preinforme1-grupo-b3-

8/16/2019 Preinforme1-Grupo-B3-

1/40

LAB. ING. DE BIOPROCESOS - PRE INFORME 01

P á g i n a 1

FACULTAD DE INGENIERIA

ESCUELA ACADEMICO PROFESIONALDE INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

TITULO:

“INGENIERIA DEL CULTIVO CELULAR

POR LOTES”

PROFESOR:

AUGUSTO CASTILLO CALDERON

GRUPO:

B-3

CURSO:

LABORATORIO DE BIOPROCESOS

ALUMNOS:

ESCOBEDO FLORES ALEX JESUS GUTIERREZ DIANA

LOPEZ ZAMORA MARILEYLA MORALES CHORRES DIANA VALVERDE LOPEZ EDINSON

NVO CHIMBOTE, ABRIL 2016


2/40


P á g i n a 2


3/40


P á g i n a 3


4/40


P á g i n a 4

DESARROLLO DEL INOCULO Y CULTIVO CELULAR POR

LOTE DE PICHIA STIPITIS NRRL Y-7124, UTILIZANDO

XILOSA Y GLUCOSA COMO FUENTE DE CARBONO

I. OBJETIVOS:

1.1. Objetivos Generales:

Diseñar y realizar una experiencia de cultivo celular por lotes en

matraces empleando una cepa de Pichia stipitis NRRL Y – 7124,

evaluándose el efecto de la fuente de carbono y la velocidad deagitación en la cinética de crecimiento y la producción de etanol.

Determinación de los parámetros cinéticos de la cepa Pichia

stipitis NRRL Y – 7124.

1.2. Objetivos Específicos:

Diseñar el medio líquido de cultivo.

Activación celular y desarrollo del inóculo

Determinar la cinética de crecimiento de la biomasa.

Determinar de la cinética de consumo de la fuente de carbono.

Determinar la cinética de generación de Etanol.

Determinación del M

ys

k ; los rendimientos del nutriente limitante

en células y en etanol además de las respectivas productividades

en células y en etanol.

Evaluar el valor del pH durante la cinética.

II. METODOLOGIA EXPERIMENTAL:

2.1. DISEÑO DE MEDIOS DE CULTIVO

Para la formulación del diseño de cultivo se tiene en cuenta los siguientes

requerimientos nutricionales para el cultivo de Pichia stipitis NRRL Y – 7124.


5/40


P á g i n a 5

2.1.1. Para el Diseño del medio de cultivo.

Macronutrientes : C, N, Mg, S, K y P

Micronutrientes : Ca, Cl, Zn, Co, BpH : 4.5

Estado : Medio líquido

Volumen del medio: 30 – 40 % del volumen del fermentador

Requerimientos nutricionales: Para ello utilizamos un Medio de

cultivo mínimo.

Fuente de carbono y energía : Xilosa + 1.5 gr glucosaFuente de N : Sulfato de amonio

Fuente de Mg y S : Sulfato de magnesio

heptahidratado

Fuente de K : Fosfato diácido de potasio

Fuente de P : Fosfato diácido de potasio

Medio líquido de Mantención: Se calcularon los compuestos para

el medio

Tabla 01: Concentración de nutrientes para el medio de mantención.

Medio Activación:

Nutriente Concentración (gr/l)

Xilosa + glucosa 10

Extracto de levadura 3

Extracto de malta 5

Solución de sales 5 ml /l

Nutriente Concentración (gr/l)


Peptona 5

Extracto de malta 3

Agar 20


6/40


P á g i n a 6

Tabla 02: Concentración de nutrientes para el medio de activación. T: 30ºC y N: 150 rpm

Medio Fermentación:

Nutriente concentración (grs/L)

Xilosa + glucosa 14,0


(NH4)2PO4 3

KH2PO4 2

MgSO4.7H2O 1,1

Solución de sales 5 ml/LTampón citrato

pH 4,5

Tabla 03: Concentración de nutrientes para el medio de fermentación. T: 30ºC y N: 150 rpm

Solución de sales:

Nutriente Concentración (g/l)

CaCl2.2H2O 2.9

ZnSO4.7H2O 0.40

MgSO4.7H2O 2.20

CuSO4.5H2O 0.25

CoCl2.6H2O 0.24

H3BO3 0.06

FeSO4.7H2O 6.42

HCl Concent.

