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LABORATORIO DE CULTIVO DE TEJIDOS

PRÁCTICA 2: DESCONGELAMIENTO DE UNA LÍNEA CELULAR

Chantal Rodríguez Navarro A01064585

Mariana Berbeyer Castillo A01098097

Miguel Ojeda Millán A01099203

Profesor: Dra. Hera Andrade Zaldívar

Tecnológico de Monterrey, Campus Puebla, México. A 27 de

Agosto del 2015

Objetivo

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Adquirir los conocimientos y destreza para realizar el descongelamiento de una línea celular.

Introducción

La crioconservación es una técnica la cual almacena células a una muy baja temperatura en

nitrógeno líquido, las células se encuentran en suspensión, la cual por lo regular es en solución de

glicerol o de DMSO y suero con el fin de conservarse sin perder sus funciones vitales. Este proceso

es crítico, ya que un inadecuado congelamiento de la línea celular reduce drásticamente la viabilidad

de las células.

Una vez asegurándonos que la crioconservación se realizó con éxito al tener disponibles células

sanas, en fase exponencial y sin contaminantes se procede al descongelamiento celular, esta es una

técnica que nos permite tener disponibles las células congeladas, siendo un paso crucial para el

desarrollo de protocolos de investigación o de producción. De igual manera, en el descongelamiento

de las células para su propagación se siguen pasos críticos como: descongelamiento lo más rápido

posible, adición lenta de medio completo para diluir el crioprotector. El realizar adecuadamente estos

pasos nos llevará a tener una viabilidad celular alta, con el consecuente éxito en la propagación de la

línea celular.

El cultivo debe monitorearse en un microscopio y si es necesario hacer otro recuento celular. Las

células se recuperan del nitrógeno de forma variable por lo cual es necesario observar los cultivos

meticulosamente durante varios días y proceder a su subcultivo cuando sea preciso.

Materiales y Métodos

Material biológico

Medio DMEM completo (10 % suero fetal bovino + 1% de antibióticos)

Medio DMEM completo (2% suero fetal bovino + 1% de antibióticos)

PBS 1 X libre de calcio y magnesio

Alcohol al 70 % + Benzal al 05%

Material

2 o 3 Crioviales con células MDCK congeladas a -80°C

1 botella T75 estéril o T25 estéril

1 vaso de precipitado de 100ml estéril

1 vaso de precipitado de 250ml estéril

1 frasco Duran de 100ml.

Tubos cónicos de 13 ml estériles

Puntas para micropipeta de 1000ul estériles

Pipetas estériles de varias medidas

Pipeteador automático.

Equipo utilizado

Campana de flujo laminar

Incubadora

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Centrífuga para tubos cónicos

Protocolo experimental

Descongelamiento

Sacamos del ultracongelador lo crioviales con células MDCK, posteriormente dentro del cuarto de

cultivo los desinfectamos con etanol 70% para colocarlos alrededor de 3 minutos dentro de la

incubadora para descongelarlas. Una vez descongeladas, procedimos a desinfectar el criovial con

etanol 70% para introducirlo a la cabina de bioseguridad. Con ayuda de una micropipeta

homogeneizamos el fluido, subiendo y bajando lentamente las células y transferimos todo el

contenido, aproximadamente 500 ul, a un tubo cónico estéril de 13 ml, al cual añadimos lentamente

0.5 ml de suero fetal bovino (SFB) atemperado a 37°C y después 4.5 ml de medio DMEM

atemperado a 37°C. Y centrifugamos a 2000 rpm durante 3 min a RT

Lavado

Dentro de la cabina de bioseguridad, con ayuda de una pipeta quitamos cuidadosamente el

sobrenadante sin dañar el pellet celular, una capa formada que se precipitó al fondo del tubo y no

presentaba ningún color. Logrado esto, añadimos 5 ml de PBS 1X (libre de calcio y magnesio)

atemperado a 37°C y centrifugamos a 2000 rpm durante 1 min y 30 seg.

Sembrado

Dentro de la cabina de seguridad quitamos con una pipeta el sobrenadante y suspendimos las

células en 1 ml de medio DMEM – 10% SFB (completo), subiendo y bajando el fluido

cuidadosamente para eliminar la formación de grumos. Una vez homogeneizado, añadimos 16 ml

más de medio, lo cual sembramos en una botella T75 s. E incubamos a 37 °C en una atmósfera de

5% de CO2. Finalmente revisamos el crecimiento celular a las 24 horas y una vez visto su

adherencia en el frasco se agregó suero para mejorar su confluencia.

Resultados

Las etapas de descongelamiento, lavado y sembrado dentro del procedimiento se realizaron con la

finalidad de obtener un crecimiento celular en tipo de monocapa, en específico este crecimiento es

clasificado como estacionario debido a que las células incubadas no tuvieron agitación ni

sedimentación. Para observar el crecimiento de las células se hizo uso de un microscopio de

fluorescencia, con mucho cuidado y tomando las precauciones necesarias para evitar cualquier

contaminación se sacó de la incubadora la botella T75 donde se realizó la siembra, debido a las

propiedades físicas de la botella se pudo observar directamente en el microscopio un crecimiento

considerable y exitoso del cultivo celular animal, se logró observar que algunas células no se llegaron

a adherir al fondo del envase, más sin embargo una cantidad considerable logro está adherencia. La

morfología de las células adheridas fue en forma poligonal tendiendo a agruparse en láminas de

células poligonales.

