Prácticas de Bioquímica Especial:

Introducción

Práctica 1

Práctica 2

Práctica 3

Práctica 4

Práctica 5

Práctica I

ACTIVIDAD LACTATO DESHIDROGENASA EN HIGADO DE RATA

Introducción Teórica: La lactato deshidrogenasa (LDH) es un enzima NAD dependiente que se encuentra ampliamente distribuida en tejidos animales, vegetales y en microorganismos.

Su peso molecular es aproximadamente 135 kDa y su estructura es la de un tetrámero dispuesto tetraédricamente, en el que las subunidades van unidas por enlaces hidrófobos, puentes de hidrógeno y fuerzas electrostáticas.

Existen dos tipos distintos de subunidades, M y H, cuyas combinaciones posibles dan lugar a cinco formas moleculares, con actividad lactato deshidrogénica y con características cinéticas y fisicoquímicas diferentes, que se han denominado isoenzimas.

Es una enzima citoplasmática que se encuentra en forma soluble o ligada a membrana. Las diferentes isoenzimas se encuentran en distintas proporciones en cada tejido, lo cual puede dar idea de la funcionalidad de cada isoenzima, atendiendo a las funciones metabólicas en que intervienen;

Cataliza la siguiente reacción:

Piruvato + NADH + H+ Lactato + NAD+

juega, por tanto, un papel importante en el metabolismo de glúcidos, interviniendo en el último paso de la glucolisis anaerobia y en un primer paso hacia la gluconeogénesis a partir de lactato. Además, aporta combustible al ciclo de Krebs en tejidos consumidores de lactato como el músculo cardiaco. Es específica para L-Lactato y utiliza únicamente NAD como coenzima.

Las diferentes isoenzimas presenta características cinéticas distintas, así la isoenzima compuesta por 4 subunidades M (M4) tiene una Km relativamente elevada para el piruvato, mientras que la isoenzima H4 tiene una Km relativamente elevada para el piruvato. Parece ser que las isoenzimas híbridas (M1H3, M2H2 y M3H1) presentan características intermedias a las de las isoenzimas puras.

La LDH es una enzima cercana al equilibrio, por tanto, no reguladora, pero sí regulada por la razón NADH / NAD+ y por la posibilidad de presentar formas iscenzimáticas con características distintas tanto cinéticas como de inhibición por sustrato. La inhibición por exceso de sustrato tiene lugar por la formación de un complejo NAD - piruvato que compite con el NADH por el centro activo del enzima. Asimismo, la LDH presenta inhibición por intermediarios de ciclo tricarboxílico: oxalacetato y citrato. Se conocen otros inhibidores como oxalato y oxamato.

Objetivos experimentales:

A) Determinación de la actividad.

B) Determinación de las constantes cinéticas: Km y Vmax . Estimación de la [S] óptima.

C) Determinación del tipo de inhibición. Estimar la Km (ap) y Vmax (ap) en presencia de Oxamato.

D) Determinación de la Ki en presencia de oxamato.

Método:

La actividad se determinará espectrofotométricamente por la velocidad de desaparición de NADH a 340 nm, pH 7,4 y 20 ªC (temperatura ambiente), en el sentido de reducción del piruvato.

Como fuente de la enzima se utiliza hígado de rata homogenado en Sacarosa 0,25 M (1 g,1O ml), centrifugado a 30.000 por g (15.8OO RPM) durante 20 min en una centrífugación Beckman refrigerada. El sobrenadante producto de la centrifugación se utilizará diluido 1 / 50 en Sacarosa 0,25 M.

A) Determinación de la actividad. Preparar dos tubos conteniendo:

Blanco Prueba

Tampón Fosfato

pH 7,4 (ml)

2,8 2,6

NADH 3,5 mM (ml)

0,1 0,1

Extracto (ml) 0,2

Se dispara la reacción con 0,1 ml de piruvato sódico (21 mM). Leer la absorbancia ( DO ) a 340 nm cada 30 seg. durante 10 min. El ÆDO / min deberá estar comprendido entre 0,05 y 0.1.

Resultados:

Representar DO frente a tiempo y calcular la Actividad Específica ( en mol / min x g de tejido ).

Coeficiente de extinción del NADH = 6,22 10 3 cm-1 M -1.

A = c l

A = Absorbancia, medida espectrofotómetricamente.

= Coeficiente de extinción del NAD = 6,22 10 3 cm-1 M -1 = 6,22 cm-1 mM -1 .

c = Concentración

l = Longitud del paso óptico.

Desarrollo :

DEBIDO A LA COMPLEJIDAD DE PROGRAMAR LAS FORMULAS PARA LOS NAVEGADORES LAS HE OBVIADO

50 = Factor de dilución

Milimolar = moles / ml

t / s D. O. D. O. - Blanco

DO

0 0,835 -0,096 0,096

30 0,725 -0.246 0,246

60 0,610 -0,361 0,361

90 0,508 -0,463 0,463

120 0,427 -0,544 0,544

150 0,375 -0,596 0,596

180 0,350 -0,621 0,621

210 0,339 -0,632 0,632

240 0,335 -0,636 0,636

270 0,334 -0,637 0,637

300 0,334 -0,637 0,637

A = 4, 47 mol/ min g

Valor referido a la actividad de la LDH

Valor control a:

pH: 7, 4

Temperatura: 37º

Práctica II

B)Determinación de las constantes cinéticas

Preparar diez tubos conteniendo:

Tubo Tampón

Fosfato

NADH

( 3.5 mM )

Piruvato

( 2.1 mM )

Piruvato

( 21 mM )

1 (blanco)

2,7 0,1

2 2,6 0,1 0,1

3 2,4 0,1 0,3

4 2,2 0,1 0,5

5 2.0 0,1 0,7

6 1,7 0,1 1,0

7 2,4 0,1 0,3

8 2,2 0,1 0,5

9 2,0 0,1 0,7

10 1,7 0,1 1,0

Una vez anadido el tampón, el NADH y el piruvato en todos los tubos, se agitan y se lee la DO a 340 nm anotanto el valor que corresponderá a t=0. Posteriormente se dispara la reacción con 0,2 ml de extracto, se agita y se lee cada tubo a los 2 min de iniciada la reacción. Para los cálculos debe restarse el ÆDO del tubo 1 (blanco) a todos los tubos.

