protocolo_practicas_alimentos_08_09

8/8/2019 protocolo_practicas_alimentos_08_09

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Prácticas de

Bioquímica y Biotecnología de Alimentos

PRACTICA 1. DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DEPROTEÍNA EN LECHE DE VACA Y EXTRACCIÓN DE CASEÍNA

La leche contiene diversas proteínas (Tabla 1), de las cuales las caseínas sonlas más abundantes, ya que representan el 80% de las proteínas totales. Lascaseínas de la leche tienen pesos moleculares que oscilan entre 25.000 y40.000; las más importantes son la α, la β y la κ, que representan,respectivamente, el 50, 30 y 15% del total de las caseínas. En la leche, estasproteínas se asocian entre si para formar micelas, que se encuentranestabilizadas y solublilizadas gracias a la presencia de la caseína κ, y delcalcio.

MICELAS DE CASEÍNA EN LA LECHETabla 1

Composición proteica de las leches devaca y humana

Proteína vaca(g/100ml)

humana(g/100ml)

Caseina 2,80 0,25

α -lactalbúmina 0,12 0,25

β -lactoglobulina 0,30 Nocontiene

Inmunoglobulinas 0,05 0,10

Lactoferrina 0,02 0,17Lactoperoxidasa 0,003 No

contiene

Totales 3,40 0,89

Cuando se va a fabricar queso, se agregan a la leche cuajo (enzimascoagulantes, principalmente Renina), que catalizan la ruptura de un solo enlacepeptídico de la κ-caseína, la unión entre el aminoácido fenilalanina en laposición 105 y la metionina en la 106, lo que provoca la desestabilización delas micelas y por lo tanto la precipitación de casi todas las caseínas, las queposteriormente se van a transformar en queso.

El suero restante contiene principalmente lactosas y proteínas solubles(lactoalbúmina y lactoglobulina), las proteínas del suero del queso tienenexcelentes propiedades funcionales y un valor nutritivo muy alto debido a suexcepcional contenido en lisina, triptofano, metionina y cisteína.



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1.1. Determinación colorimétrica del contenido de proteínas en leche devaca

Con frecuencia se nos presenta el problema de tener que analizar proteína enuna muestra de alimento, como puede ser la leche de vaca entera. En este tipode casos es bueno saber el contenido aproximado de proteína de la muestra(en el caso de la leche de vaca está en torno al 2-3% p/v) para hacer lasdiluciones pertinentes que nos permitan encajar la muestra en la recta patrón.Lo que se pide en este caso es que el alumno haga precisamente eso yobtenga un valor exacto del contenido proteico de una muestra de leche devaca.

PREGUNTA1.¿Cual es la dilución de la leche necesaria para que, al hacer la determinaciónde proteína el valor de absorbancia se encuentre dentro del rango del patrón?,tomar como referencia una concentración de proteína en leche del 2%.

Realización de la practica:

1. Reactivos y tampones:

- Reactivo de Bradford- Patrón de calibrado: Seroalbúmina bovina (BSA), 0,02 mg/ml

2. Determinación de proteína

La determinación de proteína se realiza de acuerdo con el siguiente protocolo,donde la toma de muestra se realizará de la disolución diluida preparada enbase a los cálculos anteriores :



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Nº de Tubo C 1 2 3 4 5 M1 M2 M3H2O(ml) 1,8 1,6 1,5 1,4 1,3 1,2 1,6 1,4 1,2 Patrón BSA (ml) - 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 - - -leche diluida (ml) - - - - - - 0,2 0,4 0,6R. Bradford (ml) 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2

Agitar suavemente

Esperar 15 min a que se desarrolle el color y medir la absorbancia de cadatubo a 595 nm. Representar en papel milimetrado los datos obtenidos ycalcular, teniendo en cuenta la dilución que se ha hecho, la concentración deproteína en el extracto crudo.

3. Cálculos numéricos

Para obtener la recta de calibrado, se representan las absorbancias obtenidaspara los tubos del 1 al 5 en función de los µg de proteínas presentes en cadatubo.

Nº de Tubo C 1 2 3 4 5 M1 M2 M3Patrón BSA (mg/ml)Abs (595 nm)

Una vez obtenida la recta, y a partir de las absorbancias obtenidas para lasmuestras M1, M2, y M3, se determinan la concentración de proteínas de cadamuestra, teniendo en cuenta las diluciones.

Comparar el resultado con el valor de proteína en g/ml de la leche comercial.



