producción de nanopartículas a partir de la cáscara del

Producción de nanopartículas a partir de la cáscara del camarón para la remoción

de Escherichia Coli

Karen Natalia Mojica López

Asesor: Jaime Plazas Tuttle, PhD

Universidad de los Andes.

Ingeniería Civil y Ambiental.

Proyecto de grado en Ingeniería Ambiental.

Enero 2020

DEDICATORIA

Esta tesis está dedica a la memoria de mi padre, quién me animó y me acompañó en cada

etapa de mi vida y que siempre me brindó amor incondicional. Su ejemplo me mantiene

soñando y me da fuerzas cuando quiero rendirme. También, quiero dedicarle este trabajo

a mi mamá, quién me ha brindado cariño y apoyo absoluto, siempre está para recordarme

que todo esfuerzo trae su recompensa. Finalmente, a mi hermana, quién siempre está

presente para escucharme, apoyarme y levantarme el ánimo.

AGRADECIMIENTOS

A mis padres, por todo su amor, inspiración, comprensión y apoyo para lograr mis

objetivos propuestos. A mi hermana, por llenarme de alegría día tras día, por su paciencia

y por todos sus consejos brindados.

Agradecimientos especiales al Ingeniero Jaime Plazas, asesor de tesis, por su orientación

en la preparación y ejecución de este proyecto. De igual forma, a los técnicos de los

laboratorios de ingeniería ambiental, por su disposición y apoyo en los ensayos

realizados.

1

ÍNDICE

Resumen. .......................................................................................................................... 5

Abstract. ............................................................................................................................ 5

1. Introducción. ............................................................................................................. 6

2. Objetivos ................................................................................................................... 9

2.1 General ............................................................................................................... 9

2.2 Específicos ......................................................................................................... 9

3. Materiales y métodos. ............................................................................................... 9

3.1 Recolección de muestras. ................................................................................... 9

3.2 Preparación quitosano. ....................................................................................... 9

3.3 Desmineralización. ............................................................................................ 9

3.4 Desproteinización ............................................................................................ 10

3.5 Decoloración .................................................................................................... 10

3.6 Desacetilación .................................................................................................. 10

3.7 Comprobación quitosano ................................................................................. 11

3.8 Molienda y tamizado ....................................................................................... 11

3.9 Caracterización fisicoquímica del quitosano. .................................................. 11

3.9.1 Capacidad de retención de grasa (FBC). .............................................. 11

3.9.2 Capacidad de retención de agua (WBC). .............................................. 12

3.9.3 Humedad. .............................................................................................. 12

3.9.4 Distribución de tamaño. ........................................................................ 12

3.9.5 Espectroscopía Infrarroja (FTIR). ......................................................... 13

3.9.6 Valoración potenciométrica. ................................................................. 13

3.9.7 Microscopio electrónico de barrido (MEB). ......................................... 14

3.10 Crecimiento bacteriano ................................................................................ 14

3.11 Prueba de tolerancia. .................................................................................... 15

2

4. Resultados y discusión. .......................................................................................... 15

4.1 Obtención quitosano. ....................................................................................... 15

4.2 Caracterización fisicoquímica del quitosano. .................................................. 16

4.2.1 Capacidad de retención de grasa (FBC). .............................................. 16

4.2.2 Capacidad de retención de agua (WBC). .............................................. 16

4.2.3 Humedad. .............................................................................................. 16

4.2.4 Distribución de tamaño. ........................................................................ 16

4.2.5 Espectroscopía Infrarroja (FTIR). ......................................................... 18

4.2.6 Valoración potenciométrica. ................................................................. 20

4.2.7 Microscopio electrónico de barrido (MEB). ......................................... 21

4.3 Crecimiento de Escherichia Coli. .................................................................... 22

4.4 Estandarización del número de colonias. ......................................................... 23

4.5 Prueba de tolerancia. ........................................................................................ 23

5. Conclusiones. .......................................................................................................... 32

6. Referencias. ............................................................................................................ 34

7. Anexos. ................................................................................................................... 39

3

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Comprobación quitosano: material obtenido en ácido acético al 2 %. ........... 11

Figura 2. Quitosano obtenido a partir de la cáscara del camarón. .................................. 15

Figura 3. Quitosano molido en licuadora (a)vista de perfil, (b)vista frontal. ................. 17

Figura 4. Cáscara de camarón después de 2 ciclos en el molino bolas planetario. ........ 17

Figura 5. Distribución de tamaño de partícula - molino de bolas planetario.................. 18

Figura 6. Espectro FTIR del quitosano producido a partir de la cáscara del camarón. .. 19

Figura 7. Titulación potenciométrica del quitosano. ...................................................... 20

Figura 8. Imágenes de microscopía electrónica de barrido (MEB) de quitosano a partir de

la cáscara de camarón (a)430×, (b)1900× y (c)3500×. ................................................. 22

Figura 9. Curva de crecimiento de Escherichia Coli. ..................................................... 22

Figura 10. Proceso para la extracción de quitosano a partir de cáscara de camarón. ..... 39

Figura 11. Siembra y cultivo de Escherichia Coli.......................................................... 40

Figura 12. Comprobación OD de Escherichia Coli. ...................................................... 40

Figura 13. Centrifugado de la muestra. .......................................................................... 41

Figura 14. Diluciones. .................................................................................................... 41

Figura 15. Estandarización de colonias para 1 y 2 horas. .............................................. 42

Figura 16. Diluciones en serie (t = 0 h). ......................................................................... 42



Figura 19. Ensayo 1 - Micropartículas (t = 1 h). ............................................................ 44

Figura 20. Ensayo 1 - Material original (t = 1 h). ........................................................... 45

Figura 21. Ensayo 1 - Dilución 10-5 (t = 1 h). ................................................................ 45










4

ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1. Tamaño de partícula - molino de bolas planetario. .......................................... 18

Tabla 2. Datos titulación potenciométrica de quitosano................................................. 21

Tabla 3. Diluciones (t = 0 h) en serie de Escherichia Coli. ............................................ 23

Tabla 4. Numeración de Figuras de los ensayos realizados. .......................................... 24

Tabla 5. Reporte (UFC/mL) de las bacterias expuestas a 1 h......................................... 24

Tabla 6. Reporte (UFC/mL) de las bacterias expuestas a 2 h......................................... 25

Tabla 7. Reporte final (UFC/mL) de Escherichia Coli expuesta a quitosano (MP y MO)

durante 1 h. ..................................................................................................................... 26

Tabla 8. Reporte final (UFC/mL) de Escherichia Coli expuesta a quitosano (MP y MO)

durante 2 h. ..................................................................................................................... 27

Tabla 9. Diluciones (t = 1 h) en serie de Escherichia Coli. ............................................ 28

Tabla 10. Diluciones (t = 2 h) en serie de Escherichia Coli. .......................................... 28

5

Resumen.

El quitosano es un biopolímero versátil con diversidad de aplicaciones y propiedades,

entre las que se destaca su efecto antimicrobiano y bactericida. Es por esto, que este

trabajo tiene como objetivo obtener nanopartículas de quitosano, a partir de la cáscara del

camarón, para evaluar su actividad antimicrobiana en Escherichia Coli. Para la obtención

de este biopolímero, se realizó un tratamiento que incluyó la desproteinización,

desmineralización, decoloración y desacetilación de la cáscara de camarón. Una vez

obtenido el quitosano, el material se molió en una licuadora para homogeneizar su tamaño

(material original) y seguido, se molió en un molino planetario de bolas, donde se obtuvo

un material con una distribución de tamaños de partículas entre 12 y 87 µm, caracterizado

como micropartículas. Después, se cuantificó el grado de pureza del quitosano a partir de

sus propiedades fisicoquímicas - humedad, capacidad de retención de grasa y agua.

Asimismo, utilizando técnicas de caracterización de distribución de tamaño,

espectroscopía infrarroja, valoración potenciométrica y microscopio electrónico de

barrido con el objetivo de evaluar la calidad del material obtenido. Por otra parte, para

medir la actividad antimicrobiana, se expuso la bacteria a diferentes concentraciones del

material original y de las micropartículas, y se comparó con un control positivo (bacteria

sin quitosano). A partir de los resultados obtenidos, se concluye que no hubo actividad

antimicrobiana por parte del quitosano y que, por lo contrario, este actuó como un

estimulador del crecimiento y de supervivencia bacteriana. Lo anterior se evidenció

porque el control positivo no tenía ningún crecimiento y las bacterias, que estuvieron

expuestas en quitosano, si presentaron colonias (solo en altas concentraciones del

material) de Escherichia Coli.