Resultados:

Con los datos de los tubos 1-6:

- Representar V ( µM / min ) frente a [S] ( mM ): curva de Michaelis-Menten.

Con los datos de los tubos 1-10:

- Representar V frente a [S]. Estimar la [S] óptima.

- Representar 1 / V frente a 1/ [S]: representación de Lineweaver-Burk. Estimar la Km y la Vmax.

Los tubos del 7 al 10 tienen exceso de piruvato, por tanto inhiben la enzima LADH, es una de las formas de regulación. Inhibición por exceso de sustrato.

Piruvato + NADH + H+ Lactato + NAD+

De la representación gráfica de esta ecuación se puede estimar la K m y vmax..

Con los datos de los tubos 1- 10 se representa v vs [S] y se estima la

concentración óptima de piruvato ( concentración a la que se alcanza la máxima

v ).

Inhibición competitiva:

Inhibición no competitiva:

Cálculos:

Se mide espectrofotométricamente la absorbancia de todos los tubos a t = 0 y a t = 2 min de disparada la reacción.

Antes de disparar

D O0 - Blanco

Disparar con el sustrato

D O2 min- Blanco

V x C = V x C

3 ml x C = 0,1 ml x 2,1 m M

3 ml = 2,7 fosfato + 0,1 NADH + 0,2 ml estracto

C = 0, 07 m M

TUBO [S] 1 / [S] DO0 DO2 DO0

DO0 /

2

V 1 / V

2 0,07 14,29 0,174 0,175 0,001 0 0,06 16,7

3 0,21 4,76 -0,058

-0,155 -0,097 -0,05 5,85 0,17

4 0,35 2,86 -0,039

-0,16 -0,121 -0,06 7,29 0,14

5 0,49 2,04 -0,043

-0,22 -0,177 -0,09 10,67 0,09

6 0,7 1,43 -0,055

-0,235 -0,18 -0,09 10,85 0,09

7 2,1 0,48 -0,012

-0,155 -0,143 -0,07 8,62 0,12

8 3,5 0,29 0,32 0,19 -0,13 -0,07 7,84 0,13

9 4,9 0,20 0,078 -0,055 -0,133 -0,07 8,02 0,12

10 7 0,14 0,367 0,262 -0,105 -0,05 6,33 0,16

C) Determinación del tipo de inhibición en presencia de Oxamato Preparar seis tubos conteniendo:

Tubo Tampón

Fosfato

NADH

( 3.5

Piruvato

( 2.1

Oxamato

( 15 mM

mM ) mM ) )

1 (blanco)

2,6 0,1 0.1

2 2,5 0,1 0.1 0.1

3 2,3 0,1 0,3 0.1

4 2,1 0,1 0.5 0.1

5 1,9 0,1 0,7 0.1

6 1.6 0.1 1.0 0.1

Proceder de la misma manera que en el apartado B.

Resultados:

- Realizar la representación de Michaelis-Menten en la misma gráfica que la del apartado B.

- Realizar la representación de Lineweaver-Burk en la misma grafica que la del apartado B.

- Estimar la Km (ap) y a Vmax (ap) en presencia del inhibidor. Deducir el tipo de inhibición (competitiva o no competitiva).

Para calcular la K m y Vmax utilizamos la representación de Lineweaver-Burk,

haciendo la regresión lineal, y despreciamos los puntos que se desvíen cuatro veces el valor de la desviación típica muestral.

pte = 1 / vmax = 6,97 x 10-3

1

—— = 0,13

vmax

vmax = 7.69 mol / min ml

min ml

K m= 6,97x 10-3 x 7,69 = 0,053 mM

Estimación de la [ S ] óptima.

Según muestra la gráfica la concentración óptima de sustrato es la correspondiente al tubo nº 5.

0,7 mM = [ S] óptima

D) Determinación de la Ki en presencia de Oxamato

Preparar once tubos conteniento:

Tubo Tampón

Fosfato

NADH

(3.5 mM)

Piruvato

(2.1 mM)

Oxamato

(1.5mM)

1(blanco )

1.7 0,1 1,0

2 2.5 0,1 0.1 0,1

3 2,3 0,1 0.1 0,3

4 2,1 0,1 0,1 0,5

5 1,9 0.1 0.1 0,7

6 1,6 0,1 0.1 1,0

7 2,3 0,1 0.3 0,1

8 2,1 0.1 0.3 0,3

9 1,9 0,1 0,3 0,5

10 1,7 0,1 0.3 0,7

11 1,4 0,1 0,3 1,0

Proceder de la misma forma que en el apartado B.

Resultados:

- Representar 1/ V frente a [I] ( representación de Dixon ). Estimar la Ki ( extrapolando el punto de corte de las dos rectas en el eje de abcisas. Deducir el tipo de inhibición.

