundamentalmente la actividad catalítica, la

estabilidad del AC y el rendimiento. No obstante, algunos trabajos, de reciente aparición,

estudian el papel que juega la química de la superficie y las propiedades estructurales en

la reacción de oxidación (Baricot, 2008; Quintanilla et al., 2008; Santiago et al., 2005).

Un parámetro clave para el desarrollo y la aplicación de la ACs es la estabilidad y

la desactivación del catalizador utilizado. Tanto de forma general, como para el caso

particular del uso de los ACs, este es un aspecto escasamente estudiado.

Descomponer el alacloro y metolacloro para eliminarlos es un proceso común en el

tratamiento de aguas; sin embargo, cuando se aplica a matrices acuosas, como un

concentrado emulsionado, lo importante es protegerlo de la foto-descomposición por luz

solar, ya que se forman principalmente metabolitos sulfónicos del alaclor (Aga y Thurman,

2001). En esta dirección algunos bioensayos han mostrado que usando formulaciones del

alaclor en organo-arcillas se mejora la fotoprotección, reduce su volatilización y mantiene

la actividad del herbicida en el suelo en condiciones de laboratorio y de campo. La

disminución de su degradación o volatilización es función de la cantidad de adsorción del

herbicida en la organoarcilla donde la arcilla actúa principalmente como fotoprotectora y el

catión orgánico se ocupa de mejorar la adsorción del herbicida; se ha probado que esta

formulación incrementa la cosecha en 1 año de experimento en campo y también es útil

para el control del metolaclor (El-Nahhal et al., 1999, El-Nahhal et al., 2001).


1.6.3 Procesos que emplean membranas

En la eliminación de contaminantes emergentes organoclorados de aguas residuales

pueden emplearse diversos tipos de procesos que emplean membranas, tal como micro

filtración, ultrafiltración, nanofiltración, ósmosis inversa, electrodiálisis, reactores de

membranas y combinaciones de membranas en serie. Se trata de tecnologías cuyo uso se

está incrementando en el campo de las tecnologías de tratamiento de aguas residuales.

Sin embargo, la microfiltración y ultrafiltración no son procesos totalmente efectivos en la

eliminación de contaminantes orgánicos organoclorados, debido a la capacidad de

retención limitada de las membranas así como a los fenómenos de ensuciamiento (fouling)

1.6.4 Procesos de Lixiviación y sonodegradación

La lixiviación de éstos organoclorados (la lixiviación es el proceso de percolación de una

sustancia disuelta y su transporte en el suelo y subsuelo principalmente) es de particular

importancia ya que podrían ser más perjudiciales que el alaclor, metolaclor y procloraz

mismo. Otro proceso de degradación propuesto ha sido la sonodegradación con ondas

ultrasónicas que acelera el proceso de destrucción del alaclor mediante el sonido

(Wayment y Casadonte, 2002).

Cuando una onda sonora se propaga en un medio líquido, las partículas de éste

oscilan alrededor de su posición de equilibrio sin que exista un movimiento del conjunto

del medio. Las variaciones de presión provocadas por la onda conducen a la aparición de

fases de compresión y expansión en el seno del medio. Estos ciclos de presión son el

origen mismo del fenómeno de cavitación acústica. La distancia promedio entre las

moléculas en el líquido variará en la medida que las mismas oscilen alrededor de su

posición de equilibrio. Cuando la presión en un punto disminuye lo suficiente, de forma tal

que se excede la fuerza de cohesión del líquido (presión del líquido menor que su tensión

de vapor), entonces se crean burbujas de vapor o gas. Este fenómeno se denomina

cavitación. Una vez que las burbujas de cavitación están formadas, ellas crecen, oscilan e



implotan bajo la acción del campo ultrasonoro. El tiempo de vida de la burbujas de

cavitación es del orden de los microsegundos y la implosión violenta de las mismas genera,

de manera localizada y transitoria, altas temperaturas (5000oC en el interior de la burbuja),

presiones (100 MPa) y la formación de especies altamente reactivas tales como los

radicales hidroxilos (•OH), los radicales hidroxiperoxilo (•OOH) y el peróxido de hidrógeno

(H2O2). (Adewuyi, 2005). Las condiciones creadas al momento de la implosión favorecen

tanto las reacciones de oxidación con los radicales formados como la pirólisis de algunos

compuestos.

Estudios realizados demuestran la existencia de tres zonas potenciales donde

pueden ocurrir las reacciones químicas bajo la influencia del ultrasonido, el núcleo gaseoso

que contiene los gases presentes en el medio y vapores de la mezcla reaccionante; la

interfase gas-líquido y el seno del líquido (Ince et al., 2001; Thompson y Doraiswamy,

1999).

La magnitud de las reacciones que van a tener lugar en cada zona depende de las

condiciones del sistema (frecuencia, potencia, etc.) y de las características del medio

reaccionante (volatilidad, solubilidad de los componentes). Por ejemplo, los contaminantes

hidrofóbicos (carboxiamidas) con altas presiones de vapor tienen una tendencia marcada

a difundir hacia el interior de la burbuja y reaccionar en la interfase o en la burbuja

propiamente dicha, ya sea por pirólisis u oxidación con los radicales •OH o ambas. Por el

contrario, los contaminantes hidrofílicos (cloroacetanilidas), con bajas presiones de vapor,

permanecerán en el seno de líquido donde reaccionarán con los radicales •OH. La

cavitación está influenciada por parámetros propios de la onda, como la frecuencia y la

intensidad; por las propiedades del medio y por las condiciones operatorias del sistema.

El uso de los reactores sonoquímicos en la degradación de contaminantes

orgánicos persistentes no es un tema nuevo para los investigadores y existen numerosas

publicaciones donde se reporta el uso del ultrasonido a escala de laboratorio para la

degradación de hidrocarburos aromáticos y clorados, colorantes, surfactantes, pesticidas

y herbicidas. La mayoría de estos estudios se realizan a escala de laboratorio y utilizan

soluciones modelo. El primer reporte sobre el uso de la sonólisis para el tratamiento de


contaminantes farmacéuticos (ambroxol) aparece en el año 2003 y luego no existe ninguna

otra bibliografía hasta el año 2007 donde se reporta el uso de la sonoquímica para el

tratamiento del ibuprofeno, el diclofenaco y de algunos fármacos disruptores del sistema

endocrino (Méndez et al., 2008; Hartmann et al., 2008; Belgiorno et al., 2007 y Fu et al.,

2007). Por otro lado, la degradación de efluentes reales lénticas ha sido poco estudiada.

Peters (2001) reporta los resultados positivos de la degradación sonolítica (F=361 kHz,

Pcal= 52 W, T= 9.8 °C, pH=6.28, V= 0.2 L) del 1,2 dicloroetano en una solución modelo y

en una muestra natural en presencia de otros compuestos orgánicos volátiles.

La degradación completa de todos los compuestos se logra en 2 horas. Sangave y

Pandit (2004) demuestran el aumento de la velocidad de biodegradación de una muestra

real de una destilería sometida a 3 horas de tratamiento ultrasónico (DQO=10000 mg/L,

F=22 kHz, P=120 W, V=1 L). Los autores recomiendan el uso del ultrasonido como paso

previo antes del tratamiento biológico, lo que convierte las moléculas complejas presentes

en el medio en otras más simples fácilmente biodegradables.

1.6.5 Procesos que involucran procesos biológicos

Los microorganismos juegan un papel muy importante en el proceso de limpieza del agua

contaminada con desechos industriales. Estos desechos incluyen los desperdicios que

salen de las minas, las curtiembres, las fábricas productoras de azúcar, panela etc. que

son colocados en el agua por las industrias para poder deshacerse de ellos, sin tener en

cuenta su capacidad de destruir el medio ambiente.

Este proceso de limpiar para remediar los daños causados por procesos

industriales se denomina BIOREMEDIACIÓN y no solo se atribuye a la limpieza del agua,

también se puede aplicar a otros espacios tales como paredes, cuadros, artesanías etc.

El motivo por el cual las bacterias, los hongos, las algas pueden desarrollar procesos de

biorremediación es porque hay algunos de ellos capaces de resistir pHs extremos o lugares

con alto contenido de sustancias tóxicas, las cuales son aprovechadas por estos



microorganismos, y a veces por plantas, para realizar sus propios procesos metabólicos.

Esto implica crecer y reproducirse en estos ambientes, que también pueden concebirse

como extremos.

En procesos de bioremediación se encuentran bacterias reductoras de sulfatos, que

convierten los metales contaminantes en insoluble. Al lograr ese estado, el material

contaminante se convierte en filtrable por ende, separable del medio ambiente al que está

contaminando. Este proceso de insolubilizar el material contaminante es una de las formas

más eficaces de separación.

La bio-remediación que tiene como objetivo desintegrar los plaguicidas por medio

de microorganismos con la ayuda de bio-reactores generando compuestos más simples y

mucho menos dañinos. Entre los problemas que limitan el uso de la bio-remediación están

que sólo es útil para compuestos específicos, la degradación es lenta, el metabolismo no

es del todo documentada y la bio-película debe regenerarse (Stamper y Tuovinen, 1998).

La bio-remediación utiliza tanto enzimas (degradación enzimática) como

microorganismos fundamentalmente (degradación por microorganismos), bacterias, pero

también hongos, y levaduras, plantas para transformar contaminantes orgánicos en

compuestos más simples poco o nada contaminantes, y por lo tanto se puede emplear

para descontaminar terrenos o aguas contaminadas con cualquier clase de agente

xenobiótico (Glazar y Nikaldo 1995). Su ámbito de aplicabilidad es muy amplio, pudiendo

considerarse como objeto cada uno de los estados de la materia (Atlas y Unterman, 1999)

2.6.5.1 Degradación enzimática

Este tipo de degradación consiste en el empleo de enzimas en el sitio contaminado con el

fin de degradar las sustancias nocivas. Estas enzimas se obtienen en cantidades

industriales por bacterias que las producen naturalmente, o por bacterias modificadas

genéticamente que son comercializadas por las empresas biotecnológicas. En estos

casos, se aplican grupos de enzimas que hidrolizar (rompen) polímeros complejos para


luego terminar de degradarlos con el uso de microorganismos. Un ejemplo lo constituyen

las enzimas lipasas (que degradan lípidos) que se usan junto a cultivos bacterianos para

eliminar los depósitos de grasa procedentes de las paredes de las tuberías que transportan

los efluentes. Otras enzimas que rompen polímeros utilizados de forma similar son las

celulosas, proteinasas y amilasas, que degradan celulosa, proteínas y almidón,

respectivamente. Además de hidrolizar estos polímeros, existen enzimas capaces de

degradar compuestos altamente tóxicos. Estas enzimas son utilizadas en tratamientos en

donde los microorganismos no pueden desarrollarse debido a la alta toxicidad de los

contaminantes. Por ejemplo, se emplea la enzima peroxidasa para iniciar la degradación

de fenoles y aminas aromáticas cloradas presentes en aguas residuales. (UNAM, 2006).

2.6.5.2 Degradación por plantas (Fitorremediación)

La fitorremediación es el uso de plantas para limpiar ambientes contaminados.

Aunque se encuentra en desarrollo, constituye una estrategia muy interesante, debido a la

capacidad que tienen algunas especies vegetales de absorber, acumular y/o tolerar altas

concentraciones de contaminantes como metales pesados, compuestos orgánicos y

radioactivos.

1.7 Degradación Bacteriana (Biorremediación)

Todos los contaminantes poseen características que los hacen capaces de perturbar el

medio ambiente y provocar daño a la salud humana y del planeta. Crear estrategias de

biorremediación para eliminarlos todos es un camino que se está iniciando para esta rama

de la ingeniería química ambiental Existen grupos de compuestos especialmente

peligrosos para el hombre en los que la biorremediación bacteriana ha logrado importantes

avances. Uno de estos grupos son los organoclorados, compuestos orgánicos no naturales

que tienen cloro en su molécula y son capaces de intervenir en los procesos celulares

normales, entre otros la reproducción.



La remediación usan microorganismos directamente en el foco de la

contaminación. Los microorganismos utilizados en biorremediación pueden ser los ya

existentes (autóctonos) en el sitio contaminado o pueden provenir de otros ecosistemas,

en cuyo caso deben ser agregados o inoculados (UNAM Biotecnologia, 2006). La

descontaminación se produce debido a la capacidad natural que tienen ciertos organismos

de transformar moléculas orgánicas en sustancias más pequeñas, que resultan menos

tóxicas. El hombre ha aprendido a aprovechar estos procesos metabólicos de los

microorganismos. De esta forma, los microorganismos que pueden degradar compuestos

tóxicos para el ambiente y convertirlos en compuestos inocuos o menos tóxicos, se

aprovechan en el proceso de biorremediación. De esta forma, reducen la polución de los

sistemas acuáticos y terrestres. La gran diversidad de microorganismos existente ofrece

muchos recursos para limpiar el medio ambiente y, en la actualidad, esta área está siendo

objeto de intensa investigación.

La alternativa a la utilización de cepas individuales es la obtención y utilización de

cultivos mixtos (consorcios), los cuales pueden ser consorcios definidos y consorcios no

definidos. Los consorcios definidos se caracterizan por ser una combinación de cepas

aisladas con capacidades degradativas conocidas que son complementarias entre sí.

(KomukaiNakamura et al., 1996; Casellas et al., 1998; Foght et al., 1998; Foght et al.,

1999). Los consorcios no definidos se caracterizan por ser el resultado de procesos

directos de enriquecimiento a partir de muestras ambientales con historia previa de

contaminación (Venkateswaran et al., 1995; Sugiura et al., 1997; Budzinski et al., 1998) y

por lo tanto no son el resultado de una combinación de cepas previamente aisladas.

1.7.1 Tipos de consorcios bacterianos

2.7.1.1 Consorcios definidos

Los consorcios definidos están bien caracterizados y son repetitivos pero tienen ciertas

desventajas. En primer lugar, se necesitaría un gran número de cepas distintas para

conseguir una degradación extensa del organoclorado, debido a la gran cantidad de

posibles interacciones y al espectro metabólico limitado de una cepa bacteriana (Leahy et


al. 1990). De hecho, tal y como se ha descrito anteriormente, muchos degradadores de

alcanos no utilizan HAPs parentales, y entre los degradadores de HAPs, se ha descrito

que, o bien degradan hidrocarburos monoaromáticos, o bien degradan HAPs de 2 a 3

anillos o de 3 a 4 anillos (Gibson y Subramanian, 1984; Van Hamme et al., 2003). Existe

poca información acerca de cepas que crezcan en los HAPs alquilados de 3 o más anillos

aromáticos y específicamente las cloradas (Gilewicz et al., 1997; Sabaté et al., 1999), muy

abundantes en las formulaciones de plaguicidas. Además, habitualmente no se describe

una degradación significativa de la parte no resuelta por cromatografía (UCM), constituida

por componentes aún no identificados. Otra desventaja que podemos encontrar en los

consorcios definidos es la posible formación de metabolitos intermediarios que sean

tóxicos para la misma cepa o para otras cepas existentes en el mismo (Casellas et al.,

1998; Kazunga y Aitken, 2000; Kazunga et al., 2001). De hecho, se ha descrito que durante

la degradación de mezclas de algunos hidrocarburos organoclorados se pueden formar

intermediarios de persistencia y toxicidad desconocidas, por fenómenos de cometabolismo

(Grifoll et al., 1995, Viñas Canals, 2005).

2.7.1.2 Consorcios no definidos

Los consorcios no definidos, especializados en la degradación de compuestos

organoclorados, se obtienen a partir de enriquecimientos de muestras ambientales donde

hayan existido episodios previos y recurrentes de contaminación por los mismos. El

resultado es una población microbiana seleccionada de forma natural por su cooperación

metabólica en la degradación de la mezcla en cuestión, la cual potencialmente dispone de

una mayor eficiencia en la degradación de compuestos conocidos y desconocidos que un

consorcio definido. (Viñas Canals, 2005). Por lo tanto, es más probable que en un

consorcio no definido se hayan seleccionado degradadores de productos finales (dead-

end products) que se acumulan como resultado de procesos cometabólicos (Grifoll et al.,

1995).



1.7.2 Géneros Bacterianos implicados en procesos biorremediativos

Uno de los géneros bacterianos más explotados en bioprocesos no convencionales es

Rhodococcus, un grupo único consistente en microorganismos que presentan una gran

diversidad metabólica, capaz de transformar, biodegradar y utilizar como ˙nica fuente de

carbono compuestos hidrófobos e hidrofílica (Flavio B,, 1999). Los Rhodococcus son

aerobios, Gram positivos, inmóviles, Nocardiformes, Actinomicetos, que en algunas

ocasiones presentan pequeñas proyecciones filamentosas.

Las caracterÌsticas bioquímicas encontradas en algunas cepas son la producción

de poli-3- hidroxialcanoatos, acumulación de metales pesados y enzimas ˙tiles como la

fenilalanina, deshidrogenasa y endoglucosidasas. El Rhododoccus sp, posee una gran

variedad de vías metabólicas para la degradación y modificación de compuestos

aromáticos, incluyendo las actividades de di-oxigenasa y mono-oxigenasa sobre anillos,

así como la actividad de ruptura de catecol.

Algunas cepas presentan también la vía del 3-oxoadipato. Lo anterior sumado a

su capacidad de crecimiento en medios con escasos nutrientes, la carencia de un sistema

de represión catabólica y su persistencia ambiental las hacen excelentes candidatas para

los tratamientos de biorremediación (Flavio B et al, 1999). El Rhodococcus sp, utiliza el

dibenzotiofeno (DBT) como única fuente de azufre, el DBT y sus derivados son los

organoazufrados más abundantes en el diesel primario.

En Colombia, investigadores del Instituto Colombiano del Petróleo han aislado

cepas de Rhodococcus de sitios contaminados con petróleo capaces de desulfurar

muestras de diesel (Restrepo R, 2002). Otros microorganismos reportados como capaces

de utilizar el DBT como fuente de azufre son las cepas de Gordona y Nocardia sp. Dentro

de las aplicaciones industriales y ambientales, se incluye la producción de ácido acrílico y

acrilamida, conversión de esteroides, biorremediación de hidrocarburos clorados y fenoles,

a lo que se añade su gran capacidad de degradar hidrocarburos alifáticos halogenados y

numerosos compuestos aromaticos clorados, como los PHA´s (hidrocarburos policíclicos


aromáticos) (Eriksson M, 2005), evidenciandose que tanto R. rhodochorus como R.

erythropolis demostraron ser una excepción, pues la degradación de naftaleno por parte

de estos no es significativa, debido a que la actividad degradadora de PAHs por parte de

estos microorganismos, se ve regulada por las proteobacterias del medio afectado (Carla

A, et al, 2004 y Kastner M,, 1998).

Otras aplicaciones potenciales son la producción de biosurfactantes

emulsificantes, los cuales son producidos por algunas bacterias y el análisis de su

metabolismo permite obtener biomoléculas a escala comercial de la deshalogenación.

La Burkholderia sp, es otro género bacteriano utilizado para biorremediación de

herbicidas y pesticidas recalcitrantes y también es usado para proteger cultivos contra

hongos. Debido a su genoma extremadamente flexible, Burkholderia cepacia, bacilo Gram

negativo no fermentador, productora de pigmento amarillo tiene una gran capacidad

mutagenica y adaptativa, ha sido recuperada a partir de agua y superficies húmedas, es

resistente a múltiples organoclorados y esta capacidad es altamente transmisible entre

especies.

Por todas estas razones, la selección de cepas seguras para su uso ambiental no es

posible por el momento y su uso en la agricultura también debe ser cauteloso. Aunque es

una excelente degradadora de los hidrocarburos aromáticos (Fan et al, 2003).

El Acinetobacter sp es un bacilo Gram negativo, es productor de ·ácido a partir de

la glucosa, se desarrolla a 41 y 44ºC, produce a-xilosa y utiliza el malato. Dentro de las

especies de importancia ambiental se destacan, A. baumanii, Acinetobacter calcoaceticus

carente de ácido metÌlico. Las cepas de Acinetobacter baumanii son eficientes en la

degradación de fracciones de alcanos (Svenja R,, 1999). Los productos de petróleo

ampliamente usados como gasolina, keroseno y Diesel son contaminantes comunes del

ambiente, se ha observado que la biodegradación de gasolina por microflora de suelo y

agua de sitios contaminados es eficiente; compuestos como el benceno, tolueno,

etilbenceno, y n-alcanos son realmente biodegradables. Se aislo una cepa con una alta

capacidad de degradar dichos compuestos identificada como Mycobacterium



austroafricanum (Floriane S, 2006). Se seleccionó una cepa en un acuífero contaminado

con gasolina, la cual tiene la capacidad de utilizar el isoctano (2,2,4-trimetilpentano) como

única fuente de carbono y energía. El microorganismo aislado fue identificado por medio

de la secuenciación del RNA16S ribosomal. Se identificó una cepa perteneciente a

Mycobacterium austroafricanum (Floriane S, 2006); y otra cepa como Mycobacterium sp.

Esta de manera inusual utilizo como fuente de carbono y sustrato de crecimiento n-alcanos

y multimetil, donde degrado el metil t-butil eter, y grupos 3-metil, posiblemente por

mecanismos de carboxilación y deacetilación; logrando finalmente la degradación del 86%

de los sustratos contenidos en este sitio contaminado con gasolina (De Lorenzo V, 2002).

Otro género estudiado dentro de las técnicas de biorremediacion es

Sphingomonas sp. , bacilos no fermentadores y dentro de estos la Sphingomona wittichi

es un microorganismo capaz de degradar en condiciones anaerobias el 2.7diclorobenceno,

produciendo el metabolito 4 clorocatenol y el 1, 2, 3 ,4 tetraclorodibenceno, y cepas como

Sphingomonas yanoikuyae, y Sphingomonas paucimobilis como degradadoras de PAH´s

utilizándolos como única fuente de energía, tienen actividad Catecol 2,3- dioxigenasa,

fenantreno y antraceno. Se han aislado cepas capaces de metabolizar diferentes tipos de

organoclorados como única fuente de carbono, 89 estas fueron taxonómicamente

implicadas en diferentes subclases de las Proteobacterias (Sphingomonas sp, Acidovorax

sp, Comamonas sp, y Pseudomonas sp), y a bacterias Gram positivas con bajo y alto

contenido de DNA G+C (Paenibacillus sp y Rhodococcus sp, respectivamente)

(Christopher W et al, 2005).

AlcalÌgenes, Micobacterium y Bacteroides han sido reportados como

degradadores de hidrocarburos aromáticos clorados, y estos filotipos son candidatos para

el tratamiento de terrenos contaminados con cloroacetanilidas. Sin embargo su poca

abundancia se convierte en una desventaja para su aplicación (Nannipieri P et al, 2001).


1.7.3 Crecimiento bacteriano

Al aumento del número de microorganismos a lo largo del tiempo se considera como

crecimiento bacteriano pero no se refiere al crecimiento de un único microorganismo, sino

al aumento de toda la población bacteriana. El crecimiento de la población bacteriana, es

la suma de todos los ciclos celulares. Un ciclo celular es el desarrollo individual de una

bacteria (replicación del material genético de la bacteria, síntesis de sus componentes

celulares, crecimiento para alcanzar un tamaño mayor al inicial y división por bipartición de

la bacteria para dar lugar a dos células hijas).

El crecimiento celular es progresivo y duplica su población a través del tiempo, a este

tiempo se le denomina tiempo de generación, el cual varía desde unos cuantos minutos u

horas, según el microorganismo.

En un cultivo discontinuo o sistema cerrado, los microorganismos se cultivan en un medio

liquido, en este sistema las concentraciones de nutrientes disminuyen y las de residuos

aumentan. Se puede representar el crecimiento de los microorganismos que se multiplican

por fisión binaria como el logaritmo del número de células frente al tiempo de incubación.

La curva resultante tiene cuatro fases diferentes (Figura 1.9):

Fase de latencia (lag);

Fase exponencial o logarítmica (log);

Fase estacionaria;

Fase de muerte.



La fase de latencia es un proceso activo, es una fase de adaptación previa al crecimiento

exponencial. La duración varía considerablemente según el estado de los

microorganismos y la naturaleza del medio. Durante la fase exponencial o logarítmica, los

microorganismos crecen y se dividen hasta el nivel máximo en intervalos regulares, en

función de su potencial genético, el tipo de medio y las condiciones en que crecen.

En la fase estacionaria, el crecimiento de la población cesa y la curva de crecimiento se

hace horizontal, este hecho puede ser el resultado del equilibrio entre la división y la muerte

de las células o la limitación de nutrientes. Finalmente, la fase de muerte es la pérdida

irreversible de la capacidad de multiplicarse. Al igual que su crecimiento durante la fase

exponencial, es normalmente logarítmica (esto es, una cantidad constante de células

muere cada hora) (Prescott, Harley, & Klein, 1996).

La evolución de una población microbiana en pleno crecimiento se ajusta a las leyes de la cinética

clásica de evolución poblatoria. Antes de describir dicha cinética, se explicará el concepto

"crecimiento celular". Como todo ser vivo, los microorganismos nacen, crecen, se reproducen y

mueren. Para que un microorganismo dé origen a otro, debe “crecer individualmente” hasta llegar a

un estado de madurez fisiológica que le permita la reproducción. Desde este punto de vista, debe

distinguirse entre "crecimiento individual" y "crecimiento poblacional", este último es consecuencia

del primero.

