presentación de powerpoint · nueva electroquÍmica de los Ácidos nucleicos fosfato 0,1 m ph...

DETECCIDETECCIÓÓN N ELECTROCATALELECTROCATALÍÍTICATICA DEDEADN ADN SOBRE ELECTRODOS DE SOBRE ELECTRODOS DE

GRAFITOGRAFITO AMPLIFICADA AMPLIFICADA EN EN PRESENCIA DE IONES CALCIOPRESENCIA DE IONES CALCIO

P. de los Santos Álvarez, N. de los Santos Álvarez, M. J. Lobo Castañón, A. J. Miranda Ordieres, P. Tuñón Blanco

Departamento de Química Física y AnalíticaUniversidad de Oviedo

2

ÁCIDOS NUCLEICOSÁCIDOS NUCLEICOS

Estructura de doble héliceEstructura de doble héliceWatsonWatson y y Crick

Secuenciación genomasSecuenciación genomasCrick

Campos de aplicaciónCampos de aplicación

Demanda de nuevos métodos de análisis más

sensibles, sencillos y baratos

• Diagnóstico y pronóstico médico

• Tecnología alimentaria

• Ciencias medioambientales

• Ciencia y tecnología farmacéutica

• Ciencia forense

enfermedades infecciosas o hereditarias, histocompatibilidad, mutaciones

control de calidad, OGM, control de procesos biotecnológicos

control contaminación biológica

nuevas drogas, control de procesos de fabricación

• Paleontología molecular

3

DETECCIÓN ELECTROQUÍMICA DE ÁCIDOS NUCLEICOSDETECCIÓN ELECTROQUÍMICA DE ÁCIDOS NUCLEICOS

Ventajas:Ventajas:

•• Instrumentación sencilla Instrumentación sencilla (se obtiene s(se obtiene señaleñal eléctrica directamente)eléctrica directamente)

•• Independencia de la turbiedadIndependencia de la turbiedad•• Bajo costeBajo coste•• MiniaturizaciónMiniaturización

•• Baja demanda energéticaBaja demanda energética

Métodos basados en la electroactividad:Métodos basados en la electroactividad:

•• No requiere marcasNo requiere marcas•• SencillezSencillez•• RapidezRapidez

4

ELECTROACTIVIDAD DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOSELECTROACTIVIDAD DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS

Oxidación Oxidación electrocatalíticaelectrocatalítica•• AzúcaresAzúcares electrodos de Cu

•• BasesBases

electrodos de Hgelectrodos de Hg

Reducción: A, G y CReducción: A, G y C

Oxidación A, G, (C y T)Oxidación A, G, (C y T)

Formación anódica sales Hg Formación anódica sales Hg insolublesinsolubles

A, G, C y TA, G, C y T

electrodos sólidoselectrodos sólidos((C,C, PtPt, , AuAu))

5

NUEVA ELECTROQUÍMICA DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS NUEVA ELECTROQUÍMICA DE LOS ÁCIDOS NUCLEICOS

Fosfato 0,1 M pH 12

-0,5 0 0,5 1,0

0

50

100

150

E / V

I /

µA

N

N NR

N

NH2

N

N NR

N

NH2

N

N NR

N

NH2

HO HO

O H

I II

H2 O H2O

-2e- -2H+ -2e- -2 H+ N

NH

NR

HN

NH2

OO

III

N

NH

NR

HN

NH2

N

N NR

N

NH2

O

O O

O

III IV

-2e- -2H+

700 ng (dA)20

La especie responsable La especie responsable catalizacatalizala oxidación de NADHla oxidación de NADH

CaCa2+2+ potencia la catálisispotencia la catálisis

10 ng (dA)20

Tris-HCl 0,1 M pH 9

-0,2 0 0,2 0,4 0,6

-0.5

0

0.5

1.0

E / V

I /

µA

Sin Ca2+

Con Ca2+

P. de-los-Santos-Álvarez, M.J. Lobo-Castañón, A.J. Miranda-Ordieres, P. Tuñón-Blanco, Analytical Chemistry, 74, 2002, 3342