Práctica III

ACTIVIDAD PIRUVATO CINASA EN HIGADO DE RATA

Introducción teórica: La piruvato cinasa ( PK ) pertenece al grupo de las hidrolasas, ya que hidroliza el éster monofosfórico de fosfoenolpiruvato ( PEP ). Cataliza el tercer paso irreversible de la glucolisis. En tejidos gluconeogénicos como hígado y riñón, la PK muestra, en condiciones cercanas a las fisiológicas, las siguientes propiedades alostéricas:

- cooperatividad en su cinética respecto a su sustrato ( PEP ). Cinética sigmoidal.

- fuerte inhibición alostérica por Alanina y ATP

- fuerte activación por Fructosa 1-6 difosfato que transforrna la cinética sigmoidal de la enzima en hiperbóIica,

Estas propiedades pueden alterarse con la temperatura.

La PK de rata presenta dos tipo bien definidos de isoenzimas: el tipo M (predominante en nusculo) y el tipo L (predomiante en hígado y riñón). Un tercer tipo, A, se ha descrito en tejido adiposo.

Podemos resumir las propiedades cinéticas de los dos tipos mas conocidos de PK como sigue:

Tipo L Tipo M

Cinética para PEP Sigmoide Hiperbólica

Inhibición por ATP Alostérica No alostérica

Inhibición por Alanina

si no

Activación por

Fructosal-6 difosfato

si no

Objetivo experimental: estudio de la actividad de la PK de hígado de rata, sus propiedades alostéricas y el efecto de dos moduladores: la Fructosa 1-6 difosfato y la Alanina.

Método:

Consiste en acoplar la reacción catalizada por la PK con la reacción de reducción del Piruvato, a través de la actividad de la LDH, detectando espectrofotométricamente la desaparición de NADH a 340 nm:

Fosfoenolpiruvato + ADP PK Piruvato + ATP

Piruvato + NADH + H+ LADH Lacatato + NAD+

Como fuente de la enzima se utiliza hígado de rata homogenado en Sacarosa 0,25 M (1 g /40 ml) centrifugado a 30.000 xg ( 15800 RPM ) en un centrífuga Beckman refrigerada durante 20 min. El sobrenadante producto de la centrifugación se utilizará diluido 1/6, en tampón imidazol, para todas las determinaciones. Este proceso debe realizarse a temperatura ambiente. No congelar ni guardar el sobrenadantede un dia para otro.

A) Actividad de la PK. Efecto de los moduladores Fructosa 1-6 difosfato y Alanina.

Preparar 3 series de diez tubos, conteniendo la primera:

Tubo Coctel

Control

PEP

CB 2,6 0,1 (ml H2O )

C1 2,6 0,1 ( ml PEP 1 mM )

C2 2,6 0,1 ( ml PEP 2 mM )

C3 2,6 0,1 ( ml PEP 4 mM )

C4 2,6 0,1 ( ml PEP 6 mM )

C5 2,6 0,1 ( ml PEP 12 mM )

C6 2,6 0,1 ( ml PEP 18 mM )

C7 2,6 0,1 ( ml PEP 24 mM )

C8 2,6 0,1 ( ml PEP 30 mM )

La segunda serie ( FB - F8 ) se prepara igual que la anterior pero utilizando Coctel Fructosa 1-6 difosfato. La tercera serie ( AB - AB ) se prepara igual pero con Coctel Alanina.

Procedimiento:

1) Poner a incubar cada serie de tubos, la solución de ADP y la solución de extrato a 37 ªC durante aproximadamente 5 min.

2) Añadir 0,2 ml de extrato a cada tubo. Mezclar y dejar en el bano durante 5 min más con objeto de que se consuma el ADP endógeno.

3) Leer la absorbancia ( DO ) de cada serie a 340 nm anotando el valor que correspoderá a DO incial.

4) Disparar la reacción añadiendo 0,2 ml de ADP ( 1 mM ) a cada tubo de la serie con un intervalo de separación de 30 seg entre tubo y tubo, anotando el momento en el que se disparo el primer tubo.

5) Realizar la segunda lectura de absorbancia ( DO final ), exactamente a los 10 min de haber disparado la reacción en el primer tubo, respetando los intervalos de 30 seg de un tubo a otro.

1Para los cálculos hay que restas a todos los tubos el valor de absorbancia ( DO ) del Blanco (CB o FB o AB, respetívamente ) ÆDO/10 mm = DO final - DO inicial

Resultado:

- Representar, en la misma gráfica, V ( M / min ) frente a [S] ( mM ) de los tres supuestos:

Control, en presencia de Fructosa 1-6 difosfato y en presencia de Alanina.

- Representar en gráficas individuales 1 / V frente a 1 / [S] con objeto de estimar la Vmax de cada supuesto.

Cálculos:

TUBO [ S ] 1 / [ S ]

V

( fructosa )

1 / V

( fructosa )

V

( control )

1 / V

( control )

V

( alanina )

1 / V

( alanina )

Blanco 0 - 0 - 0 - 0 -

1 1 1 0,347 2,88 0,03 33,33 0,4 2,5

2 2 0,5 0,203 4,92 0,484 2,06 0,21 4,76

3 4 0,25 0,174 5,74 0,419 2,38 0,43 2,32

4 6 0,16 0,55 1,82 0,463 2,15 0,33 3

5 12 0,08 1,23 0,81 0,535 1,86 0,53 1,86

6 18 0,05 0,043 23,2 0,52 1,92 0,2 5

7 24 0,04 0,695 1,44 0,477 2,09 0,17 5,88

8 30 0,03 0,376 2,66 0,564 1,77 0,72 1,38

Cálculo de la vmax y K m a partir de la ecuación de Lineweaver - Burk

1 K m 1 1

— = —— + —— + —

v vmax vmax [S]