Palabras clave: quitosano, Escherichia Coli, camarón, actividad antimicrobiana,

nanopartículas.

Abstract.

Chitosan is a versatile biopolymer with a variety of applications and properties, among

which it is antimicrobial and bactericidal effect stands out. For this reason, this work aims

to obtain chitosan nanoparticles, from the shrimp shell, to evaluate its antimicrobial

activity in Escherichia Coli. To obtain this biopolymer, a treatment was performed which

included the deproteinization, demineralization, discoloration and deacetylation of the

shrimp shell. Once the chitosan was obtained, the material was ground in a blender to

6

homogenize its size (original material) and then, ground in a planetary ball mill, where a

material with a particle size distribution between 12 and 87 µm was obtained,

characterized as microparticles. Then, the degree of purity of chitosan was quantified

from its physicochemical properties - moisture, fat and water binding capacity. Likewise,

techniques of characterization of size distribution, Fourier transform infrared

spectroscopy, potentiometric titration and scanning electron microscope were used to

evaluate the quality of the material obtained. Furthermore, to measure the antimicrobial

activity, the Escherichia Coli was exposed to different concentrations of the original

material and the microparticles, then it was compared with a positive control (bacteria

without chitosan). Based on the results obtained, it’s concluded that there was no

antimicrobial activity by the chitosan, but it acted as a growth and bacterial survival

stimulator. The above was evidenced because the positive control had no growth and the

bacteria, which were exposed in chitosan, did present colonies (only in high

concentrations of the material) of Escherichia Coli.

Keywords: chitosan, Escherichia Coli, shrimp, antimicrobial activity, nanoparticles.

1. Introducción.

La disponibilidad de agua limpia, libre de agentes contaminantes, que incidan sobre la

calidad de esta, es una prioridad mundial. Es por esto, que entre los Objetivos de

Desarrollo Sostenible (ODS) se encuentra un ítem alusivo a la importancia que tiene el

agua: garantizar la disponibilidad y la gestión sostenible del agua y el saneamiento para

todos. La importancia de este objetivo radica en que el acceso a agua, con calidad, es un

derecho humano; sin embargo, se estima que su escasez afecta a más del 40 % de la

población mundial y alrededor de “1800 millones de personas en el mundo utilizan una

fuente de agua potable que está contaminada por restos fecales” [1]. Entre las principales

consecuencias asociadas a esta problemática, se encuentran efectos en el crecimiento y

desarrollo, y en el peor de los casos, la muerte de niños menores de 5 años [2]. Según la

ONU [1], diariamente mueren alrededor de 800 niños por enfermedades diarreicas

(asociadas a la falta de higiene). A partir de esto, se evidencia que el tratamiento efectivo

del agua es de alta importancia, dado que es un sistema que tiene como objetivo la

eliminación de sustancias no deseadas para proteger la salud pública y el medio ambiente.

7

La desinfección del agua, una de las etapas dentro del proceso de potabilización -

tratamiento del agua, tiene como objetivo garantizar la eliminación de microorganismos

existentes, capaces de producir enfermedades [3]. Este proceso es fundamental e

indispensable, debido a que, si bien “los procesos de coagulación, sedimentación y

filtración remueven el mayor porcentaje de microorganismos patógenos del agua, su

eficiencia no llega al 100 %” [4], por lo que es necesario eliminar los microorganismos

restantes. Entre los principales microorganismos que se eliminan en este proceso, se

encuentra la bacteria Escherichia Coli (E. Coli), perteneciente al grupo de coliformes

fecales, que se caracteriza por ser Gram-negativa y que comúnmente se encuentra en los

intestinos de los seres humanos y de los animales [5]. La importancia de remover este

microorganismo del agua se debe a que E. Coli está asociada a la enfermedad diarreica

grave (EDA), una las principales causas de mortalidad en el mundo, principalmente en

niños y en adultos mayores [6]. Para eliminar este microorganismo presente en el agua,

existen metodologías como la cloración, siendo el método más común de desinfección de

agua, debido a su bajo costo, manejo sencillo y fácil aplicación. No obstante, utilizar cloro

tiene desventajas como la alta corrosión de cualquier equipo o instalación metálica que

esté ubicado en el ambiente, debido al riesgo potencial de que se produzca una fuga [7],

produce un sabor desagradable en el agua y genera subproductos no deseados al

reaccionar con la materia orgánica natural presente en el agua [7]. A partir de esta

problemática, se han buscado nuevas o mejores metodologías que permitan cumplir con

el objetivo de la desinfección, sin generar resultados contraproducentes en la salud

pública y del medio ambiente [8].

La nanotecnología se ha identificado como una potencial alternativa, que puede

reemplazar los métodos convencionales como la cloración. Lo anterior se debe a que los

nanomateriales no producen una desinfección dañina por sus coproductos, son inertes en

agua y son fuertes oxidantes [8]. En un estudio elaborado por la Universidad del Cauca

(Colombia), se produjeron nanopartículas de dióxido de titanio (TiO2) en fase amorfa,

utilizando el método sol-gel [3], con el objetivo de evaluar su potencial en la inactivación

de E. Coli. Este método consistió en la obtención de soles (solución coloidal) estables,

por medio de hidrólisis y policondensación del tetrabutóxido de titanio (TBT-Across),

Ti(OBu)4 [3]. En dicho estudio se obtuvo un tamaño de partícula primario de

aproximadamente ~100 nm y mediante curvas de letalidad (considerando el efecto del

8

tiempo de contacto de las bacterias con las nanopartículas) se obtuvo una concentración

de E. Coli de 2.7 × 106 UFC/mL respecto a una concentración inicial incontable [3].

Asimismo, con el objetivo de remover E. Coli, investigadores de la Universidad

Autónoma de San Luis Potosí (México) realizaron un estudio con geomembranas de

polietileno y propileno, impregnadas con diferentes concentraciones de nanopartículas de

óxido de zinc y plata. A partir de esto, se concluyó que la geomembrana en polietileno,

con una composición de 200 ppm de óxido de zinc y 127 ppm de plata fue la mejor, al

eliminar el 99 % de E. Coli [9].

Los estudios mostrados anteriormente son el resultado de la impregnación de

nanopartículas metálicas en diferentes superficies, para la inactivación de E. Coli. Sin

embargo, a pesar de la eficiencia de estos materiales para remover esta bacteria, en estos

estudios no se evalúan los efectos contraproducentes que estos podrían generar en la

salud. Se ha demostrado que el uso de metales puede causar a largo plazo enfermedades

como Alzheimer y problemas renales [10] en las poblaciones que consumen estas aguas.

Braydich-Stolle et al. mostraron que las nanopartículas de plata causaban toxicidad en las

células madre, accedían a los espermatozoides humanos y como consecuencia, causaban

problemas en la fertilidad [11].

A partir de lo anterior, surge el presente trabajo, que tiene como objetivo evaluar el efecto

de las nanopartículas producidas a partir de quitosano, para la inactivación de E. Coli. La

razón de utilizar este material es que es un producto natural de bajo costo y que se

caracteriza por ser amigable con el medio ambiente [12]. Adicionalmente, el quitosano -

un biopolímero, se obtiene a través de un proceso químico de N-desacetilación de la

quitina, uno de los polisacáridos más abundantes que se producen en la naturaleza,

después de la celulosa [13]. Entre las principales fuentes de este biopolímero se

encuentran las paredes celulares de los hongos y del exoesqueleto de algunos crustáceos,

como el camarón, el cangrejo y el kril. Por esta razón, en este trabajo se obtendrá

quitosano a partir de la cáscara del camarón, siendo un material que se puede conseguir

como un residuo generado en restaurantes y pescaderías. Asimismo, se utilizará este

material debido a que presenta un grupo amino con carga positiva (a un pH menor a 6.3)

que al interactuar con las cargas negativas de la pared celular de los microorganismos,

genera un rompimiento de sus estructuras, lo que conlleva a la pérdida de compuestos

proteicos y de otros constituyentes intracelulares [12].

https://es.wikipedia.org/wiki/Pared_celular

https://es.wikipedia.org/wiki/Hongo

https://es.wikipedia.org/wiki/Exoesqueleto

9

2. Objetivos

2.1 General

Producir nanopartículas de quitosano a partir de la cáscara del camarón, para la

inactivación de Escherichia Coli.