Tabla 04: Concentración de sales para el medio de fermentación.


7/40


P á g i n a 7

2.2. PREPARACIÓN DE MEDIOS

2.2.1. Preparación de los materiales para el medio de cult ivo :

COLOCAR

ESTERILIZAR

PESAR

DILUIR

DILUIR

COLOCAR

DILUIR

ESTERILIZAR

AGREGAR

ELABORAR

estufa en posición vertical

vasos precipitados, matraz

y tubos de ensayo.

a 121 °C por 15 minutosXilosa y glucosa

demás nutrientes

En matraces de 125ml diluir

las sales con 50ml de agua destilada.

En un matraz de 125mlXilosa

matraces previamente

recubierto con papel

aluminio en la estufa.

a 121 °C por 15

minutos.

Agua destilada

50 ml

En un matraz de 125mlnitrógeno

Agua destilada

50 ml

En un matraz de 1 L3 disoluciones

curva de calibración para la determinación

de azucares reductores

por el método del

LAVAR Y SECAR materiales de vidrio a utilizar.


8/40


P á g i n a 8

Inoculación: Se debe tener el lugar bien desinfectado, se colocan los

mecheros se prosigue de la siguiente manera:

EXPONERLa aza bacteriológica al

fuego del mechero hasta

alcanzar el rojo vivo.

ENFRIAR EINTRODUCIR

EXTRAER una gota

REALIZAR

LLEVAR

COLOCAR

por duplicado es

decir 2 azadas.

o sembrar en un tubode ensayo con medio

rico sólido (con agar).

en tubo de ensayo que

contenía las células

desarrolladas en medio

rico liquido

A la incubadora por 6 horas


9/40


P á g i n a 9

2.2.2. Determinación de la cinética de crecimiento de la biomasa.

Determinación de los parámetros cinéticos: uM y KS

Utilizando la ecuación ln(X/ X0) = μt, determinamos distintos

valores de μ.

Tabular Si vs. μi

Con la ecuación 1/ μ = 1/μm + (KS/ μm) 1/S, graficamos.

La intercepción con el eje y será el valor de 1/μm siendo su

inversa el valor de μm, además la pendiente m= KS/ μm

conocido anteriormente μm determinamos KS.

dX / dt = μm X ……………….( )

X = X0 e μmt

PREPARAR

DILUIR

UTILIZAR

INOCULAR

8 matraces con diferentes

concentraciones de xilosa

a 121 °C por 15 minutos

Curva de calibración para

azucares reductores,

determinando así laconcentración en cada

matraz

Los matraces con un

1mL

DETERMINAR

Utilizando la curva decalibración al cabo detiempos determinados la

concentración final de

células.


10/40


P á g i n a 10

2.2.3. Determinación de la cinética de consumo de la fuente de

carbono.

-dS / dt = (1/ YX/S) (dX/dt)

Reemplazando en esta ecuación y conociendo YX/S.

Tenemos -dS / dt = (1/ YX/S) μm X , conociendo μm ya para

diferente concentraciones finales podemos determinar la

cinética de consumo de sustrato.

2.2.4. Determinación de los rendimientos del nutriente limitante en

células.

Fuente de carbono y energía: xilosa (C5 H10 O5) M= 150g

/ = % % é

YX/S = % de C en el nutriente / % de C en la célula

% de C en el nutriente = 12(5) x 100 / 150 = 40 %

% de C en la célula = 46.57 %

YX/S = (40/46.57) x 0.6 (este factor por ser aireado)

YX/S = 0.86 x 0.6 = 0.52 g/g

Fuente de carbono y energía: glucosa (C6 H12 O6) M= 180g

/ = % % é

YX/S = % de C en el nutriente / % de C en la célula

% de C en el nutriente = 12(6) x 100 / 180 = 40 %


11/40


P á g i n a 11

% de C en la célula = 46.57 %

YX/S = (40/46.57) x 0.6 (este factor por ser aireado)

YX/S = 0.86 x 0.6 = 0.52 g/g

2.2.5. Determinación del contenido de azúcares reductores mediante

el método del DNS.