FRUCTOSA

mol

vmax = 1 / 2,37 = 0,42 ———

min ml

K m

pte = —— = 1,75

vmax

K m = 0,735 mM

COCTEL CONTROL

mol

vmax = 1 / 1,946 = 0,51 ———

min ml

K m

pte = —— = 0,541

vmax

K m = 0,27 mM

ALANINA

mol

vmax = 1 / 3,39 = 0,29 ———

min ml

K m

pte = —— = 1,11

vmax

K m = 0,32 mM

Ponemos los tubos en el baño cinco minutos, medimos y disparamos. Después los dejamos diez minutos en el baño

Reactivos:

Tampón Imidazol pH 7 (CI2Mg 5 mM, KCI 0,1 M; Imidazol 50 mM).

Coctel Control (Tampón imiazol, NADH 0,15 mM, LDH 5 UI).

Coctel Fructosa 1-6 difosfato (Tampón Imiazol, NADH 0,15 mM, LDH 5 UI, Fruct 1-6 difosf 0,1 mM).

Coctel Alanina (Tampón Imiazol, NADH 0,15 mM, LDH 5 Ul, Alanina 2 mM).

Práctica IV

ALGUNOS ASPECTOS DEL METAOBOLISMO EN RATAS AYUNADAS, DIABETICAS

Introducción:

Una de las características fundamentales de los seres vivos es su capacidad de adaptación al medio que les rodea. El mantenimiento de las funciones especificas de las distintos órganos requiere un aparte energético continuo, cuyas características vienen determinadas por el volumen y composición de le ingesta y por la capacidad de almacenamiento y regulación de algunos tejidos.

El hígado juega un papel regulador esencial debido a la complejidad y diversidad de su maquinaría metabólica. Es el órgano que recibe y procesa las sustancias nutritivas procedentes de la ingesta y que, junto con el tejido adiposo, es capaz de almacenar sustancias de reserva en forma de triglicéridos y glucógeno. Por otro lado, el riñón se encarga de mantener la proporción de agua y el balance ácido-base sanguíneo, así coma de la recuperación de determinadas sustancias de desecho que son reutilizadas por otros tejidos y/o por él mismo. La coordinación de las funciones de estas órganos se lleva a cabo mediante finos sistemas de regulación horrnal. Todos estos mecanismos, en su coniunto, permiten una adecuación del organismo a las distintas condiciones metabólicas.

El obieto de esta segunda parte de las practicas es la determinación de algunos parametros metabólicos característicos de cada una de las situaciones anteriormente citadas. En este sentido, se deteminar:

1 ) Niveles plasmáticos do glucosa

2 ) Niveles de glucógeno hepático.

3 ) Actividad de la fosfoenoipiruvato carbaxicinasa ( PEPCK ) hepática como enzima clave de la vía gluconeogénica.

4 ) Capacidad gluconeogénica de la cortezta renal.

Tratamiento do los animales:

Se utilizarán ratas de la raza Wistar hembras ( 250 a 350 g ) que tienen en todo momento libre acceso a la bebida. Estos animales se dividirán en cuatro grupos:

-CONTROLES: Disfrulan de libre cocesa a una dieta comercial estandar rica en hidratos de carbono.

-AYUNADAS: 48 Horas antes del sacrificio se les retire el alimento.

-DIABETICAS: 3 ó 4 Días antes del sacrirícla se les inyecta, por vía intraperitoneal, el antibiótico estreptozotccina a una dosis de 60 mg / Kg de peso. Se les deja litare acceso al alimento, ( la estreptozotocina destruye

selectivamente las células del páncreas, encargadas de la producción de insuilna ).

EXTRACCION DE SANGRE HIGADO Y RIÑONES.

1. Extracción de sangre.

Las ratas seran anestesiadas por los profesores con Nembutal sódico administrado por vía lntraperitoneal a una dosis de 50 mg / kg de peso. Los alumnos situarán la rata sobre la tabla de disección y la fijaran con esparadrapo en la posición decúbito supino.

Con unas tijeras se retira la piel de la zona abdominal. A continuación se realiza un corte a lo largo de la línea alba y se retira la capa muscular hacia los lados.

Separar la masa intestinal hada el lado derecho hasta dejar al descubierto la vena cava y la arteria sorta. En este momento debe estar preparada una jerínga de 5 ml ( sin aguja ) heparinízada.

Añadir 0,1 ml de heparina al 1% en solución salina en el lado izquierdo de la cavidad abdominal.

Realizar con una lanceta estéril una incisión sobre la vena cava y la arteria aorta.

Recoger la sangre con la jeringa lentamente para evitar hemólisis, evitando igualmente tomar restos de tejido y coágulos.

Pasar la sangre cuidadosamente a un tubo de centrífuga (rotulado) que contiene 0,1 ml de heparina al 1% en solución salina. Agitar suavemente según se va añadiendo la sangre.

2. Extracción del hígado.

Con ayuda de unas pinzas y tijeras. extraer lo más rápidamente posible el hígado completo y depositario en un vaso de precipitados ( rotulado ) que contiene solución salina. Dejarlo en el barreño de híelo.

3. Extracción de los riñones.

Con ayuda de pinzas y tijeras, extraer lo más rápidamente posibie los dos riñones y depositarIos en un vaso de precipilados ( rotulado ) que contiene solución salina Continuar inmediatamente con el apartado 2.1.2.