2.2 Específicos

- Pretratar y moler el quitosano extraído de la cáscara del camarón, para conseguir un

tamaño nanométrico.

- Caracterizar fisicoquímicamente el material producido para determinar su tamaño y

propiedades.

- Realizar experimentos de tolerancia para determinar la inactivación de E. Coli a

diferentes concentraciones de quitosano.

- Comparar la eficiencia de las nanopartículas con el material original.

3. Materiales y métodos.

3.1 Recolección de muestras.

Para extraer el quitosano, se utilizó cáscara del camarón, obtenida en Bogotá - pescadería

Martínez Martelo. Para esto, se siguió y se adaptó la metodología de Al-Manhel et al. [14]

iniciando con una muestra de 10 g de este material.

3.2 Preparación quitosano.

Con el fin de limpiar los desechos e impurezas que acompañan la cáscara de camarón,

como las colas, patas y restos orgánicos, fue necesario realizar un pretratamiento a los 10

g de este exosqueleto. Para esto, se lavó la cáscara con agua destilada, después, en una

refractaria de vidrio y en un horno a 45 °C, se dejó secar la cáscara y se colocó en un

desecador durante 24 h. Una vez se efectuó esta etapa, se realizó el siguiente

procedimiento (Anexos Figura 10), con el fin de extraer el quitosano.

3.3 Desmineralización.

Para remover los carbonatos de calcio presentes en la cáscara del camarón, se utilizó una

refractaria de vidrio para añadir el material seco en una solución de ácido clorhídrico (1

N), siguiendo una relación 1:15 peso/volumen (P/V). Las cáscaras se dejaron en esta

solución durante 6 h a temperatura ambiente (19 °C aproximadamente). Después, se lavó

el exoesqueleto desmineralizado con agua destilada hasta alcanzar un pH neutro (~7.0).

10

Finalmente, se dejó secar el material durante 5 horas en un horno a 65 °C y utilizando un

desecador, se estabilizó su temperatura.

3.4 Desproteinización

Con el fin de extraer los tejidos y proteínas adheridos a la cáscara seca, se utilizó una

proporción 1:10 P/V para añadir en una solución de NaOH, a una concentración del 3.5

% M, el material proveniente de la desmineralización. Para esto, se utilizó una refractaria

de vidrio y durante 2 horas en un horno a 65 °C, se dejó el exoesqueleto en la solución de

NaOH. Después de este tiempo, el material sólido se lavó con agua destilada, hasta bajar

el pH a un rango de 6.5 a 7.0 y se dejó secar a temperatura ambiente (aproximadamente

durante 2 días).

3.5 Decoloración

El proceso de despigmentación o decoloración se realiza para separar del exoesqueleto la

astaxantina (C40H52O4), un pigmento característico de este material, con alta capacidad

antioxidante e insoluble en solventes acuosos y la mayoría de solventes orgánicos [15].

Este procedimiento se realizó para obtener un producto completamente puro, a pesar de

que este pigmento no afecta la influencia del comportamiento del polímero en solución,

su reactividad o propiedades fisicoquímicas [16]. Para esto, el material proveniente de la

desproteinización se sometió a una solución de hipoclorito de sodio (NaOCl) al 0.315 %

M, durante dos horas a temperatura ambiente. Después, se lavó con agua destilada hasta

conseguir un pH neutro y se dejó secar en un horno a 45 °C durante 24 horas. Una vez

realizado este procedimiento, el material obtenido se conoce como quitina.

3.6 Desacetilación

La quitina obtenida se somete al proceso de desacetilación, permitiendo la eliminación

del grupo acetilo de la molécula, mediante el cual, se convierte en quitosano. Para este

tratamiento, se pesó el material proveniente del proceso de decoloración y se vertió en

una refractaria de vidrio con una solución de NaOH al 50 % , siguiendo una relación 1:10

P/V. Seguido de esto, se puso en un horno a 100 °C durante 5 horas. Después, se lavó con

agua destilada hasta alcanzar un pH neutro y se dejó secar a 45 °C. Finalmente, se dejó el

quitosano en un desecador con el fin de estabilizar su temperatura.

11

3.7 Comprobación quitosano

Para verificar que se obtuvo quitosano, se tomó 0.1 g del material obtenido y 2 mL de

ácido acético (CH3COOH) al 2 %, y se mezcló hasta obtener un gel homogéneo. Como

se puede observar en la Figura 1, el quitosano en la solución de ácido acético se disolvió,

formando un gel con apariencia viscosa. Lo anterior permite comprobar que el

procedimiento descrito anteriormente se realizó de manera correcta.

Figura 1. Comprobación quitosano: material obtenido en ácido acético al 2 %.

3.8 Molienda y tamizado

Con el objetivo de disminuir el área superficial del quitosano obtenido, primero se realizó

una molienda en una licuadora, empleando 1 ciclo de 4 minutos. Después, el material se

molió en el molino planetario de bolas (Fritsch, Premium Pulverisette7) para obtener un

material de menor tamaño en comparación al obtenido en la licuadora. Para esto, se

realizaron 2 ciclos de 450 segundos, cada uno a 500 rpm. Una vez la muestra fue molida,

se tamizó para trabajar con un tamaño de partícula más pequeño.

3.9 Caracterización fisicoquímica del quitosano.

3.9.1 Capacidad de retención de grasa (FBC).

Para caracterizar la capacidad de grasa (FBC por sus siglas en inglés) [17], se tomaron

0.5 gramos de muestra de quitosano y 10 mL de aceite de soya. Seguido, con el fin de

dispersar la muestra, esta se mezcló en un vórtex durante 1 minuto. Este contenido se dejó

reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos y cada 10 minutos se realizó una

agitación intermedia de 5 segundos. Finalmente, se centrifugó la mezcla a 3200 rpm

durante 25 minutos. Después de la centrifugación, se decantó el sobrenadante, se pesó

12

nuevamente el tubo y se calculó la capacidad de unión de grasa con la siguiente ecuación

(1).

𝐹𝐵𝐶 (%) = 𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙 (𝑔)

𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙 (𝑔)𝑥100 (1)

3.9.2 Capacidad de retención de agua (WBC).

La capacidad de retención de agua (WBC por sus siglas en inglés) se determinó utilizando

el método por Kumari et al. [17], donde se tomaron 0.5 gramos de la muestra obtenida de

quitosano y se le añadió 10 mL de agua, para posteriormente mezclarla en un vórtex

durante 1 minuto (con el fin de dispersar la muestra). Después, la muestra se dejó a

temperatura ambiente durante 30 minutos y cada 10 minutos se hizo una agitación de 5

segundos con un vórtex. Una vez pasado este tiempo, se centrifugó a 3200 rpm durante

25 minutos y extrajo el sobrenadante, para pesar el tubo para comprobar la diferencia de

peso inicial con la del tubo tras las agitaciones. La capacidad de retención de agua se

calculó utilizando la siguiente relación (2).

𝑊𝐵𝐶 (%) = 𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙 (𝑔)

𝑃𝑒𝑠𝑜 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙 (𝑔)𝑥100 (2)

3.9.3 Humedad.

El contenido de humedad se determinó empleando el método gravimétrico [17]. Para esto,

se pesó 1 g de la muestra en un crisol (peso húmedo) y se llevó a un horno a 105 °C

durante 24 horas. Después, se dejó en un desecador durante 1 hora y se pesó nuevamente

(peso seco). Para calcular el contenido de humedad se utilizó la siguiente relación (3).