6

DETECCIÓN VOLTAMPEROMÉTRICA DE ÁCIDOS NUCLEICOSDETECCIÓN VOLTAMPEROMÉTRICA DE ÁCIDOS NUCLEICOS

Elevado potenciaElevado potenciallIrreversibleIrreversible

Bajo potencialBajo potencial

ReversibleReversible

Fuerte adsorciónFuerte adsorción

VentajasVentajas::

SensibilidadSensibilidad

DetectabilidadDetectabilidad

Fosfato 0,1 M pH 12; v=0,05 V/s

-0,5 0 0,5 1,0

0

50

100

150

E / V

I /

µA

SelectividadSelectividad

Separación etapas Separación etapas oxidación y detecciónoxidación y detección

7

PROCEDIMIENTO

0,20-0,2 0,4 0,6-4

-2

0

2

4

E / V

I /

µA

DEPOSICIÓNDEPOSICIÓN10 µL

disolución de oligonucleótido

EVAPORACIÓNEVAPORACIÓNa sequedad

0,20-0,2 0,4 0,6

-4

-2

0

2

4

E / V

I /

µA

REGENERACIÓNREGENERACIÓNpulido lija de agua;ultrasonidos 2 min

8

DeposiciónDeposición--evaporaciónevaporación

Preconcentración 45 minutosPreconcentración 45 minutos

-0,2 0 0,2 0,4 0,6

-2

0

2

E / V

I /

µA

4

9

PROCEDIMIENTO

REGENERACIÓNREGENERACIÓNpulido lija de agua;ultrasonidos 2 min

DEPOSICIÓNDEPOSICIÓN10 µL

disolución de oligonucleótido

EVAPORACIÓNEVAPORACIÓNa sequedad

0,20-0,2 0,4 0,6-4

-2

0

2

4

E / V

I /

µA

E=-0,4 V; t= 30 s; 400 r.p.m.

OXIDACIÓNOXIDACIÓNFosfato 0,1 M, pH 12

Acondicionamiento:Acondicionamiento:

Oxidación:Oxidación:E inicial:-0,45 V

E pulso: +1,1 V; t= 5 sE final: -0,45 V

IR A

MEDIDASMEDIDAS

IR A

Fosfato 0,1 M, pH 7Fosfato 0,1 M, pH 7

10

DETECCIÓN NO CATALÍTICA DE ÁCIDOS NUCLEICOS

DPVDPV 2,12,1·10·10--77 110110 0,990,999393 99 2 2 -- 100100 22SWVSWV --2·102·10--66 29329300 0,990,999292 66 2 2 -- 4040 1,91,9a.c.Va.c.V --5·105·10--77 330330 0,990,9999 55 22 -- 2020 1,91,9

CCVV 22·10·10--88 4040 0,990,999191 99 2 2 -- 8080 22

(dA)(dA)2020

DPVDPV --1,0·101,0·10--77 1414,2,2 0,90,99191 66 1010 -- 200200 1010

SWSWVV --9·109·10--77 484822 0,90,9995995 55 1010 -- 100100 1010VIHVIH--BBa.c.a.c.VV --3·103·10--88 3232,6,6 0,90,9992992 55 1010 -- 100100 1010

DPVDPV --5·105·10--88 1515,8,8 0,90,9992992 77 1010 -- 120120 1010

SWSWVV --4·104·10--77 686800 0,90,99898 55 1010 -- 100100 1010CTCT--AAa.c.a.c.VV --2·102·10--66 7272 0,90,9996996 44 2020 -- 100100 2020

Secuencias de bases:Secuencias de bases:

Virus del SIDA (VIH-B): 5’-ATG TGG AAA ATC TCT AGC AGT-3’C.Trachomatis (CT-A): 5’-CAC AGG CAG AGC TTG CAA GGA-3’