4. Tratamiento de la sangre ( por el profesor ).

Centrifugar la sangre ( 1000 rpm / l0 min). Recoger el plasma con pipeta Pasteur, realizar las diluciones indicadas en la practica 2.2 (para la determinación de glucosa) y congelar todas estas alicuotas ( -20 ªC ).

5. Tratamiento del hígado ( por el profesor ).

-Distribuir el hígado en dos partes de 2,5 g cada una.

-Homogeneizar 2.5 g en 43 ml ( dil 1 / 5 ) de sacarosa 0,25 M ( vidrio - vidrio ). Centrifugar a 47.800 g (20.000 rpm) / 30 min. Congelar ( -20 ºC ) el sobrenadante en alícuotas de 0,5 ml para la realizadon de la práctca 2.3 ( PEPCK ).

-Homogenizar 2,5 g en 23 ml ( dil 1 / l0 ) de HCIO4 al 2% ( vinilo - vidrio ). Guardar el homogenado en camara fría ( 4 ºC ) para permitir la extracción del glucógeno ( práctica 2.2 ).

2.1.2. GLUCONEOGENESIS EN CORTES DE RIÑON.

La gluconeogénesis es sí proceso metabólico encargado de la síntesis de glucosa y otras hexosas a partir de sustratos no glucídicos. Este proceso es particularmente Importante en los mamíferos superiores en los que tanto la glucogenolisis como la gluconeogénesis se inducen como mecanismos reguladores de la glucemia durante los per lodos di IntermitencIa en la Ingestión. La gluconeogénesis también es particularmente activa en el caso de ejerddo muscular prolongado, cuando las reservas de glucógeno muscular han sido agotadas y el lactato producido por la glucolisis anaerobia es transformado por el hígado y riñón en glucosa para su reutilización.

No sólo el hígado es el responsable de la regulación de los niveles de glucosa en sangre. El riñón. que en estados fisiológicos normales soporta un 10 % del proceso gluconeog6níco total del animal en condiciones tales como acidosis metabólica, ayuno o diabetes, aumenta su participación hasta cubrir caso un 50% de la síntesis total de glucosa.

Durante el ayuno. así corno por la ingestión de una dieta rica en proteínas y pobre en glúcidos, se produce un mayor incremento de la capacidad gluconeogénica renal que de la hepática, con lo que se consigue una mayor rapidez en la excrección del amonio producido.

Los principales sustratos gluconeogénicos son el lactato, el gilcerol y los aminoácidos. los cuales entran en la vía gluconeogénica en tres puntos: piruvato. acetoglutarato y succinato.

Obietivo: Determinar la capacidad giuconeogénica de la corteza renal en condiciones control, ayuno (de 48 h), diabetes ( por la administración de estreptozotocina ).

Al poner un corte de riñón durante un cierto tiempo en un medio salino idóneo, temperatura adecuada, suficiente oxigenación y los precursores gluconeogónicos oportunos ( utilizaremos lactato y acetoglutarato ), el tejido renal realiza su actividad gluconeogénica que se mide por la cantidad de glucosa producida durante ese tiempo y cedida al medio.

Procedimiento:

-Limpiar uno de los riñones de toda materia grasa y depositarlo sobre un soporte cubierto de papel de parafina y humedecido con NaCl al 0,9%.

-Sujetándolo con un portaobjetos se realizan tres cortes sagitales en la parte exterior del riñón ( despreciando el primer corte y de forma que se obtenga únicamente tejido de la corteza y no de médula ) de menos de 0.5 mm de grosor mediante una cuchilla humedecida en solución salina.

-Depositar inmediatamente cada corte en un matraz de Erlenmeyer de 25 ml de capacidad conteniendo 4 ml del medio de incubación correspondiente ( blanco,

lactato y -cetoglutarato.

BLANCO ( sin sustrato ): 4 ml de medio de incubación ( Krebs-Ringer-Bicarbonato. M.l. )

LACTATO: 3.6 mide M.l. + 0.4 mide lactato 0.1 M.

- CETOGLUTARATO: 3,6 mide M.l. + 0,4 mide - cetoglutarato 0.1 M.

-Gasear con carbógeno ( 95% de O2 de C02 ) durante 30 segundos y tapar los matraces inmediatamente con tapón de goma.

-Poner a Incubar a 39 ºC ( Tª fisiológica renal ) con agitación durante 60 minutos.

-Transcurridos los 60 minutos se retiran los matraces del baño.

-Recoger con pinzas los cortes y depositarios en la casilla correspondiente del papel de aluminio suministrado por el profesor para su desecación en estufa a 70 ºC y posterior pesada.

-Cada medio de incubación se regoge en un tubo. se anota el volumen y se añade

0.1 ml de HCIO4 del C0% por cada ml de medio de incubación. Este tratamiento

tiene por objeto desnaturalizar y precipitar las proteínas del corte que hayan quedado en solución y puedan interferir en la posterior determinación de la glucosa.

-Añadir una gota de indicador universal y KOH al 20% gota a gota agitando continuamente hasta alcanzar la neutralidad ( pH 7: color VERDE ). Anotar el volumen final para calcular el factor de neutralización ( vol final / vol inicial).

-Guardar en carnare fría hasta el día siguiente, cuando se centrifugará a 1000 rpm / min antes de utilizar el sobrenadante para la determinación de glucosa.