La preparación del reactivo DNS se requiere de lo siguiente:

10 g /L de ácido 3,5 dinitrosalicilico (DNS)

200 mL / L de NaOH 2N 300 g/L de tartrato de sodio y potasio tetrahidratado

Para la preparación de este reactivo, se disuelve el tartrato en

Aproximadamente 500 ó 600 mI de agua, paralelamente se disuelve

el ácido DNS. Ambas soluciones se mezclan en un matraz aforado de

1 litro y se agita hasta la completa disolución de todos los

componentes, para posteriormente aforar hasta un litro.

AÑADIRUn volumen del reactivo DNS

a un volumen de muestra

a analizar.

MANTENER

AÑADIR 10 volúmenes de aguadestilada.

OBTENER

LEER

La concentración

interceptando la medidade absorbancia en la

curva de calibrado.

La absorbancia a 540nm, utilizando agua como blanco.

La mezcla en un baño de

agua a ebullición durante

5 minutos para luego dejar

enfriar.


12/40


P á g i n a 12

2.2.6. Determinación de la concentración celular por densidad óptica.

El método se basa en el aumento de la turbidez del medio, al

incrementarse la concentración de microorganismo s, esto puede ser

detectado fácilmente por espectrofotometría a 640 nm. Para ésta

determinación es necesario que previamente' se elabore una curva de

calibrado, para lo cual las concentraciones de microorganismos en el

medio son determinadas por peso seco de acuerdo al siguiente

procedimiento:

TOMARuna muestra de

volumen conocido

CENTRIFUGAR

ELIMINAR el sobrenadante y sesuspende el centrifugado

con agua destilada.

SECAR

CENTRIFUGAR

en la estufa a 80°C hasta

peso constante.

Otra vez

a 1200 rpm durante

20 minutos.


13/40


P á g i n a 13

III. MATERIALES, INSTRUMENTOS Y REACTIVOS:

3.1 PREPARACIÓN DE MEDIOS DE MANTENCIÓN:

3.1.1 MATERIALES Y EQUIPOS

Balanza analítica: Las balanzas analíticasmodernas pueden ofrecer valores deprecisión de lectura de 0,1 micras a 0,1 mg,están bastante desarrolladas.En este caso pesaremos todos loscompuestos para el medio así que tiene queser con mucho cuidado.

Matraz Erlenmeyer : Es más seguro que unvaso de precipitado, ya que la estructura delmatraz evita perdidas de solución contenida(agitación o evaporación).Es ideal paraagitar soluciones. Se puede tapar fácilmenteutilizando algodón o tapa.

Espátula, pipeta: Objetos deayuda al pesar y medirvolúmenes respectivamente.

Mechero Bunsen: Se utiliza paracalentar, fundir o evaporar sustancias. Lallama del mechero que ardecorrectamente es transparente y tiene unmatiz azulado. Se agita hasta la apariciónde la primera burbuja de la solución quecontiene el matraz.


14/40


P á g i n a 14

Agua destiladaGlucosa

Varilla de vidrio: Son unas varillas de unos 20cm de longitud que se utilizan para agitar lasdisoluciones ayudando a que los sólidos sedisuelvan en los disolventes más rápidamente.

Tubo de ensayo: Es un pequeño tubo de vidrio con unaabertura en la zona superior, y en la zona inferior escerrado y cóncavo. Esta hecho de un vidrio especial queresiste las temperaturas muy altas, sin embargo loscambios de temperatura muy radicales pueden provocarel rompimiento de tubo (Pyrex).

Algodón, gasa y capachitos de

aluminio

Olla a presión: Se introducen lostubos y se afloja las tapas para elintercambio de gases


15/40


P á g i n a 15

3.1.2. REACTIVOS

Cepa de Pichia stipitis NRRL Y-7124: es unalevadura fermentadora de hexosas y pentosasque presenta un rendimiento de etanol de 0.4 gg-1, sin producción de xilitol. Este cultivo a trabajarnos da referencia para el medio cultivo.

Peptona Extracto de malta

Extracto de levadura:Es un excelente estimulador del crecimiento debacterias, es utilizado en la preparación de mediosde cultivo microbiológicos. Extracto de Levadura esla parte soluble en agua de autolisis levaduraque es cuidadosamente controlada para preservar

la forma natural del complejo B.