𝐻𝑢𝑚𝑒𝑑𝑎𝑑 (%) = 𝑃𝑒𝑠𝑜 ℎú𝑚𝑒𝑑𝑜 (𝑔) − 𝑝𝑒𝑠𝑜 𝑠𝑒𝑐𝑜 (𝑔)

𝑃𝑒𝑠𝑜 ℎú𝑚𝑒𝑑𝑜 (𝑔)𝑥100 (3)

3.9.4 Distribución de tamaño.

Para caracterizar la distribución de tamaño de las partículas obtenidas, se empleó la

metodología de granulometría por difracción por rayos láser. Esta metodología consiste

en pasar la muestra (aproximadamente 1 g) en un líquido no reactivo (agua desionizada),

a través de un rayo láser monocromático, donde la luz difractada es detectada por

diferentes sensores del equipo [18]. Estas partículas difractan la luz a través de un ángulo

que es inversamente proporcional al tamaño de la partícula, y la intensidad de luz

difractada, en cualquier ángulo, representan el número de partículas con un área de

sección transversal específica [19]. De este modo, para obtener el tamaño de partícula, se

13

supone que todas las partículas son esféricas (teoría de Fraunhofer y Mie), así, el equipo

origina una figura de difracción en el detector que, en su mayoría, maneja rangos entre

0.04 mµ a 500.00 mµ / 100 Classes. El equipo utilizado fue CILAS, 1064L.

3.9.5 Espectroscopía Infrarroja (FTIR).

La utilización de espectroscopía infrarroja permite la identificación de compuestos

orgánicos, debido a que los espectros representan propiedades físicas características de

estos. De esta manera, se tomó una muestra de 1 mg de quitosano y 100 mg de gránulos

de KBr, utilizando un rango de exploración de 400 - 4000 cm- 1 en el equipo (Thermo

Scientific Nicolet 380 FT-IR Spectrometer).

Adicionalmente, esta metodología se utilizó para determinar el grado de desacetilación

(GD) del quitosano (pureza del material), siguiendo la técnica sugerida por Brugnerotto

et al. [20]. En esta técnica toman las bandas características de la amida III y como

referencia los grupos metilos, para la correlación lineal propuesta en (4).

Grado de N − acetilación (%) = 31.92 (𝐴1320

𝐴1420) − 12.2 (4)

Según Ming-Tsung [21], el grado de N-desacetilación en la quitina estará dado por la

ecuación (5).

GD (%) = 100 − Grado de N acetilación (5)

3.9.6 Valoración potenciométrica.

La valoración potenciométrica consiste en determinar el porcentaje de grupos aminos

presentes en la muestra de quitosano, también conocido como grado de desacetilación

(GD). Para determinar esto, se tomaron 0.5 g de quitosano y se disolvieron en 20 mL de

HCl a 0.3 M, luego se cambió el pH, por titulación, con NaOH a 0.1 M. La valoración se

llevó a cabo midiendo el cambio de pH cada 1 mL de base añadida (esta adición se realizó

de manera lenta y con agitación continua) hasta que el pH de la solución se estabilizara.

Después, se graficó el cambio de pH contra los mililitros de base consumidos, obteniendo

una curva con dos puntos de inflexión, “y la diferencia entre estos proporciona la razón

de la cantidad de ácido requerido para protonar los grupos amino del quitosano”[22]. Para

calcular el GD se utilizó la siguiente ecuación (6):

%𝑁𝐻2 =16.1(𝑦−𝑥)

𝑤∗ 𝑓 (6)

14

Donde,

y: mayor punto de inflexión (expresado como volumen).

x: Menor punto de inflexión (expresado como volumen).

f: Molaridad NaOH

W: Peso en gramos de la muestra

16.1 corresponde a un valor relacionado con el peso equivalente del quitosano.

3.9.7 Microscopio electrónico de barrido (MEB).

El quitosano se examinó mediante un microscopio de barrido de electrones JEOL, modelo

JSM 6490-LV, el cual permitió obtener imágenes con información morfológica y

composicional de la muestra de quitosano. Esta técnica consiste en “enfocar sobre la

muestra un fino haz de electrones, acelerado con energías de excitación desde 0.1 kV

hasta 30 kV” [23].

3.10 Crecimiento bacteriano

Inicialmente se sembró por estría, 10 µL de una muestra de Escherichia Coli (ATCC

25922) en medio sólido Luria-Bertani1 (LB) y se incubó durante 24 horas a 37 °C (Anexos

Figura 11). Después, se tomó una muestra aislada del medio LB, se inoculó en LB líquido

y se puso en un Shaker a 37 °C (hasta que la bacteria alcanzara su fase exponencial

media). Para comprobar esto, se tomó 1 mL de la bacteria en el medio líquido y con la

ayuda de un espectrofotómetro (Nanodrop 2000) se midió la concentración,

aproximadamente cada 30 minutos a 600 nm, hasta que la bacteria alcanzara un OD

(densidad óptica) de 0.4 (Anexos Figura 12) [24], [25].

Luego, la solución bacteriana se centrifugó (Thermo Scientific, Legend XFR) a 5000 rpm

durante 5 minutos y con el objetivo de quitarles el medio nutritivo a estas, el medio se

reemplazó con buffer fosfato salino2 [conocido como PBS por sus siglas en inglés

(phosphate buffered saline)]. Las bacterias en fase media exponencial se centrifugaron y

se lavaron 3 veces (Anexos Figura 13).

Para estandarizar la dilución óptima (rango contable entre 30-300 colonias) para el OD

de 0.4, se prepararon 7 tubos de ensayo con 9 mL de agua destilada, previamente

esterilizada, y se agregó 1 mL de la muestra centrifugada al primer tubo (dilución de

1Preparación: 100 ml de agua destilada se mezcla con 1 g de NaCl, 0.5 g de extracto de levadura, 1 g de

triptona y 1.8 g de agar bacteriológico. 2Preparación: 1 L de agua destilada se disuelve con 8 g de NaCl, 0.2 g de KCl, 1.44 g de Na2HPO4 y 0.24

g de KH2PO4. Ajustar pH a 7.4 con HCl.

15

1:10), luego se tomó 1 mL del primer tubo y se agregó al segundo (dilución 1:100), de

esta manera se hicieron diluciones en serie para los tubos siguientes. Este procedimiento

se realizó hasta llegar a la dilución de 10-7 (Anexos Figura 14). Seguido de esto, se

sembraron 100 µL de cada dilución en medio LB sólido y se dejaron incubar durante 24

horas a 37 °C.

3.11 Prueba de tolerancia.

Para las pruebas de tolerancia se utilizaron 5 diferentes concentraciones (2000 mg/L, 200

mg/L, 20 mg/L, 2 mg/L y 0.2 mg/L) de nanopartículas y del material original. Para esto,

en un tubo eppendorf de 1.5 mL, se añadieron 750 µL de cada concentración y de cada

material, y 750 µL de Escherichia Coli. La bacteria se expuso al material durante 1 y 2

horas en un agitador (Lab Companion, SIF5000) a 180 rpm y a una temperatura de 37 ºC.

Finalmente, se cultivaron 10 µL en medio LB y se incubaron durante 24 horas a 37 ºC.

Es importante mencionar que esta prueba si realizó por triplicado y que también se dejó

la bacteria (sin material) en el Shaker durante las mismas condiciones. Adicionalmente,

se cultivó un negativo (C-), con el objetivo de asegurar que ningún otro organismo

estuviera presente.

4. Resultados y discusión.

4.1 Obtención quitosano.

En la Figura 2 se puede observar la cáscara de camarón, una vez sometida a los procesos

de desmineralización, decoloración, desproteinización y desacetilación; obteniendo como

resultado quitosano. En esta figura se puede observar que el material obtenido está

despigmentado, tiene una contextura gruesa y un gran tamaño.

Figura 2. Quitosano obtenido a partir de la cáscara del camarón.

16

4.2 Caracterización fisicoquímica del quitosano.

4.2.1 Capacidad de retención de grasa (FBC).

La muestra de quitosano de camarón mostró una capacidad de retención de grasa de

330.54 %. Según Hossain & Iqbal [26], FBC depende de los procesos de

desmineralización y desproteinización, al cambiar la secuencia de pasos este valor puede

aumentar o disminuir. Por ejemplo, una disminución de FBC se observa cuando se realiza

la desproteinización antes de la desmineralización, seguida de la desacetilación y un

aumento en FBC cuando la desmineralización se realiza antes de la desproteinización,

seguida de la desacetilación [26]. Adicionalmente, los valores de FBC para el camarón

están alrededor de 314 y 535 %, con un promedio de 417 % [27]. En el presente caso, el

proceso de desmineralización se llevó a cabo primero, lo que resultó en un aumento de

FBC. Al comparar el resultado obtenido con estudios previos, se puede observar que la

capacidad de retención de grasa tiene un valor cercano al quitosano comercial [28], de

igual forma, se evidencia que al llevar a cabo primero el proceso de desproteinización,

hay una disminución en los valores de FBC [17].