Cálculos y resultados:

-Con la concentración de glucosa obtenida para medio de incubación

neutralizado ( se determinara en la práctica 2.2). Calcular los moles de glucosa en el medio de incubación sin neutralizar (es decir multiplicando por FN y por 4

ml ). Referir esta cantidad a peso ( en g ) de tejido seco y al tiempo de

incubación ( es decir, expresar en mol de glucosa / h x g capacidad gluconeogénica ). Tener en cuenta que para calcular la capacidad

gluconeogénica a partir de lactato o a partir de -cetoglutarato. hay que restarle a estas la obtenida en los matraces blanco (Sin sustrato).

Reactivos ( 8 grupos de 4 alumnos )

-Lactato 0.1 M (112 mg + csp 10 ml agua).

- -Cetoglutarato 0.1 M ( 168.1 mg + csp 10 ml agua).

-Medio de Incubación Krebs - Ringer - Bicarbonato :

NaCI 1,43 g

KCI 46 mg

MgS04 29 mg

KH2PO4 11 mg

CaCl2 39 mg

NaHCO3 420 mg

+ csp 200 ml agua. Gasear con C02 10 min. Mantener en frío.

-Heparina al 1% ( 5 ml del 5% + 20 ml de sol. salina ).

-Pentobarbital sódico ( 125 mg en 5 ml de sol. salina: 0.5 ml / rata ).

-NH4CI 1,5% ( 7.5 g + 500 ml agua corriente ). Para bebida de las ratas 10 días antes.

-Estreptozotocina ( 120 mg en 4.5 ml de sol. salina: 0,5 ml / rata ).

-Material necesario para para la disección y extracción de muestras (bisturí, tijeras, pinzas, portaobjetos. tabla de disección, jeringa de 5 ml sin aguja, jeringa de insulina, esparadrapo, tapón).

-Sacarosa 0,25 M, HCI04 60% y 2%. KOH 20%. NaCí 0.9%.

DETERMINACION DE LA CONCENTRACION HEPATICA DE GLUCOGENO

EN RATA. DETERMINACION DE GLUCOSA EN PLASMA.

El mantenimiento de los niveles plasmáticos de glucosa ( glucemia ) en los organismos superiores es fundamental para el funcioramiento de todos los órganos, al ser la glucosa su metabolito energético fundamental. Los procesos metabólicos implicados en el cometido son dos: el metabolismo del glucógeno y la gluconeogénesis.

La coordinación de estos mecanismos se lleva a cabo por la relación insulina / glucagón.

En situaciones de escasez de glucosa se produce una disminución de la citada relación, lo que provoca la estimulación de la glucogenolisis. así como de la gluconeogénesis. mientras que después de la ingesta la relación hormonal se invierte. estimulándose la glucogenosíntesis y la lipogénosis. El resultado final es la amortiguación de las fluctuaciones de la glucemia.

El glucógeno es un polímero de glucosa. funcionando como reservorio de energía en determinadas ocasiones. Existe en la mayoría de los tejidos. pero principalmente en hígado y músculo. El tejido muscular degrada su glucógeno en circunstancias de ayuno, estrés o ejercido para su utilización exclusiva, debido a que carece de actividad glucosa - 6 - fosfatásica. Sin embargo, el glucógeno hepático posee un papel esencial en el mantenimiento de la glucemia. En situaciones de ayuno, las reservas glucídicas del hígado son suficientes para mantener la concentración de glucosa en sangre durante las 12-14 primeras horas.

El metabolismo del glucógeno es muy activo en animales de alimentación intermitente. como el hombre y la rata. degradándose en los períodos de ayuno y sintetizándose después de cada Ingesta.

Objetivo: En esta practica. el glucógeno se determinará midiendo la cantidad de

glucosa total hepática obtenida después de una hídrolisis con - amilogiucosidasa. que degrada totalmente el glucógeno hasta convertirlo en glucosa, y restando a esta medida el valor obtenido para la glucosa libre hepática. Asimismo, se determinará la glucosa en plasma y en los medios de incubación de gluconeogénesis renal.

- amiloglucosidasa

GLUCOGENO + H2O ( GLUCOSA ) n

pH 4,8

Método:

1. Obtención del hígado ( para realizar el día anterior ). Sacrificar una rata adulta por dislocación cervical. Extraer el hígado completo y depositarlo en un vaso que contenga NaCl al 0,9% en exceso y en baño de hielo. Pesar 5 g de tejido e introducirlo en otro vaso que contenga 46 ml ( para que la dilución sea de

1110 ) de HCIO4 al 2% también en hielo. Trozear finamente con unas tijeras y homogenizar a mano con homogenizador vidrio-vidrio. Guardar el homogenado en cámara fría (4 ºC ) durante 24 h con objeto de permitir la extracción del glucógeno.

2. Hidrólisis del gIucógeno.

Encender la centrífuga a 20 ºC. Encender un baño de agua termostatizado a 40 ºC. Mezclar el homogenado e introducirlo en un tubo de centrífuga. Centrifugar ( rotor 20, 1000 rpm, 10 min ). Medir el Volumen de sobrenadante. Neutralizar con KOH al 20% y al 2%. Medir Volumen final con objeto de conocer el factor de neutralización ( FN ). Guardar unos 15 min en hielo. Centufugar nuevamente ( 1000 rpm ). De este sobrenadante. guardar unos 10 ml en la cámara fría para determinar GLC LIBRE ).

Cada pareja: tomar 0,2 ml de sobrenadante y añadirle 3 ml de mezcla

enzimática - 1 ( M.E.-1, - amiloglucosidasa ), en un tubo de vidrio largo.

Dejar en baño termostatizado a 40 ºC, con agitación durante 1 hora. Detener la reacción mediante la adición al tubo de 0.8 ml de HCIO4 al 2%. Extraer del baño. Esta solución se empleará para la determinación de GLC TOTAL. (vol = 0,2 + 3 +0,8).