16/40


P á g i n a 16

3.1.3. PROCEDIMIENTO

PESAR

MEDIR

AGREGAR

AGITAR

Agua destilada hasta

llegar a los 50 ml que se

requiere.

PREPARAR

COLOCAR

CALENTAR

AÑADIR

LLEVAR

CALENTAR

AJUSTAR

Los tubos en un vaso

de precipitado

Hasta 121ºC y a partir de

ello controlar de 15 a 20

minutos

Mezcla

7 ml

En un vaso de precipitados

con agua destilada para diluir

todos los compuestos pesadosanteriormente

Con el mechero Bunsen la

mezcla disuelta en el matraz;

Constantemente con la

ayuda de una varilla de

vidrio, hasta la aparición de

la primera burbuja

6 tubos de ensayo con tapa

Con la ayuda de una

pipeta de 10 ml, e

inmediatamente taparlos.

A olla a presión,

previamente aflojar las

tapas, para permitir el

intercambio de gases.

Las tapas de los tubos

estando estos aun

dentro de la olla

Las cantidades requeridasde cada compuesto con

la ayuda de la balanza analítica.


17/40


P á g i n a 17

3.2. MEDIO DE ACTIVACIÓN:

3.2.1. Materiales y equipos

2 matraces

Balanza analítica

Varilla de vidrio, pipeta y espátula

PH metro: es un sensor utilizado en el métodoelectroquímico para medir el pH de una disolución.

La determinación de pH consiste en medir el

potencial que se desarrolla a través de una fina

membrana de vidrio que separa dos soluciones condiferente concentración de protones.

Mechero Bunsen Una probeta de 100 ml

Estufa: La estufa de secado es unequipo que se utiliza para secar y

esterilizar recipientes de vidrio y

metal en el laboratorio. Se identifica

también con el nombre Horno de

secado.

http://es.wikipedia.org/wiki/PHhttp://es.wikipedia.org/wiki/Disoluci%C3%B3nhttp://es.wikipedia.org/wiki/Membrana_el%C3%A1sticahttp://es.wikipedia.org/wiki/Vidriohttp://es.wikipedia.org/wiki/Vidriohttp://es.wikipedia.org/wiki/Membrana_el%C3%A1sticahttp://es.wikipedia.org/wiki/Disoluci%C3%B3nhttp://es.wikipedia.org/wiki/PH


18/40


P á g i n a 18

3.2.2. Reactivos:

Agitador orbital- Shaker: Un agitador, a vecesllamado mezclador, es un dispositivo que se utiliza en

los laboratorios de química y biología para mezclar

líquidos o preparar disoluciones y suspensiones

Solución de sales

Glucosa: es un azúcarque está presente de

manera natural en

elementos tales como

las frutas o la miel.Las frutas también

poseen otro tipo deazúcar natural que seconoce como fructosa.

Extracto de malta: Debido a suespecial sabor, color y agradable aroma,

el extracto de malta se usa ampliamente

en la industria alimentaria con el fin de

mejorar las propiedades organolépticas,

valor nutricional, textura y vida útil de

los productos.

Extracto delevadura: Es unexcelente estimulador

del crecimiento de

bacterias,

es utilizado en la

preparación

de medios de cultivo

microbiológicos.

http://es.wikipedia.org/wiki/Disolucioneshttp://es.wikipedia.org/wiki/Suspensi%C3%B3n_(qu%C3%ADmica)http://es.wikipedia.org/wiki/Suspensi%C3%B3n_(qu%C3%ADmica)http://es.wikipedia.org/wiki/Disoluciones


19/40


P á g i n a 19

3.2.3. Procedimiento

3.3. MEDIO DE FERMENTACIÓN

Se pesan las sales de acuerdo a la tabla Nº 3

Acido ascórbico

PESAR

ESTERILIZAR

AJUSTAR Ajustar el pH a 4.5 dela solución de quecontiene Xilosa

MEZCLAR

Por separado el extracto delevadura en un tubo deensayo

Estos componentes para el

medio de activación “bajo

mechero” para evitar la

contaminación.

