Producción de compuestos antifúngicos volátiles por la levadura biocontroladora Candida sake 41E aislada de muestras antárticas.

Arrarte, Eloísa1; Garmendia, Gabriela1; Rossini, Carmen2; Vero, Silvana1

1 – Cátedra de Microbiología, 2 –Ecología Química, DEPBIO, Facultad de Química, Universidad de la República

Agradecimientos Referencias BibliográficasAdams, R. P. 2007. Identification of essential oil components by Gas Chromatography/Mass Spectrometry. Allured Publishing Corporation, Carol Stream, Illinois. ShimadzuHernández-Montiel, l.G.; Ochoa, j.L.; Troyo-Diéguez, e.; Larralde-Corona, C.P. (2010) Biocontrol of postharvest blue mold (Penicillium italicum Wehmer) on Mexican lime by marine and citrus Debaryomyces hanseniiisolates. Postharvest Biology and Technology, v.56, p.181-187.Huang, R., Li, G.Q., Zhang, L., Che, H. J., Jiang, D. H., Huang, H. C. (2011) Control of postharvest botrytis fruit rot of strawberry by volatile organic compounds of Candida intermedia. Phytopathology, 101(7), 859-869.Nunes, C., Usall, J., Teixid, N., Mir, M. (2001) Nutritional enhancement of biocontrol activity of Candida sake (CPA-1) against Penicillium expansum on apples and pears. European Journal of Plant Pathology, 107, 543-551.Rosa, M., Tauk-Tornisielo, S. M., Rampazzo, P. E., Ceccato-Antonini, S.R.. (2010) Evaluation of the biological control by the yeast Torulaspora globosa against Colletotrichum sublineolum in sorghum. World Journal of Microbiology and Biotechnology, v. 26,p.1491–1502.

Referencias Bibliográficas

INTRODUCCIÓN

Durante el almacenamiento poscosecha prolongado de frutas se han empleado tradicionalmentelas bajas temperaturas y la aplicación de fungicidas químicos con el fin de evitar el desarrollo deenfermedades. En la búsqueda de una alternativa a los productos químicos sintéticos es que surge elCONTROL BIOLÓGICO.

1

METODOLOGÍA

De los muestreos de agua y suelo realizados en la Antártida, se lograron seleccionar 36 levaduras con buena capacidad biocontroladora. Alevaluar el modo de acción por el cual las levaduras ejercían su actividad biocontroladora, una única cepa fue capaz de producir compuestosvolátiles que inhibían el crecimiento de P. expansum. Esta levadura codificada como 41E fue identificada como Candida sake.

Inhibición del crecimiento por compuestos orgánicos volátilesLos ensayos se realizaron según Rosa et. al (2010). Las bases de dos placasde Agar Jugo de Manzana (Hernández-Montiel et. al 2010), unaconteniendo a la levadura y la otra al hongo se unen por sus bases y sesellan con parafilm (Fig. 1). Las placas se incuban a 25 ⁰C durante 3 días yluego se mide el diámetro de crecimiento del hongo. Se realiza un controlúnicamente con el patógeno.

Cultivo de interés: Manzana Red Delicious almacenada a bajas temperaturas (0-1 oC) durante períodos mayores a 3 meses.Patógeno de interés: Penicillium expansum, responsable de la podredumbre azul.Microorganismo antagonista: levaduras adaptadas al frío provenientes de la Antártida.

OBJETIVOS2GENERAL: seleccionar levaduras provenientes de la Antártida capaces decontrolar el desarrollo de P. expansum en manzanas Red Delicious.

ESPECÍFICOS: identificar los compuestos volátiles producidos por Candida sake41E involucrados en la inhibición de P. expansum.

Isla Rey JorgeAntártida

Aislamiento de levaduras

Ensayos de control biológico contra

P. expansum

Mecanismos de acción por producción de:- Sideróforos- Quitinasas- Biofilm- Compuestos antifúngicos solubles- COMPUESTOS ANTIFÚNGICOS VOLÁTILES

Crecimiento en jugo de manzana 0 oC, Crecimiento a 37 oC, producción de pectinasas

4 RESULTADOSEn la Figura 2 se observa la inhibición del crecimiento de P.expansum debido a los compuestos antifúngicos producidospor C. sake.El porcentaje de inhibición fue de 60 ± 2 (con N=4) conrespecto al control. Esta inhibición se observó a partir de las48 h de incubación y se mantuvo hasta el descarte del ensayo(1 mes).

Figura 2.

Inhibición del crecimiento de P.

Expansum en presencia de C. sake

Control: crecimiento de P.

Expansum en ausencia de C. sake

Candida sake ha sido reportada anteriormente como controladora biológica (Nunes et. al2001), sin embargo no hay información acerca de la producción de compuestos volátiles.

Hasta el momento se lograron identificar tentativamente 11 compuestos volátilesproducidos por C. sake 41E, siendo algunos de ellos reportados anteriormente para Candidaintermedia (Huang et. al 2011).

La identificación definitiva se realizará mediante la comparación con estándares adquiridos osintetizados.A su vez, con estos estándares se realizarán ensayos de inhibición de P.expansum, para estudiar dosis –respuesta y posibles efectos sinérgicos.