Figura 1-9 Curva de crecimiento bacteriano


En un cultivo microbiano debe distinguirse el crecimiento "sincrónico" del "asincrónico", el primero

indica una división o reproducción de todos los individuos de una población a un mismo tiempo y el

segundo a una división o reproducción azarosa, con respecto al tiempo, de los individuos que

componen a la población. El crecimiento sincrónico se da bajo ciertas condiciones especiales de

cultivo. Otro concepto igualmente útil es el denominado crecimiento "balanceado" o

"desbalanceado", en aquél ocurre que las velocidades de formación de los componentes celulares

(carbohidratos, lípidos, proteínas, etc.) conservan una proporcionalidad mantenida con respecto al

tiempo, mientras que en el desbalanceado, al menos un componente no conserva dicha

proporcionalidad1. En una fermentación industrial, el crecimiento usualmente es evaluado como

"crecimiento poblacional asincrónico" y generalmente ocurre en forma balanceada (además del

detrimento en la economía, es irrelevante cuantificar el crecimiento individual, lograr una sincronía

y desbalancear el crecimiento).

Los requisitos fundamentales para que se dé el crecimiento son dos: i) la existencia de un medio de

cultivo que aporte los elementos nutritivos en todas sus formas (fuentes de C, N, S, P, O, etc.); ii) el

establecimiento y mantenimiento de las condiciones fisicoquímicas o ambientales necesarias

(temperatura, pH, fuerza iónica, potencial redox, etc.). Con base en estos requisitos se puede

establecer una clasificación de los distintos tipos de microorganismos. Así por ejemplo, desde el

punto de vista en que los microorganismos obtienen la energía para su crecimiento se pueden

clasificar en autótrofos y heterótrofos; los autótrofos la obtienen a partir de fuentes de carbono

inorgánicas (CO, CO2, carbonatos, etc.) y los heterótrofos a partir de fuentes orgánicas tales como

carbohidratos, lípidos, aminoácidos, etc. Otra clasificación se basa en el consumo de un nutriente

específico; el oxígeno: los microorganismos que lo consumen durante y para su crecimiento se

denominan aerobios, mientras que los que crecen en su ausencia se denominan anaerobios. Desde

el punto de vista de las condiciones ambientales, los microorganismos pueden clasificarse de

acuerdo a su temperatura y pH óptimos de crecimiento (psicrófilos, mesófilos y termófilos; acidófilos,

neutros o alcalinófilos).

1.7.4 Fuentes nutricionales para las Bacterias

La selección de las fuentes nutricias componentes de un medio de cultivo para la producción de un

metabolito de interés, dependerá, entre otras cosas, del tipo de microorganismo; de la finalidad de

la producción (fines comerciales o no); de si se requiere de una rápida velocidad de crecimiento;

del valor agregado del producto; etc. Por esta razón, solo se hará breve mención de las distintas

fuentes que se han utilizado a escala industrial, sin entrar en detalle de las particularidades

establecidas por la investigación básica para la selección de sus materias primas.



1.7.4.1 Fuente de carbono.

Todas las fuentes nutricias son importantes, sin embargo, debido a la naturaleza orgánica del

proceso fermentativo, la fuente de carbono (FC) es la más relevante. El carbono contenido en la

biomasa, en el producto o productos y en el bióxido de carbono producido, provienen de dicha

fuente. De aquí su importancia. Puesto que las materias primas representan del 30 al 50% del costo

de producción3, es muy importante la selección adecuada de la FC. Entre las más comúnmente

usadas se encuentran los carbohidratos en sus distintas formas: hexosas (glucosa, fructosa,

galactosa, etc.); pentosas (xilosa, arabinosa y ribosas); disacáridos (sacarosa, lactosa, maltosa,

etc.) y polisacáridos (almidones, celulosas, hemicelulosas, etc.). Una fuente muy importante de

carbohidratos es la melaza (de caña o de remolacha), la cual contiene cantidades significativas de

vitaminas, factores de crecimiento, micronutrientes y cantidades pequeñas de nitrógeno orgánico;

por estas características y por ser un subproducto de la industria azucarera, las melazas son una

muy buena opción para la industria de fermentaciones. Algunos otros subproductos utilizados como

fuentes de carbono son: suero de leche, licores sulfíticos, vinazas, etc. Entre las características más

importantes que debe reunir una FC para utilizarse en un proceso fermentativo a escala industrial,

se encuentran las siguientes: i) abundante; ii) disponible; iii) de bajo costo; iv) de producción

centralizada; v) alta miscibilidad en agua; vi) parcialmente oxidado; vii) de fácil degradación por

parte del microorganismo; viii) que muestre altos rendimientos de producto.

1.7.4.2 Fuente de nitrógeno.

Después del carbono, el nitrógeno es el elemento que normalmente se encuentra en mayor

concentración en el medio de cultivo . Se utiliza en la síntesis de aminoácidos, de proteínas, de

purinas y pirimidinas (constituyentes de los ácidos nucleicos), etc. Las fuentes de nitrógeno (FN)

generalmente se pueden clasificar en orgánicas e inorgánicas. Entre las orgánicas sobresalen el

agua de cocimiento de maíz, harinas de pescado y de soya, hidrolizados de proteínas, etc.; mientras

que en las inorgánicas sobresalen la urea, nitratos, nitritos, sales de amonio y amoniaco líquido o

gaseoso (en ciertos casos el amoniaco, al usarse como FN, sirve como agente controlante del pH

de fermentación). La selección de esta fuente sigue los mismos criterios establecidos para la FC.


1.7.4.3 Fuentes de macro y microelementos.

Los demás elementos necesarios para el crecimiento se pueden clasificar en macro y

microelementos, los primeros comprenden al fósforo, azufre, calcio, magnesio, hidrógeno y oxígeno.

Estos dos últimos muy particulares, el hidrógeno, por ejemplo, generalmente es tomado por el

microorganismo con la fuente de carbono, mientras que el oxígeno, necesario para la respiración,

tiene que ser adicionado al medio con el aire. Entre los microelementos o micronutrientes (los que

se requieren en muy pequeñas concentraciones) se encuentran el fierro, zinc, manganeso, cobre,

vitaminas, etc. Los rendimientos de varios metabolitos primarios y secundarios se ven afectados

por los microelementos. Estos son importantes por distintas razones, entre las que se pueden

mencionar las siguientes: i) regulan las propiedades electrolíticas y osmóticas del interior de las

células; ii) actúan como cofactores de algunas enzimas importantes; etc. A diferencia de un medio

de cultivo preparado en el laboratorio y a utilizar en la investigación básica, en el que normalmente

se utiliza agua destilada (o bidestilada) y sales químicamente puras, en la preparación de un medio

de cultivo industrial, frecuentemente se requiere la adición de los macronutrientes pero no la de los

micronutrientes, ya que estos pueden ser satisfechos a través del agua de proceso (de la red

municipal, pozos, manantiales, lagos o ríos) o a través de las materias primas que no son

químicamente puras.

1.7.4.4 Fuente de oxígeno.

Este nutriente es muy importante para las degradaciones aeróbicas. A diferencia de los demás, el

oxígeno se tiene que estar suplementando continuamente en el medio por dos razones principales:

I) por el consumo por parte de los microorganismos (un cultivo en pleno desarrollo puede consumir

en pocos segundos 14 mg de oxígeno por litro); II) por su baja solubilidad en medios de cultivo (no

mayor a 14 ppm). La fuente común de oxígeno en una fermentación es el aire, que por lo general

se burbujea en el medio de cultivo desde el fondo del fermentador. La transferencia de oxígeno

desde las burbujas del aire hasta el microorganismo, es una de las principales limitantes de la

productividad en una fermentación, por lo que el biorreactor debe ser diseñado para satisfacer la

máxima demanda por parte del m.o.



1.8 Modelos para el crecimiento microbiano.

Los estudios necesarios para investigar el efecto que sobre el crecimiento microbiano presentan las

condiciones ambientales, el tipo y concentración de las fuentes nutritivas y las características de

transferencia de masa del sistema, se podrían realizar en una forma totalmente empírica a través

de un sinnúmero de condiciones experimentales que cubran todas las combinaciones posibles,

presentándose los resultados como una serie de correlaciones mediante las cuales sea posible

predecir los efectos con un nuevo juego de condiciones de operación. Este procedimiento, aun

cuando es lógico, implica gran cantidad de experimentación (con el consecuente consumo de

materias primas, energía y mano de obra) y lo que es peor, solo da información escasa y de baja

calidad para la comprensión real del fenómeno de crecimiento.

El modelamiento es una herramienta poderosa mediante la cual se puede describir el

comportamiento actual y probable del crecimiento microbiano mediante una teoría bien establecida

que, cuando es descrita en términos matemáticos, representa un modelo de trabajo del proceso.

Para el establecimiento de un modelo, el modelador debe conocer la naturaleza de todos los

parámetros importantes del proceso, sus efectos sobre el mismo y cómo pueden ser definidos en

términos cuantitativos (debe identificar las variables importantes y sus efectos por separado sobre

el proceso, tomando en consideración efectos sinergísticos, etc.). La expresión matemática del

modelo constituye un factor determinante para la concepción básica y real del proceso. Una vez

que se ha formulado el modelo matemático, tiene que ser resuelto y comparado o validado con

datos experimentales bajo las mismas condiciones establecidas en el modelo. Cualquier diferencia

debe ser investigada para redefinirlo o mejorarlo hasta que posea exactitud en la predicción de los

datos experimentales. Así, el modelo servirá para el diseño, optimización y control de procesos y

para predecir el comportamiento bajo nuevas condiciones de experimentación.

Un primer paso en el modelado del crecimiento microbiano, es la formulación apropiada de

las ecuaciones de balance de masa y energía, lo cual implica el establecimiento de las ecuaciones

cinéticas para las velocidades de crecimiento, consumo de sustrato, formación de producto y de

transferencia de masa, calor y momento. La formulación de tales ecuaciones puede ser desde lo

más simple hasta lo más compleja posible, dando origen a distintas "categorías" de modelos

cinéticos.


La naturaleza biológica del crecimiento microbiano es, por necesidad, de una complejidad tal que

puede dar origen a modelos cinéticos tan complicados que realicen una descripción detallada del

proceso de crecimiento (estos contarán con un gran número de parámetros experimentales y de

ecuaciones de balance), por tal razón, entre las preguntas a contestar en el modelado cinético

sobresalen las siguientes: ¿qué nivel de descripción se requiere? y ¿qué ventajas representa un

modelo altamente complejo respecto de uno sencillo?. Estas preguntas deben contestarse en

función de la precisión y/o exigencias que se requieran para el modelo.

Se sabe que los individuos que componen una población microbiana, salvo raras

excepciones, son completamente heterogéneos en cuanto a su tamaño celular, edad, velocidad de

crecimiento, composición celular y otras características que dan origen a las distintas clasificaciones

de los modelos de crecimiento. Un modelo en él se represente al total de la población como un

"microorganismo promedio”, en el que su estado fisiológico se describa en función de su velocidad

de crecimiento, sin considerar variaciones en las estructuras internas que lo componen, se clasifica

como “no segregado y no estructurado”. Si en dicho modelo se tomaran en cuenta las estructuras

internas, sus relaciones y variaciones con el tiempo, se clasificaría como "no segregado y

estructurado".

Los modelos que no consideran las variaciones entre los individuos de una población se llaman "no

segregados" y “segregados” a los que sí consideran las variaciones. De acuerdo a esto, los modelos

segregados serán de mayor precisión que los no segregados, sin embargo, la precisión de estos

últimos está en función directa del tamaño de la población. Como en una población microbiana la

densidad de población comúnmente oscila por arriba de 107 individuos por ml, los modelos no

segregados se vuelven muy precisos.

A pesar de las distintas clasificaciones de los modelos matemáticos que describen el crecimiento

microbiano, en esta sección solo se verán los modelos "no estructurados y no segregados",

quedando fuera del alcance de los objetivos de este trabajo establecer modelos complejos como

los “estructurados y segregados”, ya que los “no estructurados” son precisos para casos de

crecimiento balanceado e imprecisos para los no balanceados.



En la tabla 1-22 se muestra en forma esquemática la clasificación de los distintos modelos cinéticos

de crecimiento microbiano.

Tabla 1-22 Perspectivas de representación de los modelos cinéticos del crecimiento microbiano.

NO ESTRUCTURADOS. ESTRUCTURADOS.

No

segregados

El caso más idealizado.

La población celular se trata

como un solo componente.

Se considera que la “célula

promedio” consta de varios

componentes.

Segregados Se considera solo un

componente con variaciones

entre los individuos.

Se consideran varios

componentes con variaciones

entre los individuos.

En la literatura existe una diversidad de modelos cinéticos no estructurados. Comúnmente

estos modelos son empíricos y relacionan la velocidad específica de crecimiento () con

una función relativamente sencilla de la composición del medio de cultivo (concentración

de sustrato, oxígeno disuelto, inhibidores, etc.), como se ve en la tabla 5. El modelo de

Monod es el más ampliamente utilizado en razón de su naturaleza relativamente sencilla.

En él se expresa que la de un microorganismo es una función de la concentración del

sustrato limitante (la fuente de carbono), dándose por hecho que los demás se encuentran

en exceso o por arriba de las mínimas necesidades del microorganismo, como se ve en la

siguiente ecuación:

= max

s

s ks (Ecuación 1-8)

En la que "µmax" es la velocidad específica de crecimiento máxima, "ks" la constante de

saturación del microorganismo por el sustrato y "s" la concentración del mismo. Las

constantes µmax y ks son función del microorganismo, del sustrato y de las condiciones

ambientales en las que se efectúa el crecimiento (Ks es la concentración de sustrato que

da como resultado que el microorganismo tenga una velocidad específica de crecimiento

igual a la mitad de su máxima). Entre más pequeño sea el valor de ks se dice que el

microorganismo es más afín al sustrato. De esta manera, cuando dos microorganismos


distintos elaboran un producto a partir de un mismo sustrato, se elegirá aquel que presente

los mayores valores de µmax y los menores valores de ks.

Una de las formas linealizadas de la ecuación de Monod es:

1 1 1

max

s

max

k

s (Ecuación 1-9)

Con la cual se pueden obtener los valores de las constantes mencionadas cuando se

gráfica 1/µ VS 1/s.

Otra forma linealizada es la siguiente:

sk smax

(Ecuación 1-10)

La diferencia entre una y otra ecuación radica en la precisión de los valores de las

constantes obtenidas, sobre todo, al sustituir valores pequeños de concentración de

sustrato residual “s”.

En la tabla 1-23 se detallan los modelos cinéticos no estructurados más comúnmente

utilizados

.

Tabla 1-23 Modelos cinéticos no estructurados más comúnmente utilizados.

Modelo de Monod.

= max

s

s ks

Modelo de Konak.

d

dsK max

p

( )

Modelo de Contois.

= max

s

Ax s

Modelo de Tessier.

max s k1 exp( / )

Modelo de Moser.

= max

s

s k

r

r

s

r

Modelo de Powel.

max

s p

s

s k k

Modelo logístico.

dx

dtx x x

x x

max max

max max

( / )

( / )

1

1

Inhibición por Producto.

= max

s

s k

k

p ks

p

p

Inhibición por sustrato.

maxs i

s

s k k s2

Doble limitación.

max

s

L

L O

s

s k

C

C k 2



1.8.1 Factores que afectan la biorremediación

Son varios los obstáculos para llevar a cabo la eliminación de ciertos compuestos como

los pesticidas cloroacetanilidos, presentando un desafío para la biorremediación, ya que

se deben identificar los factores que evitan que las bacterias degraden completamente los

compuestos. Por ejemplo, uno de los principales inconvenientes de las rutas de

degradación es que los metabolitos de compuestos orgánicos con átomos de cloro en una

configuración particular (orto o meta) tienen tendencia a bloquear pasos críticos de

degradación, inhibiendo enzimas oxigenadoras que catalizan el paso critico de escisión del

anillo [Perelo, l. W, 2010].

La biorremediación puede dirigirse a ambientes multifásicos y heterogéneos tales

como aguas eutróficas u oligotróficas en los cuales el contaminante esté presente en

asociación con las partículas suspendidas de la misma, disuelto y en la atmósfera del suelo

lixiviador [Boopathy, R, 2000]. Los parámetros más importantes para la biorremediación

son la naturaleza de los contaminantes, el tipo de matriz acuosa, pH, e hidrogeología, el

estado nutricional y diversidad microbiana empleada, temperatura y potencial redox

[Shukla, K. P, 2010].

Las heterogeneidades físicas y químicas del agua afectan la biorremediación in situ ya que

controlan la disponibilidad de nutrientes y sustratos que regulan los procesos

microbiológicos. Si la cinética de estos procesos fisicoquímicos de transferencia de masa

es más lenta que la velocidad potencial de la biodegradación, se afectará la tasa global de

biorremediación y el sistema estará limitado por la transferencia de masa. Por esta razón,

la evaluación de la viabilidad de un proyecto de biorremediación in situ está dominada por

la necesidad de identificar y estimar correctamente el fenómeno controlante de velocidad

apropiado [SONG, X., 2008].


Las principales variables que afectan la actividad de las bacterias y por ende la

biorremediación se muestran en la tabla 1

Tabla 1-24 Principales factores que afectan la biorremediación

Factores que afectan la biorremediación bacteriana

Parámetro Observación

Microbiológicos Crecimiento hasta que se alcanza

la biomasa crítica

Mutación y transferencia horizontal

de genes

Inducción de enzimas

Enriquecimiento de las poblaciones

microbianas capaces de hacer

biorremediación

Producción de metabolitos e

intermediarios tóxicos

Ambientales Agotamiento preferencial de

sustrato

Falta de nutrientes

Condiciones ambientales

inhibitorias

Sustrato Concentración muy baja de

contaminantes

Estructura química del

contaminante

Toxicidad del contaminante

Solubilidad y demás propiedades

de Destino ambiental del

contaminante

Procesos Biológicos aerobios vs

anaerobios

Potencial de óxido-reducción

Disponibilidad de aceptores de

electrones

Población microbiana presente en

el sitio

Sustrato de crecimiento vs cometabolismo Tipo de contaminantes

Concentración

Fuente alternativa de carbono

presente



Interacciones microbianas

(competición, sucesión y

predación)

Biodisponibilidad fisicoquímica de

contaminantes

Sorción en equilibrio

Sorción irreversible

Incorporación en materia húmica

Limitaciones de transferencia de masa Difusión de oxígeno y solubilidad

Difusión de nutrientes

Solubilidad/miscibilidad en agua

Estudios previos concluyeron que la evaluación de la viabilidad de un proyecto de

biorremediación depende de la identificación correcta de los fenómenos que controlan la

velocidad del proceso, y de esta manera seleccionar el enfoque remedial apropiado para

mejorar la velocidad de biorremediación (Song, X, 2008, y Singh S., 2009).

Por ser las cloroacetanilidas de los herbicidas más usados y vendidos en el

continente Americano, pese a las convenciones ambientales vigentes; porque existen

grandes concentraciones remanentes en cuerpos de agua y suelo al tener un elevado

coeficiente de partición octanol-agua, una alta solubilidad acuosa y una resistencia a

bloquear los pasos críticos de degradación que catalicen la escisión del anillo bencénico,

razones que ponen en riesgo la salud ambiental de ecosistemas y de la sociedades que

se abastecen de cuerpos lénticos de agua.

Se han desarrollado investigaciones y simulaciones con compuestos de la familia de la

cloroacetanilida, mostrando resultados significativos que sirven de base para adelantar

investigación con estas moléculas de interés químico-ambiental (alacloro, metolacloro y

procloraz); todo esto en pro de buscar la biodegradación de la cloroacetanilida, obtener su

cinética (tiempos de residencia), y utilizar el consorcio de bacterias mesofílicas más

adecuado para la biorremediación de aguas lénticas.

Por tanto este estudio pretende evaluar la capacidad biodegradativa de los consorcios

bacteriano sobre una matriz acuosa sintética contamina con un ORGANOCLORADO

PERSISTENTE (Alacloro, metacloro y procloraz).


1.9 Antecedentes de investigación

La revisión literaria del tema de investigación sobre los últimos cinco años, fue estructurada

por etapas, ya que un estudio de biorremediación es interdisciplinario y abarca las ciencias

de la Microbiología Ambiental (Etapa 1), la ingeniería química ambiental (Etapa 2) y la

toxicología (Etapa 3)

Tabla 1-25 Etapa 1 Biodegradación-cepas empleadas y condiciones mínimas

AÑO

AUTOR

ASPECTOS RELEVANTES A LA INVESTIGACIÓN

2013 Dehghani, M.,

Nasseri, S., &

Zamanian, Z.

Los principales objetivos de esta investigación a nivel

laboratorio se han centrado en el aislamiento de

consorcios bacterianos capaces de biodegradación de

alaclor y cloroacetanilidas en suelo y sus a diferentes

concentraciones de carbono y nitrógeno (aguas

eutróficas). Emplea bioestimulantes, y muestra la

influencia de los diferentes compuestos de carbono como

bioestimulantes (glucosa, citrato de sodio, sacarosa,

almidón y la combinación de estos compuestos), y el efecto

de las fuentes de nitrógeno (nitrato de amonio y urea) y del

pH diferente (5.5 a 8.5),

Se concluye como pH óptimo 7.2 y citrato de sodio como

bioestimulantes de carbón.

No se registran Tiempos de degradación, ni mecanismos

de degradación de la cloroacetanilida, así como de

porcentajes de degradación del compuesto xenobiótico

2013 Paule, A., Roubeix, V.,

Lauga, B., Duran, R.,

Delmas, F., Paul, E., &

Rols, J. L.

Se muestra la metodología para experimentos

biorremediativos y ecotoxicológicos que se han realizado

en microcosmos fúngico, algales y bacterianos sobre

diferentes amidas cloradas, se desarrolla a nivel de

laboratorio para investigar consorcios bacterianos y

propone un biorreactor anular giratorio (RAB) con flujo tipo

Taylor-Couette bajo condiciones constantes.



No hubo efecto significativo de acción de las diatomeas

empleadas, pero si muestra acción fúngica degradativa a

los 8 dias.

Establece posibles rutas de biogradación del Alacloro y

metolacloro propios de la acción enzimática fúngica

2013 Sanchis, S., Polo, A.

M., Tobajas, M.,

Rodriguez, J. J., &

Mohedano, A. F.

Muestra la importancia de buscar técnicas de

biodegradabilidad de nitro clorados y de cloroacetanilidas,

usando varios bioensayos, tiempos y proporciones de

biomasa / sustrato de prueba.

Se realizaron experimentos en el reactor de secuenciación

por lotes (SBR) y en el biorreactor de membrana (SB-

MBR). Los investigadores utilizaron concentraciones fijas

por debajo del valor límite tolerable EC50 (2 ppm). Aporta

la concentración inicial con la que se debe trabajar a nivel

laboratorio para ensayos de biodegradabilidad, no informa

los tiempos de degradación de nitro clorados, pero no logra

resultados satisfactorios para las cloroacetanilidas.

2013 Tien, C. J., Lin, M. C.,

Chiu, W. H., & Chen,

C. S. . .

En este estudio a nivel laboratorio se investigó la

capacidad de los agregados naturales para degradar

carbamatos y carbofurano, compuestos de estructura

familiar a las carboxiamidas cloradas y cloroacetanilidas.

Se encontraron condiciones de saturación de Oxígeno

necesarias (>6ppm).

Tabla 1-26 Etapa II Caracterización del agua, Condiciones de Cinética Bacteriana

AÑO

AUTOR

ASPECTOS RELEVANTES A LA INVESTIGACIÓN

2015 Bohuss, I., Rékasi, T.,

Szikora, S., Barkacs, K.,

Zaray, G., & Acs, E.

Detalla los procesos de reproducción y colonización,

de agregados, temperatura y nutrientes de un agua

enriquecida con herbicida acetoclor y atrazina en fase

acuosa


2014 Antić, N., Radišić, M.,

Radović, T., Vasiljević, T.,

Grujić, S.,Petković, A.,

Dimkić, M., & Laušević, M.

En este trabajo, un total de 38 pesticidas se evaluaron

en la cuenca del río Danubio en Serbia. Muestra la

técnica experimental para la cuantificación de los

analitos en especial del Metacloro y acetocloro via

LC -MS / MS o GC-MS.L-1

Herbicidas de la familia química de las

cloroacetanilidas la cual sirve de referencia para el

método experimental con igual velocidad de

degradación natural en el medio ambiente

TOXICOLOGIA –ETAPA III

AÑO

AUTOR

ASPECTOS RELEVANTES A LA

INVESTIGACIÓN

2014 Gozalbes, R; JV, de Julián-Ortiz;

Fito-López, C

Muestra la aplicación de la toxicología

predictiva con normativa europea REACH,

para proyectar procesos de biodegradación

de interés ecotoxicológicos.