Pesar los componentes

descritos en la tabla Nº 2

Xilosa

10 ml agua destilada

Sales

5 ml agua destilada

AlcoholAgua destilada


20/40


P á g i n a 20

3.3.1. Materiales y Equipos

Matraz 1L.2 matraces de 125 ml

pH metro

Balanza analítica Varilla de vidrio

Gasa, capachitos y algodón.


21/40


P á g i n a 21

3.3.2. Reactivos

KH2PO4 = fosfato de potasio:

MgSO4.7H2O

Agua destilada

Solución de

sales

Alcohol

Sacarosa: es el término apropiado para describir elazúcar común. Dos azúcares simples, glucosa y

fructosa, se combinan para formar el hidrato de

carbono complejo conocido como sacarosa. La

sacarosa es fina, incolora, inodora y tiene un sabor

dulce. La sacarosa da un impulso de energía rápida

para el cuerpo. Es fermentable y absorbe humedad.

Extracto de levadura

(NH4)2SO4 = sulfato de amonio: En bioquímica, la

precipitación del sulfato de amonio es un métodocomún para purificar las proteínas al lado de

precipitación selectiva; El sulfato de amonio es

extremadamente soluble en agua y así que puede hacer

las soluciones muy concentradas que pueden “salar

hacia fuera” las proteínas, causando su precipitación en

las concentraciones particulares.


22/40


P á g i n a 22


PESAR

DILUIR

ENFRIAR

ESTERILIZAR

Agua destilada hasta

llegar a los 50 ml que

se requiere.

REGULAR el pH de la solución de

xilosa a 4.5.

las diluciones por

separado.

Xilosa y KH2PO4


Extracto de levadura


Peptona


REFRIGERAR


23/40


P á g i n a 23

3.4. RESIEMBRA CELULAR (SOLIDO - SÓLIDO )


Aza bacteriológica

Tubo de ensayo con medio sólido donde se encuentra el M.O.

Mechero Bunsen, trípode y rejilla.


MANTENER

SOMETER

ENFRIAR

HACER

Por unos segundos

EXTRAER

El asa bacteriológica al

fuego del mechero

hasta alcanzar el rojo vivo.

una azada del tubo de

ensayo que contiene

células desarrolladas en

medio sólido

El procedimiento de

resiembra en los tubos deensayos preparados con

medio sólido (con agar).

Un ambiente estéril

LLEVAR a la incubadora a 30 ºC durante 48 horas


24/40


P á g i n a 24

3.5. ACTIVACIÓN CELULAR Y DESARROLLO DEL INÓCULO


Matraz de 125 ml.

Algodón

Gasa

Agua destilada

Shaker

Mechero Bunsen, trípode y rejilla.


PARTIR

TOMAR

INOCULAR

LLEVAR

en el matraz con los

30 ml del medio de

activación

TAPAR

Una azada

El tubo con un tapón

de gasa y algodón

al Shaker a 180 rpm, Tº =

35 ºC y un t = 24 (1) hasta

alcanzar un desarrollo

celular suficiente,

Con la cepa

incubada en medio

sólido


25/40


P á g i n a 25

3.6. DETERMINACIÓN DE LA CINÉTICA DE CRECIMIENTO DE LA

BIOMASA


Matraz de 1 L conteniendo el medio de fermentación

Espectrofotómetro

pHmetro

Gasa y algodón

Centrifuga

Tubos de ensayo

Capachos de papel aluminio


INOCULAR

EXTRAER

TOMAR

EXTRAER

Medidas de asepsia

en la zona de trabajo

el encendido del

AGREGAR

TOMAR

Caldo

30 ml

Luego se medir X0 y S0 con D.O.

Muestras se inicia desde la

dilución del medio de

activación en el medio de fermentación.

Se le agrega al tubo del

espectrofotómetro y el

resto se le agrego al tubo

de centrifugado.

Caldo5 ml

Caldo

5 ml

Caldo

3 ml

La un matraz de 1L

conteniendo 270 ml. de

medio definido.


26/40


P á g i n a 26

DISOLVER

MEDIR

al tubo de centrifugado

para completar los 5 ml

el sobrenadante se vierte a

los viales

absorbancia a 640 nm y pH

a la máxima velocidad

por 20 minutosCENTRIFUGAR

VERTIR

GUARDAR

en el refrigerador con

el fin de después

determinar el

consumo de sustrato.