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1.2. Aislamiento de la caseína en leche de vaca

Introducir 200 ml. de leche descremada en un vaso de precipitado de 600 ml.No se debe dejar la leche en reposo durante mucho tiempo antes de utilizarla,ya que la lactosa puede convertirse lentamente en ácido láctico, aunque seguarde en la nevera.

Calentar la leche hasta aproximadamente a 30° C y añadir 2 ml de ácidoacético (también puede realizarse en con 0,2 ml de cuajo líquido (renina), obien jugo de limón). Agitar continuamente la mezcla con un imán durante todoel proceso de adición hasta que se forma una gran masa amorfa.

Para separar la caseína, tomar 40 + 40 ml de la suspensión en 2 tubos Falcon(pesar antes) y con el tapón puesto centrifugar a 3000 rpm durante 3 min.Separar el suero lacteo de la caseína en un vaso de precipitado de 100 ml.

Para retirar la caseína añadir 5 ml del suero a cada uno de los tubos Falcon yagitar vigorosamente. Verter la suspensión sobre una placa de petri, con papelde secado en la base (determinar el peso antes de añadir la suspensión) ydejar en la estufa a 35º C durante 24 h.

Pesar la placa y determinar los gramos de caseina de la leche.



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PRÁCTICA 2: DIGESTIÓN DE NUTRIENTES (AMILASASALIVAL)

Una de las funciones fundamentales del aparto digestivo es transformar losalimentos ingeridos en estructuras sencillas capaces de ser absorbidas a nivelintestinal. La digestión de carbohidratos ingeridos (como es el caso delalmidón) comienza en la boca a través de la ptialina. Esta enzima es una α-amilasa que hidroliza enlaces α(1,4) internos, pero no los α(1,6) próximos a lasramificaciones. Los productos de esta digestión en la boca son maltosa eisomaltosa y otros polímeros que contienen de 3 a 9 moléculas de glucosa.Aunque el alimento permanece en la boca un corto período de tiempo, laacción de la amilasa salivar continúa hasta que el pH ácido del contenido

estomacal la inactiva, de manera que hasta ese momento la enzima hidrolizade un 30 a un 40% de los almidones de la dieta.A nivel intestinal actúa otra α-amilasa de origen pancreático y con una actividadsemejante a la salival, rindiendo productos de degradación similares. Estosproductos sufren finalmente la acción de otras carbohidrolasas (maltasa,lactasa, isomaltasa) liberando los monosacáridos que posteriormente sonabsorbidos.

OBJETIVOEl objetivo de esta práctica es determinar cualitativamente la actividad de la α-amilasa salival (ptialina).

MATERIALES Y REACTIVOS- Baño termostatizado- Tubos de ensayo- Baño a 100ºC- Papel de filtro- Embudo- Pipetas- Solución de almidón al 0,2% (preparar en agua destilada calentando)- Solución de lugol (comercial)

o

16,6 g IKo 1,25 g I2 o c.s.p. 1000 mL agua destilada

- Fehling A: 17,34 g CuSO4 /100 mL agua (comercial)- Fehling B: (comercial)

o 173 g Tartrato sódico potásicoo 50 g de NaOHo c.s.p. 500 mL agua

PROCEDIMENTOEl almidón es el polisacárido de reserva más abundante en los vegetales. Esta

formado por α-amilosa (lineal de unas 200 unidades de D-glucosa unidas por



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elaces α-(1,4) glucosídicos) y por amilopectina (lineal de glucosa con enlacesα-(1,4) y con ramificaciones mediante enlaces α-(1,6)-glucosídicos).

La α-amilosa en agua presenta una ordenación espiral característica, con 6 ó 7residuos de glucosa por vuelta. En esta hélice los grupos hidroxilos quedanhacia fuera, mientras que en el interior se disponen los grupos hidrofóbicos. Eneste interior es donde se incluye el yodo, formando un complejo de intensocolor azul que permite la identificación positiva de trazas de almidón.

La amilasa salival actúa sobre el almidón de los alimentos liberando azucaresreductores. Los azúcares reductores, en medio alcalino, son capaces dereducir el ion Cu2+ de color azul a Cu+ de color rojo. Por otro lado, en mediofuertemente básico, el ión Cu2+ formaría Cu(OH)2 insoluble, por ello se añade

tartrato sódico potásico que actúa como estabilizador al formar un complejo conel Cu2+.

PREGUNTA. ¿A qué se debe al presencia de azucares reductores, tras tratarel almidón con la amilasa salival?, ¿si el Cu2+ se reduce, qué se oxida y a qué?

En consecuencia, se podrá demostrar la acción de la α-amilasa salival sobre elalmidón, comprobando que los productos resultantes de la acción enzimáticason reductores y no dan la reacción del yodo.