2015 Nikita Basant,† Shikha Gupta,‡

and Kunwar P. Singh

Detalla cómo debe adelantarse la predicción

de moléculas con potencial tóxico

(Pesticidas), mediante el uso de técnicas

como QSAR-QSRT



2. Metodología Experimental

Este trabajo se desarrolló con consorcios definidos del Laboratorio de Operaciones

Unitarias, de la Sección de Estudios de Posgrado de la ESCUELA SUPERIOR DE

INGENIERIA QUÍMICA E INDUSTRIAS EXTRACTIVAS –ESIQIE, campus Zacatenco, así

como de consorcios no definidos extraídas en el sector Industrial de MINATITLAN, Istmo

del Estado Mexicano de Veracruz,, y de los laboratorios de INGENIERIA DE

BIOREACTORES del Centro de Investigaciones Avanzadas CINVESTAV del INSTITUTO

POLITÉCNICO NACIONAL, Unidad Ticomán.

Por la relevancia de la investigación se contó con la colaboración interinstitucional e

interdisciplinaria de los siguientes laboratorios:

Laboratorios de Microbiología y Química ambiental de la Planta de Tratamiento de

Aguas Residuales I, del Organismo Público Descentralizado de los Servicios de

Acueducto y Alcantarillado de Tlalnepantla, Estado de México.

Laboratorios de Química Instrumental de la Procuraduría General de Justicia de la

Ciudad de México, Delegación Coyoacán

Laboratorios de Ecotoxicología del Instituto Mexicano de Tecnología del Agua,

ubicado en la ciudad de Jiutepec de Morelos.

La Unidad de Servicio de Apoyo a la Investigación y a la Industria USAII a través

del Laboratorio del Edificio H Mario Molina de la Facultad de Química de la

Universidad Nacional Autónoma de México


DISEÑO EXPERIMENTAL

La parte experimental de este trabajo está constituido por cinco partes. La primera parte

consistió en la activación y selección del consorcio bacteriano, la segunda parte en el

aislamiento de cepas y caracterización del consorcio microbiano Mx y Px mediante

pruebas bioquímicas, así como de las materias primas y del agua sintética contaminada.

En la tercera parte, se cuantificó el crecimiento microbiano de los aislamientos bacterianos

y los consorcios en los bioreactores en fase libre suplementados con cloroacetanilidas., asi

como de las concentraciones del sustrato y metabolitos intermediarios. Finalmente, a

diferentes tiempos de incubación se determinó el porcentaje de biodegradación de las

cloroacetanilidas y carboxiamidas a través de la cuantificación y cualificación de los s a lo

largo de la fase experimental con la técnica de cromatografía de líquidos y Cromatografía

de Gases acoplada a masas (GC-MS).

También en esta fase, se relacionó el crecimiento bacteriano a lo largo de la

experimentación con el porcentaje de degradación, la cuantificación se llevó a cabo con la

medida de la densidad óptica a 625 nm por espectrofotometría UV-Visible.

El trabajo experimental se dividirá en 5 etapas (ver tabla 2-1), las cuales se describen a

continuación:

Tabla 2-1 Diseño Metodología Experimental desarrollada

Etapa Metodológica Comprende

Etapa Experimental I Activación, Adaptación, Selección e Identificación de los

Agregados Bacterianos halotolerantes

Etapa Experimental II Caracterización de Sustrato de Activación, Medios de

Crecimiento, Agua sintética Materias Primas

(Cloroacetanilidas empleadas), Caracterización del agua

sintética para cada diseño experimental.

Etapa Experimental III Caracterización Microbilógica durante las fases de

degradación o crecimiento microbiano.

Caracterización Fisicoquímica, ambiental, e instrumental

del agua durante los procesos de Degradación

Etapa Experimental IV Caracterización Ecotoxicológica y Ambiental de los

productos finales de la degradación

Etapa Experimental V Obtención de variables de cinética de Crecimiento

Microbiano



Todos los experimentos se llevarán a cabo por triplicado.

2.1 Etapa Experimental 1

Corresponde a las etapas de activación, selección, adaptación e identificación de los

agregados bacterianos definidos y no definidos empleados para el objeto de estudio.

2.1.1 Activación y Selección Bacteriana

Se utilizaron 70 consorcios nativos de México, los cuales fueron empleados con el

ánimo de seleccionar cual consorcio tiene actividad tolerante y degradadora de las

cloroacetanilidas y carboxiamidas cloradas. De los 70 consorcios: 60 corresponden

a consorcios nativos de propiedad conjunta de la Universidad Autónoma de

Chapingo y de investigadores del laboratorio de posgrado de Operaciones Unitarias

de la Escuela Superior de Ingeniería Química del IPN (Ver Tabla 2-2), 5

corresponden a consorcios bacterianos empleados en investigaciones por parte del

Centro de Investigaciones Avanzadas CINVESTAV del Instituto Politécnico

Nacional (Ver Tabla 2-3), otros 3 correspondientes a agregados bacterianos que

se emplean actualmente en la Planta de Tratamiento de Aguas Residuales

Industrial de Tlalnepantla (Ver Tabla 2-4), y 2 Corresponden a agregados

bacterianos recolectados en zonas de afección ambiental de industriales de

Minatitlan (Veracruz) (Ver Tabla 2-4).

Estos agregados inicialmente fueron activados en medio pre-enriquecido

(Ver tabla 2-7), y observados en microscopio óptico, para su clasificación

taxonómica previa, y así garantizar solo agregados bacterianos en su composición,

se evaluaron en viales de vidrio ambar de 50 mL, realizando una adaptación al

sustrato hidrocarbonado (agente xenobiótico). La adaptación se realizó en frascos

OXITOP ambar de 50 mL previamente esterilizados, durante 72 horas a una


temperatura de 30ºC y sin agitación, en cámara de incubación industrial (Ver Tabla

2-5).

Igualmente el medio pre-enriquecido sólido se obtuvo agregando agar-agar 15g/L con 1%

de la cloroacetanilida.

La identificación de los principales organismos responsables de la biodegradación

de contaminantes, y su caracterización de importancia para la comprensión, evaluación y

desarrollo de estrategias de biorremediación que se aplicó, fue adelantada en las

instalaciones de los laboratorios de microbiología y química ambiental de la planta de

tratamiento de aguas residuales industriales I, del Organismo público descentralizado de

los servicios de acueducto y alcantarillado de Tlalnepantla, Estado de México.

Los nombres de dichos consorcios, son como el laboratorio los tiene

identifcados bajo alguna referencia, más no obedecen a ningún tipo de

genotipificación microbiológica desarrollada. (Actualmente dichos consorcios se

encuentran en proceso de genotificación y clasificación filogenética, que están

protegidos por trámite de patente)

El material de vidrio se sometió por 5 h a calor seco (180 °C); los medios de cultivo,

puntillas fueron esterilizados en autoclave (Ver Tabla 2-5) por 15 minutos a 20 libras de

presión y 121°C, para garantizar completa esterilidad. Se hicieron pruebas previas a la

autoclave bajo la Técnica de Bowie-Dick, en cada ciclo de esterilización.

Para la realización de las fases de pre–enriquecimiento y de enriquecimiento

bacterianos, se realizaron algunas modificaciones a los procedimientos sugeridos por la

literatura abierta. (Gómez et al., 2006; Narváez et al., 2008; Mohajeri et al., 2010; Bacosa

et al., 2010; y Zhengzhi Zhang et al., 2011)

Para la determinación de la población microbiana que sobrevive, se utilizó el

método de recuento directo en microscopio óptico (Ver Tabla 2-5), mediante la cámara de

Neubawer



Tipo de Muestreo empleado: Puntual

Tabla 2-2 Consorcios definidos Laboratorio de Operaciones Unitarias SEPI-ESIQIE

Consorcios iniciales

Starmart Nemátodos

Morelos Degradex

Me Rhizobium

Datil Phc

Bio-5 Mhetarizum phc

Maya Magic Pochonia

Loxich Pueselomisis

Montaña Micorrizas

Bacillus subtilis Metorrizum

Thericoderm Mch

Biopool Thricoderm

Biofert Degraquim

Virens Rhizobium II

Verticilium Paecelomisis

S. turigensis Px

Gaia subtilis Microrrisis

Gaia Thricoderm Ortiplus

Azospirillum Bauveria

Bioactivador Rumens1

Pacellomisis Rumens 2

Rumens 3 Clostridium

Rumens 4 Chloracidobacteria

Rumens 5 Lecanicillum

Manglar Acidobacteria

Pastosal Paelomyces

Agua T Bacillus II

Pseudomonas Mx

Paccelomisislo My

Bacillus Mz

Aeromicrobium Mw

Tabla 2-3 Consorcios definidos empleados –CINVESTAV

Agregado Bacteriano

1 BioC I

2 BioC II

3 BioC III

4 BioC IV

5 BioC V


Tabla 2-4 Consorcios no definidos –Zona Industrial Minatitllan y Tlalnepantla

Agregado Bacteriano Origen

Bacterias Lodos Reactor 1 PTAR I Tlalnepantla Agua Industrial



Ex Minatitlan

Px Minatitlan

Se emplearon los siguientes equipos en esta etapa (Ver Tabla 5-5)

Tabla 2-5 Equipos empleados en la selección del agregado

Equipo empleado Referencia Especificaciones Técnicas

Incubadora Industrial Modelo G17 Marca SHELAB Serie 3017904 Part No. 9121079

Fecha de Calibración : 19/10/2015 Empresa: REKNER ft-cg-003

Autoclave Industrial Marca All América Modelo 75X

Fecha de Calibración de Manómetros: 22/10/2016 Empresa: REKNER

Microscopio Óptico Vanguard

Termómetro interno validación

Control Company TRaceable Thermometer

2.1.2 Enriquecimiento (mantenimiento celular)

La fase de enriquecimiento constó de un proceso de tres semanas. Inicialmente, pasados

7 días de incubación de las muestras pre– enriquecidas y ya seleccionadas por

supervivencia, se tomó 1 ml de estas y se sembraron cada uno en tubos con caldo de

enriquecimiento (Ver Tabla 2-6 y Tabla 2-9). Se incubaron a 30°C por 7 días con agitación

continua. Este mismo procedimiento se realizó a los 14 y a los 21 días.



Tabla 2-6 Especificaciones de enriquecimiento empleadas

Datos Cantidad

Temperatura °C 37 ± 0.7

Humedad relativa interior

Medio de Cultivo empleado Mineral

Toda el agua empleada en los procesos de análisis salvo los que corresponde a HPLC,

fue agua tipo desionizada (ver Tabla 5-7)

Tabla 2-7 Especificaciones del Agua desionizada empleada

Datos Cantidad

Marca Fermont

Especificación 0507

Lote 606461

Tabla 2-8 Medio mínimo estandarizado de crecimiento bacteriano

Componente Cantidad Unidades Función

Agua Destilada 1 L

Sucrosa 2 g C y fuente de energía

KH2PO4 0.5 g buffer pH; fuente de P y K

MgCl2*6H2O 0.4 g fuente de Cl y Mg++

NaCl 0.4 g

fuente de Na+ para halofílicas e inhibidor

para no halofílicas

NH4Cl 0.4 g fuente de Mn++

CaCl2*2H2O 0.05 g fuente de Ca++

Solución de Elementos Traza 1 mL


Tabla 2-9 Solución de Elementos Traza empleada

Compuesto Cantidad Unidad

Citrato de Hierro (III) 1.6 g

FeCl2 al 0.1% (Solución) 1.2 g

Solución de Elementos Traza Cantidad Unidades

ZnSO4*7H2O 10 mg

MnCl2*4 H2O 3 mg

H3BO3 30 mg

CoCl2*6H2O 20 mg

CuCl2*2H2O 1 mg

NiCl2*6H2O 2 mg

Na2MoO4*2H2O 3 mg

Tabla 2-10 Agentes xenobióticos empleados

Tipo Agente Xenobiótico empleado Descripción

Clo

roa

ce

tan

ilid

a

Alacloro 2-cloro-2',6'-dietil-N-metoximetilacetanilida No. Lote Empleado SZBD163XV Marca: Alachlor Pestanal® Sigma Aldrich Pureza: 99.8%

Metolacloro 2-cloro-2’,6’-dietil-N-metoximetilacetanilida No. Lote empleado SZBD163XV, SZBE044XV Marca: Metolachlor Pestanal® Sigma Aldrich Pureza: 97.6%

Ca

rbo

xia

mid

a

clo

rad

a

Procloraz

N-propil-N-(2-(2,4,6-tricloro fenoxi)etil)imidazol-1-carboxamida No. Lote empleado: 02991410 Marca: Sportak 45CE Pureza: 31.7%

Todos los reactivos empleados son de grado analítico detallados en la tabla 2-9 y

2-10 se prepararón y ajustaron a pH de 7.2 con solución 0.1 N de NaOH, para

evaluar las condiciones microbiológicas de los agregados



2.1.3 Adaptación

5.1.3.1 Adaptación inicial bacteriana

El medio será contaminado de manera sintética con la cloroacetanilida (2 ppm) en una

proporción de nueve volúmenes de medio mínimo por uno de agente xenobiótico,

manteniendo la mezcla a 30ºC por tres días a 20 rpm en sistema aireado, 50 mL de medio

mínimo contaminado en frascos ambar de OXITOP de 50 mL, los cuales serán evaluados

cada 12 horas por un período de una semana en condiciones aeróbicas (Ver tabla 2-11).

Tabla 2-11 Metodología de adaptación inicial bacteriana

Ítem Cantidad de viales

Viales con alacloro 2 ppm 3 por consorcio seleccionado

Viales con metolacloro 2 ppm 3 por consorcio seleccionado

Viales con Procloraz 2 ppm 3 por consorcio seleccionado

5.1.3.2 Adaptación bacteriana en cloroacetanilidas

El medio (50 mL) fue contaminado de manera sintética con la cloroacetanilida (300 ppm)

y la Carboxiamida respectivamente (300 ppm), sobre un agua con características de agua

oligotrófica (en contenido de fósforo), manteniendo la mezcla a 30ºC, sin agitación (sistema

léntico) bajo un sistema aireado en incubación, con 1 mL de las bacterias del medio

enriquecido (etapa exponencial), en frascos ambar, los cuales fueron evaluados cada 12

horas por un período de una 2 semana en condiciones aeróbicas –anaeróbicas.


2.2 Etapa Experimental II

2.2.1 Análisis Termogravimétrico

El análisis termo gravimétrico (TGA) se realizó en un equipo TGA 4000 y DMA 8000 Perkin

Elmer Instrument (Número de serie: 533N8111801, Numero de parte: N5330101) (ver

figura 2-1, bajo atmósfera oxidante con un incremento de 10 ºC/min. Este análisis se llevó

a cabo en los laboratorios de la Unidad de Servicio de Apoyo a la Investigación y a la

Industria USAII, del edificio H Mario Molina, de la Universidad Nacional Autónoma de

México, bajo el método descrito en la Tabla 2-12.

Se desarrolló solamente análisis Termogravimétrico al Alacloro al ser el único de los 3 en

fase sólida, Los métodos empleados para el cálculo de la cinética de degradación a detalla

se encuentran en el anexo magnético, en la carpeta de TGA

Tabla 2-12 Método general TGA para alacloro

Ítem Descripción

Modelo de instrumento TGA 4000/Pyris 6TGA

Parte No. N4100020

Número de serie del instrumento

005072302

Condición Inicial 30°C

Condición Final 300°C

Rampas 10, 20, 30, 40

Peso inicial 1.20 mg

Peso final -93.706 mg

Gas Nitrógeno a 20 mL/min



Figura 2-1 Equipo empleado en Análisis TGA

2.2.2 Medios de Crecimiento empleados en aislamiento bacteriano

Se utilizaron caldo nutritivo, agar nutritivo y agar-agar comerciales marca Merck, y se

prepararon según las instrucciones del fabricante. En la tabla 2-13 se relacionan las

especificaciones de los medios de crecimiento empleados.

Tabla 2-13 Medios de crecimiento selectivos empleados

Medio Selectivo

Tipo de Bacteria Marca y Lote Empleado

Caldo Tripticasa Soya

Merck Lote: VM665588446 Venc.: 06/10/2019

Agar Pseudomona sp.

Pseudomonas sp. Merck Lote: VM665588446 Venc.: 06/10/2019

APC, Agar Plate Count

Medio de cultivo empleado para el recuento de bacterias aeróbicas en aguas y para determinar poblaciones microbianas base del estudio.

Merck Lote: VM665588446 Venc.: 06/10/2019

2.2.3 Medio sintético oligotrófico contaminado con cloroacetanilidas

Después de la adaptación del consorcio microbiano, se procedió al biotratamiento experimental. Para llevar a cabo este proceso se realizó en un sistema consistente de biorreactores de vidrio de fase libre, con capacidad de 0.005 L, los cuales se airearon hasta saturación (aprox. 8 ppm), en un sistema isotérmico que permitió mantener la temperatura


fija en 30ºC ± 0.7. Para el sistema de incubación se empleó una incubadora industrial de atmósfera controlada (Ver Tabla 2-5).

El biorreactor operó de manera intermitente, con un suministro continuo de aire sin agitación a efectos de evalularlo como sistema léntico. La operación se realizó de la siguiente manera:

Se cargó cada biorreactor con la muestra con las soluciones sintéticas de agua contaminada con el tipo de cloroacetanilidas y carboxiamidas a degradar hasta un volumen de 49.5 mL; más 0.5 mL de Medio de Bacterias enriquecidas adaptadas con valoración de supervivencia.

Se inocularon 0.5 mL de consorcio adaptado, realizando la cuenta microbiana en el momento de la inoculación (relación de inoculación 1:100);

Se mantuvieron las condiciones de temperatura y aireación por un período de 14 días, monitoreando los parámetros fisicoquímicos, microbiológicos.

Se aislaron igualmente para su purificación 3 colonias bacterianas, de las cuales

se seleccionaron 5 cepas representativas según características micro y macro biológicas

pero sobretodo se seleccionaron aquellas con capacidad de tomar el alacloro como fuente

de carbono y energía reportados anteriormente en literatura.

El repique de las colonias se realizó al azar y por duplicado en los tres distintos

medios. Cada cepa se purificó varias veces mediante la técnica de repiques sucesivos,

hasta obtener cepas aisladas en medio selectivo. Las cepas fueron conservadas en agar

nutritivo inclinado (Ver Tabla 2-13).

2.2.4 Pruebas bioquímicas empleadas para fenotipicación bacteriana consorcial

Para la caracterización macroscópica ó morfológica colonial, se tomaron en

cuenta los siguientes aspectos: forma, borde, elevación, aspecto y tamaño. En

cuanto a las características microscópicas, el estudio se hizo mediante el método

de tinción de Gram (Anexo A). Este método consiste en diferenciar la estructura de

la pared celular, catalogándolas como Gram positivas y Gram negativas, según la

tinción generada por los colorantes (Hernández-Chavarría, 2002). Las tinciones

fueron observadas en el microscopio óptico a 100x. A la par se realizó las pruebas

bioquímica catalasa y oxidasa como parte de la caracterización de las cepas

aisladas. Las pruebas anteriormente señaladas, fueran pieza clave para

seleccionar las cepas representativas del consorcio, para los análisis posteriores.



2.2.4.1 Tinción de Gram y repique en agar nutritivo.

Se realizó coloración de Gram a cada uno de los tubos de caldo de pre-enriquecimiento

que mostraron supervivencia. Posteriormente, Se tomaron 10 µl de cada tubo de caldo

de preenriquecimiento y se realizó siembra por agotamiento en Agar nutritivo con 1% de

agente xenobiótico como única fuente de carbono y energía, con el fin de aislar colonias

de cada muestra cultivada por 7 días. Los cultivos fueron incubados por 24 horas a 35°C

En la tabla 2-14 se muestran las pruebas bioquímicas realizadas para la investigación

.Tabla 2-14 Pruebas Bioquímicas empleadas en el estudio

Parámetro Bioquímicos evaluados

Catalasa

Oxidasa

Test de KOH

Relación con el Oxígeno

Metabolismo Oxido-ferm de la glucosa

Hidrólisis de la gelatina

Hidrólisis del almidón

Hidrólisis de Tween

Crecimiento en NaCl 2%

Crecimiento en NaCl 5%

Crecimiento en Medio Selectivo

2.2.5 Técnicas analíticas empleadas en la caracterización física del agua

La caracterización física y química del agua de activación, enriquecimiento y de

degradación se desarrollaron bajo los procedimientos normativos y equipos descritos en

la Tabla 2-15 y 2-16 respectivamente


Tabla 2-15 Técnicas de análisis físico empleada en el agua sintética

Parámetro Norma o Procedimiento Método

pH NMX-AA-008- SCFI-2001

Potenciométrico Equipo: Estándar Buffer pH 7 Estándar Buffer pH 4

Conductividad NMX-AA- 93-SCFI-2000

Conductimétrico Equipo

Oxígeno Disuelto NMX-AA-012-SCFI-2001

Electrométrico Equipo HACH Estandar de Calibración: Yodo como Yodato Ref. Lot a2086

Sólidos suspendidos totales NMX-AA-034-SCFI-2001 Potenciométrico

Equipo

Sólidos suspendidos volátiles NMX-AA-034-SCFI-2001

Temperatura Potenciométrico Equipo

2.2.6 Técnicas analíiicas empleadas en la caracterizaci+on química del agua sintética

Tabla 2-16 Técnicas de análisis químico empleada en el agua sintética

Parámetro Norma Equipo

Cloruros NMX-AA-073-SCFI-2001

HACH DR 2700 Viales: HI3815 Ref.:

Dureza de calcio NMX-AA-072-SCFI-2001 HACH DR 2700 Viales: Ref.:

Dureza de magnesio NMX-AA-072-SCFI-2001 HACH DR 2700 Viales: Ref.:

Dureza total NMX-AA-072-SCFI-2001

HACH DR 2700 Viales: Ref.:

Demanda química de oxígeno NMX-AA-30-SCFI-2001

Termoreactor HACH DR 2700 Viales: Chemetrics 0-1500 ppm



Lote No. 12421 Ref.: K7365

Nitrógeno total NMX-AA-026-SCFI-2001

HACH DR 2700 Viales: TNT 828 Ref:UHR

Fosforo total y Reactivo NMX-AA-029-SCFI-2001

HACH DR 2700 Viales TNT 845 Ref. : UHR

Nitritos NMX-AA-30-SCFI-2001

HACH DR 2700 Viales TNT 839 Ref.: UHR 12300

Carbono orgánico total Analizador TOC (marca: General Electric, serie:)

2.3 Etapa Experimental III

2.3.1 Caracterización Microbiológica

2.3.1.1 Microscopia electrónica de Transmisión en modo criogénico

Se les realizó Crio-microscopia electrónica de transmisión, Un SEM / haz de iones

focalizados (FIB) se utiliza para identificar las características de interés en muestras y

extraer una lámina delgada, transparente-de electrones para la transferencia a un crio-

TEM.

El JEOL-2100 (ver figura 2-2) es un microscopio de transmisión con un filamento

de LaB6 que pudo ser operado a diferentes voltajes de aceleración (80, 100, 120, 160 y

200 kV) y proporcionar una buena iluminación en altas amplificaciones, para la obtención

de las imágenes de alta resolución. Cuenta con una pieza polar objetiva y un porta

muestras criogénico que hacen posible la observación de muestras a una temperatura de

hasta -160 °C que pueden ser caracterizadas mediante tomografía o haz indirecto En el

caso del estudio se adelantaron por haz indirecto en campo oscuro, sobre sobre las

muestras que presentaron supervivencia y algunas de las cuales no presentaron

adaptación.


Figura 2-2 Equipo TEM -Criogenia

2.3.2 Espectrofotometría UV-vis de las cloroacetanilidas

El análisis UV-vis se realizó en un equipo Lambda 365 Perkin Elmer Instrument (Ver Tabla

2-17 y Figura 2-3, Este análisis se llevó a cabo en los laboratorios de Termodinámica y en

Perkin Elmer.

Se realizaron curvas de calibración de los compuestos

Tabla 2-17 Detalles del equipo empleado UV-VIS

Ítem Descripción

Modelo de instrumento Lambda 365

Parte No. N4100020


365K6082408

Revisión del software UV Express Version 4 2015



Figura 2-3 Equipo empleado en los análisis UV Mc-Farland

2.3.2.1 Calibración del Equipo Linea Base (Aire/ Selección de Celda de Trabajo)

Como se hizo el recuento microbiológico por la técnica de Mc Farland, y los compuestos

aromáticos con heterotermos en su estructura, se hizo necesario la respectiva calibración

del equipo (ver tabla 2-18) y validación de la lámpara ultravioleta-visible que por literatura

abierta se recomienda el empleo del vapor de benceno como molécula a emplear. El

método consistió básicamente en corroborar las señales características que arroja la

molécula aromática y definida para verificar que la lámpara está operando

adecuadamente.

Pruebas Realizadas Estándar Utilizado

Exactitud de longitud de onda o exactitud

espectral

Lámpara de Deuterio

Lámpara de vapor de mercurio

Filtro de óxido de Holmio

Filtro de Didymio

Óxido de Holmio en ácido perclórico


Tabla 2-18 Pruebas de rendimiento adelantas en el equipo UV-vis previo análisis

Criterio de aceptación aplicada:

: ± 1 nm en el rango ultra violeta (200 – 380 nm).