El descubrimiento de sustancias antifúngicas volátiles que no dañen la fruta y cuyo uso norepresente un riesgo para el consumidor plantearía la posibilidad de utilizar nuevasestrategias de control durante el almacenamiento poscosecha.

5DISCUSIÓN Y PERSPECTIVAS

Figura 3. Cromatogramas obtenidos por cromatografía gaseosa.

La Fig.3 representa los cromatogramas obtenidos para los 4 ensayos realizados, a partir de esta se puedeconcluir:• El ensayo realizado únicamente con el AJM permite detectar los compuestos volátiles aportados por el

medio de cultivo, los cuales estarán presentes en todos los cromatogramas.• No se detectaron compuestos volátiles producidos por P. expansum en las condiciones del ensayo, lo

cual podría sugerir que la liberación de compuestos antifúngicos volátiles por parte de la levadura esindependiente de la presencia del hongo.

• Los cromatogramas para C. sake en presencia y en ausencia de P. expansum son similares, lo querefuerza la hipótesis anterior.

La identificación de dichos compuestosse realizó mediante la comparación delos índices aritméticos de retención (IR)y los espectros de masas de loscompuestos producidos por Candidasake 41E con la información reportadaen las bases de datos de NIST (NationalInstitute of Standards and Technology)y Adams (2007). Los compuestosidentificados se muestran en la Tabla 1.

Identificación de los compuestos

Se empleó un GCMS Shimadzu (QP2010 Plus) equipado con una columna DB-5MS, en modo splitlesscon una temperatura de inyección de 250 ⁰C. Se utilizó He como gas portador (1 mL/min) con unatemperatura programada de 40 oC (1 min) a 5 oC/min, 270 oC (1,3 min) a 15 oC/min. Los espectros demasas se obtuvieron por impacto de electrones (70 eV), en modo scan de 50 a 550 m/z.

Extracción de compuestos orgánicos volátiles con fibras SPME

Una fibra para microextracción en fase sólida (SPME) de polidimetilsiloxano (100μm, Supelco) fueinsertada entre las placas del ensayo de volátiles (Fig. 1). El muestreo se realizó durante 40 min a 25 ⁰C,realizándose el análisis posterior por cromatografía de gases acoplado a espectrometría de masas(GCMS).

TR (min)a IRb FórmulaQuímica

Posible compuesto AR (%)c PMd

10,153 1001 C8H16O2 Etil hexanoato 3,45 144

13,304 1108 C10H20O2 3-metil-butil pentanoato 29,05 172

13,575 1117 C8H10O Fenil-etil alcohol 2,09 122

14,640 1153 C10H20O2 2-metil-propil hexanoato 11,16 172

16,878 1231 C10H20O 3,7-Dimetil-6-octen-1-ol 1,16 156

17,464 1252 C11H22O2 3-metil-butil hexanoato 37,08 186

17,547 1256 C11H22O2 Pentil hexanoato 9,68 186

17,704 1261 C10H12O6 2-Fenil-etil acetato 0,47 228

18,894 1305 C11H20O2 3-metil-butil ciclopentan-carboxilato 1,24 184

20,270 1356 C13H24O2 3,7-Dimetil-6-octenil propionato 3,80 212

22,660 1449 C13H26O2 3-metil-butil octanoato 0,82 214a Tiempo de retención en el cromatógrafo de gases b Índice aritmético de retenciónc Área de pico relativa a los 11 compuestos identificados (%) d Peso molecular

Tabla 1. Compuestos orgánicos volátiles producidos por Candida sake 41E.

De acuerdo a la Figura 3 se observa que C. sake produce una serie de compuestos orgánicos volátilesque difieren de los aportados por el medio AJM, los cuáles se detectan en su mayoría a tiempos deretención entre 13 y 19 min (IR 1001 a 1449)

Se lograron identificar tentativamente 11 compuestos, siendo estos mayormente esteres de ácidos decadena corta. Entre los de mayor abundancia se encuentran el 3-metil-butil hexanoato (37,08%), 3-metil-butil pentanoato (29,05%), 2-metil-propil hexanoato (11,16%) y el pentil hexanoato (9,68%)

3

Volátiles producidos por C. Sake en presencia de P. Expansum

Volátiles producidos por C. Sake

Volátiles producidos por P. expansum

Volátiles aportados por el medio AJM

AJM

AJM

AJM

P. expansum

C. sake

AJM

C. sake

P. expansum

18.0 18.517.517.016.516.015.515.014.514.013.513.0 19.0

1.50

1.25

1.00

0.75

0.50

0.25

1.50

1.25

1.00

0.75

0.50

0.25

1.75

2.00

2.25

2.50

2.75

3.00

3.25

25.022.520.017.515.012.510.0

(x1,000,000)

(x1,000,000)

Figura 1. Ensayo de producción de compuestos antifúngicos volátiles.

ParafilmPenicillium expansum

(disco de micelio no esporulado)

Candida sake 41E

Fibra para SPME

72 levaduras 36 levaduras 36 levaduras