4.2.2 Capacidad de retención de agua (WBC).

La capacidad de retención de agua para el quitosano fue de 1087.75 %. Según Rout [29]

el WBC de este material oscila entre 581 y 1150 %, con un promedio de 702 %. No

obstante, al igual que el FBC, revertir la secuencia de pasos entre la desmineralización y

la desproteinización tiene un efecto pronunciado en la caracterización de este método.

4.2.3 Humedad.

Las muestras de quitosano extraído de las cáscaras de camarones tenían un contenido de

humedad del 9.22 al 12.14 %. Según Li et al. [30], el contenido de humedad para los

productos comerciales de quitosano contienen menos del 10 % de humedad. Sin embargo,

es importante considerar que el quitosano es de naturaleza higroscópica3 [31], por lo tanto,

puede verse afectado por la absorción de humedad durante el almacenamiento.

4.2.4 Distribución de tamaño.

Molienda por licuadora. En las Figura 3a y 3b se puede observar el quitosano obtenido,

una vez este se sometió a una licuadora durante 4 minutos. En la Figura 3a se evidencia

que el material tiene gran tamaño, respecto a su área, debido a que no se encuentra en una

3 Capacidad de algunas sustancias de absorber humedad del medio circundante.

https://es.wikipedia.org/wiki/Humedad

17

escala nano, ni macro y su área promedio es mayor a 0.06 cm2. No obstante, en la Figura

3b se observa que después de esta molienda se obtuvo un material uniforme y con una

textura firme.

Figura 3. Quitosano molido en licuadora (a)vista de perfil, (b)vista frontal.

Molino de bolas planetario. Luego de obtener un material con mayor homogeneidad,

este se sometió a un molido adicional durante 450 segundos (2 ciclos) a 500 rpm. En la

Figura 4 se puede observar el resultado obtenido de este procedimiento.

Figura 4. Cáscara de camarón después de 2 ciclos en el molino bolas planetario.

En la Tabla 1 y en la Figura 5, obtenidas a partir de un análisis de granulometría, se

presentan los tamaños de las partículas después de someterse al molino de bolas

planetario. En esta tabla y en esta figura se observa que el 10 % de las partículas tienen

un tamaño menor a 12.67 µm, mientas que la mitad de estas tienen un diámetro menor o

aproximado a 46.46 µm. Asimismo, se evidencia que el 90 % del material obtenido tienen

a. b.

18

diámetros menores a 87.72 µm o menor a este valor. Finalmente, se observa que el

diámetro medio es de 47.6 µm (aproximado al 50 % de las partículas obtenidas). A partir

de este análisis, y teniendo en cuenta que una nanopartícula se define como “cualquier

partícula con un tamaño mayor a 1 nanómetro (nm) y menor a 100 nanómetros” [32] se

evidencia que el material obtenido no se encuentra en una escala nano. No obstante, se

obtuvieron micropartículas (MP), las cuáles se caracterizan por tener un tamaño

comprendido entre 1 y 1000 µm [33].

Tabla 1. Tamaño de partícula - molino de bolas planetario.

Porcentaje en volumen de partículas con

un diámetro igual o menor que el valor

(Rango entre 0.04 a 500 µm/100 clases)

Valor [µm] Valor [nm]

10 % 12.67 12670

50 % 46.46 46460

90 % 87.72 87720

Diámetro medio 47.6 47600

Figura 5. Distribución de tamaño de partícula - molino de bolas planetario.

4.2.5 Espectroscopía Infrarroja (FTIR).

La prueba FTIR se utilizó para evaluar los grupos funcionales presentes en el quitosano,

producido a partir de la cáscara del camarón. De esta manera, la Figura 6 muestra los

espectros de este material, donde se revela la presencia de los grupos hidroxilos (grupo

19

O-H) en la región 3440.14 cm-1 [34]. Además, se evidencia en la banda 2880.68 cm-1 una

vibración tensión del enlace C-H, que posiblemente corresponde a la clase de aldehídos

[34], [35]. Sumado a lo anterior, el GD en la muestra del quitosano se asocia con el

debilitamiento progresivo de las bandas relacionadas a los grupos NH [36]. De esta

manera, los enlaces N-H de la amida secundaria se encuentran en 1559.36 cm-1, para la

amida terciaria en 1317.75 cm-1, asociados con un grupo estiramiento C-N [34] y para los

enlaces de la amida primaria se encuentra en 1662.68 cm-1, asociados con un grupo

estiramiento C=O [34], [37].

Lo anterior se puede corroborar con la intensidad en espectro, dado que “la quitina

aparece [aproximadamente] a 1655 cm-1, debida a la tensión de grupos carbonilo amídicos

libres, y la banda que corresponde a la flexión del grupo amino [quitosano], aparece

aproximadamente a 1556 cm-1” [38]. Por otro lado, en la Figura 6 se aprecia un pico en

1378.93 cm-1, que corresponde a la deformación simétrica de los grupos CH3; asimismo,

la banda de 1157.65 cm-1 hace referencia al grupo estiramiento C-O-C (éteres) [34].

Finalmente, las bandas a 1071.08 y 1029.07 cm-1 corresponden al grupo estiramiento C-

O, como alcoholes primarios [39].

Figura 6. Espectro FTIR del quitosano producido a partir de la cáscara del camarón.

20

De esta manera, para la determinación del porcentaje de N-acetilación conseguido para

el quitosano, con la correlación lineal expresada en la ecuación (4), se tomó como banda

característica la amida III localizada a 1317.75 cm-1 y como referencia la banda de grupos

metilos a 1378.93 cm-1, y la desacetilación se tomó como la resta del grado de N-

acetilación, expresada en (5).

Grado de N − acetilación (%) = 31.92 (25.1

22.52) − 12.2 = 23.38 %

DD (%) = 100 − 23.38 = 76.62 %

Los valores calculados a partir de las ecuaciones arrojan un porcentaje de desacetilación

del 76.62 % para el quitosano extraído de la cáscara del camarón.

4.2.6 Valoración potenciométrica.

Para corroborar los resultados obtenidos por el método de espectrofotometría infrarroja

(FTIR), se procedió analizar el contenido de grupos amino en la muestra por titulación

potenciométrica. A partir de este ensayo, en la Figura 7 se presenta la curva obtenida del

cambio de pH contra los mililitros de base (NaOH) consumidos. En esta figura se

evidencian los dos puntos de inflexión, que corresponden a 51 y 75 mL respectivamente.

Figura 7. Titulación potenciométrica del quitosano.

0,00

1,00

2,00

3,00

4,00

5,00

6,00

7,00

8,00

9,00

10,00

11,00

12,00

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

pH

V NaOH [ml]

Valoración potenciomética

21

Adicionalmente, En la Tabla 2 se presentan los datos que se necesitan para calcular el GD

(NH2) y utilizando la ecuación (6) se calcula este valor.

Tabla 2. Datos titulación potenciométrica de quitosano.

Titulación potenciométrica

Concentración NaOH (M) 0.1

Peso de la muestra (g) 0.5

Punto de inflexión 1 (mL) 51

Punto de inflexión 2 (mL) 75

Donde,

%𝑁𝐻2 =16.1(51 − 75)

0.5∗ 0.1

%𝑁𝐻2 = 77.28

A partir de este resultado, se evidencia que el quitosano obtenido tiene un GD del 77.28

%, al comparar este valor con el método FTIR, se puede corroborar que el quitosano,

obtenido de la cáscara del camarón, tiene un GD entre 76.62 % y 77.28 %.

Es importante recalcar que, teóricamente se establece que “la quitina con más de un 50

% de desacetilación es considerada quitosano e incluso otros la definen […] ante un GD

superior al 60 %” [40]. A partir de esto, se evidencia que el procedimiento realizado se

hizo de manera correcta, debido a que el material obtenido fue quitosano. Paralelamente,

al comparar este resultado con quitosano comercial y con valores reportados en la

literatura [22], [28], [36], [38] se puede concluir que este biopolímero producido tiene

buena calidad, dado que su GD es cercano al comercial y superior a los que están

reportados en otros estudios.