± 3 nm en el rango visible (380 – 800 nm).

Tres lecturas del pico deben estar entre ± 0.5 nm.

Figura 2-4 Calibración del Equipo UV-vis (Barrido de Aire/ Selección de Celda)

Reproducibilidad de la longitud de Onda Solución de Dicromato de Potasio a 350 y

257 nm

Luz difusa Solución de cloruro de potasio ( 200 nm )

Solución de yoduro de potasio ( 220 nm )

Exactitud fotométrica Filtros de vidrio de densidad neutra

Filtros de metales en cuarzo

Solución de dicromato de potasio

Reproducibilidad fotométrica Solución de dicromato de potasio

Línea de base Barrido de aire en modo de absorbancia.

Estabilidad Barrido del aire por 60 min. A 340 nm.

Linealidad Solución de dicromato de potasio en ácido



El aire fue barrido en el modo de absorbancia por 10 minutos, el ruido de pico a

pico es registrado a 500 nm. Se calculó la raíz cuadrada del promedio del ruido la cual es

una medida de la desviacion estándar de la señal de ruido de fondo. Aunque cabe aclarar

que el equipo que se empleó está equipado con una función que estima el ruido.

Criterio de aceptación empleado: La raíz cuadrada del promedio fue típicamente

menor que 0.001 UA

Igualmente se hicieron pruebas para ver el corrimiento con las diferentes celdas, y

posibles interferencias futuras (ver figura 2-4), ya que se desconoce la interacción química

del analito xenobiótico con el material de la celda, seleccionándose la celda de cuarzo,

como la adecuada para la experimentación.

La exactitud de la longitud de onda fue determinada por comparación entre las

medidas obtenidas de un material de referencia (vapor de benceno) y el valor estándar

establecido en el certificado del material de referencia (ver figura 2-5). Entre los materiales

de referencias utilizados tenemos un material óptico neutro el cual tiene poca dependencia

de la longitud de onda para las transmitancias o absorbancias es deseable porque este

elimina la dependencia del ancho de banda espectral de las mediciones.

.

Figura 2-5 Calibración del Equipo UV-Lámpara de Ultravioleta-Visible


Tabla 2-19 Señales vapor de benceno

No. Peak(nm) Peak(AU)

1 242,85 0,8296

2 249,00 1,2480

3 255,20 1,4297

4 261,35 0,9710

Se verificaron (Gráfica 2-5) en la región UV las tres bandas de absorción de origen 𝝅𝝅*.

Estas bandas han recibido históricamente diferentes denominaciones (una definición más

rigurosa, basada en los elementos de simetría molecular, queda fuera de este tratamiento).

Se corroboraron las siguientes bandas:

1.-Banda secundaria, bencenoide o α (λmax = 254 nm εmax= 250). Esta banda de origen

𝝅𝝅* resulta de muy baja intensidad por ser prohibida por simetría. Su presencia en el

espectro se debe a la reducción de simetría por movimiento vibracional (banda vibrónica)

por lo que muestra una estructura fina vibracional característica. La banda secundaria se

hace más intensa en los derivados bencénicos por reducción de la simetría molecular.

Asimismo se mantiene en los derivados bencénicos como una transición de los orbitales 𝝅

locales del benceno por lo que su posición muestra relativamente poca sensibilidad a la

sustitución (efectos batocrómicos moderados).

2.-Banda primaria o p (λmax = 204nm εmax= 8800). Esta banda de origen 𝝅𝝅* es también

relativamente débil pero mucho más intensa que la anterior. Esta banda se desplaza

batocromicamente en los bencenos sustituidos por presentar carácter de transferencia de

carga entre el anillo aromático y el sustituyente y puede llegar a sumergir a la más débil

banda bencenoide.

3.-Segunda banda primaria o β (λmax = 184nm εmax = 68000). Esta intensa banda

presente en el UV lejano puede desplazarse hacia el UV cercano en el caso de bencenos

sustituidos por cromóforos de extensa conjugación (aromáticos policondensados).

Igualmente se hizo corrección por linea base en el equipo empleado conforme lo muestra

la figura 2-7 y los datos arrojados de dicha calibración se muestran en la tabla 2-20.



Figura 2-6 Corrección por Linea Base

Tabla 2-20 Corrección UV por línea base empleada

Name Peak(nm) Peak(cnt)

Baseline Valley(nm) Valley(cnt)

1 233,15 20930,8772

2 656,10 28804,8781

Una vez adelantadas los anteriores procesos se procedió a adelantar la

visualización del espectro de cada compuesto, y ubicar su respectiva longitud de

onda.

2.3.3 Metodología de cuantificación microbiológica por espectrofotometría UV-vis,

2.3.3.1 Técnica de McFarland

Para la cuantificación bacteriana (objeto de evaluar la cinética de degradación), se

empleó la aplicación directa de la turbidimetría y del recuento de microorganismos por

diluciones seriadas con la realización de una curva patrón de estándares de Mc Farland

en la que se relaciona la medida de la absorbancia con el número de células viables del

cultivo. Por el volumen de muestras, se optó por esta técnica de mayor simplificación y no

interrupción del proceso degradativo


Se muestra en la Tabla 2-21, la escala de McFarland con los valores de turbidez de

unos patrones de sulfato bárico (mezcla de cloruro bárico al 1% y ácido sulfúrico al 1%)

con el número de bacterias presentes en una muestra. La exactitud de la densidad de la

turbidez estándar de Mc Farland preparada se comprobó con el espectrofotómetro

anteriormente descrito con un paso de luz de 1 cm, empleando el estándar de 0.5 de

McFarland, la absorbancia d una longitud de onda de 625 nm debió estar entre 0.08-0.1.

Tabla 2-21 Tabla Mc-Farland empleada

Lote Estándar

McFarland

% B

aC

l2

(mL

)

% H

2 SO

4

(mL

)

Bacterias aproximadas suspendidas por mL

TM50 0.5 0.05 9.95 1.5 x 108 UFC

TM51 1 0.10 9.90 3.0 x 108 UFC

TM52 2 0.20 9.80 6.0 x 108 UFC

TM53 3 0.30 9.70 9.0 x 108 UFC

TM54 4 0.40 9.60 1.2 x 109 UFC

TM55 5 0.50 9.50 1.5 x 109 UFC

TM56 6 0.60 9.40 1.8 x 109 UFC

TM57 7 0.70 9.30 2.1 x 109 UFC

TM58 8 0.80 9.20 2.4 x 109 UFC

TM59 9 0.90 9.10 2.7 x 109 UFC

TM60 10 1.0 9.0 3.0 x 109 UFC

Para los datos de la curva de crecimiento se midió la densidad óptica a diferentes

tiempos para cada cepa (Chandankere et al., 2013). El blanco de calibración del

espectrofotómetro utilizado fue el medio mínimo mineral contaminado con el xenobiótico.

El espectrofotómetro modular Jaz UV-VIS (Ocean Optics, Inc; Florida, USA) y el Lambda

arrojaron los resultados de densidad óptica evaluados a distintas valores de λ que van

desde 178.53 a 875 nm; para fines de este trabajo, se tomará el valor de D.O. a la λ=625.17

nm.



Es importante hacer mención que en una suspensión microbiana, la cantidad de

microorganismos está directamente relacionada con la turbiedad o densidad óptica. Esta

metodología se aplica con cultivos en donde los microorganismos son unicelulares y con

un tamaño de unos cuantos micrómetros, características que les permiten mantenerse

suspendidos y homogéneamente distribuidos como es el caso de las cepas de estudio

(Villa, n.d.).

2.3.4 Caracterización de las cloroacetanilidas por FTIR-ATR

Las mediciones experimentales se llevaron a cabo en el Laboratorio de la Procuraduría

General de Justicia de la Ciudad de México dentro de las instalaciones del Laboratorio

de Orgánicos (Figura 2-8)

Figura 2-7 Equipo FTIR-ATR empleado

A continuación se describen las características del equipo y software empleados para

el análisis de las cloroacetanilidas

Detalles del instrumento (completos)

Modelo de instrumento Spectrum Two


104850

Revisión del software NIOS2 Main 00.02.0079 15-December-2014 11:35:32

Cantidad de barridos 13

Resolución 4

Detector MIR TGS


Fuente MIR

Divisor de haz OptKBr

Apodización Fuerte

Tipo de espectro Espectro

Tipo de haz Relación

Corrección de fase Magnitud

Velocidad de barrido 0.2

Tipo de Igram Doble

Dirección de barrido Combinado

Cruces de cero 0

JStop 8.94

Número de onda de IR-Laser

11750.00

Fabricante L1600235

Número de pieza L1600235

Número de serie 44467

Descripción ATR Sample base plate Diamond

Rango de barrido predeterminado / cm-1

4000 550

Fuerza aplicada/N 69

Tipo de accesorio Universal ATR

Combinación cristal UATR

Diamante

Cantidad de saltos de UATR

1

Opción UATR No especificado

Detalles del accesorio

Fabricante L1600235

Número de pieza L1600235

Número de serie 44467

Descripción ATR Sample base plate Diamond

Rango de barrido predeterminado / cm-1

4000 550

Fuerza aplicada/N 69

Tipo de accesorio Universal ATR

Combinación cristal UATR

Diamante

Cantidad de saltos de UATR

1

Opción UATR No especificado

Verificaciones de calidad

Vapor de agua Aprobadas

Mínimo de la línea de base

Aprobadas



Máximo de la línea de base

Aprobadas

Pendiente de la línea de base

Aprobadas

Bandas fuertes Aprobadas

Bandas débiles Precaución

Ruido alto Aprobadas

Viñetas Aprobadas

Haz bloqueado Aprobadas

Bandas negativas Aprobadas

Transmisión cero Aprobadas

Luz dispersa Aprobadas

En la Figura 2-9 se detalla los valores establecidos para la medición con ATR-FTIR sobre

los compuestos organoclorados.

Figura 2-8 Ajuste de Fuerza para ña medición FTIR-ATR (Cloroacetanilidas)


2.3.5 Cuantificación de las cloroacetanilidas por HPLC

La preparación de la muestra

Se desarrolló micro-extracción en fase sólida (MSFE) previa a través de columnas

SUPRACLEAN C.18 SPE de 200 mh/L Batch R02L171/ Q07L210 Marca Perkin Elemer

con agentes dispersantes de base de silica (ver figura 2-10), con el fin de que se

proporcione una muestra .Se empleó un materia de fase inversa, especialmente C-18, para

la fase enlazada. La selección del disolvente de elución correspondió a las fases móviles

empleadas, con un tiempo de goteo de 20 por minuto. La polaridad de los analitos es media

a alta, por lo que las opciones de fase móvil para la técnica fueron acetonitrilo, y mezclas

de agua con metanol grado HPLC a 20 kPa, y 20 gotas/min.

Figura 2-9 Cámara de Microextracción en Fase Solida

Condiciones de trabajo (Técnica HPLC para alacloro)

Se realizaron diferentes concentraciones del analito, desde 1 hasta 350 ppm, para el cálculo de las áreas y las respectivas curvas de calibración, siguiendo los montajes analíticos descritos en las tablas 2-22 a 2-24.



Tabla 2-22 Montaje técnica HPLC para alacloro

Figura 2-10 Montaje técnica HPLC alacloro

Figura 2-11 Cromatograma alacloro

Parámetro Descripción

Columna: Supelcosil LC-18 5μm, L= 250 mm, ID= 4,6 mm

Eluente A: Acetonitrilo

Eluente B: Agua HPLC

Gradiente

Tipo Gradiente

Tiempo %A %B

5 50 50

15 90 10

Flujo : 1.4 mL/min

Detector: UV-225 nm

Volumen de Inyeccion 20 μL


Tabla 2-23 Montaje técnica HPLC para metolacloro

Tabla 2-24 Montaje técnica HPLC Procloraz

Figura 2-12 Cromatograma Procloraz



Eluente A: Acetonitrilo


Tipo Isocrático

A% 70%

B% 30%

Flujo : 1.4 mL/min

Detector: UV-220 nm

Volumen de Inyección 10 μL



Eluente A: Metanol


Tipo Isocrático

A% 85%

B% 15%

Flujo : 1 mL/min

Detector: UV-212 a 254 nm

Volumen de Inyección 30 μL



2.3.6 Cualificación de las cloroacetanilidas por GC-MS

2.3.6.1 Preparación de Muestra SPME

Las muestras se procesaron bajo microextracción en fase solida (solid-phase

microextraction MSFE), la fibra del MSFE (Ver figura 2-14 ) expuso por un tiempo de 30 a

1 min dependiendo de qué tan concentrada podría estar la muestra, para muestras muy

diluidas 1 min, y para muestras concentradas 30 segundo en espacio de cabeza HSSPME

Aunque la SPME es una técnica de equilibrio y por eso no extrae exhaustivamente

la muestra, esta investigación desarrollada empleo la técnica junto con el equipo TORION

6 GC-MS portátil, únicamente para la identificación de los compuestos químicos, durante

el proceso de biodegradación.

Las especificaciones técnicas de la fibra SPME empleada corresponde a fibra de

Divinylbenceno/Polimetilsiloxano (DVB/PDMS) de 85 μm utilizando los os métodos de

MSFE en función del grado de concentración presente para que todos los componentes

sean absorbidos por dicha fibra para después proceder a introducir el puerto al inyector a

270°C y dichos componentes sean desorbidos por temperatura y con el gas de acarreo de

Helio ( HE 99.9999% puro) , los ingrese a la columna Elite-5, de 5mx0.1mmx0.4 μm.

Figura 2-13 Técnica MSFE aplicada GC-MS para las cloroacetanilidas


Las muestras fueron analizadas en el laboratorio Z-6 de la ESIQIE, de cada muestra por

medio del Instrumento GCMS Portátil modelo Torion-9 de la Marca Perkin Elmer, empleado

el siguiente método instrumental descrito en la figura 2-15.

Figura 2-14 Método Instrumental GC-MS empleado

La calibración del equipo TORION se realizó utilizado un estándar mix que contiene

13 compuestos, a continuación en la tabla 2-25 se relacionan los compuestos que hacen

parte del estándar de calibración del equipo con sus respectivas masas de verificación

detalladas en la figura 2-16,

Tabla 2-25 Estándar de Calibración empleada en GC-MS



Figura 2-15 GC-MS del estándar de calibración realizado

El software de procesamiento de datos corresponde al CROMION® versión 1.2.0.8, junto

con el software NIST MS Search /EPA versión 2.2 del 2014


2.4 Etapa Experimental IV

2.4.1 Análisis Ecotoxicológicos

El estudio se realizó en el Laboratorio de Toxicología en el INSTITUTO MEXICANO DE

TECNOLOGÍA DEL AGUA IMTA, en la ciudad de Jiutepec de Morelos, órgano rector del

tema hídrico en México, y el único laboratorio con aval en la actualidad para el desarrollo

de dichos análisis especializados.

El método consiste en emplear una batería de ensayos de toxicidad compuesta por la

bacteria luminiscente (Vibrio fischeri, antes Photobacterium phosphoreum, sistema

Microtox. El análisis de resultados incluyó la evaluación de valores de concentraciones

letales o inhibitorias (CL50 , CI50). (Ver Figura 2-17 )

Figura 2-16 Equipo de Microtox empleado en la prueba ecotoxicológica del IMTA

En la tabla 2-26, se muestran las especificaciones del equipo como del sustrato

empleado en los análisis ecotoxicológicos.



Tabla 2-26 Especificaciones del equipo y Sustrato prueba Vibrio fisherii

Referencia Descripción

EQUIPO MODER WATER MICROTOX Model 500

Microtox® P855-637-6426

Lote 16D403

Exp. 05/2018

Laboratorio MODERN WATER

La prueba se basó en la medición de la luminiscencia emitida por las bacterias V.

fischeri después de su exposición a una muestra problema por un período de 5 a 30

minutos. La intensidad de la luz emitida por las bacterias expuestas a la muestra problema

se comparó con la emitida por bacterias que permanecen en las condiciones óptimas del

sistema control.

Ante la presencia de sustancias tóxicas, la luminiscencia de V. fischeri disminuye

de forma proporcional a la carga tóxica en la muestra problema. Este decaimiento se

produce como resultado del daño ocasionado a los procesos metabólicos asociados con

la respiración bacteriana. Este ensayo igualmente se ejecuta como método para validar

internacionalmente el proceso biorremediativo desarrollado exigido por la comunidad

internacional ambiental bajo la ISO 11348-7 aplicable en estudios de toxicología acuática;

como control legal y evaluación de procesos de tratamiento y estudios integrales de

contaminación, donde para el análisis de toxicidad se requiera manejar una concentración

inicial de la muestra del 100%.

Para el cálculo de los CL50/CE50/CI50 se usó el análisis Probit (con o sin ajuste).

Este experimento típico de pruebas de toxicidad aguda contó con la siguiente situación:

• Concentración de la sustancia o dosis (d).

• Número de individuos (n).

• Número de organismos muertos o afectados (r).

• Porcentaje de efecto (p).


La representación gráfica de p vs. d, o relación dosis-respuesta, generó una curva

parabólica que presentó dificultades en la construcción de un modelo lineal. Por tal razón

se abordó este problema transformando d a una escala logarítmica (X = log10(d),

Para facilitar estos cálculos, simplemente se usó un software suministrado por la US

Environmental Protection Agency (US EPA): Probit Analysis Program, versión 1.5. En el

anexo D se presenta los ajustes del cálculo de la CL50/CE50/CI50 por el método Probit.



3. Análisis de Resultados

3.1 Resultados Etapa Experimental 1

El proceso de selección de los consorcios bacterianos para el desarrollo de la actividad de

biodegradación de las cloroacetanilidas y las carboxiamidas cloradas incluyó factores y

variables que inciden al momento de elegirlos, uno de ellos es el crecimiento de

microorganismos que trabajen bajo las condiciones planteadas del agua sintética, lo cual

supone que serán afectados por una gran variedad de factores físicos, (tales como pH

ligeramente ácidos, conductividad media, y temperatura ambiente), y químicos que

pueden actuar complementaria o antagónicaniente entre sí, caso la presencia-ausencia de

algún tipo de oligoelemento necesario o inhibitorio de algún proceso enzimático.

Para la investigación y en pro de normalizar el proceso, el experimento se desarollló

isotérmicamente (30°C ± 0.7), en cada etapa (selección, adaptación, enriquecimiento) a

efectos de evitar interferencia por esta variable en los proceso vitales de todos los

microorganismos presentes en el agregado bacteriano seleccionado, concretamente no

generar afectación a la velocidad de crecimiento, necesidades de nutrientes y composición

química y actividad enzimática de las células frente al xenobiótico.

Estos factores mencionados influyen no sólo en el tamaño y composición de las

poblaciones microbianas al momento de seleccionarlas, sino en la morfología y fisiología

de sus componentes individuales, pudiendo producir cambios considerables en los

procesos metabólicos, morfofisiología celular y procesos involucrados con la reproducción,

por todo ello, la supervivencia de los microorganismos en las aguas es muy variable,

incluso para especies relacionadas o de reconocida remediación.


Inicialmente la observación al microscopio de cada uno de los agregados activos en

medio mineral sin el sometimiento al stress del agente xenobiótico, permitió conocer un

poco de la estructuras y fisiología celular de algunos de ellos, encontrándose que dentro

del banco consorcial con el que cuenta el laboratorio de operaciones unitarias, incluye

microorganismos de los reinos fungi, protista, monera y animal.

A efectos de delimitar el trabajo experimental, en primer lugar se excluyeron aquellos

que tuvieran agregados de hifas, así como de la presencia o ausencia de paredes

transversales (septos) y levaduras, ya que son características propias de los hongos, y el

estudio está delimitado a procesos biorremediativos empleando únicamente bacterias.

Igualmente se excluyeron los demás agregados o consorcios que incluyeran otro tipo de

organismo diferente a las bacterias.

Posterior a la visualización previa, y activación se procedió a evaluar los agregados

bacterianos frente a concentraciones bajas del organoclorado persistente (alacloro,

metolacloro, y procloraz), y evaluar supervivencia mediante observación directa en el

microscopio En la tabla 3-1, 3-2 y 3-3 se muestran los resultados de supervivencia vitales

para un proceso de biorremediacion bacteriana, informando como negativo aquellos

agregados que no presentaron supervivencia o que fueron excluidos por no ser bacterias

y positivos , aquellos agregados bacterianos que presentaron adaptabilidad al medio.

3.1.1 Resultados de Selección

Tabla 3-1 Resultados de Selección de agregados bacterianos IPN-ESIQIE

Consorcios iniciales

Starmart Negativo Nemátodos Negativo

Morelos Negativo Degradex Negativo

Me Negativo Rhizobium Negativo

Datil Negativo Phc Negativo

Bio-5 Negativo Mhetarizum phc Negativo

Maya Magic Negativo Pochonia Negativo

Loxich Negativo Pueselomisis Negativo

Montaña Negativo Micorrizas Negativo

Bacillus subtilis Negativo Metorrizum Negativo

Thericoderm Negativo Mch Negativo



Biopool Negativo Thricoderm Negativo

Biofert Negativo Degraquim Negativo

Virens Negativo Rhizobium II Negativo

Verticilium Negativo Paecelomisis Negativo

S. turigensis Negativo Aecelomisis Negativo

Gaia subtilis Negativo Microrrisis Negativo

Gaia Thricoderm Negativo Ortiplus Negativo

Azospirillum Negativo Bauveria Negativo

Bioactivador Negativo Rumens1 Negativo

Pacellomisis Negativo Rumens 2 Negativo

Rumens 3 Negativo Clostridium Negativo

Rumens 4 Negativo Chloracidobacteria Negativo

Rumens 5 Negativo Lecanicillum Negativo

Manglar Negativo Acidobacteria Negativo

Pastosal Negativo Paelomyces Negativo

Agua T Negativo Bacillus II Negativo

Pseudomonas Negativo Mx Positivo

Paccelomisislo Negativo My Negativo

Bacillus Negativo Mz Negativo

Aeromicrobium Negativo Mw Negativo

Tabla 3-2 Consorcios definidos –CINVESTAV

Agregado Bacteriano Resultado

1 BioC I Negativo

2 BioC II Negativo

3 BioC III Negativo

4 BioC IV Negativo

5 BioC V Negativo

Tabla 3-3 Consorcios no definidos –Zona Industrial Minatitllan y Tlalnepantla

Agregado Bacteriano Resultado

Bacterias Lodos Reactor 1 Negativo



Ex Negativo

Px Positivo

Concordante con investigaciones (Valenzuela, 2003), la resistencia y adaptabilidad

bacteriana presenta más de un mecanismo de resistencia y cuando tiene la facultad de

transmitirlo, no sólo a su descendencia, sino también a otras bacterias de su misma o


diferente especie permite el desarrollo frente a ambientes que normalmente otras

bacterias no generarían crecimiento.

Entre dichos mecanismos se encuentra el empleo de enzimas específicas, la modificación

del sitio activo, la disminución de la permeabilidad de la pared celular, las bombas de eflujo

y la transferencia horizontal de genes por conjugación, transducción y transformación entre

otros. (Moreno, 2009).

En la figura 3-1, se muestra el agregado bacteriano Px en fase de adaptación,

donde se aprecian bacterias de morfología variable (cocos, bacilos, espirilos), propio de un

consorcial con diferentes tipos de bacterias constituyentes.

Figura 3-1 Agregado Bacteriano Px en Microscopio óptico a 40 X, en fase de adaptación en medio (alacloro)

Una vez seleccionado los agregados bacterianos (Px y Mx), se procedió a valorar su

crecimiento y degradación cuyos resultados se describen a continuación.



3.2 Resultados Etapa Experimental 2

Empleando la metodología descrita en la etapa experimental, se procedió a cuantificar las

unidades formadoras de colonias (UFC), a través de las mediciones de absorbancia

descritas en la técnica espectrofotométrica de McFarland del capítulo anterior.

La turbidez producida por el crecimiento microbiano de microorganismos unicelulares

puede ser medida de acuerdo a la capacidad de absorber la luz. Dichas muestras a

determinar son generalmente translúcidas cuando no presentan crecimiento microbiano y

turbias cuando manifestan desarrollo. Esta turbidez aplicada por McFarland usa la

Densidad óptica para

3.2.1 Resultados Mc Farland (Crecimiento Bacteriano)

En la figura 3-2 se ilustra el crecimiento bacteriano de los consorcios Mx y Px en sustrato

de alacloro (300 pm). Aunque presentan UFC de cantidades diferentes reflejadas por el

incremento en un 50% entre Mx y Px, ambas muestran una curva en su fase exponencial

y estacionaria cercanos a los mismo tiempos, propio de las actuaciones sinérgicas y

antagónicas de las bacterias que integran cada consorcio, el metabolismo de los nutrientes

que este medio acuoso oligotrófico le aporta, y al aumento de la masa celular pero no del

número de células.