3. Determinación de glucosa.

Dilución de las muestras (a realizar por cada pareja en tubos cortos ):

Para Glc libre:

CONTROL AYUNADA DIABETICA

Dilución 1 / 20 1/ 10 1 / 10

Muestra ( ml )

0,25 0,5 0,5

Agua 4,75 4,5 4,5

destilada

Para Glc total:

CONTROL AYUNADA DIABETICA

Dilución 1 / 10 1/ 5 1 / 5

Muestra ( ml )

0,5 1,0 1,0

Agua destilada

4,5 4,0 4,0

Para Plasma: (Estas diluciones las realizará el profesor )

CONTROL AYUNADA DIABETICA

Dilución 1 / 20 1 / 20 1 / 50

Muestra ( ml )

0,1 0,1 0,05

Agua destilada

1,9 1,9 2,45

Para Medio GNG:

CONTROL AYUNADA DIABETICA

Dilución SIN DILUIR SIN DILUIR SIN DILUIR

Fundamento del método:

Se realiza por un mátodo enzimático ("glucosa oxidasa-peroxidasa"), que pesenta dos ventajas: especificidad y sensibilidad ( aunque un 36% de la

glucosa está en su forma -, la que reacciona es la forma -. que está en

equilibrio con la forma - "mutarrotación"- y, a medida que se consume la

forma - el equilibrio se desplaza hacia la forma -). La -D-glucosa. mediante

la glucosa oxidasa ( .D-glucosa-oxígeno oxidorreductasa. GOD ) y en presencia de H2O y oxígeno molecular, se oxida dando ácido D-glucónico y agua oxigenada :

GOD

.D.glucosa + H2O + O2 ácido - D -glucónico + H2O2

El peróxido de hidrógeno formado se descompone mediante la acción de la peroxidasa ( POD ) y, el oxigeno liberado oxide a un agente cromógeno.

POD

H2O2 + DH2 ( Incoloro. leucobase ) 2 H2O + D ( coloreado, cromobase )

El contenido de D formado a partir de DH2 es una medida de la cantidad de glucosa. siempre y cuando la cantidad de leucobase utilizada sea suficiente. El espectro de absorción del compuesto D ( o-dianisidina, 3,3'-dimeloxibencidina ) llene un máximo de absorción a 440 nm. El coeficlente de extinción de esta sustancia varía con las condiciones experimentales. por lo que las medidas han de referirse siempre a las de un patrón de glucosa conocida.

Protocolo: Distribuir en tubos de vidrio largos lo que a continuación se indica ( tener en cuenta que las muestras deben estar ya diluidas convenientemente ):

TUBO Nº GLUCOSA 0,2

mM / ml

H2O Muestra

ml

1 ( blanco ) 1

2 ( 0.05 mol glu ) 0,25 0,75

3 ( 0.10 mol glu ) 0,5 0,5

4 ( 0.15 mol glu ) 0,75 0,25

5 ( 0.20 mol glu ) 1

6 ( GLC LIBRE ) 0,5 0,5

7 ( GLCTOTAL ) 0,5 0,5

8 ( GLC PLASMATICA ) 0,5 0,5

9 ( MEDIO GNG bl ) 1

10 ( MEDIO GNG Lac ) 1

11 ( MEDIO GNG - KG )

1

Añadir e todos los tubos 5 ml de mezcla enzimática- II (M.E.- II ). Mezclar y leer la absorbancia al cabo de les 60 minutos.

Cálculos:

Construir una curva patrón, representando absorbancia ( ordenadas ) frente a mol de glucosa ( abcisas ). La relación debe ser lineal y pasar por el origen. La absorbancla obtenda en las muestras se extrapola a la recta patrón y se deduce

así los mol de glucosa en la muestra utilizada. A partir de estos datos y, teniendo en cuenta las diluciones, calcular:

a) Glucosa libre hepática en mol / de tejido.

b) Glucosa total hepática en mol / 1 g de tejido.

c) Glucógeno hepático en mol / g de tejido.

d) Glucemia (mM) ( mol / ml obtenido en gráfica ) x (1 / 0,5 ) x FD

e) [Glucosa en medio de incubación de GNG neutralizado ( mol / ml obtenido en gráfica ).

Tener en cuenta:

Glc libre: ( mol / ml obtenido en gráfica ) x ( 1 / 0.5 ) FD ( FH ml / g) = mol / g

Glc total: ( mol / ml obtenido en gráfica ) x ( 1 / 0,5 ) x ( 4 / 0,2 ) x FD x (FH ml

/ g ) = mol / g

Glucógeno = glc total - glc libre

TUBOSD.O. D.O. - BLANCO

1 0,067 0

2 0,155 0,088

3 0,200 0,133

4 0,258 0,191

5 0,328 0,261

6 0,198 0,131

7 0,170 0,103

8 0,074 0,007

FD = Factor de dilución

FH = Factor de homogeneización, es común 25 ml / 2,5 g tej.

mol 4 ml 1 ml 25 ml mol

glc total = 0,37 ——— x ———— x ———— x 5 x ——— = 740 ———

ml 0,2 ml 0,5 ml 2, 5 g g tejido

mol 1 ml 25 ml mol

glc libre = 0,42 ——— x ———x 10 x ——— = 84 ———

ml 0,5 ml 2, 5 g g tejido

mol 1 ml mol

glucemia = 0,01 ——— x ——— x 50 = 1 ——— = 1 mM

ml 0,5 ml ml

Glucógeno = glc total - glc libre = 740 - 84 = 656 mol / g tejido

Reactivos :

- Mezcla enzimática - I : 170 mg de - amiloglucosidasa en 100 ml de tampón acetato 0.1 M a pH 4,75 ( 0,82 g + cap 100 ml ).