PROTOCOLO

a) Disponer en una gradilla de 4 tubos numerados del 1 al 4, colocando encada uno de ellos 2 mL de solución de almidón al 0,2%.

b) Tubo 1: añadir 3-4 gotas de solución diluida de Lugol (una parte de lugoly dos de agua). Anotar el resultado

c) Añadir al tubo 2, 1 mL de solución Fehling A y otro de Felhing B.Calentar a 100 ºC y anotar el resultado.

d) Agregar a los tubos 3 y 4, una pequeña cantidad (0,5 ml) de saliva. Paraello tras enjuagar la boca, se mastica un trozo de filtro para estimular lasalivación. La saliva se recoge en un tubo Falcon (pequeño). Incubar lostubos 3 y 4 durante 15-20 min en un baño a 35-40º C. Transcurrido esetiempo se sacan del baño y se dejan enfriar.

e) Añadir al tubo 3, 3-4 gotas de solución diluida de Lugol y observar elresultado.

f) Añadir al tubo 4, 1 mL de Fehling A y 1 mL de Fehling B. Calentar a 100º C y observar el resultado.

PRESENTACIÓN DE RESULTADOS:- Tubo I …………………………………………………………………………..- Tubo II ………………………………………………………………………….- Tubo III …………………………………………………………………………- Tubo IV …………………………………………………………………………



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INTERPRETACIÓN:



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PRÁCTICA 3. VALORACIÓN DEL ESTADO NUTRICIONALMEDIANTE TALLA, PESO Y CREATININA

La talla es un parámetro antropométrico de fácil obtención e interpretación, quenos indica el estado de nutrición y que varía según la edad y otros factores.

El peso corporal es uno de los parámetros antropométricos que más se utiliza.Es un indicador global del estado nutricional. Muestra el estado nutricionalactual, es de fácil uso pero de difícil interpretación.

La creatinina procede de la degradación de la creatina, unamolécula energética de síntesis hepática situada en losmúsculos. La creatinina formada es excretada

íntegramente por la orina y está relacionada con la masamuscular.

OBJETIVOLa práctica permite:

- Detectar posibles problemas de malnutrición- Evaluar el estado nutricional de un individuo a partir de la observación

de los parámetros antropométricos antes citados, así como con losvalores de la creatinina.

MATERIAL Y REACTIVOS - Peso de precisión- Tallímetro- Cinta métrica inelástica- Calculadora- Tabla de peso ideal, excreción ideal de creatinina.- Reactivo (Picrato alcalino: ácido pécrico en NaOH) (comercial)

PROTOCOLO:- Talla: medida en el tallímetro dispuesto al efecto. La medida se efctúa

con el sujeto descalzo, en posición firme, con los brazos relajados ycuidando que el ojo y meato auditivo estén en el mismo plano horizontal.

- Peso: en ropa ligera y descalzo

- Circunferencia de la muñeca: del brazo no dominante, con una cintamétrica distal a la apófisis estiloides en el pliegue de la muñeca.



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- Determinación de creatinina: La creatinina reacciona con el ácido pícrico, a saturación, en medioalcalino, formando un complejo marrón, cuya absorbancia a 510 nm esproporcional a la concentración de creatinina. Para el cálculo de lacreatinina utilizar la siguiente recta de calibrado:

Y = 29,74x + 0,0019 (r2=0,9998)

Donde Y es la Abs a 510 de la muestra y X los mg/ml de creatinina.

Se diluye la orina: 1:50 con agua destilada Se preparan los siguientes tubos:

Control M1 M2 M3Agua destilada 0.1 0.04 0.02 0Muestra diluida 0 0.06 0.08 0.1Reactivo 1 1 1 1

1 min a 35-37 ºCAbs 510 (alumno 1)Abs 510 (alumno 2)

Calculo de creatinan (mg/ml):

Conociendo la cantidad de orina eliminada (600-1800 ml) por el pacienteen 24 h, se calcula la excreción total de creatinina por día (en mg/dl).Sabiendo que los valores normales son 23 mg/Kg/d para el hombre y 17mg/Kg/d para la mujer, se calcula el índice de excreción de creatinina yse interpreta el resultado. El dato también puede compararse con lastablas suministradas.