Figura 3-2 Crecimiento Bacteriano en Alacloro

0.00E+00

2.00E+08

4.00E+08

6.00E+08

8.00E+08

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0

UFC

/m

L

Tiempo (dias)

Crecimiento Bacteriano en Alacloro

Mx UFC/mL

Px UFC/mL


Igualmente se observa una adaptación previa, a pesar de ser inoculados bacterianos en

fase exponencial de la etapa de preenriquecimiento y enriquecimiento, no se evidenciaron

características de amensalismo dentro del desarrollo bacteriano, y la producción de

biomasa fue consistente con el agotamiento de nutrientes establecidos para el montaje

experimental.

Igualmente para el caso del crecimiento bacteriano en el sustrato de procloraz (Figura 3-

3), estos agregados alcanzan un máximo sobre los 8 dias de desarrollo experimental,

caracterizándose por tener una fase estacionaria corta, propia del agotamiento rápido de

los nutrimentos por la acción pronta de mecanismos de adaptación bacteriana, que para

este compuesto no representa co-metabolismos de periodos degradativos altos,

comparado con los otros dos sistemas (alacloro y procloraz< 12 dias

Figura 3-3 Crecimiento Bacteriano en Procloraz

0.00E+00

2.00E+07

4.00E+07

6.00E+07

8.00E+07

1.00E+08

1.20E+08

1.40E+08

1.60E+08

1.80E+08

2.00E+08

0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0

UFC

/mL

Tiempo (dias)

Crecimiento Bacteriano en Procloraz

Mx Px



Los consorcios bacterianos (Mx y Px) presentaron una fase exponencial de crecimiento

luego de un periodo de adaptación de 4 dias en el sustrato de esta cloroacetanilida

(metolacloro), luego de este periodo se presentó un incremento significativo en el número

de unidades formadoras de colonia para el caso de Mx , mostrando una mejor

adaptabilidad al sustrato, por el mayor crecimiento de células bacterianas , alcanzando un

máximo sobre los 8 dias, luego de los 15 dias se registran evidencias claras de fase de

muerte de los agregados bacterianos, propio de las limitaciones por falta de nutrientes y

producción de compuestos que inhiben el desarrollo consorcial.

Figura 3-4 Crecimiento bacteriano en metolacloro

A pesar de que los agregados se enriquecieron y la inoculación fué en etapa exponencial,

no se observa en los resultados (Ve figura 3-4), una continuidad de fisión binaria bacteriana

propia de dicha fase sino una nueva adaptabilidad al medio de mayor concentración ( de

2 ppm a 300 ppm), razón por la cual se observa que los agregados bacterianos adelantan

procesos de funciones celulares sobre el sustrato de mayor concentracion, que incuyen el

metabolismo energético , por lo que no hay incremento bacteriano (3.00x 10 04UFC) y la

población consorcial para ambos casos mantiene niveles estacionarios en su nueva fase

latente dada por la carencia de varios componentes esenciales para dividirse y el nuevo

tiempo para la síntesis de elementos requeridos (mayor producción enzimática)

Igualmente algunos microorganismos pueden tener un crecimiento diferente propio de

cada consorcio bacteriano empleado, razón por la cual algunas el balance total de

ausencia de incremento en el número de bacterias observado en esta fase de

adaptabilidad a concentraciones mayores de xenobiótico clorado, genera un crecimiento

críptico para los 3 casos analizados.

0.00E+00

2.00E+07

4.00E+07

6.00E+07

8.00E+07

1.00E+08

1.20E+08

1.40E+08

0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0

UFC

/m

L

tiempo (dias)

Crecimiento bacteriano en metolacloro

Mx Px


Todas las gráficas de crecimiento bacteriano mostradas (Figura 3-2 a 3-4) presentaron un

modelo de incremento poblacional exponencial característico de las velocidades de

crecimiento de un cultivo discontinuo, iniciando en la fase latencia como velocidades lentas

propias de la adaptación y supervivencia, y luego con la división celular progresiva de

determinada frecuencia. Cabe aclarar que los crecimientos acá descritos obedecen a

crecimientos globalizados de las bacterias participantes en el sinergismo degradativo de

las cloroacetanilidas (alacloro y metolacloro) y de la Carboxiamida (procloraz) y no al

comportamiento de un único modelo bacteriano.



3.2.2 Resultados de análisis TGA

En esta sección se discuten los resultados obtenidos en el análisis termogravimétrico de

TGA para el alacloro, mostrando la descomposición térmica de la muestra en una sola

etapa (Figura 3-5 y 3-6), la cual fueron medidos a diferentes rampas de incrementos (10,20,

30°C)

Los resultados del análisis Termogravimétrico muestran un proceso simple característico

para un sólido con una pureza alta.

Figura 3-5 Resultados TGA alacloro

Figura 3-6 Cinética Degradación térmica TGA del alacloro


3.2.3 Caracterización fisico-quimica agua inicial

Los resultados de las características fisco-químicas del agua sintética corresponden a una

misma matriz acuosa a las cuales se les separo para la adición de su respectivo

organoclorado.

Los resultados de caracterización de agua revela las condiciones que los elementos del

agua sintética se encuentra dentro de los rangos para un agua oligotrófica, con niveles de

saturación de oxígeno adecuados y rangos de pH óptimos para trabajo bacteriano Ver

(Tabla 3-4), (Tabla 3-5) (Tabla 3-6)

El control de la alcalinidad y del contenido de calcio también contribuye a la estabilidad del

agua a través del sistema ácido-base de los carbonatos, y a controlar la experimentación

a efectos de no generar procesos inhibitorios por pH, por lo que las aguas corresponden

a un matriz con pH ligeramente básico, con amortiguamento buffer, con niveles de oxígeno

normales para un agua léntica, contenido de sales bajo, y valores de calcio que le

categorizan como un agua blanda. Al tener niveles de sales ionizables bajos, los niveles

de conductividad también son bajos.

La Demanda química de oxígeno para el caso de las cloroacetanilidas estuvo por el orden

de los 560 a 630 ppm y de la carboxiamida clorada de 560 ppm, que las ubican según la

Escala de clasificación de la calidad del agua, conforme a la Demanda Química de Oxígeno

(DQO), de la Subdirección General Técnica, CONAGUA, con cualidad de agua

fuertemente contaminada (DQO>200) características primordiales para adelantar un

proceso biorremediativo.



Tabla 3-4 Caracterización fisicoquímica Agua Sintética oligotrófica con alacloro

ALACLORO (300 ppm)

2-cloro-2',6'-dietil-N-metoximetilacetanilida

No. Lote Empleado SZBD163XV Alachlor Pestanal®

Pureza: 99.8%

Parámetro Unidad Valor

pH [H+] 7.36

Oxígeno Disuelto mg/L 4.42

Cloruros mg/L 56

Dureza de calcio mg/L 35

Dureza de magnesio mg/L 15

Dureza total mg/L 50

Conductividad µS/cm 166

Demanda química de oxígeno mg/L 560

Nitrógeno total mg/L ND

Fosforo total mg/L 71

Sólidos suspendidos totales mg/L 12.4

Sólidos suspendidos volátiles mg/L 5.4

Carbono orgánico total mg/L 260

Temperatura °C 21-22

Tabla 3-5 Caracterización fisicoquímica Agua Sintética oligotrófica con metolacloro

METOLACLORO(300 ppm)

2-cloro-2’,6’-dietil-N-metoximetilacetanilida

No. Lote SZBD163XV Metolachlor Pestanal®

Pureza: 97.6%


pH [H+] 7.67


Cloruros mg/L 45













Tabla 3-6 Caracterización fisicoquímica Agua Sintética oligotrófica con procloraz

PROCLORAZ(300 ppm)

N-propil-N(2-(2-4,6-triclorofenoxi)etil imidazol-1 Carboxiamida 300 ppm

No. Lote 02991410


pH [H+] 7.36


Cloruros mg/L 76














3.2.4 Caracterización de los consorcios bacterianos evaluados bajo Crio-MET

Los resultados de caracterización de microscopía electrónica de transmisión son

concordantes con los de la etapa de selección, se pueden observar en la figura 3-7

ausencias de desarrollo bacteriano del blanco y en la Micrografia 3-8, también la poca o

nula adaptabilidad desarrollada por el consorcio Maya Magic.

Figura 3-7 Blanco observado en MET-Criogenico a 200X

Figura 3-8 Maya -magic observado en MET-Criogenia a 200X

Las microscopias de los agregados bacterianos definidos Bio CII y Bio CIII (Figura 3-9 y

3-10 respectivamente), no tuvieron apreciable desarrollo celular.


Figura 3-9 Bio CII observado en MET-Criogenico a 200X

Figura 3-10 Bio CII observado en MET-Criogenico a 500X

Para el caso de aislados bacterianos como los de B. subtilis, el resultado mostró a 300x

inicios de adaptabilidad frente a la cloroacetanilida (alacloro) observables en pequeñas

aglomeraciones bacterianas (ver figura 3-11)



Figura 3-11 Consorcio Bacillus subtillis observado en MET-Criogénico a 300X

En la micrografía presentada en la figura 3-12 a 500x, observamos agregados bacterianos

de organismos del consorcio con denominación Pseudomona sp con adaptabilidad lenta

a la cloroacetanilida (alacloro)

Figura 3-12 Consorcio Pseudomona sp. observado en MET-Criogénico a 500X


En la micrografía 3-13 se aprecia a 11500x agregados bacterianos del consorcio Mx, los

cuales manifiestan una morfología bacilar, con movilidad activa (flagelar), adheridas al

soporte con membrana celular definida.

Figura 3-13 Agregados Bacterianos Mx en alacloro visto en MET-Criogenia a 11056 X



3.2.5 Aislamiento de cepas y análisis preliminares.

Se seleccionaron dos cepas del total de los 70 consorcios de los aislamientos para su

análisis, según los resultados obtenidos de los análisis preliminares. La tabla 3-7 ilustra

las características macro y micro morfológico de cada una de ellas y los resultados de los

análisis preliminares de la tinción de Gram, las pruebas bioquímicas (catalasa y oxidasa)

y la caracterización morfológica (ver figura 3-14 y 3-15).

Pérez et al., 2008, sustenta que las comunidades microbianas en áreas

contaminadas son dominadas por los organismos capaces de utilizar o sobrevivir a

compuestos tóxicos, como los ambientes contaminados con hidrocarburos, tal es el caso

del género Pseudomona. La Pseudomona aeruginosa ha sido identificada como un género

destacado en diversos procesos de degradación y es la que con mayor frecuencia se aísla

de ambientes contaminados con hidrocarburos. Sin embargo, otras especies de

Pseudomonas han sido aisladas de sedimentos de otras costas como Pseudomonas

oleovorans, Pseudomonas synxatha, Pseudomonas reactans y Pseudomonas putida.

Otras investigaciones han demostrado que especies de Acinetobacter involucradas en la

biorremediación de hidrocarburos aromáticos clorados, así como en la producción de

heteropolisacáridos de alto peso molecular que actúan como emulsionantes de gran

alcance.

Figura 3-14 Crecimiento bacteriano medio selectivo


Figura 3-15 Crecimiento bacteriano medio selectivo Plate count

Tabla 3-7 Resultados de los análisis preliminares bioquímicos de las cepas aisladas del consorcio Mx.

Morfología celular Morfología colonial pruebas bioquímicas

Tinción de

Gram

Morfolo- gía

Forma Borde Elevación

Tamaño Aspecto Oxidasa

catalasa

(+) (-)

✔ Bacilo circular entero plana grande roja - +

✔ Bacilo circular entero convexa pequeña Beige/transparente/brillante

- +

✔ Bacilo circular entero convexa mediano Amarillento (bajo)/transparente/ brillante

- +



Tabla 3-8 Resultados de los análisis preliminares bioquímicos de las cepas aisladas del consorcio Px


Tinción de Gram

Morfolo- gía


Tamaño

Aspecto Oxidasa

catalasa

(+) (-)

✔ Bacilo circular entero plana grande opaca - +

✔ Bacilo circular entero convexa pequeña

Beige/transparente/brillante - +

✔ Bacilo circular entero convexa mediano

opaca - +

✔ Bacilo irregular

irregular (ondulado

)

plana grande opaca - +

✔ Bacilo irregular

irregular convexa grande Mucoidal - +

Tabla 3-9 Resultados de los análisis preliminares bioquímicos de las cepas aisladas del consorcio Bacillus subtilis


Tinción de

Gram

Morfolo-

gía


Tamaño

Aspecto Oxidasa

catalasa

(+) (-)

✔ Bacilo circular entero plana grande Marfil/ opaca - +

✔ Bacilo circular entero convexa pequeña

Beige/transparente/brillante

- +

De acuerdo con los resultados obtenidos (Tablas 3-7 y 3-8), los consorcios están

conformados por bacterias procariotas gram negativa a excepción del consorcio

subtilis (Tabla 3-9); en cuanto a los resultados de las dos pruebas bioquímicas,

todas mostraron el siguiente patrón: Catalasa positiva y oxidasa negativa.

Cabe destacar que los dos consorcios bacterianos seleccionados, el crecimiento

fue inmediato en los tres medios de cultivo en un periodo de incubación de 24 horas

a 30ºC.

Con el crecimiento de biomasa en el medio enriquecido con el agente xenobiótico

a 350 ppm, se demuestra la habilidad de dichas cepas de utilizar estas moléculas

como fuente de carbono y energía o en otras palabras, se asume la capacidad

degradadora de hidrocarburos del consorcio microbiano.

Los resultados de las pruebas bioquímicas aplicadas a cada tratamiento

organoclorado muestra que las bacterias que participan en los procesos

adaptativos en su gran mayoría obedecen a bacterias gram negativas, catalasas

positivas, oxidasas positivas, con metabolismos en su mayoría oxidativos, y con


presencia de enzimas hidrolasas, y con participación de especies del genero

Pseudomona sp.

Tabla 3-10 Pruebas Bioquímicas a consorcios en alacloro

Prueba Bioquímica Resultado Mx

Resultado Px

Tinción de gram Gram (-) Gram (-)

Test de KOH Positivo Positivo

Catalasa Positivo Positivo

Metabolismo Redox glucosa Oxidativa Redox

Hidrólisis de gelatina Positivo Positivo

Hidrólisis de almidón Positivo Positivo

Hidrólisis de Tween Muy Lento Rápido

Crecimiento en medio selectivo Pseudomonas

Positivo Positivo

Tabla 3-10 Pruebas Bioquímicas a consorcios en metolacloro


Resultado Px




Metabolismo Redox glucosa Oxidativa Redox



Hidrólisis de Tween Muy Lento Rápido


Positivo Positivo

Tabla 3-11 Pruebas Bioquímicas a consorcios en procloraz


Resultado Px




Metabolismo Redox glucosa Redox Redox



Hidrólisis de Tween Rápido Rápido


Positivo Positivo



3.3 Resultados Etapa Experimental III

3.3.1 Resultados de Espectrofotometría UV –vis

Las bandas de absorción en las regiones ultravioleta que presentan los compuestos

orgánicos analizados caso de las cloroacetanilidas y carboxiamidas, se asocian con

transiciones electrónicas en la capa de valencia. Los electrones involucrados en dichas

transiciones corresponden a aquellos más débilmente atraídos por el conjunto de núcleos

atómicos que componen la molécula y cuyos estados pueden ser descritos a través de

orbitales moleculares que se expresan como combinaciones lineales de orbitales atómicos

de la capa de valencia. Las transiciones electrónicas a orbitales moleculares más externos

dan lugar a las denominadas transiciones Rydberg presentes en el Ultravioleta de Vacío.

Por otra parte las transiciones electrónicas que involucran a los electrones de las

capas internas son muy energéticas y se presentan en la región de los rayos X del espectro

electromagnético. El análisis experimental de los resultados uv-vis obtenidos se reducirá

a las transiciones electrónicas en la capa de valencia de estos compuestos, ya que por la

ausencia de cromóforos y a la no derivatización de las moléculas analizadas no fue posible

usar como referencia la curva de calibración realizada.

El cromóforo de las cloroacetanilidas es el carbonilo que contienen en su estructura

(λ=210nm) lo que presenta una estructura más compleja que los aromáticos normales.

Este grupo funcional en su estado base presenta, además de electrones de valencia en

orbitales σ, un par de electrones en el orbital 𝝅 y dos pares de electrones no enlazantes

sobre el oxígeno (que podemos representar como n1, esencialmente sobre un orbital

atómico p y n2, sobre un híbrido sp, de carácter más interno y que no tendremos en cuenta

en lo adelante). En efecto la presencia del oxígeno con sus pares electrónicos libres hace

posible la existencia de transiciones n𝝅* y nσ*


Figura 3-16 Resultados de Evaluación UV-VIS Procloraz

En la figura 3-16 y 3-17 se muestran los resultados de uv-vis de los compuestos

metolacloro y procloraz respectivamente, estas moléculas se caracterizan por tener una

fracción aromática y otra saturada con heteroátomos. La fracción saturada contiene

heteroátomos tales como oxígeno, nitrógeno, y el halógeno lo cual presentan transiciones

de tipo nσ*. Estas transiciones se ubican generalmente en la región cercana a los 200 nm

dando lugar a la denominada absorción final, un incremento en la absorción hacia el límite

de detección del equipo a longitudes de onda inferiores a 200 nm, sin máximo definido.

Los resultados mostraron que las cloroacetanilidas absorben sobre los 220 nm, y

las carboxiamidas cloradas sobre los 216 nm, dato relevante para efectos del montaje de

la técnica de cuantificación por HPLC. En este experimento

Las características de absorción de las moléculas analizadas dependen de la naturaleza

específica de sustituticón del heteroátomo clorado y en particular de la energía del par

electrónico libre que disminuye al aumentar la electronegatividad (Es relevante la ubicación

del Cloro). En los compuestos con clorados azufrados y yodo las bandas de absorción de

origen n! * pueden aparecer con máximos bien definidos en la región del UV-cercano. La

polisustitución por heteroátomos sobre el mismo carbono puede contribuir al

desplazamiento batocrómico de estas transiciones.



Figura 3-17 Evaluación UV-vis Metolacloro

Para el caso del metolacloro, el cromóforo aromático es mucho más complejo que el

anteriormente estudiado (alacloro), esto obedece a la presencia de varios orbitales 𝝅 y 𝝅*

muy cercanos en energía (o degenerados) que hacen al modelo orbital de descripción de

las transiciones electrónicas poco viable.

La interacción electrónica juega aquí un papel muy importante, complicando la

descripción de los estados del sistema. Las características de la absorción del benceno y

los efectos que produce la sustitución sobre las mismas. En la Figura presentada 2-4 y 2-

5 durante los procesos de calibración de la lámpara con vapor de benceno se muestra el

espectro de absorción UV del benceno como soporte de validación.

Para el caso del estudio de las cloroacetanilidas y carboxiamidas se ven solapadas

por las bandas de los cromóforos carbonílicos.


La sustitución de un hidrógeno en el benceno por un grupo auxócromo produce

desplazamientos batocrómicos de todas las bandas, siendo observables en UV cercano

tanto la banda bencenoide como la banda primaria. La interacción del auxócromo (átomo

de Nitrógeno) con el sistema " bencénico reduce la simetría e intensifica marcadamente la

banda secundaria. La banda primaria se desplaza batocromicamente en proporcionalidad

directa al carácter donor (+M) del sutituyente. La presencia N aromáticas puede ratificarse

por la fuerte sensibilidad del espectro UV a los cambios de pH que para los procesos

biodgradativos son fluctuantes y la capacidad de interacción mesomérica con el anillo se

anula, desplaza hipsocromicamente a las bandas de absorción.

3.3.2 Cálculos para simular las estructuras más estables de reactantes y productos

Las moléculas de alaclor, calculadas por Ramirez, (2004) mediante CAChe se muestran

en las Figuras 3-18, respectivamente. La del herbicida muestra la estructura óptima del

compuesto, puede verse la orientación espacial de los grupos carbonilo y cloro hacia atrás

del plano del bencilo, esta orientación favorecerá la interacción de uno u otro con el

receptor. El grupo éter también tiene posibilidades de interaccionar aunque menor a los

ya mencionados. Se puede ver con claridad en la molécula, la buena disposición espacial

de los CH del bencilo. En la Figura 3.18b se presenta el confórmero de más baja energía

del alaclor, se nota claramente la cercanía del carbonilo a uno de los grupos etilos

sustituyentes. En la Figura 3.14c se da la molécula del alaclor cuando se calcula el calor

de formación con efecto de solvente (H2O), se puede notar la orientación del carbonilo y

el cloro con respecto al plano del bencilo en la misma dirección y del otro lado del plano

el grupo éter.

El grupo carbonilo mantiene una distancia espacial con respecto a los hidrógenos de los

metilos del grupo sustituyente etilo de alrededor de 1 Å, esta cercanía del carbonilo a los

grupos etilos de esta molécula desfavorecería algún tipo de enlace entre el carbonilo y

algún receptor (Figura 3.18c). En contraste, la planaridad del bencilo favorecerá un tipo

de enlace con un receptor capaz de formar enlaces de hidrógeno al través de

interacciones π ••• H, π ••• π y fuerzas de van der Waals principalmente; la orientación

del cloro que muestra la ausencia de posible interacción intramolecular, favorecerá su

interacción con un receptor capaz de formar principalmente enlaces de hidrógeno con un



Ilustración 3-1 Estructura molecular del alaclor calculadas por: a) MM3, b) CONFLEX, c) MOPAC/PM5/COSMO.

Figura 3-18 Estructura molecular del alaclor calculadas por: a) MM3, b) CONFLEX, c) MOPAC/PM5/COSMO.

átomo fuertemente donador de electrones. En estos casos, la molécula con la que forme

enlace el alaclor será un receptor putativo es decir asignado por sus características

químicas y estructurales (Bauer y Gutsche, 1985). La orientación de los sustituyentes en

el anillo bencilo explica la existencia de confórmeros ya demostrado mediante RMN por

Schmidt et al., 1995.

carbonilo cloro

a b c

DATOS DE CÁLCULO

Tabla 3-11 Datos de cálculo de degradación alacloro

MM3 CONFLEX MOPAC Calor de Energía mínima de la Energía del PM5/COSMO reacción especie más estable confórmero más (Efecto de solvente) (kcal/mol) (kcal/mol) estable calor de formación (kcal/mol) (kcal/mol)

Alaclor 34.62 34.62 - 106.99

eter


3.3.3 Identificación de grupos funcionales por FTIR-ATR en las cloroacetanilidas

La espectroscopía de infrarrojo analiza las interacciones entre la materia y la radiación

infrarroja, generalmente en el intervalo de números de onda entre 200 y 4000 cm-1. Esta

técnica se fundamenta en la absorción de fotones con energías correspondientes a la

región del infrarrojo, que generan en las moléculas una transición a un estado vibracional

de mayor energía. Ello permite la identificación de las especies químicas a través de la

determinación de la frecuencia a la que los distintos grupos funcionales presentan bandas

de absorción en el infrarrojo.

Para procesos de análisis de grupos funcionales, asi como para evaluar la retención

de moléculas de H2O o la adsorción disociativa de las mismas, lo que da lugar a la

presencia de grupos OH superficiales que pueden ser extraordinariamente importantes en

reacciones degradativas. En este sentido, la espectroscopía infrarroja proporciona

información sobre el tipo de interacción del agua con la superficie, así como de la densidad

de grupos OH superficiales. Por otro lado, la espectroscopía infrarroja por transformada de

Fourier (FTIR), basada en la interferencia entre dos haces radiación, reduce el tiempo de

adquisición y da lugar a espectros con una mayor relación señal/ruido en comparación a

otras técnicas espectroscopías convencionales. La reflectancia difusa es la herramienta

más adecuada para medir espectros de sólidos en polvo que presentan absorción elevada.

En el proceso, un espejo elipsoidal recoge la radiación dispersada en todas las direcciones

por las partículas orientadas al azar, y dirige esta radiación hacia un detector. Los

espectros así obtenidos no presentan relación numérica directa entre la intensidad de las

bandas y la concentración y no pueden ser comparados, por ello, se emplea la función de

KubelkaMunk para corregir estas diferencias



En este apartado se muestran los resultados de la técnica de caracterización de la química

de los agentes xenobióticos trabajados, con objeto de discernir cómo influyen las

modificaciones realizadas en la química superficial de cada uno de los principales grupos

funcionales. En primer lugar, en la Figura 3-19 se muestran los espectros infrarrojos FTIR

del alacloro, como primer representante de las cloroacetanilidas, asi como los datos del IR

en la tabla 3-12.

En el espectro se observan las bandas características de las cloroacetanilidas,

Figura 3-19 Infrarrojo del alacloro estado inicial sin tratamiento con sus grupos funcionales característicos

Tabla 3-12 Datos Infrarrojo alacloro

Parámetro Valor Unidades del eje X cm-1

Valor de inicio del eje X 4000 Valor de fin del eje X 600 Intervalo de datos -1 Cantidad de puntos 3401

Unidades del eje Y %T Descripción Alacloro Inicial


Las vibraciones de los grupos funcionales más importantes del alacloro se señalan en la

Tabla en la Figura 6.10 sus espectros de infrarrojo (figura 3-20 y 3-21). Como ya se ha

indicado éstos poseen en su estructura grupos carbonilo, éter, halógeno, -O-H cuyas

vibraciones de estiramiento aparecen como una banda ancha en la región de 3500 – 3100

cm-1 (Gutsche, 1998). La vibración –O-H de deformación aparece en la región de 1410 –

1260 cm-1 y la vibración –C-O de estiramiento entre los 1150 – 1040 cm-1.