27/40


P á g i n a 27

3.7. MÉTODO DEL DNS (ACIDO DINITROSALICÍLICO)


Barra magnética Vaso de precipitado 250ml

Matraz de aforo de 100ml.

Papel aluminio

Balanza de platos

Balanza analítica

Frasco de vidrio

Agitador magnético Mechero bunsen

3.7.2. Reactivos

1g de acido 3,5 dinitrosalicílico (DNS)

1.6g de NaOH 2N.

30g de tartrato de sodio y potasio tetrahidratado.


DISOLVER

DISOLVER

MEZCLAR Ambas soluciones en unmatraz aforado de 1lt

AFORAR

AGITAR

Hasta 1 lt

Hasta la completa

disolución de todos los

componentes.

Paralelamente

Tartrato

500 ml agua

Acido DNS


28/40


P á g i n a 28

IV. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES:

4.1. PROGRAMACION DE CINETICA CULTIVO CELULAR POR LOTES

ACTIVIDADES Abril Mayo

13 20

27 02 04 05 11 13 17 18Selección y prelación de reactivos y materiales.

Esterilización de medios.

Preparación del medio de cultivo

Inoculación del medio de cultivo

preparación de la solución tampón

Evaluación y supervisión del medio.


Evaluación y supervisión del medio. Evaluación y supervisión del medio.


Determinación de las cinéticas de crecimiento, consumo.

Sustentación Examen Unidad I


29/40


P á g i n a 29

CINETICA CULTIVO CELULAR POR LOTES

Plan de Muestreos y Registro de Datos

Grupo: __________________________________ Día: ___ /___ / ___

Microorganismos: ___________________________

Fuente Carbono: ____________________________

pH __________ T °C __________ N rpm ________

Nª HORA TIEMPO Abs.(640nm)

Nombre

delalumno

Observaciones


30/40


P á g i n a 30

IV. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS:

1. http://www.microbiologia.com.ar/bacteriologia/fisiologia.php?Mostrar=q

uimicos2. Biotechnol. Bioprocess. Eng. 2000, 5: 27-31 - Department of Molecular

Science and Technology, Ajou University, Suwon 442-749, Korea -

Enari, T. M. and M. L. Suihko (1984)

3. Ethanol production of pentose and hexoses from cellulose materials.

CRC Crit. Rev. Biotechnol. 1: 229-240. - Vol. 28, No. 01, pp. 151 - 156,

January - March, 2011 - Martínez, A., Rodríguez M. E., York S. W.

4. “Determinación de parámetros de co-cultivo de scheffersomyces stipitis y saccharomyces cerevisiae para la fermentación de residuos

lignocelulosicos para la obtención de bioethanol” Ana Karina Castillo

Plata

5. http://www.laboratoriosmicrokit.com/docs/..%5Cmanual%5CKits-C.pdf.

6. http://www.monografias.com/trabajos15/lactobacilos/lactobacilos.shtml

7. QUINTEROS RAMIREZ Rodolfo, Ingeniería Bioquímica.

http://www.microbiologia.com.ar/bacteriologia/fisiologia.php?Mostrar=quimicoshttp://www.microbiologia.com.ar/bacteriologia/fisiologia.php?Mostrar=quimicoshttp://www.laboratoriosmicrokit.com/manual/Kits-C.pdfhttp://www.laboratoriosmicrokit.com/manual/Kits-C.pdfhttp://www.microbiologia.com.ar/bacteriologia/fisiologia.php?Mostrar=quimicoshttp://www.microbiologia.com.ar/bacteriologia/fisiologia.php?Mostrar=quimicos


31/40


P á g i n a 31

V. ANEXOS:

HALLANDO EL % EN CÉLULAS: se sabe la fórmula del m.o.:

CH1,79 O0,6 N0,17ELEMENTO Peso

molecularCantidad Peso (g) % por

elemento

C 12 1 12 46.57

H 1 1.79 1.79 6.95

O 16 0.6 9.6 37.25

N 14 0.17 2.38 9.24

TOTAL(g) 25.77

Peso (g) = peso molecular * cantidad

% = ∗100

Diseño del medio de activación y de Fermentación:

PARA LA XILOSA:

%C nutr iente = 40% %C. en biomasa= 46.57%

6.0.%

.%º

enbiomasaC

eennutrient C

S

X Y

C X

gg

Y C

X 52.06.0%57.46

%40º

Si: S Y X l

g X

S

X

º

2

X Y S S C

X f

º

º Si: 0 f S

gg

lg

C X Y

X S

C 52.0

2

ºº

l

gC S 85.3

º


32/40


P á g i n a 32

PARA LA GLUCOSA:

%C nutriente = 40% %C. en biomasa= 46.57%

6.0.%

.%º

enbiomasaC

eennutrient C

S

X Y

C X

gg

Y C

X 52.06.0%57.46

%40º

TOTAL DE SUSTRATO (GLUCOSA: 1.5 g/l GRUPO B3)

Xilosa 3.85 gr/l

Glucosa 1.5 gr/l

MEZCLA TOTAL 5.35 gr/l

PARA KH2PO4:

enbiomasaPeennutrient P

S X Y

P X

.%.%º

%794.22136

10031.%

eennutrient P

ggP

X Y 408.13%7.1

%794.22º

lg

lg

gg

lg

p X

pY

X S 224.05.1149.0

408.13

2

ºº

lg pS 224.0º

enbiomasaK

eennutrient K Y

K X

.%

.%º

%676.28100136

39.% eennutrient K


33/40


P á g i n a 33

gg

gg

K X Y 47.11

5.2

676.28

º

ggK

X Y 47.11º

gg

lg

K X Y

X S

K 47.11

2

ºº

5.1174.0º

lgK

S

lgK

S 262.0º

PARA (NH4)2SO4:

enbiomasa N

eennutrient N Y

N X

.%

.%º

%21.21100132

214.%

eennutrient N

gg N

X Y 2957.2%24.9

%21.21º

gg

lg

N X

N Y

X S

2957.2

2

ºº

5.18712.0º

lg N

S

lg N

S 3068.1º

enbiomasaS

eennutrient S Y

S X

.%

.%º

%24.24100132

32.% eennutrient S

gg N

X Y 072.44%55.0

%24.24º

gg

lg

N X

N Y

X S

2957.2

2

ºº

5.18712.0º

lg N

S

lg

N

S 3068.1º


34/40


P á g i n a 34

PARA MgSO4.7H2O:

enbiomasaS

eennutrient S Y

S X

.%

.%º

%01.13100246

32.% eennutrient S

ggS

X Y 65.2355.0

01.13º

gg

lg

S X

S

Y

X S

65.23

2

ºº

5.108.0º

l

gS S

lgS

S 13.0º

enbiomasa Mg

eennutrient MgY

Mg X

.%

.%º

%756.9100246

24.% eennutrient Mg

gg Mg

X Y 51.195.0

756.9º

gg

lg

Mg X

MgY

X S

51.19

2

ºº

5.11025.0º l

g MgS

lg MgS 1538.0º


35/40


P á g i n a 35

NUTRIENTES PARA EL MEDIO DE FERMENTACION

Elemento Nutriente P.M. % en % en

Nutriente

Yx/s So

Célula (g/g) (g/l)C C5H10O5 150 46.57 40 0.52 5.769

C C6H12O6 180 46.57 40 0.52 5.769

P KH2PO4 136 1.7 22.794 13.408 0.224

K KH2PO4 136 2.5 28.676 11.470 0.262

N (NH4)2SO4 132 9.24 21.21 2.295 1.307

S (NH4)2SO4 132 0.55 24.24 44.073 0.068

Mg (MgSO4.7H2O) 246 0.5 9.756 19.512 0.154

S (MgSO4.7H2O) 246 0.55 13.01 23.655 0.127

5.2. DISEÑO DE MEDIO DE CULTIVO:

Medio Sólido De Mantención (Pgy- Agar)

NutrienteConcentración

(g/l)Peso (g)

Extracto de

levadura3 0.15

Peptona 5 0.25

Extracto de malta 3 0.15

Agar 20 1

T: 30ºC, N: 150 rpm

TABLA 01: Concentración de Nutrientes para el medio de mantención (50mL)