4.2.7 Microscopio electrónico de barrido (MEB).

Los pasos de desmineralización y desproteinización para la cáscara del camarón causaron

la eliminación del contenido de proteínas y minerales, dando como resultado la extracción

del quitosano; sus imágenes MEB se muestran en la Figura 8 (a, b y c). En la Figura 8b

se observa una estructura lisa - no porosa en la superficie y las estructuras de microfibra

se ven con una apariencia fracturada. En la Figura 8a y 8c, se pueden apreciar patrones

regulares que pueden asociarse a las escamas de la cáscara del camarón. Por otra parte,

retomando los resultados de granulometría láser, se puede comprobar que las partículas

obtenidas no se encuentran en una escala nano, no obstante, se evidencian partículas entre

22

o menores a 50 µm, lo que permite corroborar que la mitad de las partículas obtenidas

tienen un diámetro menor o aproximado a 46.46 µm. De igual forma, es importante

recalcar que las muestras tomadas para granulometría láser y para el microscopio

electrónico de barrido no fueron las mismas, por lo que existen variaciones entre los

resultados obtenidos.

Figura 8. Imágenes de microscopía electrónica de barrido (MEB) de quitosano a partir de la cáscara de

camarón (a)430×, (b)1900× y (c)3500×.

4.3 Crecimiento de Escherichia Coli.

La curva de crecimiento para E. Coli, ATCC 25922, se evidencia en la Figura 9. En esta

figura se observa que para una densidad óptica (OD) de 0.4, a una absorbancia de 600nm,

se necesitan al menos 3 horas para que la bacteria alcance su fase exponencial media.

Figura 9. Curva de crecimiento de Escherichia Coli.

0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Den

sid

ad

Óp

tica

(OD

60

0n

m)

Hora

Curva de crecimiento 1 - E. Coli

A A Aa. c. b.

23

4.4 Estandarización del número de colonias.

El resultado de las diluciones en serie, para un OD600 de 0.4, se presentan en la Tabla 3

y en la Figura 16, que se encuentra en Anexos. Con el objetivo de determinar y

estandarizar el número de colonias en un rango contable, se debe tener en cuenta que estas

deben estar entre 30 y 300 colonias. Lo anterior se debe a que mayor a 300 es incontable

y menos de 30 se reporta el número como conteo estimado.

Tabla 3. Diluciones (t = 0 h) en serie de Escherichia Coli.

Dilución 1

[UFC/mL]

2

[UFC/mL]

Promedio

[UFC/mL]

Inicial Crecimiento

extendido

Crecimiento

extendido -

10-1 Crecimiento

extendido

Crecimiento

extendido -

10-2 Crecimiento

extendido

Crecimiento

extendido -

10-3 Incontable Incontable -

10-4 Incontable Incontable -

10-5 115 111 113

10-6 14 8 11

10-7 0 0 0

Teniendo en cuenta estos resultados, se evidencia que la dilución óptima para someter al

quitosano es 10-5. Dado que se encuentra en un rango contable y las colonias son

significativas. A continuación, utilizando la ecuación (7) se reporta el resultado de cuenta

en placa inicial para una dilución de 10-5.

UFC

mL=

Colonias enumeradas (media)

mL sembrados× Factor de dilución (7)

UFC

mL=

113

1 mL × 105

UFC

mL= 11 × 106

4.5 Prueba de tolerancia.

En la Tabla 5 se pueden observar los resultados de las pruebas de tolerancia, para un

tiempo de 1 y 2 horas en que las bacterias estuvieron expuestas a distintas concentraciones

24

y tamaño del quitosano. Adicionalmente, en la sección de Anexos se pueden observar las

Figuras (cajas Petri) de los ensayos realizados. A continuación, en la Tabla 4 se presentan

los números de las figuras a la que corresponden los resultados reportados en la Tabla 5.

Tabla 4. Numeración de Figuras de los ensayos realizados.

Tiempo Ensayo

Material

(MP: micropartículas;

MO: material original; C+:

control positivo)

Anexo

1 hora

1

MP Figura 19

MO Figura 20

C+ Figura 21

2

MP Figura 22

MO Figura 23

C+ Figura 24

2 horas

3

MP Figura 25

MO Figura 26

C+ Figura 27

4

MP Figura 28

MO Figura 29

C+ Figura 30

Tabla 5. Reporte (UFC/mL) de las bacterias expuestas a 1 h.

Ensayo Concentración Material 1

[UFC/mL]

2

[UFC/mL]

3

[UFC/mL] C-

1

2000 mg/L

MP 1 0 0

OK

MO 5 12 15

C+ 0 0 0

200 mg/L

MP 0 0 0

MO 0 0 0

C+ 0 0 0

20 mg/L

MP 0 0 0

MO 0 0 0

C+ 0 0 0

2 mg/L

MP 0 0 0

MO 0 0 0

C+ 0 0 0

0.2 mg/L

MP 0 0 0

MO 0 0 0

C+ 0 0 0

25

2

2000 mg/L

MP 1 1 0

OK

MO 40 35 IN

C+ 0 0 0

200 mg/L

MP 0 3 0

MO 0 0 0

C+ 0 0 0

20 mg/L

MP 0 0 0

MO 0 0 0

C+ 0 0 0

2 mg/L

MP 0 0 0

MO 0 0 0

C+ 0 0 0

0.2 mg/L

MP 0 0 0

MO 0 0 0

C+ 0 0 0

Tabla 6. Reporte (UFC/mL) de las bacterias expuestas a 2 h.


[UFC/mL]

2

[UFC/mL]

3

[UFC/mL] C-

3

2000 mg/L

MP 5 3 4

OK

MO 126 133 149

C+ 0 0 0

200 mg/L

MP 1 2 0

MO 1 0 0

C+ 0 0 0

20 mg/L

MP 0 0 0

MO 0 0 0

C+ 0 0 0

2 mg/L

MP 0 0 0

MO 0 0 0

C+ 0 0 0

0.2 mg/L

MP 0 0 0

MO 0 0 0

C+ 0 0 0

4

2000 mg/L

MP 10 7 3

OK

MO 33 50 27

C+ 0 0 0

200 mg/L

MP 0 0 0

MO 0 0 0

C+ 0 0 0

20 mg/L MP 0 0 0

MO 1 0 0

26

C+ 0 0 0

2 mg/L

MP 0 0 0

MO 0 0 0

C+ 0 0 0

0.2 mg/L

MP 0 0 0

MO 0 0 0

C+ 0 0 0

Sin embargo, es importante tener en cuenta que para la prueba de tolerancia se utilizó un

factor de dilución de 10-5 y que las bacterias se diluyeron a la mitad. Por esta razón, en la

Tabla 5 y Tabla 6 se reportan las colonias totales. Para calcular esto, se utilizó la siguiente

ecuación (8):

UFC

mL=

Colonias enumeradas

mL sembrados× Factor de dilución × 2 (8)

Tabla 7. Reporte final (UFC/mL) de Escherichia Coli expuesta a quitosano (MP y MO) durante 1 h.


[UFC/mL]

2

[UFC/mL]

3

[UFC/mL] C-

3

2000 mg/L

MP 2.E+05 0 0

OK

MO 1.E+06 2.E+06 3.E+06

C+ 0 0 0

200 mg/L

MP 0 0 0

MO 0 0 0

C+ 0 0 0

20 mg/L

MP 0 0 0

MO 0 0 0

C+ 0 0 0

2 mg/L

MP 0 0 0

MO 0 0 0

C+ 0 0 0

0.2 mg/L

MP 0 0 0

MO 0 0 0

C+ 0 0 0

4

2000 mg/L

MP 2.E+05 2.E+05 0

OK

MO 8.E+06 7.E+06 IN

C+ 0 0 0

200 mg/L

MP 0 6.E+05 0

MO 0 0 0

C+ 0 0 0

20 mg/L MP 0 0 0

27

MO 0 0 0

C+ 0 0 0

2 mg/L

MP 0 0 0

MO 0 0 0

C+ 0 0 0

0.2 mg/L

MP 0 0 0

MO 0 0 0

C+ 0 0 0

Tabla 8. Reporte final (UFC/mL) de Escherichia Coli expuesta a quitosano (MP y MO) durante 2 h.