Hay que reseñar también que la intensidad de las bandas es especialmente alta

en el caso del metolacloro, en particular, la banda de 3000 cm-1, debida a la vibración C-

H del metilo adicional con la que cuenta dicha molécula. Asimismo, la banda a 1729 cm-1

encontrada en el espectro del es específica de las distorsiones vibracionales de los

enlaces C=O propios de los grupos carbonílicos

El grupo carbonilo del alacloro suele ser fácilmente identificable en el FTIR. Este

presenta un pico en su espectro en la región de 1660 a 1900 cm-1 (Promedio Banda de

Tensión C=O: 1725 cm−1, Tensión C-H carbonilo: dos bandas débiles a 2850 y

2750 cm−1. La banda a 2850 suele solaparse con la de tensión C(sp3)−H, Sobretono de

Tensión C=O sobre 3500 cm−1). Este pico es característico de la vibración del enlace

C=O, es la banda más intensa de dicho espectro, y su intensidad es proporcional al

cambio en el momento dipolar cuando el enlace que absorbe se estira o flexiona. Para

que esto suponga un cambio sustancial en el momento dipolar, el enlace debe ser

francamente polar. La elevada intensidad observada en el espectro de la tensión C=O es,

por lo tanto, otra indicación de que el enlace C=O, está altamente polarizado.

Las desviaciones en los valores normales de la frecuencia de los carbonilos del

alacloro nos indican la presencia de caracteres estructurales excepcionales. Por ejemplo,

las frecuencias del grupo carbonilo aumentan regularmente a medida que disminuye el

tamaño del anillo. Podemos entonces relacionar esta tendencia con la creciente tensión

angular de estos compuestos. La tensión angular conduce a un cambio en la hibridación

del átomo de carbobo carbonílico que, a su vez, afecta la frecuencia de tensión del enlace

C=O. Por tanto el seguimiento en el valor de los espectros nos sirve de base tanto

estructural como analítica.



Figura 3-20 Corroboración del compuesto alacloro con base de datos NIST Herbicidas

Figura 3-21 Análisis de grupos funcional de compuestos orto sustituidos


Figura 3-22 Análisis Estructurales de grupos funcionales de carácter tóxico del alacloro (Carbonilo).

Estos grupos funcionales (éter y aldehído) se les hacen seguimiento especial por su

toxicidad (figura 3-22), ya que la polarización del carbonilo los hace reactivos, y pone de

manifiesto que el carbono del carbonilo actuara como centro electrofílico.

El espectro infrarrojo del grupo funcional del éter, es otro rasgo de toxicidad

medido, puesto que en los procesos degradativos su banda se encuentra en la

zona de la banda de O-H característica de los alcoholes y del agua.

El oxígeno del éter del alacloro aparece sobre los 3125 cm-1 desprotege tanto a

los protones como a los carbonos y desplaza la absorción a campo bajo (Fig. 3-

23)

Figura 3-23 Identificación del grupo funcional éter en el alacloro



El metolacloro presenta un espectro típico de las cloroacetanilidas pero con una mayor

transmitancias en lo que respecta a las señales del carbonilo y de las flexiones C-C y C-

H de los metilos (Ver figura 3-24).

Figura 3-24 Espectro FTIR -ATR Metolacloro

Nombre Descripción

___ Metolacloro St Se procesa ATIR Muestra Estándar

En los resultados del infrarrojo (Ver Figura 3-25) al comparar los espectros de las

dos cloroacetanilidas del estudio (Alacloro y metolacloro), la intensidad de una

banda sobre la de los 3000 cm-1 nos informa la variación del momento dipolar con

la coordenada del modo de vibración (dμ/dx). Estas bandas del infrarrojo

específicamente, muestran variación amplia en intensidad. (0.04 a 0.07

Absorbancia), pero confirman que ambas muestran pertenecen a la misma familia

de compuesto químico (Cloroacetanilidas).


Figura 3-25 Comparativo FTIR entre las cloroacetanilidas evaluadas (alacloro-metolacloro)

Nombre Descripción

___ Alacloro St. Muestra 011 Por Administrator Fecha viernes, marzo 31 2017

___ Metolacloro St Se procesa ATIR Muestra Estándar

Seguimiento en infrarrojo de la degradación del Alacloro

La degradación de las cloroacetanilidas, caso del alacloro y metolacloro (ver figura

3-26 y 3-27) según los resultados del infrarrojo que fueron medidos cada 5 dias,

indica el ataque al centro electrofílico del carbonilo, ya que sobre los dias las

señales propias y características del carbonilo no se aprecian, igualmente, la banda

característica de la flexión C-Cl , tampoco se aprecia una vez inicia el proceso

degradativo. Las vibraciones empiezan a mostrar una marcada tendencia en

flexiones OH, sobre las bandas de los 3200 propio de la formación de alcoholes o

de ácidos carboxílicos.



Figura 3-26 Seguimiento Degradación Alacloro FTIR

Seguimiento en infrarrojo de la degradación del metolacloro

Figura 3-27 Seguimiento Degradación FTIR Metolacloro


3.3.4 Degradación de las Cloroacetanilidas y Carboxiamidas cloradas

El cromatograma del alaclor se muestra en la Figura 3-28, se puede notar dos tiempos

de retención 10 y x12 min con un porcentaje de área de 5.64 y 94.36 %,

respectivamente, esto confirma la pureza del reactivo. Sin embargo, el tiempo de

retención de 14 min señalado en la descripción de las características del reactivo no

se reproduce, es lógico que el tiempo de retención varíe debido a que las condiciones

de trabajo fueron diferentes a las usadas para obtener ese tiempo. El porcentaje de

5.64 % es muy posible que corresponda a algún isómero conformacional del alaclor,

ya que se ha demostrado por RMN la existencia de confórmeros en el alaclor (Schmidt

et al., 1995).

Figura 3-28 Cromatograma Alacloro

El cromatograma del procloraz se muestra en la Figura 6-20, se puede notar un

tiempo de retención 5 min con un porcentaje de área de 12.64 y 28.36 %,

respectivamente, esto confirma la pureza del reactivo trabajada. Sin embargo, se

desconocen los tiempos de retención, ya que obedeca una muestra comercial



Figura 3-29 Cromatograma metolacloro

Los análisis de las muestras Mx, Px para cada tipo de compuesto clorado revelaron que

al final del tratamiento la concentración de las cloroacetanilidas se redujo de forma

significativa, con porcentajes que oscilaron entre el 98% y el 96%. (Ver figruas 3-30, 3-31,

3-32)

La evolución en los tres casos de estudio, disminuye de forma dramática al cabo de 72 h

para Mx ; lo cual confirma una disminución en la concentración del contaminante validando

los procesos de biodegradación que se están presentando, resultado a los 20 dias,

concentraciones menores a 1 ppm

Se observa que de los dos consorcios, el consorcio Mx es más selectivo para degradar

alacloro y Px para degradar Metolacloro y procloraz en menos tiempo (11 dias

aproximadamente)


Figura 3-30 Cinética de remoción del alacloro

Figura 3-31 Cinética de remoción metolacloro



Figura 3-32 Cinética de remoción procloraz


3.3.5 Comportamiento del Oxígeno Disuelto

Los valores de Oxígeno Disuelto encontrados en los resultados muestran una

concentración variable que va desde 8.2 mg/L a valores promedio de 3.2 ppm. Esta

distribución encontrada en los sistemas experimentales son importantes porque habla de

las reacciones oxido-redox que pudiesen suceder en la matriz.

La distribución encontrada experimentalmente en superficie para los tres sistemas

organoclorados, informa de un intercambio gaseoso a través de la superficie que sucede

en cada matriz de agente xenobiótico, al no existir floc´s o agregados bacteriano en el

espejo del agua se permitió el libre intercambio gaseoso.

Donde hubo una caída súbita de las concentraciones fue en la zona media, propia de los

equilibrios y presiones existentes sobre los viales, que para este caso no tuvo afectaciones

por cambio brusco de temperatura (homotermia), de salinidad sino por los procesos

oxidativos que desarrollan los microorganismos.

El decrecimiento en los valores del oxígeno inicia sobre las 24 horas de iniciar la

experimentación, en fase de latencia y/o críptica bacteriana, lo cual disminuye el contenido

de Oxigeno requerido para que las bacterias aeróbicas inicien sus mecanismos

enzimáticos.

La distribución vertical encontrada (Ver Tabla 3-13) obedece a un patrón de distribución

clinógrada por su contenido ligeramente mayor en espejo de agua (cerca de la superficie),

propio de un cuerpo de agua sintético que simula estratificación y con alta productividad

microbiológica desarrollada en cada experimentación.

Al final de la degradación biológica se encuentran valores de Oxígeno Disuelto muy bajos,

por lo que pudiera sugerir que en el proceso biorremediativo de las cloroacetanilidas y

carboxiamidas cloradas pudieron intervenir bacterias de comportamiento anaeróbica

facultativa o aerotolerantes.



Tabla 3-13 Comportamiento Oxígeno disuelto

SISTEMA ALACLORO SISTEMA METOLACLORO SISTEMA PROCLORAZ

px px mx mx px px mx mx px px mx mx

Tiempo (dias)

OD Superficie

OD Medio

OD Superficie

OD Medio

OD Superficie

OD Medio

OD Superficie

OD Medio

OD Superficie

OD Medio

OD Superficie

OD Medio

1 8.2 7.6 8.2 8.2 8.2 8.2 8.2 8.2 8.2 8.2 8.2 8.2

2 5.2 4 5.2 5.2 5.2 5.2 5.2 5.2 5.2 5.2 5.2 5.2

3 4 3.4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4

4 4.1 3.2 4.1 4.1 4.1 4.1 4.1 4.1 4.1 4.1 4.1 4.1

5 4.3 3.2 3.6 3.6 3.6 3.6 3.6 3.6 3.6 3.6 3.6 3.6

6 4.3 3.1 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2

7 4.3 3.1 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2

8 4.3 3.1 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2

9 4.3 3.1 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2

10 4.3 3.1 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2

11 4.3 3.1 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2

12 4.3 3 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2

13 4.3 2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2

14 4.3 2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2

15 4.1 2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2

16 4.1 2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2

17 4.1 2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2

18 4.1 2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2

19 4.1 2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2

20 4.1 2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2 3.2


3.3.6 Comportamiento del Fósforo Total y Reactivo (PO4-P y PO4)

Los significativos de interés químico ambiental se centran sobre la forma significativa de

fósforo inorgánico como ortofosfato (PO4-3). Ya que la mayoría de las aguas lénticas

poseen proporciones elevadas del fósforo en lagos está unida a materia orgánica formando

fosfatos orgánicos y constituyentes celulares en la fase acuosa. Las mediciones median la

reactividad del fósforo en el molibdato y los cambios en reactividad de las formas complejas

de fósforo, durante hidrólisis enzimática y acídica, según éstas son convertidas a

ortofosfato propias del experimento.

Se encontró que en la matriz con alacloro y metolacloro (figuras 3-33 y 3-34), las

concentraciones de fosforo inorgánico o reactivo fueron bajas menores a 10, haciendo un

agua oligotrófica en contenido de fosforo reactivo por el bajo contenido de materia orgánica

y de otros ligandos como sulfatos, SO4

.

Figura 3-33 Comportamiento Fosforo en matriz con alacloro

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 2 4 6 8 10 12

pp

m

Tiempo (dias)

Variación Fósforo en agua con alacloro

ALACLORO MX FOSFORO TOTAL ALACLORO MX FOSFORO REACTIVO

ALACLORO PX FOSFORO TOTAL ALACLORO PX FOSFORO REACTIVO



El comportamiento del fosforo orgánico, durante el proceso degradativo del metolacloro

aumenta el potencial de toxicidad del compuesto

Figura 3-34 Comportamiento Fósforo en matriz acuosa con metolacloro

Como se obtuvieron valores de curva de oxígeno clinógrado durante los procesos

biodegradativos, esto demuestra una mayor variabilidad vertical en la distribución

de fósforo y sus formas orgánicas e inorgánicas.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

pp

m

TIEMPO

Variación Fósforo en agua con metolacloro

MX FOSFORO TOTAL MX FOSFORO REACTIVO

PX FOSFORO TOTAL PX FOSFORO REACTIVO


3.3.7 Comportamiento del Nitrógeno Total

Como elemento biogénico incorporado en moléculas orgánicas que desempeñan

funciones vitales para toda célula bacteriana, se observa en los resultados experimentales

de Nitrógeno Total un incremento después de los 10 dias , los cuales son consecuentes

con las actividades de mantenimiento celular del proceso biorremediativo del alacloro y las

fases de lisis bacteriana (Ver figura 3-35)

Figura 3-35 Comportamiento del Nitrógeno total en Matriz Alacloro

Igual comportamiento se observa en la cloroacetanilida (metolacloro), inicia el incremento

sobre los 10 dias (Ver figura 3-36), pasando de una concentracion de 30 a 70 ppm.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 5 10 15 20 25

pp

m C

OM

PU

ESTO

S N

ITR

OG

ENA

DO

S

Tiempo (dias)

METABOLISMO DEL NITROGENO Alacloro

MX PX



Figura 3-36 Comportamiento del Nitrógeno total en Matriz Metolacloro

El comportamiento del nitrógeno en el procloraz se detalla en la figura 3-37 mostrando una

tendencia constante de incremento gradual desde los 2 a los 10 dias, pasando de los 30

a 100 ppm, acá cabe aclarar que el procloraz contiene más excipientes, que pudieron

generar ruido a la hora de medir el nitrógeno.

Figura 3-37 Comportamiento del Nitrógeno total en Matriz Procloraz

0

10

20

30

40

50

60

70

0 5 10 15 20 25

pp

m C

OM

PU

ESTO

S N

ITR

OG

ENA

DO

S

Tiempo (dias)

METABOLISMO NITROGENO Metolacloro

MX PX

0

20

40

60

80

100

120

0 2 4 6 8 10 12

pp

m C

OM

PU

ESTO

S N

ITR

OG

ENA

DO

S

Tiempo (dias)

COMPORTAMIENTO DEL NITROGENO Procloraz

MX PX


3.3.8 Comportamiento de CO2

El dióxido de carbono como participante de los procesos aeróbicos y biológicos de

respiración, medidos a través del CO2 producido y de la biosíntesis del proceso

remediativo, interactúa con los equilibrios heterogéneos de los iones presentes durante la

degradación, formando compuestos y precipitados de CaCO3, que a su vez interrelaciona

el sistema tampón de los diferentes equilibrios ácido-base presentes en el experimento al

referirse y medido como alcalinidad.

Se observa que en la matriz de alacloro el proceso productivo de CO2 es constante propio

del crecimiento aeróbico de biodegradación desarrollado. En las gráficas 3-38 a 3-40 se

observan rangos de producción entre 0.1 a 0.9 nCO2 (mol), normales de un proceso

respiratorio. Con estos datos a pesar de tener condiciones clinógradas en Oxigeno aun así

se garantizaban procesos aeróbicos dentro del sistema.

Figura 3-38 Comportamiento del CO2 total en Matriz Alacloro

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

0 5 10 15 20 25

nC

O2

(mo

l)

Tiempo (dias)

COMPORTAMIENTO DIOXIDO DE CARBONOAlacloro

MX PX



Figura 3-39 Comportamiento del CO2 total en Matriz Metolacloro

Figura 3-40 Comportamiento del CO2 total en Matriz Procloraz

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

0 5 10 15 20 25

nC

O2

(m

ol)

Tiempo (dias)

COMPORTAMIENTO DIOXIDO DE CARBONO

Metolacloro

MX PX

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0 2 4 6 8 10 12

N c

o2

(M

OLE

S)

Tiempo (dias)

COMPORTAMIENTO DIOXIDO DE CARBONO Procloraz

MX PX


3.3.9 Resultados de seguimiento e identificación de compuestos degradados via GC-MS

3.3.9.1 GC-MS Alacloro

Los resultados de cualificación de compuestos que surgen dentro del proceso

biodegradativo, inicia con la corroboración de la señal del compuesto del alacloro,

el cual arrroja una señal sobre los 122.8 segundos, y al analizar las respectivas

masas del compuesto con la base NIST, nos arroja una probabilidad superior al

800%. (Ver Figura 3-41 a 3-43).

Figura 3-41 Cromatograma de gases y espectro de masas de alacloro

Ilustración 3-2

Cromatograma en la parte superior, corrida completa de la muestra en tan solo 180 s., encontrándose la señal del alacloro a un tiempo de retención de 122.8 segundos en la parte inferior el espectro de masas de acuerdo a la posición del curso sobre el cromatograma



Figura 3-42 Espectro de masas obtenido de alacloro

Figura 3-43 Búsqueda de compuesto por medio del espectro de masas, comparando con la base de datos NIST 2014, de 273,000 componentes

Corroboración del componente de acuerdo a la formula química, y datos como peso molecular, Numero NIST,

CAS, Espectro de Masas.

(mainlib) Alachlor

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 2800

50

100

15

29

31 36

39

45

51

5559 65

77

79

8189

91

93 97

105

117 132

146

148

160

174

188

190

194

202208 220

224

234

237269

N O

O

Cl


Figura 3-44 Probabilidad de la identificación del componente alacloro > 800.

Se corrobora (figura 3-44) que iniciamos el proceso degradativo con la cloroacetanilida

alacloro, sin presencia de otro tipo de contaminantes o ruido, para evaluar posibles

molecular que se generan en la degradación del mismo.



3.3.9.2 Compuestos Intermediarios encontrados en la degradación alacloro

Dentro de los compuestos intermediarios obtenidos a los 10 y 20 dias está el

ácido benzoico y el triclorofenilester.

Figura 3-45 GC-MS de la biodegradación del alacloro a los 10 dias

Figura 3-46 Espectro de masas del Ac. Benzoico, intermediario alacloro 10 dias

(mainlib) Benzoic acid

20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 115 120 125 1300

50

100

27 29

39

4045

47 49

50

51

52

53 55 61 63 65 73

7476

77

78

7994

104

105

106

107 121

122

123

124

HO O


Figura 3-47 Espectro de masas de subproductos biodegradación alacloro 10 dias

Igualmente encontramos otras moléculas en menor proporción como el dodecanal

Figura 3-48 Cromatograma y Espectro de masas del Dodecanal

(mainlib) Quinoline, 8-ethyl-

60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 115 120 125 130 135 140 145 150 155 160 165 1700

50

100

62

63

6475

77

78 87 89 101

102115

117127

128

129

130

141

142

154

155

156

157

158

N



Figura 3-49 Cromatograma completo perfil de biodegradación de alacloro a los 10 dias

Entre los 10 y los 12 dias encontramos moléculas probables tales como Diclorometildimetilxiloxibenceno,

1-Octadecanamina, codecanal,


3.3.9.3 Producto Final alacloro

Sobre los 15 dias de haberse adelantado el proceso biodegradativo

encontramos trazas de muchos compuestos, entre los que hayamos está

el ácido propiónico como producto final de la degradación.

Figura 3-50 Producto Final degradación Alacloro, cromatograma de gases

Figura 3-51 Espectro de masas subproducto final del alacloro (ácido propiónico)

Estos resultados de las figuras 3-50, 3-51 concuerdan con los reportados David M

et al 1998 y Dick B. Janssen 2010, Muñoz Ana, 2011 que informan algunos

productos intermediarios y como productos finales ácidos carboxílicos de cadena

corta.

(mainlib) Propanoic acid

10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 900

50

100

13 14 15 16 17 18 19 2425

26

27

28

29

30

31

36 37 38 39 40 41

4243 44

45

4647

5253

54

55

56

57

58 59 72

73

74

7576

OH

O



3.3.9.4 GC-MS Metolacloro

En la figura 3-52 y 3-53 se muestra los espectros de masas de la molécula del

metolacloro

Figura 3-52 GC-Ms Metolacloro

Figura 3-53 Espectro de Masas del Metolacloro inicial

(mainlib) Metolachlor

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 2900

50

100

15

17

29

31 3539

41

43

45

4953 57

6573

77

7989

91

93103

117131

146

162

168 174 182 188 194 202

211

234

238

252 283

NO

OCl


Como molécula intermediarias del proceso de degradación tenemos el ácido

benzoico, el ácido benzodioico (Ver figura 3-54 a 3-55).

Figura 3-54 Cromatograma de gases biodegradación metolacloro (15 dias)

Figura 3-55 Espectro de masas subproductos intermediarios (Ác. Benzoico) a 15 dias

Figura 3-56 Espectro de masas subproducto intermediario (Ácido Benzodioico) a 15 dias

Como producto final de degradación igualmente encontramos ácidos carboxílicos

de cadena corta (Figura 3-56).

(mainlib) Benzoic acid

20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 115 120 125 1300

50

100

26 2939 45 47 49

50

51

5255 61 63 65

74 76

77

78 94 104

105

106121

122

123

HO O

(mainlib) 1,2-Benzenedicarboxylic acid

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 1800

50

100

14 16

17

18

25 27 29 31

38

39 43 4549

50

5261 63 66 73

74

76

77

104

148

163 166

OH

O

O

OH



Figura 3-57 Cromatograma de gases biodegradaciión metolacloro a 15 dias

3.3.9.5 GC-MS Procloraz

La carboxiamida clorada (procloraz), tiene como intermediarios en su ruta

metabólica de degradación ácido pentanedioico, fenoles, ácido propiónico (Figura

3-57).

Figura 3-58 Espectro de masas Procloraz estado inicial

(mainlib) Acetic acid

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 50 52 54 56 58 60 62 64 66 68 700

50

100

2 12 13 14

15

16 17 18 24 25 26 27 2829

30 31 32 40 41

42

43

44

45

46 47 55 57

60

61 62

O

OH

(mainlib) Prochloraz

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 370 3800

50

100

15

27

41

43

4854

56

62

68

70

77

81 95

109125 132

138

143 150167

180

188

196

207 216

223

238 244 252

266

280

308

321

Cl

Cl

Cl

O

N

O

N

N


Figura 3-59 Cromatograma del proceso biodegradativo del procloraz a los 10 dias

Figura 3-60 Espectro de masas de subproductos a los 10 dias en procloraz (Ácido Pentanedioico)

Figura 3-61 Espectro de masas de subproductos a los 10 dias en procloraz (Ácido Propanoico)

(mainlib) Pentanedioic acid

10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 90 95 100 105 110 115 120 125 130 135 1400

50

100

14 16 26

27

2931

34 38

39

40

41

42

43

44

45

46 49 51 53

55

57

58

59

60

61 63 65 68 70 72

73

74 76 79 82 85

86

87

89 91 94 96 109 112

114

115

OH

O

OH

O

(mainlib) Propanoic acid

10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 70 75 80 85 900

50

100

13 14 15 16 17 18 19 24 25

26

27

2829

3031

36 37 38 39 40 4142

43 44

45

46 47 52 53 54

5556

57

58 59 72

73

74

75 76

OH

O



3.3.10 Caracterización fisico-quimica agua final

En la tabla 3-14 al 3-16 se muestran los resultados del producto de biodegradación

sobre la matriz alacloro, metolacloro y procloraz , encontrándose como

características importantes la acidificación del pH, la reducción considerable de los

niveles de Oxígeno disuelto, y los valores de DQO bajos que la catalogan como

agua sin contaminantes.