36/40


P á g i n a 36

Medio Activación:

TABLA 02: Concentración de Nutrientes para el medio de activación (30 mL)

Nutriente Concentración(g/l)

Peso (g)

Glucosa 10 0.3

xilosa 10 0.3

Extracto de

levadura3 0.09

Extracto de malta 5 0.15

Solución de sales 5 ml/L 0.15 ml

T: 30ºC, N: 150 rpm

Medio De Fermentación

Para un volumen de medio: 30% - 40% del volumen del matraz. Para una concentración f inal: 2 g/l

TABLA 03: Concentración de Nutrientes para el medio de fermentación 250 ml (75 ml –

30%)

Nutriente Concentración (g/L) Peso (g)

Glucosa 1.5 0.375

Xilosa 3.85 0.9625

(NH4)2SO4 3 0.75

KH2PO4 2 0.5

MgSO4-7H2O 1.1 0.275

Solución de sales 5 ml/L 1.25 ml

Ajustar pH 4.5

T° 30°C, N 150 rpm

HALLANDO EL TIEMPO DE FERMENTACION

Ln ( ) = μMx ∗ t Ln ( 20.2) =0.301∗t

t = 7.6horas = 7 horas,36 min


37/40


P á g i n a 37

5.3. CALCULO PARA LA SOLUCIÓN TAMPÓN

Diseño de medio: (N)(NH4)2SO4

PM = 132 g/mol

%21.21100132

14x2 Nutriente % x

Requerimientos en biomasa:

Hallando el rendimiento de nutr iente en célula ( s x

Y /

):

biomasa

nutriente

s x

N

N Y

%

%/

24.9

21.21/ s x

Y

ggY s x

/295.2/

Hallando So:

5.1

/

0 x

Y

X X S S

s x

o f

f N

Considerando:

% %

C 6.57

H 6.94

O 37.25

N 9.24

%24.9 N% biomasa


38/40


P á g i n a 38

Sf = 0

Xf = 2 g/lt

Xo 0 g/lt

5.1

/

xY

X S

s x

f

o

5.1

295.2

2 xS

o

lt gS o /307.1

Con el (NH4)2SO4 produce a condiciones acidas:

H NH NH 22234

Hallando la concentración de (NH4)2SO4:

PM

S oN

solución

moles

(NH4)2SO4lt

n ][Conc.

132g/mol

1.307g/lt [Conc.] (NH4)2SO4

lt mol /9.9015x10[Conc.] -3(NH4)2SO4

Hallando la concentración de hidrógenos liberados:

1mol/lt (NH4)2SO4 2H+

9.9015x10-3 mol/lt (NH4)2SO4 X

X = 0.01980H+


39/40


P á g i n a 39

Calculo para la preparación de la solución tampón

][

][log

acido

base pK pH

a

77.4

5.4

1.0

a pK

pH

pH

Acido: ácido cít ri co Anhidro

C6H8O7.H2O: Peso molecular = 210 g/mol

Base: citrato de sodio anhidro:

C6H5Na3O7.2H2O: Peso molecular = 294 g/mol

Entonces tenemos:

][

][log77.45.4

acido

base . . . . . (1)

][

][log77.44.4

X acido

X base

. . . . . (2)

De la ecuación (1):

][

][log77.45.4

acido

base 53703.0

][

][

acido

base . . . . .

(3)


40/40


De la ecuación (2):

][

][log77.44.4

X acido

X base

42658.0

][

][

X acido

X base . . . .

(4)

Desarrol lando la ecuación (4):

lt molácido

ácido x

ácido

X x

ácido

X x

ácido

base

xX xácido X base

/2557.0

01980.042658.111045.0

42658.142658.053703.0

42658.142658.0

42658.042658.0

De (3) tenemos:

lt molbase

lt mol xbase

/1373.0

/2557.053703.0

Por lo tanto:

lt gbasemol

g x

lt

molbase

lt gácidomol

g x

lt

molácido

/3662.402941373.0

/697.532102557.0

Se preparara medio litro de solución.

Nota:

Cuando el pH está por debajo de 4.5 se agrega Hidróxido de

sodio.

preinforme1-grupo-b3-

Documents