[UFC/mL]

2

[UFC/mL]

3

[UFC/mL] C-

3

2000 mg/L

MP 1.E+06 6.E+05 8.E+05

OK

MO 3.E+07 3.E+07 3.E+07

C+ 0 0 0

200 mg/L

MP 2.E+05 4.E+05 0

MO 2.E+05 0 0

C+ 0 0 0

20 mg/L

MP 0 0 0

MO 0 0 0

C+ 0 0 0

2 mg/L

MP 0 0 0

MO 0 0 0

C+ 0 0 0

0.2 mg/L

MP 0 0 0

MO 0 0 0

C+ 0 0 0

4

2000 mg/L

MP 2.E+06 1.E+06 6.E+05

OK

MO 7.E+06 1.E+07 5.E+06

C+ 0 0 0

200 mg/L

MP 0 0 0

MO 0 0 0

C+ 0 0 0

20 mg/L

MP 0 0 0

MO 2.E+05 0 0

C+ 0 0 0

2 mg/L

MP 0 0 0

MO 0 0 0

C+ 0 0 0

0.2 mg/L

MP 0 0 0

MO 0 0 0

C+ 0 0 0

28

A partir de estos resultados se puede evidenciar que, para un tiempo de 1 y 2 horas, no se

encontraron colonias para el control positivo (C+) con un factor de dilución de 10-5. Esto

es importante, dado que en el tiempo cero se había estandarizado que aproximadamente

había una concentración de E. Coli de 11 × 106, y en el transcurso que duraron los ensayos

las bacterias disminuyeron en un 100 %. Lo anterior puede atribuirse a que el volumen

que se utilizó fue muy bajo (750 µL) y es posible que, bajo las condiciones a las que se

expuso la bacteria (37 °C a 180 rpm) no fueran las ideales; la velocidad pudo ser muy

alta, generando que estas murieran muy rápido. Adicionalmente, es importante recordar

que las bacterias no se encontraban en un medio de cultivo, dado que se habían lavado

previamente con PBS. En consecuencia, es posible que, al carecer de una fuente de

alimento, la tasa de muerte bacteriana aumentara. Asimismo, al haber utilizado una

dilución de 10-5, es probable que la concentración de E. Coli no fuera lo suficiente para

que los residuos de estas sirvieran como una fuente de alimento para las restantes.

A partir de estos resultados, se repitió este procedimiento (Anexos Figura 15), pero en

este caso, se tomó un volumen de 1 mL de la dilución. Este procedimiento se realizó para

factores de dilución de: 10-1, 10-2, 10-3,10-4 y10-5 (Anexos Figura 17 y Figura 18). En la

Tabla 9 y Tabla 10 se muestran los resultados obtenidos.


Dilución 1

[UFC/mL]

2

[UFC/mL]

Promedio

[UFC/mL]

Inicial Crecimiento

extendido

Crecimiento

extendido -

10-1 Crecimiento

extendido

Crecimiento

extendido -

10-2 Crecimiento

extendido

Crecimiento

extendido -

10-3 33+IN 29+IN -

10-4 4 3 4

10-5 0 0 0


Dilución 1

[UFC/mL]

2

[UFC/mL]

Promedio

[UFC/mL]

Inicial Crecimiento

extendido

Crecimiento

extendido -

29

10-1 Crecimiento

extendido

Crecimiento

extendido -

10-2 Crecimiento

extendido

Crecimiento

extendido -

10-3 3 1 2

10-4 0 0 0

10-5 0 0 0

Dado lo anterior, se evidencia que, al tomar un volumen mayor, las bacterias tienen mejor

resistencia bajo las mismas condiciones utilizadas previamente. No obstante, como se

mencionó anteriormente, un rango contable se encuentra entre 30 y 300 colonias, y en

ningún factor de dilución se obtuvo este resultado. Es por esto que, se plantea que para

tener resultados óptimos, es necesario tomar un mayor volumen de bacterias y utilizar

una velocidad (rpm) menor.

Por otra parte, teniendo en cuenta que el control positivo no tuvo crecimiento de

Escherichia Coli, se esperaba que sucediera lo mismo con las bacterias expuestas al

material de interés, dado que este biopolímero actúa como bactericida (elimina) o como

bacteriostático (inhibe). No obstante, en los resultados reportados en la Tabla 7 y la Tabla

8 se evidencia lo contrario, dado que si hubo crecimiento para las bacterias que fueron

expuestas, durante 1 y 2 horas, a diferentes concentraciones de quitosano (nanopartículas

y material original). Este resultado puede atribuirse a la eficiencia de la actividad

antimicrobiana del quitosano, debido a que este depende de varios factores intrínsecos y

extrínsecos; como el pH, la masa molecular, la solubilidad, la concentración, el grado de

desacetilación, el tiempo, entre otros. Respecto a la masa molecular, en la literatura se ha

reportado que el quitosano debe estar entre 4.6 - 100 kDa para que exista un efecto

antimicrobiano. Lo anterior se debe a que, cuando la masa molar es menor, la actividad

antimicrobiana no es percibida y cuando es mayor hay pérdida de solubilidad, por lo que

el quitosano no puede pasar a través de la membrana microbiana y, por lo tanto, tiende

acumularse en la superficie celular [41], [42]. Li et al. [43] evaluaron la capacidad de

inhibición del quitosano en E. Coli a 3, 50 y 1000 kDa. Sus resultados demostraron que

el quitosano de 50 kDa mostró la actividad inhibidora más efectiva. A partir de esto, se

debe tener en cuenta que, al no haber medido este factor, es posible que el quitosano no

estuviera dentro del rango óptimo para tener actividad antimicrobiana y como efecto, no

se puede garantizar la eficiencia de la actividad antimicrobiana del quitosano.

30

Por otra parte, también se debe tener en cuenta el grado de desacetilación, que “está dado

entre 0 y 100 %, donde un mayor GD está asociado con una mayor solubilidad y densidad

de carga protónica” [42], lo que significa que el efecto antimicrobiano es más fuerte a

mayor GD. Takahashi et al. [44] evaluaron el efecto del quitosano en Escherichia Coli,

utilizando diferentes grados de desacetilación (75.5 %, 79.7 %, 83.9 %, 88.0 %, 90.1 %

y 92.2 %). Los autores concluyeron que a mayor GD la membrana de quitosano inhibía

suficientemente el crecimiento bacteriano. A partir de esto, si bien el GD del quitosano,

que se obtuvo en el presente trabajo, está alrededor de 77 %, la eficiencia no es lo

suficiente alta; haciendo que la actividad antimicrobiana de este biopolímero

disminuyera.

De lo contario, la actividad antimicrobiana del quitosano se ve inversamente afectada por

el pH, dado que esta se consigue cuando este biopolímero está en un medio ácido [42].

Lo anterior se explica debido a que con un pH < 6.3, el quitosano puede interactuar con

las membranas de células microbianas (cargadas negativamente), generando que el

intercambio de nutrientes de las células disminuyan rápidamente [12], [41]. Teniendo en

cuenta la metodología realizada para la obtención del quitosano, se debe recordar que se

utilizó un pH neutro, por lo que este factor pudo ser otro determinante en la eficiencia del

material, respecto a su actividad antimicrobiana.

A partir de los factores intrínsecos y extrínsecos descritos anteriormente, se puede

evidenciar que las características propias del quitosano influyen directamente en su

actividad antimicrobiana; por esto, es importante tener en la calidad de factores

intrínsecos y de los factores ambientales en los que está expuesto el material.

Paralelamente, es importante mencionar que esta actividad también está influenciada por

el tipo de microorganismo utilizado y la fase de desarrollo en la que se exponga. Tsui-

ChuYang et al. [45] reportaron que células de E. Coli en la fase exponencial media tienen

mayor susceptibilidad al interactuar con quitosano, en comparación a cuando se

encuentran en la fase estacionaria. Por esta razón, se debe recalcar que los resultados

obtenidos no se atribuyen a la edad de la célula, dado que, como se mencionó en la sección

de materiales y métodos (crecimiento bacteriano), para el presente trabajo se utilizó una

fase exponencial media (OD de 0.4).

31

Adicionalmente, es posible que la concentración de quitosano utilizada fuera otro de los

factores que pudieron incidir sobre los resultados. Lo anterior se puede explicar debido a

que a bajas concentraciones, el quitosano, cuya estructura tiene un número de cargas

positivas (por la presencia de grupos amino) [12], puede unirse a la superficie de las

células (cargadas negativamente), y como consecuencia, perturbar su membrana celular

e interferir con el intercambio de nutrientes; lo que puede causar la muerte de la bacteria

[41]. Sin embargo, en concentraciones altas, el quitosano se protona y por ende, puede

cubrir la superficie celular y evitar la fuga de componentes intracelulares [41]. De esta

manera, para las concentraciones de 20 mg/L, 2 mg/L y 0.2 mg/L no hubo crecimiento de

E. Coli, mientras que en las concentraciones mayores (2000 mg/L y 200 mg/L) el

quitosano pudo cubrir la superficie de las bacterias, permitiendo que estas no murieran.