Tabla 3-14 Caracterización Fisicoquímica Agua biodegradada Alacloro px

ALACLORO (<1 ppm)

2-cloro-2',6'-dietil-N-metoximetilacetanilida

No. Lote SZBD163XV


pH [H+] 6.82


Cloruros mg/L 16




Conductividad µS 45


Nitrógeno total mg/L 40


Sólidos Totales mg/L 55.9

Sólidos suspendidos volátiles mg/L


Temperatura °C 23


Tabla 3-15 Caracterización Fisicoquímica Agua biodegradada Metolacloro px

METOLACLORO( <1 ppm)

2-cloro-2’,6’-dietil-N-metoximetilacetanilida

No. Lote SZBD163XV SZBE044XV


pH [H+] 6.5


Cloruros mg/L 8








Sólidos Totales mg/L 55.8



Temperatura °C 23



Tabla 3-16 Caracterización Fisicoquímica Agua biodegradada procloraz con el consorcio px

PROCLORAZ(<1 ppm)

N-propil-N(2-(2-4,6-triclorofenoxi)etil imidazol-1 Carboxiamida 300 ppm

No. Lote 02991410


pH [H+] 6.8


Cloruros mg/L 18








Solidos Totales mg/L 12.4



3.3.11 Resultados de Biodegradación –DQO

Figura 3-62 Comportamiento de la DQO en biodegradación desarrollada por Mx

Figura 3-63 Comportamiento de la DQO en biodegradación desarrollada por Px

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

0 5 10 15 20 25

DQ

O

Tiempo (idas)

COMPORTAMIENTO BIODEGRADATIVO CONSORCIO Mx

ALACLORO METOLACLORO PROCLORAZ

0

200

400

600

800

1000

0 5 10 15 20 25

DQ

O

Tiempo (dias)

COMPORTAMIENTO BIODEGRADATIVO CONSORCIO Px




3.3.12 Resultados de Biodegradación – Mineralización COT

Figura 3-64 Comportamiento del COT en biodegradación desarrollada por Px

Figura 3-65 Comportamiento del COT en biodegradación desarrollada por Mx

0

100

200

300

400

500

600

0 5 10 15 20 25

pp

m

Tiempo (dias)

COT-Px


20, 220, 1.90

100

200

300

400

500

600

0 5 10 15 20 25

PP

M

TIEMPO (DIAS)

COT -MX



3.3.13 Resultados de Biodegradación – Mineralización CI

Figura 3-66 Comportamiento del CI en biodegradación desarrollada por Px

Figura 3-67 Comportamiento del CI en biodegradación desarrollada por Mx

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

pp

m

Tiempo (dias)

Carbono Inorgánico Px


0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

1.8

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

pp

m

Tiempo (dias)

Carbono Inorgánico Mx




3.3.14 Resultados de Biodegradación – Mineralización CT

Figura 3-68 Comportamiento CT Mineralización Consorcio Px

Figura 3-69 Comportamiento CT Mineralización Consorcio Mx

0

100

200

300

400

500

600

0 5 10 15 20 25

pp

m

Tíiempo (dias)

Carbono Total por Consorcio Px


0

100

200

300

400

500

600

0 5 10 15 20 25

pp

m

Tíiempo (dias)

Carbono Total por Consorcio Mx



3.3.15 Resultados de Remoción Alacloro

Figura 3-70 Cinética de remoción de Alacloro (comparación entre consorcios)

Figura 3-71 Cinética de remoción de metolacloro (comparación entre consorcios)

0

50

100

150

200

250

300

350

0 2 4 6 8 10 12 14

pp

m

Tiempo (dias)

Remoción Alacloro

Mx Px

0

50

100

150

200

250

300

350

0 2 4 6 8 10 12 14

pp

m X

eno

bió

tico

Tiempo (dias)

Remoción Metolacloro

Mx Px



Figura 3-72 Cinética de remoción de procloraz (comparación entre consorcios)

0

50

100

150

200

250

300

350

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2 1 3

PP

M X

ENO

BIO

TIC

O

TIEMPO (DIAS)

REMOCIÓN DEL PROCLORAZ

Mx Px


3.4 Resultados Experimentales Etapa IV

3.4.1 Resultados Experimentales Vibrio Fischeri

El ensayo desarrollado es una versión ampliada y modificada por el Instituto Mexicano de

Tecnología del Agua, basada en MICROBICS (1992) y en la Norma Mexicana NMX-A-

112-1995-SCFI (SECOFI, 1995).

Los resultados experimentales se desarrolló sin ajuste osmótico, usando como control

positivo a una prueba efectuada con una solución de fenol, que es el compuesto tóxico de

referencia para la prueba con V. fischeri. A través de él es posible verificar la adecuada

sensibilidad y el estado fisiológico de los microorganismos liofilizados antes de iniciar el

análisis de muestras problema. El control negativo se prepara con una solución de agua

deionizada libre de compuesto tóxicos, adicionada con solución diluente al 2%. Los valores

de luminosidad en la celda del control negativo deben ser siempre superiores al valor de

90.

Se observa en la tabla 3-17 la evolución de la toxicidad mediante este análisis. Como se

puede ver, la toxicidad de cada uno de los organoclorados tanto de las muestras iniciales

sin proceso biodegradativo como de las biodegradadas, al igual la toxicidad aportada por

los medios de activación y de enriquecimiento empleadas. Para el caso de las muestras

con organoclorados sin ningún tipo de tratamiento se muestran valores de inhibición de

bioluminiscencia altos. Estos resultados muestran que el ensayo es mucho más sensible

que los aportados por DQO y COT, por que sirve como referente de la total detoxificación

del efluente tratado.

Tabla 3-17 Tiempos experimentales obtenidos en prueba Vibrio fisherii

ITEM COMPUESTO ANALIZADO 5´ 15´ 30

1 Alacloro 8 5 4

2 Metolacloro 5 3 1

3 Procloraz 11 7 3

4 Alacloro 20 dias biodegradación 108 96 86

5 Metolacloro 20 dias biodegradación 104 92 84

6 Procloraz 20 dias biodegradación 115 107 94

7 Medio activacion básico 120 113 108

8 Medio enriquecimiento 116 108 88



Por otro lado como se puede observar en las tablas 3-18 la evolución de la toxicidad de

cada muestra organoclorada disminuye considerablemente al ser sometidas al proceso

biodegradativo, se aprecia una mayor toxicidad en el metolacloro y procloraz, y estos

disminuyen paulativamente a medida que transcurre el tratamiento biodegradativo. La

eliminación de los principios activos de los xenobióticos y la no formación de internedios

que muestren una cierta toxicidad hacen que los resultados finales de la prueba confirmen

la remediación del agua sintética.

Tabla 3-18 Resultados de Luminiscencia -Probit del proceso biodegradativo

CONTROL LUMINISCENCIA CONCENTRACION PROBIT

052 /2017 94 93.5 100

F1 93

CE50 55 11.37704545 41.17647059

17.430 mg/L 42 22.75409091 55.0802139

SE ACEPTA 28 45.50818182 70.05347594

100.118 19 91.01636364 79.67914439

CONTROL LUMINISCENCIA CONCENTRACION (100%)

TIEMPOS (minutos) 5 15 30

052 /2017 95 84 78

MUESTRA 1- Alacloro

95 84 78

EFECTO 58 52 48

EC50 SE LLEVARA A CABO AL 100 %




052 /2017 95 84 78

MUESTRA 2 -Metolacloro

95 84 78

EFECTO 5 3 1




052 /2017 95 84 78

MUESTRA 3- Procloraz

95 84 78

EFECTO 11 7 3




052 /2017 95 84 78

MUESTRA 4 (Biodegradado

Alacloro)

95 84 78

EFECTO 108 96 86

EC50 TOXICIDAD NO DETECTADA





052 /2017 95 84 78

MUESTRA 5 (Biodegradado Metolacloro)

95 84 78

EFECTO 104 92 84




052 /2017 95 84 78

MUESTRA 6 (Biodegradado

Procloraz)

95 84 78

EFECTO 115 107 94




052 /2017 95 84 78

MUESTRA 8 (Medio enriquecimiento)

95 84 78

EFECTO 116 108 88




052 /2017 95 84 78

MUESTRA 7 (medio mineral activación)

95 84 78

EFECTO 120 113 108



CALCULO DE LAS CE50


052 /2017 94 94 100

MUESTRA 1 (Alacloro) 94

76

CE50 73 11.3625 22.34042553

97.753 69 22.725 26.59574468

UT 61 45.45 35.10638298

1.022986507 45 90.9 52.12765957


052 /2017 95 94.5 100

MUESTRA 2 (metolacloro)

94

74 0.625 21.693122

CE50 71 1.25 24.867725

10.117 66 2.5 30.15873

UT 56 5 40.740741

9.884353069 47 10 50.26455


052 /2017 93 93 100

MUESTRA 3 (Procloraz) 93

53

CE50 37 2.5 60.21505376

1.58 25 5 73.11827957

UT 14 10 84.94623656

63.251 12 20 87.09677419


052 /2017 93 93 100

2D 93

81 0.625 12.903226

CE50 74 1.25 20.430108

71 2.5 23.655914

UT 61 5 34.408602

49 10 47.311828




052 /2017 93 93 100

3 93

76 0.078125 18.27956989

72 0.15625 22.58064516

69 0.3125 25.80645161

63 0.625 32.25806452

CE50 53 1.25 43.01075269

40 2.5 56.98924731

UT 21 5 77.41935484 17 10 81.72043011

Figura 3-73 Reporte de Resultados 052 IMTA frente al proceso biorremediativo


3.5 Cinética de biodegradación

En una reacción biológica son varios los sustratos que participan en ella, las bacterias

crecen y utilizan muchísimas enzimas para llevar a cabo la reacción biológica deseada. Si

se quisiera describir detalladamente las reacción deberíamos usar un modelo segregado

y estructurado, lo cual es muy complejo y escapa a este trabajo de investigación.

El modelo utilizado para el crecimiento celular, es la ecuación de Monod Se asume que

el crecimiento bacteriano sigue el modelo cinético de Monod (1942, 1949)

𝑟𝐵 =𝜇𝑚𝑎𝑥𝐶𝑆𝐶𝐵

𝐾𝑚+𝐶𝑆

Donde μmax es su máxima velocidad y Km la velocidad media y CS y CB las concentraciones

de sustrato y bacteria respectivamente

El balance de masa para un reactor por cargas o lotes en fase líquida perfectamente

mezclado

𝑑𝐶𝐵

𝑑𝑡= 𝑟𝐵

Donde la velocidad de reacción por unidad de volumen se expresa como:

𝑟𝐵 =𝜇𝑚𝑎𝑥𝐶𝑆𝐶𝐵

𝐾𝑀 + 𝐶𝑆− 𝑚𝐶𝐵

Al sustituir y desarrollar de forma análoga para el sustrato y producto:

𝑑𝐶𝐵

𝑑𝑡=

𝜇𝑚𝑎𝑥𝐶𝑆𝐶𝐵

𝐾𝑀 + 𝐶𝑆− 𝑚𝐶𝐵

𝑑𝐶𝑆

𝑑𝑡= −


𝐾𝑀 + 𝐶𝑆

𝑑𝐶𝑃

𝑑𝑡=


𝐾𝑀 + 𝐶𝑆

Se define la conversión en función del sustrato como:

𝑥 =𝐶𝑆0 − 𝐶𝑆

𝐶𝑆0

De donde por balance de masa por componente

𝐶𝑆 = 𝐶𝑆0(1 − 𝑥)

𝐶𝐵 = 𝐶𝐵0 + 𝐶𝑆0𝑥



En la fase de crecimiento se considera que el termino por muerte de bacterias en

despreciable

𝑑𝐶𝐵

𝑑𝑡=


𝐾𝑀 + 𝐶𝑆

1

𝐶𝐵

𝑑𝐶𝐵

𝑑𝑡=

𝑑𝐿𝑛𝐶𝐵

𝑑𝑡=

𝜇𝑚𝑎𝑥𝐶𝑆

𝐾𝑀 + 𝐶𝑆

(𝑑𝐿𝑛𝐶𝐵

𝑑𝑡)

−1

=𝐾𝑀

𝜇𝑚𝑎𝑥

1

𝐶𝑆+

1

𝜇𝑚𝑎𝑥

De igual manera para la etapa de estado estacionario se puede decir:

0 =𝜇𝑚𝑎𝑥𝐶𝑆𝐸𝐶𝐵𝐸

𝐾𝑀 − 𝐶𝑆𝐸− 𝑚𝐶𝐵𝐸

⇒ 𝑚 =𝜇𝑚𝑎𝑥𝐶𝑆𝐸

𝐾𝑀 − 𝐶𝑆𝐸

y = 203.35x - 203.16R² = 0.9999

3.5

3.55

3.6

3.65

3.7

3.75

3.8

3.85

3.9

3.95

4

1 1.002 1.004 1.006 1.008 1.01 1.012 1.014 1.016 1.018

(dLn

Cb

/dt)

^-1

1/(1-x)

Alacloro


Los resultados de los ajustes de parámetros, para el modelo cinético de este experimento

, se pueden resumir en la Tabla 3-19

y = 774.191575x - 776.969130R² = 0.989983

0.0423

0.0424

0.0425

0.0426

0.0427

0.0428

0.0429

0.043

0.0431

23.2 23.25 23.3 23.35 23.4 23.45 23.5 23.55 23.6 23.65

(dLn

Cb

/dt)

^-1

1/(1-x)

Metolacloro

y = -91.244281x + 101.404608R² = 0.998093

9.75

9.8

9.85

9.9

9.95

10

10.05

10.1

10.15

10.2

0.9995 1 1.0005 1.001 1.0015 1.002 1.0025 1.003 1.0035 1.004 1.0045

(dLn

Cb

/dt)

^-1

Procloraz



Tabla 3-19 Parámetros cinéticos degradación cloroacetanilidas

Sustrato R2 KM µmax m

Alacloro 0.9999 1.000 0.004922 0.00242586

Metacloro 0.9899 1.004 0.001292 0.00053981

Procloraz 0.9981 0.89980 0.009861 0.000244084

rg=velocidad de crecimiento de la célula, mg/L día;

CC=concentración de células, mg/L

µ=velocidad de crecimiento específico, dia-1

La velocidad de crecimiento específico de la célula se puede expresar como:

3.6 Estequiometria

El proceso de crecimiento bacteriano implica que se lleven a cabo reacciones de

generación de energía y de biosíntesis.

Tomando como referencia lo expresado en la sección 7.4 de Mecanismos de reactores,

rutas y biorreacciones de Fogler (2008), la estequiometria del crecimiento celular es muy

compleja y varía con el sistema de microorganismos, los nutrimentos y las condiciones

ambientales, como pH, temperatura y potencial redox. Tal complejidad es particularmente

cierta cuando más de un nutrimento contribuye al crecimiento de células, como en este

caso:

Células + sustrato más células + producto

Con el propósito de relacionar el sustrato consumido, las nuevas células formadas y el

producto generado, se definen los coeficientes de rendimiento. El coeficiente de

rendimiento para células y sustrato es:

YCS⁄

=masa de nuevas células formadas

masa de sustrato consumido= −

∆Cc

∆Cs Ecuación 7.1

Con

YCS⁄

=1

YCS⁄

Ecuación 7.2


La formación de producto puede tener lugar durante diversas fases del ciclo del crecimiento

de la célula. Cuando la formación de producto sólo ocurre durante la fase de crecimiento

exponencial, la velocidad de formación de producto es:

rp = Yp c⁄ rg = Yp c⁄ μCc = Yp c⁄μmáxCcCs

Ks+Cs Ecuación 7.3

Donde

Ypc⁄ =

masa de producto formado

masa de nuevas células formadas=

∆Cp

∆Cc Ecuación 7.4

El producto de Ypc⁄ a menudo se llama tasa específica de formación del producto. Cuando

los productos degradados de los xenobióticos (alacloro, metolacloro, procloraz) se forman

durante la fase estacionaria, en la cual no hay crecimiento celular, es posible relacionar la

tasa de formación del producto con el consumo por sustrato. A su vez la reacción se

completa cuando todo el xenobiótico ha sido convertido a productos de oxidación

(respiración) o de biosíntesis.

Cada una de las reacciones del metabolismo, energía y síntesis, son el resultado de los

procesos de óxido-reducción (semi-reacciones redox).

El sustrato de la investigación es de tipo orgánico, por lo que utiliza como fuente de energía

el carbono. El número de eq-e que puede liberar el sustrato orgánico se determina como

si éste fuera enteramente oxidado a CO2 (mineralización). Parte de los eq-e pasarán a

aceptores finales para continuar con la generación de energía libre, y lo restante será

transferida como biomasa sintetizada.

El coeficiente de rendimiento estequiométricos que relaciona la cantidad de producto

formado por masa de sustrato consumido es:

Yps⁄ =

masa de producto formado

masa de sustrato consumido= −

∆Cp

∆Cs Ecuación 7.5

Además del consumo de sustrato para producir nuevas células, parte del sustrato se

emplea simplemente para mantener las actividades cotidianas de las células. El término

correspondiente de utilización para mantenimiento es:

m =masa de sustrato consumida para mantenimiento

masa de celulas×tiempo Ecuación 7.6

La ecuación para relacionar la tasa de consumo de cloroacetanilidas, -rs, con las

velocidades de crecimiento celular, generación de producto y mantenimiento celular es:



3.1 Balance del sustrato

[Tasa neta de

consumode sustrato

] = [

Velocidada la que esconsumido

por las células

] + [

Velocidad a la que es

consumido paraformar producto

] + [

Velocidad a la que es

consumido paramantenimiento

] Ecuación 7.7

−rs = (Ys c⁄ ) (rg) + (Y´s p⁄ ) (r𝑝) + mCc Ecuación

7.8

Como el producto se sintetiza durante la fase de crecimiento, no es posible separar la

cantidad de sustrato consumido para crecimiento celular de la que se consume para

sintetizar producto (ya que el producto sintetizado es utilizado para el desarrollo celular),

todo el sustrato consumido se agrupa en el coeficiente estequiométrico YS/C.

3.2 Balance de masa

Hay dos formas en las que es posible explicar el crecimiento de los microorganismos. Una

es tomar en cuenta el número de células vivas y la otra la masa de las células vivas. Para

este caso se usara la segunda. Un balance de masa para el microorganismo en reactor

continuo de mezcla perfecta de volumen contante es (Fogler, 2008):

[

Velocidad deacumulación

de células,g/s

] = [

Velocidad deentrada

de células, g/s

] − [

Velocidad desalida

de células,g/s

] + [

Velocidad degeneración

de células vivas,g/s

] Ecuación 7.9

VdCc

dt = υ0Cc0 − υCc + (rg − rd)V Ecuación 7.10

El balance de sustrato correspondiente es:

[

Velocidad deacumulaciónde sustrato,

g/s

] = [

Velocidad deentrada

de sustrato, g/s

] − [

Velocidad desalida

de sustrato,g/s

] + [

Velocidad degeneraciónde sustrato,

g/s

] Ecuación 7.11

VdCs

dt = υ0Cs0 − υCs + rsV Ecuación 7.12

Para este caso experimental , la concentración de entrada del microorganismo Cc0 no es

cero.


3.2.1 Cálculo de peso seco, masa de CO2 y de sustrato

La ecuación que relaciona el número de células microbianas con la masa de peso seco

es (Sánchez Gonzales, 2012):

𝑊𝑠𝑒𝑐𝑜 = 7.0 × 10−6𝑈𝐹𝐶 + 3382.6 Ecuación 7.13

Donde

Wseco[=] mg/L

UFC[=] número de unidades formadoras de colonia

Para encontrar los parámetros de la ley de velocidad µmáx y Ks se efectúa una regresión

de los datos con la forma de Hanes-Woolf de la ecuación de Monod:

Cc

rg=

Ks

μmáx(

1

Cs) +

1

μmáx Ecuación 7.14

Conclusiones y recomendaciones

Conclusiones

• ETAPA 1

• Se seleccionaron de los 70 agregados bacterianos 2 consorcios (Mx y Px) para el

desarrollo degradativo de las cloroacetanilidas y carboxiamidas cloradas

• Se identificaron las especies bacterianas que constituyen el consorcio Mx y Px

mediante pruebas PCR16s , Bioquímicas y de Proteómica (Proceso de registro de

patente)

• Se conoce las características fisicoquímicas del agua para la aplicación de los

protocolos de biodegradación.

ETAPA 2

• Se logró la remoción > 98% del Procloraz, 99% del Metacloro y 99% del Alacloro

• El análisis comparativo demostró que a los 20 dias el consorcio Mx mostró mayor

porcentaje de remoción de cloroacetanilidas

• Se logró estudiar el comportamiento y la influencia de variables físico-químicas y

biológicas que intervienen el proceso de descontaminación y adaptación del

consorcio

• ETAPA 3.

• Se determinó la concentración de Alacloro, metolacloro, procloraz y metabolitos,

concentración de biomasa, a lo largo del proceso de biodegradación.

• Se encontraron posibles mecanismos de acción de los consorcios bacterianos y

las posibles enzimas que participaron en el proceso degradativo a través de los

intermediarios

• ETAPA 4

• Se Aplicaron pruebas de toxicidad como mecanismo de evaluación del proceso de

biorremediación y se encontró que para los 3 sistemas tratados, la biorremediación

se desarrolla satisfactoriamente.

206 ANEXOS

Aportaciones de la tesis

Los resultados obtenidos durante el desarrollo de este trabajo han sido gracias al

apoyo del INSITITUTO POLITÉCNICO NACIONAL, y el CONSEJO NACIONAL DE

CIENCIA Y TECNOLOGIA-CONACYT, para el desarrollo de proyectos de

investigación. Estos resultados han sido presentados en distintos congresos

nacionales e internacionales.

PARTICIPACION EN CONGRESOS NACIONALES E INTERNACIONALES

Autores: Guzman-Martinez, Boris, CastroArellando, JJ.

Título: Biodegradación de las cloroacetanilidas en aguas lénticas oligotróficas

empleando consorcios bacterianos mesofílicos

Tipo de Participación: Poster-Ponencia

XVI World Water Congress

IWRA 2017 (Mayo 29 al 03 de Junio de 2017)

Lugar de Celebración: Cancún

Autores: Guzman-Martinez, Boris, CastroArellando, JJ. Rico-Arzate Enrique

Título: Biodegradation of Oligotrophic Waters Contaminated with Chloroacetanilides

Using Bacterial Mesophylic Consortiums

Tipo de Participación: Poster

2017 AIChE Annual Meeting ID# 500923:

Environmental Division

Wednesday, November 1, 2017: 3:15 PM - 4:45 PM, MCC, Exhibit Hall B

Lugar de Celebración: Minneapolis Convention Center, MN

Anexos de Trabajo de Tesis 207

Glosario

Agua deionizada: es el agua a la que se le han removido los iones en solución,

pasándola a través de columnas de resina o de un sistema de ósmosis inversa.

Análisis replicado: es la prueba realizada a una muestra en dos o más ocasiones

durante la misma sesión de trabajo.

Bioluminiscencia: fenómeno en donde los organismos vivos emiten luz como

resultado de procesos enzimáticos ligados a la respiración.

Blanco: es usado indistintamente con la palabra control.

Blanco de pretratamiento: deberá entenderse como blanco de pretratamiento aquel

que se prepara de la misma forma que las muestras, pero sin contener a la muestra.

Se realiza cuando las muestras son tratadas previamente al análisis de toxicidad y

se elabora para evaluar en qué medida el pretratamiento contribuye a la toxicidad

de la muestra.

Compuesto tóxico de referencia: sustancia pura utilizada en ensayos de toxicidad

para determinar la sensibilidad de los organismos de prueba y validar las

mediciones de toxicidad.

Concentración efectiva media (CE50): es la concentración estimada de material

que causa un efecto no letal detectado por la reducción del 50% de la intensidad

luminosa generada por una población de 106 bacterias.

Control: lote o tratamiento dentro de un diseño experimental que replica todos los

factores que puedan afectar el resultado, excepto la condición que está siendo

investigada (sinónimo de control negativo).

Cultivo: conjunto de plantas o animales que se mantienen bajo condiciones

definidas y controladas, para producir organismos saludables.

Efecto tóxico agudo: es aquel que es inducido y observado en un período corto,

que puede ser de 5 a 30 minutos para el caso de V. fischeri. Este período de

respuesta óptimo está definido a partir de estudios previos basados en el

conocimiento de biología bacteriana, en conjunto con la química de los compuestos

tóxicos. Se ha observado la existencia de procesos que facilitan el paso de los

compuestos tóxicos al interior de las células bacterianas, siendo más ágiles y

rápidos los relacionados a compuestos orgánicos que los de incorporación de

elementos metálicos (Bulich, 1979; Bulich et. al., 1981; Kauser, 1984; Bulich, 1988).

208 ANEXOS

Liofilizado: congelado y deshidratado al vacío; es aplicado a la bacteria usada en

la prueba Microtox, la cual se comercializa.

Porcentaje (%): es una concentración expresada en partes por ciento. Representa

una unidad o parte del material (por ejemplo efluente o agua receptora) diluida con

agua a un total de 100 partes. Las concentraciones pueden ser preparadas en

volumen-volumen o peso-peso y son expresadas como un porcentaje de material

de prueba en la solución final.

Prueba de toxicidad: también denominada bioensayo o ensayo de toxicidad, la cual

consisten en la exposición de organismos vivos a soluciones preparadas o

muestras naturales con el fin de evaluar en ellas la presencia de algún compuesto

tóxico a través de alteraciones de la vitalidad o funcionamiento metabólico de los

organismos de prueba.

Toxicidad: es la capacidad o potencialidad inherente de un material para causar

efectos adversos en los organismos. El efecto puede ser letal o subletal.