• pH (orina): normal (4,6 - 8)• Cuerpos cetónicos:

Pequeña: < 20 mg/dL (normal) ; Moderada: 30-40 mg/dL; Grande: > 80 mg/dL

• Glucosa en orina: debe ser negativo



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INTERPRETACIÓN

PESO:Es interesante conocer el peso actual (P); el peso ideal (PI)Para el PI existen diversas fórmulas:

• Brocca: PI = A-100 donde (A=altura en cm)

• Lorenz: PI = A – 100 – [(A-150)/4] + [(E-20)/k];donde A=altura en cm; E= edad en años; k= 4(Hombres) ó 2,5 (Mujeres)

• Metropolitan Life Insurance Company PI = 50 + 0,75(A-150) donde A= altura en cm

COMPLEXION CORPORALSe clasifica en pequeña, mediana y grande. Se mide como la razón (r) entre latalla y la circunferencia de la muñeca del brazo no dominante.

r = Altura (cm) / Circunferencia de la muñeca (cm)

Complexión Hombres MujeresPequeña r>10,4 r>11Mediana 9,6 < r < 10,4 10,1 < r < 11Grande r<9,6 r<10,1

INDICES:• Porcentaje de peso habitual %PH = P/PI x 100 (valores superiores a

120% se considera obesidad)

• Indice de masa corporal, se obtiene mediante la siguiente fórmula

IMC = Peso (kg)/ Talla2 (m2)

- IMC < 20 Desnutrición- 20 < IMC < 24,9 Normalidad- 25 < IMC < 29,9 Sobrepeso- 30 < IMC < 40 Obesidad- > 40 Obesidad mórbida

• En un estado nutricional normal y con una función renal correcta, laexcreción de creatinina diaria sería:

o Hombres: 23 mg/kg de peso idealo Mujeres: 18 mg/Kg de peso ideal

El índice de excreción de creatinina (IEC) (ver tablas adjuntas)IEC = excreción renal de creatinina en 24h / excreción ideal de creatinina en 24h x 100



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La excreción ideal de creatinina se obtiene de las tablas adjuntas.Según el IEC se estima:

o Nutrición normal: 80-100 %o Malnutrición leve: 60-80%o Malnutrición moderada: 40-50%o Malnutrición severa: < 40%

Presentación de resultados

Alumno (1): Alumno(2):

PesoTallaDiámetro muñecaPeso Ideal% PIComplexiónIMCIECpHCuerpos cetónicosGlucosa (orina):

Glucosa (sangre):

EVALUACIÓN NUTRICIONAL



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Antocianinas

PRÁCTICA 4: ENSAYOS DE ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE CONEL DPPH (PARA LA FRESA)

El DPPH· (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) es un reactivoutilizado para evaluar la capacidad antioxidante dedistintos compuesto naturales, entre ellos lasantocianinas contenidas en frutos.

Las antocianinas son un tipo de flavonoides complejos,utilizados como colorantes naturales, que además secaracterizan bajo el punto de vista nutricional por tener

un importante efecto antioxidante al apoyar laregeneración de los tejidos, fomentar el flujo de lasangre, reducir el colesterol, promover la formación de colágeno, reducir elenvejecimiento del cuerpo, disminuir los riesgos de ataque al corazón y sonexcelentes preventivos contra el cáncer.

La práctica consiste en evaluar la capacidad antioxidante de extractos defresas.

1. Preparación del extracto de las muestras.

- Se toman aproximadamente 0.25 g de fresa en crudo (procedente de un“pull” homogeneizado)

- Rompemos con N2 líquido.- Se extraen con 10 ml de metanol acidíficado al 1 % con HCl.

DPPH

Colorantes alimentarios:

E163a (cianidina): colorante rojo

E163b (delfinidina) : colorante azul

E163c (malvidina) : colorante púrpura

E164d (pelargonidina) : colorante anaranjado

E164e (peonidina) : colorante rojo-marrón

E165f (petunidina) : colorante ro o oscuro



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- Se mantiene en oscuridad a 4º C durante 24 horas. Si el pellet no está losuficientemente blanco, re-extraer hasta que se crea conveniente.

- Centrifugar y filtrar las muestras.

2. Desarrollando el ensayo

- Tomar 3,9 ml de DPPH 6 x 10-5 M en metanol y añadir 0,1 ml delextracto de antocianinas en una cubeta desechable.

- Medir la disminución de absorbancia a 0’, 1’ y cada 5’ a 515 nm durante2 horas o hasta que la absorbancia llegue a ser constante.

- Calcular la concentración de DPPH restante usando la siguienteecuación:

CDPPH(M) = (A515 + 2.58·10

-3

) x 12509

-1

OBSERVACIONES

• No es recomendable mantener la solución de DPPH más de un día yaque su poder de degradación es bastante alto y podemos encontrarnoscon que la absorbancia disminuye considerablemente (se pierdenradicales libres). Esta solución debe mantenerse en frío a 4º C y enoscuridad.

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