Asimismo, se podría aludir este resultado a que Escherichia Coli tiene un agente

enzimático con capacidad de degradar el quitosano y transformarlo, por desaminación, a

carbohidratos; dado que este biopolímero es un exoesqueleto formado por la

polimerización de unidades acetiladas y no de glucosamina. Así, las bacterias podrían

haber usado el quitosano como combustible, es decir como alimento.

Finalmente, respecto al tamaño del material utilizado, se puede observar en los resultados

que no hay gran variación entre las micropartículas y el material original. Lo anterior se

debe a que las partículas que tienen un tamaño alrededor de 50 nm son las que mejor

absorben células [46] y como se describió anteriormente, se obtuvieron tamaños mucho

mayor a esto (escala macro), por lo que su eficiencia antimicrobiana no fue considerable.

No obstante, en la Tabla 8 se puede evidenciar que para el ensayo 3, con una

concentración de 2000 mg/L, había más colonias cuando se utilizó el quitosano molido

por la licuadora. Esto puede atribuirse a que el MO tenía mayor área superficial, de tal

forma que pudo ser una fuente de alimento más amplia en comparación a las MP.

Teniendo en cuenta los resultados obtenidos, no se puede estimar una eficiencia de

inactivación, debido a que el quitosano producido a partir de la cáscara del camarón no

tuvo características antimicrobianas; sino que aparenta haber actuado como un

estimulador del crecimiento y de supervivencia bacteriana.

32

5. Conclusiones.

El quitosano se produjo a partir de la cáscara del camarón, la cual pasó por un tratamiento

con solución de NaOH para la desproteinización, seguido de un tratamiento con HCl para

la desmineralización. Después, para despigmentar la cáscara se utilizó NaOCl y usando

el método de desacetilación, el quitosano se sintetizó con NaOH a partir de la quitina, la

cual se obtuvo a partir de los tratamientos anteriores. El quitosano obtenido se pasó por

una licuadora y por un molino planetario de bolas, con el objetivo de disminuir su tamaño.

Una vez se realizaron estos procedimientos, las muestras obtenidas se caracterizaron. El

tamaño obtenido no fue el esperado, dado que se obtuvieron micropartículas y no

nanopartículas (> 100 nm). El grado de desacetilación calculado por el método FTIR y

por titulación potenciométrica del quitosano fue del 76.62 % y 77.28 % respectivamente.

Adicionalmente, se demostró que revertir la secuencia de pasos entre la desmineralización

y la desproteinización tiene un efecto pronunciado en la caracterización del quitosano.

A partir de lo anterior, se comprobó que este biopolímero tiene características del

quitosano comercial, es decir, de buena calidad. Sin embargo, se debe tener en cuenta

que, para aplicaciones como la actividad antimicrobiana, se necesita garantizar otros

factores intrínsecos y ambientales, para avalar la eficiencia de este material. De esta

manera, al someter la bacteria, Escherichia Coli, en quitosano no se obtuvieron los

resultados esperados. Si bien hay variación entre el material original y las micropartículas,

aludido a la diferencia de tamaño, si existe una tendencia a que a mayor concentración

del biopolímero hay mayor Unidades Formadoras de Colonias. Lo anterior puede

explicarse en que, para concentraciones altas, el quitosano se protona y, por ende, puede

cubrir la superficie celular, evitando la fuga de componentes intracelulares. También, se

puede aludir este resultado que las bacterias pudieron utilizar el quitosano como una

fuente de alimento. Lo anterior sería posible por medio de un agente enzimático de la

bacteria, que tiene la capacidad de degradar el quitosano y transformarlo, por

desaminación, a carbohidratos.

Es importante recalcar que si bien se quiere comprobar que el quitosano, bajo condiciones

no ideales, actúa como estimulador del crecimiento y de supervivencia bacteriana, es

necesario aumentar las concentraciones utilizadas, para verificar que si existe una

tendencia entre concentración y número de colonias que están por encima del control

positivo. De igual forma, se debe estudiar la estructura de E. Coli, con un ATCC de 25922,

33

con el fin de determinar si existe algún mecanismo de acción (enzima) que le permita

utilizar el quitosano como una fuente de energía.

De esta manera, para obtener resultados acordes a lo esperado o para corroborar lo

obtenido, se recomienda realizar más ciclos en el molino planetario de bolas, con el

objetivo de alcanzar el tamaño de una nanopartícula (< 100 nm). Respecto a los factores

intrínsecos del material, como el peso molecular, solubilidad, grado de desacetilación,

densidad de carga positiva y capacidad quelante, es necesario garantizar que estos se

encuentren dentro de los rangos óptimos para que exista actividad antimicrobiana. De

esta manera, los resultados podrían ser confiables para medir la capacidad inhibidora del

material. Asimismo, en la metodología, para las pruebas de tolerancia, se recomienda que

el volumen de bacterias y de quitosano sea 2:1 respectivamente. Adicionalmente, se

recomienda exponer la concentración inicial de bacterias al quitosano y después hacer las

diluciones, dado que las colonias presentes en la concentración inicial son mayores y se

evitan que estas mueran en su totalidad, por factores naturales, durante los ensayos.

Dado lo anterior, es necesario corroborar este experimento a partir de las variaciones en

la metodología utilizada. Debido a que está comprobado que el quitosano es un

biopolímero, al cual se le pueden hacer cambios en su estructura molecular y por ende

existen variedades de aplicaciones; entre estas el tratamiento de aguas. Donde el

quitosano podría ser una alternativa natural de bajo costo y amigable con el medio

ambiente. Además, con una buena implementación de esta metodología, se podría

garantizar la disponibilidad y la gestión sostenible del agua y el saneamiento para todos,

uno de los Objetivos de Desarrollo Sostenible (ODS). Así, aunque suene inalcanzable, la

implementación de nanopartículas (alcanzando el tamaño) a partir de la cáscara del

camarón, podrían disminuir la escasez de agua, la cantidad de personas que son afectadas

al consumir de una fuente de agua contaminada por restos fecales y como un gran desafío,

disminuir la tasa de mortalidad en niños menores de 5 años.

https://uniandes.sharepoint.com/sites/ACAMBU/Documentos%20compartidos/General/Entrega%201/Cronograma%20entrega%201.xlsx?web=1

34

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39

7. Anexos.

Figura 10. Proceso para la extracción de quitosano a partir de cáscara de camarón.

40

Figura 11. Siembra y cultivo de Escherichia Coli.

Figura 12. Comprobación OD de Escherichia Coli.

41

Figura 13. Centrifugado de la muestra.

Figura 14. Diluciones.

42

Figura 15. Estandarización de colonias para 1 y 2 horas.

Concentración inicial. Dilución 10-3

Dilución 10-4 Dilución 10-5


Figura 16. Diluciones en serie (t = 0 h).

43

Concentración inicial Dilución 10-1




Concentración inicial Dilución 10-1


44



2000 mg/L 200 mg/L

20 mg/L 2 mg/L

0.2 mg/L

Figura 19. Ensayo 1 - Micropartículas (t = 1 h).

2000 mg/L 200 mg/L

45

20 mg/L 2 mg/L

0.2 mg/L

Figura 20. Ensayo 1 - Material original (t = 1 h).

Dilución 10-5

Figura 21. Ensayo 1 - Dilución 10-5 (t = 1 h).

2000 mg/L 200 mg/L

20 mg/L 2 mg/L

46

0.2 mg/L


2000 mg/L 200 mg/L

20 mg/L 2 mg/L

0.2 mg/L


Dilución 10-5


47

2000 mg/L 200 mg/L

20 mg/L 2 mg/L

0.2 mg/L


2000 mg/L 200 mg/L

20 mg/L 2 mg/L

48

0.2 mg/L


Dilución 10-5


2000 mg/L 200 mg/L

20 mg/L 2 mg/L

0.2 mg/L


49

2000 mg/L 200 mg/L

20 mg/L 2 mg/L

0.2 mg/L


Dilución 10-5


producción de nanopartículas a partir de la cáscara del

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