ANEXOS

210 ANEXOS

A. Anexo: Caracterización inicial del agua sintética y procedimiento de muestreo

DATOS DE CALIBRACION DE CUVA DE DQO

Tabla A-0-1 Datos de Calibración DQO Alacloro

2-cloro-2’,6’-dietil-N-

metoximetilacetanilida

Long: 420 nm a 620 nm

Tubo Concentración DQO

0 0 0

1 5 34

2 10 56

3 20 100

4 30 125

5 45 157

6 50 200

7 75 256

8 100 390

9 200 580

10 300 840

11 500 1530

Figura A0-1 Curva de Calibración DQO Metolacloro

y = 3.025xR² = 0.9906

0

500

1000

1500

2000

0 100 200 300 400 500 600

DQ

O (

mg/

L O

2)

CONCENTRACIÓN

METOLACLORO



Tabla A-0-2 Datos de Calibración DQO Procloraz

N-propil-N(2-(2-4,6-triclorofenoxi)etil

imidazol-1 carboxiamida 250 ppm


Tubo Concentración (ppm) DQO (mg/L)

0 0 0

1 5 27

2 10 33

3 20 82

4 30 96

5 45 135

6 50 182

7 75 207

8 100 272

9 200 480

10 300 710

11 500 1321

Figura A0-2 Curva de Calibración DQO Procloraz

y = 2.5708xR² = 0.993

0

500

1000

1500

0 100 200 300 400 500 600

DQ

O (

mg/

L O

2)

Concentracion del Analito

PROCLORAZ

212 ANEXOS


Tabla A-0-3 Datos de Calibración DQO Alacloro

2-cloro-2’,6’-dietil-N-

metoximetilacetanilida


Tubo Concentración DQO

0 0 0

1 5 34

2 10 56

3 20 100

4 30 125

5 45 157

6 50 200

7 75 256

8 100 390

9 200 580

10 300 840

11 500 1530

Figura A0-3 Curva de Calibración DQO alacloro

y = 3.025xR² = 0.9906

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

0 100 200 300 400 500 600

DQ

O (

mg/

L O

2)

CONCENTRACIÓN

ALACLORO


B. Anexo: Procedimientos de Identificación Microbiológica

Protocolo para la tinción de Gram.

Materiales:

Portaobjetos.

Violeta cristal al 90% (2g de violeta cristal en 20 mL de alcohol 95º).

Solución Lugol (2g de Yoduro de potasio, 1g de yodo, 200 mL de agua destilada).

Safranina (2.5g de Safranina en 100 mL de alcohol 95º).

Decolorante (alcohol 95º).

Se prepararon los frotes bacterianos a partir de cultivos sólidos de cada cepa en portaobjetos. El protocolo se realizó de la siguiente manera:

1. Agregar cristal violeta suficiente cantidad para cubrir el frote y dejar actuar el colorante por 1 minuto.

2. Al cabo del tiempo, eliminar el exceso de colorante con agua. 3. Agregar Lugol en cantidad suficiente para cubrir el frote y dejar actuar 2 minutos. 4. Decolorar con alcohol e inmediatamente lavar con abundante agua para eliminar el

exceso del disolvente. 5. Añadir safranina en cantidad suficiente y dejar actuar 1 minuto. 6. Lavar con agua para eliminar el exceso del colorante de contraste. 7. Dejar secar la preparación a temperatura ambiente. 8. Observar al microscopio con el objetivo 100x, añadiendo previamente aceite de

inmersión.

214 ANEXOS

C. Anexo: Resultados Probit Valoración Ecotoxicológica IMTA


EPA PROBIT ANALYSIS PROGRAM

USED FOR CALCULATING LC/EC VALUES

Version 1.5 Vf05217-F1 Proportion

Observed Responding Predicted

Number Number Proportion Adjusted for Proportion

Conc. Exposed Resp. Responding Controls Responding

11.3770 100 41 0.4118 0.4118 0.4131

22.7540 100 55 0.5508 0.5508 0.5546

45.5080 100 70 0.7005 0.7005 0.6894

91.0160 100 80 0.7968 0.7968 0.8026

Chi - Square for Heterogeneity (calculated) = 0.086

Chi - Square for Heterogeneity

(tabular value at 0.05 level) = 5.991

Mu = 1.241310

Sigma = 0.843456

Parameter Estimate Std. Err. 95% Confidence Limits

---------------------------------------------------------------------

Intercept 3.528305 0.301396 ( 2.937569, 4.119041)

Slope 1.185599 0.199115 ( 0.795334, 1.575864)

Theoretical Spontaneous Response Rate = 0.0000

Estimated LC/EC Values and Confidence Limits

Exposure 95% Confidence Limits

Point Conc. Lower Upper

LC/EC 1.00 0.190 0.016 0.679

LC/EC 5.00 0.714 0.111 1.849

LC/EC 10.00 1.447 0.317 3.161

LC/EC 15.00 2.329 0.641 4.549

LC/EC 50.00 17.430 11.708 22.737 LC/EC 85.00 130.457 85.307 285.112

LC/EC 90.00 210.031 123.769 571.856

LC/EC 95.00 425.314 212.997 1617.532

LC/EC 99.00 1597.500 583.097 11498.237 PLOT OF ADJUSTED PROBITS AND PREDICTED REGRESSION LINE

Probit

10+

-

-

-

-

9+

-

-

-

-

8+

-

-

- .

-

7+ .

- ..

- ..

- ...

- ....

6+ ....

- ..o.

- o...

- ....

- .o..

5+ ...

- .o..

- ....

- ...

- ....

4+ ....

- ....

- ...

- ..

- ..

3+ .

-

-.

-

-

2+

-

-

-

-

1+

-

-

-

-

0+

-+--------------+--------+---------+---------+--------+--------------+-

EC01 EC10 EC25 EC50 EC75 EC90 EC99

216 ANEXOS



Version 1.5 Vf5217-1 Proportion




11.3620 100 22 0.2234 0.2234 0.2006

22.7250 100 27 0.2659 0.2659 0.2856

45.4500 100 35 0.3511 0.3511 0.3846

90.9000 100 52 0.5213 0.5213 0.4918




Mu = 1.981153

Sigma = 1.102844


---------------------------------------------------------------------

Intercept 3.203597 0.312193 ( 2.591699, 3.815495)

Slope 0.906746 0.198315 ( 0.518049, 1.295444)





LC/EC 1.00 0.260 0.006 1.158

LC/EC 5.00 1.469 0.132 3.942

LC/EC 10.00 3.696 0.654 7.636

LC/EC 15.00 6.889 1.906 12.041

LC/EC 50.00 95.753 63.115 229.784 LC/EC 85.00 1330.884 430.258 21297.967

LC/EC 90.00 2480.607 668.540 63027.977

LC/EC 95.00 6240.524 1281.720 315207.938


Probit

10+

-

-

-

-

9+

-

-

-

-

8+

-

-

- .

-

7+ .

- ..

- ..

- ...

- ....

6+ ....

- ....

- ...

- ....

- ....

5+ .o.

- ....

- ...o

- ..o

- .o..

4+ ....

- ....

- ...

- ..

- ..

3+ .

-

-.

-

-

2+

-

-

-

-

1+

-

-

-

-

0+

-+--------------+--------+---------+---------+--------+--------------+-









1.2500 100 25 0.2487 0.2487 0.2390

2.5000 100 30 0.3016 0.3016 0.3176

5.0000 100 41 0.4074 0.4074 0.4055

10.0000 100 50 0.5026 0.5026 0.4984




Mu = 1.005064

Sigma = 1.279763


---------------------------------------------------------------------

Intercept 4.214648 0.128767 ( 3.962265, 4.467032)

Slope 0.781395 0.194694 ( 0.399795, 1.162995)





LC/EC 1.00 0.011 0.000 0.075

LC/EC 5.00 0.079 0.002 0.291

LC/EC 10.00 0.232 0.016 0.607

LC/EC 15.00 0.477 0.063 1.003

LC/EC 50.00 10.117 6.397 29.911 LC/EC 85.00 214.491 54.774 10634.911

LC/EC 90.00 441.782 89.475 43426.797

LC/EC 95.00 1288.681 184.694 350031.375


Probit

10+

-

-

-

-

9+

-

-

-

-

8+

-

-

- .

-

7+ .

- ..

- ..

- ...

- ....

6+ ....

- ....

- ...

- ....

- ....

5+ .o.

- .o..

- ....

- o..o

- ....

4+ ....

- ....

- ...

- ..

- ..

3+ .

-

-.

-

-

2+

-

-

-

-

1+

-

-

-

-

0+

-+--------------+--------+---------+---------+--------+--------------+-


218 ANEXOS







1.2500 100 43 0.4301 0.4301 0.4533

2.5000 100 60 0.6022 0.6022 0.5908

5.0000 100 73 0.7312 0.7312 0.7178

10.0000 100 85 0.8495 0.8495 0.8220

20.0000 100 87 0.8710 0.8710 0.8979




Mu = 0.198716

Sigma = 0.868084


---------------------------------------------------------------------

Intercept 4.771087 0.111753 ( 4.552052, 4.990122)

Slope 1.151963 0.151592 ( 0.854843, 1.449082)





LC/EC 1.00 0.015 0.002 0.049

LC/EC 5.00 0.059 0.013 0.145

LC/EC 10.00 0.122 0.035 0.259

LC/EC 15.00 0.199 0.067 0.384

LC/EC 50.00 1.580 1.025 2.124 LC/EC 85.00 12.543 9.135 20.183

LC/EC 90.00 20.476 13.803 38.176

LC/EC 95.00 42.328 25.052 99.680


Probit

10+

-

-

-

-

9+

-

-

-

-

8+

-

-

- .

-

7+ .

- ..

- ..

- ...

- ...o

6+ o...

- ....

- o..

- ....

- ..o.

5+ ...

- ..o.

- ....

- ...

- ....

4+ ....

- ....

- ...

- ..

- ..

3+ .

-

-.

-

-

2+

-

-

-

-

1+

-

-

-

-

0+

-+--------------+--------+---------+---------+--------+--------------+-





Version 1.5 Vf05217-2D Proportion




1.2500 100 20 0.2043 0.2043 0.1845

2.5000 100 24 0.2366 0.2366 0.2626

5.0000 100 34 0.3441 0.3441 0.3549

10.0000 100 47 0.4731 0.4731 0.4566




Mu = 1.124629

Sigma = 1.143862


---------------------------------------------------------------------

Intercept 4.016813 0.134785 ( 3.752635, 4.280992)

Slope 0.874232 0.200536 ( 0.481181, 1.267283)





LC/EC 1.00 0.029 0.001 0.136

LC/EC 5.00 0.175 0.013 0.476

LC/EC 10.00 0.456 0.075 0.937

LC/EC 15.00 0.869 0.237 1.499

LC/EC 50.00 13.324 8.210 40.604 LC/EC 85.00 204.234 57.638 5418.473

LC/EC 90.00 389.585 90.399 17437.766

LC/EC 95.00 1014.302 175.762 98723.711


Probit

10+

-

-

-

-

9+

-

-

-

-

8+

-

-

- .

-

7+ .

- ..

- ..

- ...

- ....

6+ ....

- ....

- ...

- ....

- ....

5+ o...

- ....

- ..o.

- ...

- o...o

4+ ....

- ....

- ...

- ..

- ..

3+ .

-

-.

-

-

2+

-

-

-

-

1+

-

-

-

-

0+

-+--------------+--------+---------+---------+--------+--------------+-


220 ANEXOS







0.6250 100 32 0.3226 0.3226 0.3094

1.2500 100 43 0.4301 0.4301 0.4483

2.5000 100 57 0.5699 0.5699 0.5940

5.0000 100 77 0.7742 0.7742 0.7276

10.0000 100 82 0.8172 0.8172 0.8348




Mu = 0.203197

Sigma = 0.818498


---------------------------------------------------------------------

Intercept 4.751744 0.079110 ( 4.596689, 4.906799)

Slope 1.221750 0.144799 ( 0.937944, 1.505556)





LC/EC 1.00 0.020 0.005 0.050

LC/EC 5.00 0.072 0.024 0.142

LC/EC 10.00 0.143 0.059 0.250

LC/EC 15.00 0.226 0.108 0.366

LC/EC 50.00 1.597 1.227 1.993 LC/EC 85.00 11.259 7.856 19.342

LC/EC 90.00 17.872 11.572 34.881

LC/EC 95.00 35.444 20.399 84.141


Probit

10+

-

-

-

-

9+

-

-

-

-

8+

-

-

- .

-

7+ .

- ..

- ..

- ...

- ....

6+ .o..

- o....

- ...

- ....

- ..o.

5+ ...

- ..o.

- o...

- ...

- ....

4+ ....

- ....

- ...

- ..

- ..

3+ .

-

-.

-

-

2+

-

-

-

-

1+

-

-

-

-

0+

-+--------------+--------+---------+---------+--------+--------------+-



D. Anexo: Cálculo de Incertidumbres

ESTIMACION DE INCERTIDUMBRES HPLC

DATOS DE INTERES

Cromatógrafo Líquido de Alta Resolución (HPLC), Agilent Serie 1100, Código CC-

ECR-4. Detector DAD N º Serie FE03458414 Bomba Cuaternaria N º Serie

FEG1702123 Autosampler N º Serie DE91611592 Compartimiento Columna N º

Serie HE74614872 Desgasificador N º Serie TP72045192.

Cromatógrafo Líquido de Alta Resolución (HPLC), Hitachi Lachrom, Código CC-

ECR-3. Compuesto de los siguientes módulos: Bomba Cuaternaria Modelo: L7100

N º de Serie: 323-016 Detector Arreglo de Diodos Modelo: L7450 N º de Serie:

0203-037

Sonicador Transsonic 460/H (ELMA R)

Balanza analítica Sartorius Modelo A200S

Material volumétrico tipo A

Cálculo de incertidumbre tipo A Se desarrolla una serie de experimentos, 5 repeticiones

en cada equipo HPLC en diferentes días utilizando la misma columna cromatográfica

Select B C18, se registra la recuperación de alacloro se calcula el promedio tanto para el

equipo 1 como para el 2, se calcula el promedio final y se divide por la raíz del número de

repeticiones, así de esta manera se obtiene una aproximación al valor de incertidumbre

tipo A.

Cálculo de incertidumbre tipo B Para el cálculo de incertidumbre tipo B se establece

primero de forma independiente la contribución tanto de la pesada como del proceso de

dilución a que fue sometida la muestra de alacloro, aquí se establece por medios

documentados la calibración de la balanza, la especificación de las masas, la incertidumbre

del estándar, la incertidumbre de los matraces aforados y de la transferpipeta. Luego se

combinan estas incertidumbres y se obtiene el valor de la incertidumbre tipo B.

222 ANEXOS

Cálculo de incertidumbre combinada Luego de tener los valores tanto de la

incertidumbre tipo A como la de tipo B, se procede a calcular la incertidumbre combinada,

a través, de las regla de sumas y restas de incertidumbres parciales.

Validación alacloro. Confirmación de identidad

En la figura N°D0-1 se muestra un cromatograma representativo, obtenido a partir de una

solución estándar de referencia de alacloro

Figura D0-1 Cromatograma obtenido de la inyección de alacloro estándar RT 11.33 min. As =1.002

Aplicación de parámetros de desempeño analítico.

Selectividad.

• Comportamiento del medio de disolución: Al inyectar el medio de disolución al HPLC se

dejó eluir por 30 minutos y no se observó ninguna señal. Esto indica que no hay influencia

del medio de disolución en la determinación cromatográfica.


• Frente a componentes de la matriz: cuando se inyectó una muestra de placebo 10 veces

más concentrada que la solución de trabajo, con elución de 30 min. No apareció señal

alguna al tiempo de retención del principio activo citalopram bromhidrato. Confirmando así

la no influencia de la matriz en la determinación cromatográfica.

• Frente a potenciales productos de degradación: En la tabla N°E0-1 se muestran los

resultados obtenidos de la degradación forzada del alacloro.

Tabla E-0-1 Degradación forzada para alacloro

Tipo de Ensayo Especificación de pureza Resultado

Selectividad al medio de

disolución

Sin presencia de señale al

tiempo de retención del

alacloro

No hay señal

Selectividad a la matriz Sin presencia de señales al

tiempo de retención del

alacloro

No hay señal

Fotólisis (98-102%) 99.98% pureza

Termóliisis (98-102%) 99.98% pureza

Hidrólisis ácida (98-102%) 99.98% pureza

Hidrólisis básica (98-102%) Degradación

La degradación forzada constituye una prueba para evaluar el comportamiento de los

principios activos a estudiar en situaciones de estrés por ejemplo: alta temperatura 105°C,

acción de la luz, presencia de soluciones oxidantes y reductoras. El fin de este ensayo es

obtener los productos de degradación que potencialmente podrían aparecer en un estudio

de estabilidad y, determinar si la metodología analítica es selectiva a través de la pureza

del peak cromatográfico, el criterio de aceptación más importante de este ensayo es que

las probables señales que aparezcan no deben interferir con la señal del principio activo o

de la molécula intacta. De esta manera las señales obtenidas en ensayos futuros serán,

con una alta probabilidad, respuesta del p.a estudiado y no de mezclas del analito-

interferencias.

224 ANEXOS

Linealidad y rango.

En la tabla N°X aparecen los resultados obtenidos en la determinación de la linealidad para

alacloro.

Tabla E-0-2 Resultados obtenidos del ensayo de linealidad para alacloro

41.20 μg/mL 60.45 μg/mL 80.48 μg/mL 105.18

μg/mL

120.16 μg/mL

Área 51.5% 75.6% 100.6% 131.5% 150.7%

1 449.783 663.610 883.086 1151.300 1318.236

2 451.572 664.205 884.637 1157.670 1320.640

3 453.167 663.245 886.043 1157.815 1321.888

4 453.336 665.353 888.256 1160.380 1325.819

5 454.024 665.455 890.265 1157.431 1329.359

Área

promedio

451.4 664.0 886.5 1157.9 1323.2

DS 1.706 0.908 2.854 4.192 4.408

RSD 0.377 0.137 0.322 0.362 0.333

Figura D0-2 expresión gráfica de la recta obtenida para la determinación de la linealidad de la metodología analítica para cuantificación de alacloro


En la tabla X se muestra un resumen con las principales características de la curva de

calibración utilizada para la determinación de la linealidad.

Tabla E-0-3 : Características de la curva de calibración para alacloro

Alacloro

Coeficiente de Correlación ( r ) 0.99999

Pendiente 10.986

Intercepto 0.540

Número de repeticiones 5

Uno de los criterios elegidos en este estudio para evaluar la linealidad de las metodologías

fue el índice de correlación “r”. En la tabla X aparece el resultado obtenido para este

parámetro, el cual fue de 0.99999 para alacloro. Este resultado demuestra que se cumplió

el criterio establecido. En la práctica generalmente “r” es mayor de 0.999. Sin embargo, el

mejor indicador para evaluar el modelo lineal es un prueba estadística, el test de Student,

en el cual se calcula un valor t experimental (texp ) con n-2 grados de libertad y se compara

con un t tabla (t tabla )para el nivel de confianza requerido (generalmente 95% o p >0.05).

En la tabla E-4 se encuentra los valores de texp y ttabla para la curva obtenida. La ecuación

que da cuenta de texp es:

𝑡𝑒𝑥𝑝 = 𝑟 𝑥 √(𝑛 − 2)

√(1 − 𝑟2)

Criterio de aceptación: la recta es lineal cuando texp es mayor que ttabla

Tabla E-0-4 Cuadro resumen de criterios estadísticos (t de Student) para evaluación de la linealidad de la metodología analítica

Alacloro

texp 340.95

ttabla 2.353

texp > ttabla Si

De los resultados anteriores puede señalarse que: existe una correlación lineal en la

metodología analítica, por lo tanto es lineal dentro de las concentraciones estudiadas

226 ANEXOS

Exactitud.

En la tabla X se muestran los datos obtenidos para la determinación de la exactitud en el

producto alacloro.

En este caso se prepararon tres muestras con 70%, 100 %, 130% de la concentración

estimada del analito y se analizó cada una por duplicado.

Tabla 0-5 Resultados de ensayo de exactitud para Alacloro

%Teórico %Recuperación Promedio DE

70 99.7 101.4 102.2 101.1 1.27

100 100.0 100.6 100.6 100.4 0.35

130 99.1 101.3 100.1 100.2 1.10

Porcentaje de recuperación media 100.5

Desviación estándar 0.958

Coeficiente de Variación (RSD) 0.95%

La exactitud debe ser tan alta como sea posible para que el valor medido se aproxime al

de referencia. Lo que quiere decir que la recuperación del analito debe ser cercana al

100%.

Para evaluar si cumple con los requisitos fijados se realizó un test estadístico ó t Student,

efectuando varias determinaciones y calculando el t experimental que se compara con el t

tabla para n-1 grados de libertad en el nivel de confianza escogido (95% generalmente).

La ecuación para texp es la siguiente:

𝑡𝑒𝑥𝑝 = |100 − 𝑋|√𝑛

𝑅𝑆𝐷

Reemplazando sería,

𝑡𝑒𝑥𝑝 = |100 − 100.5|√9

0.95= 1.58


Si texp resulta menor que el ttabla, el método tiene la exactitud requerida para este nivel de

confianza. Es decir, no existe diferencia significativa con el 100% de recuperación y la

exactitud es la apropiada.

Alacloro

texp 1.58

ttabla 1.860

texp < ttabla Si

De acuerdo con los datos obtenidos, texp< ttabla, por lo tanto no existe diferencia significativa

entre la recuperación media y 100% para la metodología analítica en estudio, por lo cual

se puede señalar que es exacta.

Precisión.

En la tabla X se muestran los resultados correspondientes al ensayo de precisión por

repetibilidad para la metodología analítica del principio activo alacloro.

Tabla E-0-6 Resultados de ensayo de exactitud para Alacloro

RSD

Concentración aproximada Alacloro

50% 0.377%

75% 0.137%

100% 0.322%

125% 0.362%

150% 0.333%

Los resultados muestran valores de RSD menores al criterio establecido en este estudio

(2%) . Lo que indica que la metodología desarrollada es precisa. Es decir hay un alto grado

de concordancia en el ensayo cuando el método se aplica repetidamente a múltiples

alícuotas de una muestra homogénea

228 ANEXOS

Estabilidad de las muestras sometidas a almacenamiento.

En la tabla X se muestran los resultados de la evaluación de estabilidad para las muestras

de alacloro. El día 1 se prepararon 2 estándares con los cuales se realizó la calibración del

HPLC luego se tomaron 2 muestras que fueron analizadas, los estándares y muestras

fueron guardados durante 24 horas en distintas condiciones ambientales, una a

temperatura ambiente y la otra en refrigerador a 4º C. El día 2 se vuelve a calibrar con

estándares recién preparados y se leen las muestras guardadas.

Tabla E-0-7 Resultados de evaluación de estabilidad para alacloro valores 24 hrs T º ambiente 25ºC y 24 hrs refrigerador 4ºC.

LECTURA

DIA 2

PROMEDIO VALOR

INICIAL DIA 1

%VARIACION

ST1 25°C 0.08157 0.08135 0.08040 1.18%

ST1 25°C 0.08112

ST2 25°C 0.7937 0.07942 0.07886 0.71%

ST2 25°C 0.07946

M1 25°C 0.08242 0.08255 0.08189 0.81%

M1 25°C 0.08267

M2 25°C 0.08187 0.08176 0.08077 1.23%

M2 25°C 0.08164

ST1* 4°C 0.08169 0.08164 0.08040 1.54%

ST1* 4°C 0.08159

ST2* 4°C 0.07950 0.07964 0.07886 0.99%

ST2* 4°C 0.07977

M1* 4°C 0.08313 0.08291 0.08189 1.25%

M1* 4°C 0.08269

M2* 4°C 0.08169 0.08184 0.08077 1.32%

M2* 4°C 0.08199

Promedio % Variación

25°C ambiente

0.98%

Promedio % Variación

4°C refrigeración

1.28%


La evaluación de la estabilidad es un ensayo para determinar si son estables las

concentraciones de los p.a durante el tiempo de trabajo, es decir de un día para otro (24

hrs), la variación de concentración no debe ser mayor a un 2% con respecto a los

resultados obtenidos del primer día de análisis En la tabla X aparecen las variaciones

tanto para las muestras a temperatura ambiente como las guardadas a 4º C y en ellas se

puede apreciar que ninguna de las muestras supera el 2%. De lo que se deduce que el

principio activo alacloro es estable a condiciones de almacenamiento de 24 hrs tanto a

temperatura ambiente como refrigerado. Lo cual se traduce en confianza de los resultados

obtenidos en la validación y en futuros análisis.

Cálculo de incertidumbre

Cálculo de incertidumbre tipo A.

La incertidumbre tipo A se relaciona con fuentes de error aleatorios, y pueden ser

evaluados a partir de distribuciones estadísticas de series de resultados , que

pueden ser caracterizadas a partir de desviaciones estándar.

Tabla E-0-8 Serie de experimentos repetidos diferentes días y en diferentes equipos.

Día Equipo 1 Equipo 2 % Recuperación RSD

10/10/2016 Merck hitachi/inyección manual 100.5 % 0.94





08/01/2016 Agilent/inyección automática 99.1 % 0.31





Promedio equipo 1 100.2 % 1.108

230 ANEXOS

Promedio equipo 2 99.4 % 0.756

Promedio final 99.8 % 0.932

𝒖 = 𝑹𝑺𝑫𝒑𝒓𝒐𝒎𝒆𝒅𝒊𝒐

√𝒏

𝒖 = 𝟎. 𝟗𝟑𝟐

√𝟏𝟎= 𝟎. 𝟐𝟗𝟓


E. Otros anexos

Anexo: Cálculo de Incertidumbres

NMX-AA-115-SCFI-2001,

Estándar Method 218 (HPLC ALACLORO)





NMX-AA-071-1981,

NMX-AA-073-SCFI-2001.

RESULTADOS DE CINETICA DE DEGRADACIÓN TGA ALACLORO

MICROSCOPIAS ELECTRONICAS DE TRANSMISIÓN CRIOGENICA

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