- Mezcla enzimática - II :

Glucosa oxidasa 20,9 mg

Peroxídasa 14,3 mg

o-Dianisidina 5 ml ( 5 mg en 5 ml etanol 80 % )

Llevar todo a 1 L de tampón fosfato-NaH2 (78g )-tris (12.1 g ), pH 7,3.

-Solución patrón de glucosa 0,2 mM (18 mg + csp 500 ml agua ).

Práctica V

DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD DE LA PEPCK EN HIGADO DE RATA

EN DISTINTAS SITUACIONES METABOLICAS.

La enzima fosfoenolpíruvato carboxicinasa (PEPCK ) tiene una gran importancia dentro del proceso de gluconeogénesis. La PEPCK cataliza in "vivo" el paso de fosforilación y descarboxilación de oxalacelato (OAA ) a fosfoenolpíruvato (PEP ).

GTP ( ITP ) GDP ( IDP )

OAA PEP

( Mn2+ ) CO2

La PEPCK tiene un peso molecular de unos 70 kda, aunque puede variar dependiendo del origen. Contiene hierro en su molécuIa. Presenta un absoluto requerimiento de metales divalentes ( Mg2+ , Mn2+ ) y puede funcionar con igual actividad con GTP o ITP. Su mecanismo cinético es del tipo secuencial ordenado.

Desde el punto de vista gluconeogénico es una enzima particularmente importante en hígado y riñón. Su localización intracelular varía segun las especies desde ser totalmente citoplasmática ( rata ) a ser tanto citoplasmática como mitocondrial (humanos y cobayas ).

A nivel de metabolitos, se regula por la relación ATPIADP, que da lugar a relaciones paralelas GTP / GDP e ITP / IDP. A nivel hornonal, la PEPCK está regulada por el glucagon y las catecolaminas. que aumentan su actividad en hígado pero no tenen efecto en la enzima renal. Los glucocorticoides estimulan la síntesis de la enzima en ambos tejidos. La insulina inhibe la enzima hepática. pero tiene que ir acompañada de un aumento de la concentración de glucosa.

Objetivo: Determinación de la actividad de la PEPCK en homogenado de hígado de rata en distintas situaciones metabólicas ( ya obtenidos en la práctica 2.1.1 ). La actividad de la PEPCK es determina utilizando un sistema enzimático acoplado con la enzima 1-malato deshidrogonasa (MDH):

PEPCK

PEP + IDP + HCO3- OAA + ITP

Mn2+

NADH ( H+ )

MDH

NADH

L - Malato

La mezcia de reacción, que se "dispara" con PEP. contiene IDP. HCO3- NADH y MDH en exceso. de tal forma que la reacción tolal esta únicamente limitada por

la actividad de la PEPCK (presente en el extracto hepático ). La actividad se determina en base a la velocidad de desaparición del NADH medida espectrofotométricamente a 340 nm. La desaparición de cada molécula de NADH corresponde a la transformación de una molécula de PEP a malato.

Protocolo:

TUBO MEZCLA DE

REACCION ( ml )

H2O

( ml )

EXTRACTO

HEPATICO ( ml )

BLANCO 3 0,2

CONTROL 3 0,2

AYUNADA 3 0,2

DIABETICA 3 0,2

-Leer y anotar la abeorbancia de las muestras (Abs Inicial ).

-Disparar la reacción ( en los tres tubos ) con 0.2 ml de PEP (16.5 mM) y poner en marcha el cronómetro.

-Despu6s de disparar cada tubo, introducirlos en el baño a 37 ºC.

-Medir y anotar la absorbancia de cada tubo a los tiempos 2, 3, 4, 5 y 6 minutos ( midiendo altematívamente los tubos cada 30 segundos a partir del minuto 2 ). Después de cada medida. devolver los tubos al baño.

Cálculos y Resultados :

Representar la absorbancia con respecto al tiempo

-Calcular la pendiente de la recta.

-Calcular la actividad en mol / min x g de tejido

mol / g = ( Abs / 6, 22 ) x ( 3, 4 / 0,2 ) x ( FH ml / g )

Muestra obtenida de una rata ayunada

La pendiente disminuye en el blanco porque el NADH se estropea a Tª ambiente.

DO 0 DO 2 DO 3 DO 4 DO 5 DO 6

BLANCO 0,737 0,696 0,693 0,690 0,687 0,684

MUESTRA 1,209 0,953 0,924 0,896 0,880 0,865

Cálculos :

pte muestra = -2,2 x 10-2

pte blanco = -3 x 10-3

pte muestra - pte blanco = Abs / min = 0,02

A = ( Abs mol / 6, 22 min ml ) x ( 3 / 0,2 ) x ( 13 ml / 2,5 g tej ) = 0,24 mol /min g

Reactivos :

-NaCl 0.9%; Sacarosa 0.25 M.

-PEP 16,5 mM (163 mg + csp 20 ml agua ).

-Tris - HCI 36 mM, pH 7,4 ( 436 mg tris + HCI hasta pH 7,4 + csp 100 ml agua).

-Mezcla de Reacción:

MnCl2 11,8 mg

NaHCO3 75 mg

Glutation Reducido 17 mg

IDP 27 mg

NADH 5 mg

MDH 20 l

+ csp 100 ml con el tanpón tris-HCI 36 mM, pH 7.4.