Secuencias aleatorias

(1): ordenada en el origen en Culombios (CV) y en Amperios (resto de técnicas) (2): sensibilidad en C/(g/L) (CV) y en A/(g/L) (resto de técnicas)

TécTécnicanica aa(1)(1) bb(2)(2) rr nn II.D.L..D.L. / / ngng L.D. /L.D. / ngng

11

DETECCIÓN BASADA EN LA HIBRIDACIÓNDETECCIÓN BASADA EN LA HIBRIDACIÓN

REGENERACIÓNREGENERACIÓN

DEPOSICIÓNDEPOSICIÓN

EVAPORACIÓNEVAPORACIÓN

OXIDACIÓNOXIDACIÓN

MEDIDASMEDIDAS

HIBRIDACIÓNHIBRIDACIÓN

0 50 100 150 200

ng (dT)20

0

4

8

12

I /

µA

I (A) = 1,21·10-5 - 43 [g (dT)20]r = 0,9992; n = 5

Sonda: 100 ng (dA)20

Hibridación en disolución

100

ng CT-B

0

1

2

0

I /

µA

50 150

I (A) = 1,22·10-6 - 5,6 [g CT-B] r = 0,996; n= 5

sonda: 120 ng (CT-A)-0.2 0 0.2 0.4 0.6

0

2

4

6

8

10

E / V

I /

µA

dA20

Señal de la hebra simple

dA20-dT20

Señal tras la hibridación

12

DETECCIÓN BASADA EN LA HIBRIDACIÓNDETECCIÓN BASADA EN LA HIBRIDACIÓN

Hibridación en superficie


MEDIDAMEDIDA


DEPOSICIÓNDEPOSICIÓNSONDASONDA


(dA)(dA)2020 o o (dT)(dT)2020

HIBRIDACIÓNHIBRIDACIÓN30 min, 30 min, TTambamb

(dA)(dA)2020

00

1010

2020

3030

4040

00 2525 5050 7575 100100ng oligonucleótidong oligonucleótido

I /

µA

I /

µA

DPVDPV

(dT)(dT)2020

13

DETECCIÓN CATALÍTICA AMPLIFICADA POR IONES CaDETECCIÓN CATALÍTICA AMPLIFICADA POR IONES Ca2+2+

AmperometríaEapl=+0,08 VTris-HCl 0,1 M; pH 9CaCl2 0,02 M10-4 M NADH

(0,20 ± 0,05) ng = 33 fmol= 3.3 nM

-0,2 0 0,2 0,4 0,6-0.5

0

0.5

1.0

E / V

I /

µA

2 ng = 330 fmol= 33 nM

2 – 1000,9993 9 15.8 %2,1·10-7 110

Método no catalítico voltamperométrico

5 %0,25 – 2,50,999 61,58·10-7 467

aa bb rr nn II.D.L..D.L. / / ngng L.D. /L.D. / ngng d.e.r.

(dA)20


DEPOSICIÓNDEPOSICIÓN



MEDIDAMEDIDA

-0,2 0 0,2 0,4 0,6-0.5

0

0.5

1.0

E / V

I /

µA

14

OTRAS POSIBLES APLICACIONES DE LA METODOLOGÍA

E / V

I/ µA

+

+

Ensayos de hibridaciónEstudios estructurales

Detección de ADN

Detección de ADN dañadoMecanismo de interacción

AAADN-Detección de

e -

Cambios en el comportamiento electroquímico de los ácidos nucleicos

15

AGRADECIMIENTOS

Universidad de Oviedo Proyecto: PBProyecto: PB--EXP01EXP01--2828

• Prof. Paulino Tuñón Blanco• Dr. Arturo J. Miranda Ordieres• Dra. María Jesús Lobo Castañón• Miembros del grupo de Electroanálisis de la Universidad de Oviedo

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