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Figura 1. Microscopía óptica de la monocapa epitelial MDCK

Discusión

Una parte muy importante para lograr el éxito del cultivo celular animal es controlar la mayor cantidad

de factores posibles, en cuanto el medio la correcta concentración del suero y de los antibióticos, su

pH, la osmolaridad, temperatura, así como conocer los requerimientos indispensables de la línea

celular con la cual se trabajó. La importancia de la adición del suero en el medio es que promueve el

crecimiento y facilita la adhesión al sustrato, en cuanto a los antibióticos ayudan a evitar el desarrollo

de contaminantes microbianos en el cultivo.

Otro punto importante que cabe resaltar y debe de estar en todo momento presente en el

procedimiento es la asepsia con la que se trabaje, el crecimiento celular radica en un correcto control

de asepsia, en esta se hace uso de etanol para limpiar todo el material y de una cámara de flujo

laminar en una cabina aislada y por otra parte para asegurar la esterilidad la siembra celular se

incuba a 37°C

En la actualidad el cultivo celular tiene un gran auge debido a que su éxito de cultivo está asociado a

sustituir ensayos con animales siendo el cultivo celular menos costoso y más fácil de manipular.

Conclusiones

Con la realización de la práctica nos dimos cuenta de todo los cuidados implicados en el

descongelamiento de una línea celular. Las células son muy delicadas por lo cual el procedimiento se

debe hacer los más rápido, cuidadoso y asépticamente posible ya que errar en cualquiera de estos

factores puede afectar la viabilidad celular y ocasionar la muerte de estas. El reto de volver viables a

células que se encontraban congeladas no acaba solo en el proceso de descongelamiento, es decir

en el paso final de colocar las células con medio en condiciones favorables de crecimiento (atmósfera

de CO2 al 5% y temperatura de 37ºC), sino que se debe llevar a cabo una inspección exhaustiva a lo

largo de los días que se mantendrá el cultivo, ya que nos podemos encontrar con varios factores que

afectan el crecimiento celular e incluso ocasionar la muerte, factores como falta de medio,

contaminación o un porcentaje de confluencia alto indicativo de que se debe realizar un subcultivo.

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En conclusión trabajar con células de mamífero representa un gran reto y compromiso del personal

de laboratorio tanto para volverlas viables como para mantenerlas viables.

Cuestionario:

1. ¿Cuáles son las medidas para llevar a cabo el adecuado descongelamiento de una línea celular?

El descongelamiento debe realizarse en el menor tiempo posible ya que esto previene la formación

de cristales cuando la temperatura aumenta de -50 a 0ºC, si este proceso es realizado con lentitud

puede causar un daño celular y pérdida de viabilidad. Además se debe tener extremo cuidado al

agregar el medio de cultivo y suero bovino nuevo, ya que el poner en contacto estos con las células

de una forma brusca puede ocasionar un choque osmótico y en consecuencia un rompimiento

celular. Es importante realizar el procedimiento de descongelamiento con suma esterilidad ya que

cualquier tipo de contaminación en el medio de crecimiento para las células es fatal para su

reanimación.

2. ¿Cómo se debe manipular el tanque de N2 líquido y qué medidas de seguridad se deben seguir?

Para cualquier manipulación de nitrógeno líquido es imprescindible el uso de guantes especiales

adaptados para el entorno criogénico, así como una máscara o pantalla facial y calzado cerrado;

nunca deben sumergirse las manos en el nitrógeno líquido ni cuando se usan los guantes especiales.

La vía principal de exposición es la respiratoria, por lo cual se debe evitar la inhalación de gases ya

que puede ocasionar asfixia por el desplazamiento del oxígeno ya que el nitrógeno es más pesado.

Para el almacenamiento y manipulación del nitrógeno se debe designar un cuarto especial, el cual

debe estar a una temperatura por debajo de los 50ºC, ventilado y señalizado correctamente haciendo

énfasis en el uso adecuado de la vestimenta de seguridad.

3. ¿Cuál es el motivo por el que se adiciona lentamente el medio completo a las células que se

acaban de descongelar?

El motivo por el cual el medio completo es agregado lentamente es para prevenir un choque

osmótico en las células, las células se expanden debido a que contienen solutos que ocasionan un

flujo osmótico del agua hacia su interior, es decir, el medio completo funge como solución hipotónica

(de baja concentración de solutos), por lo cual para regular el gradiente de concentración deja que

moléculas de agua fluyan a su interior, esta expansión puede producir lisis o rompimiento celular

4. ¿Cómo se evalúa la viabilidad de las células recién descongeladas?

La viabilidad celular puede ser evaluada realizando un conteo celular en una cámara de neubauer, se

toma una alícuota de células provenientes del medio y se tiñe con un colorante, generalmente azul

de tripano. Posteriormente se realiza un conteo de células vivas en el microscopio, las células vivas

serán aquellas que no se encuentran teñidas, ya que la membrana celular impide el paso del

colorante al interior de la célula, mientras que las células muertas serán las que se encuentren

teñidas de azul, indicativo de que hubo una lisis celular y el colorante logro penetrar el interior celular

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5.- ¿Qué es el DMSO?

El DMSO (dimetilsulfoxido) es un disolvente orgánico industrial, en la microbiología se utiliza como

criopreservante, tiene la función de prevenir la formación de cristales de agua en el interior de la

célula durante el proceso criogénico, ya que la formación de cristales puede ocasionar un

rompimiento celular.

6.- ¿Para qué sirve el buffer PBS?

EL buffer fosfato salino (PBS) es una solución acuosa que contiene cloruro sódico, fosfato sódico y

cloruro de potasio. Su concentración y composición es muy semejante a la de la matriz extracelular

de las células de mamíferos, esta solución se encuentra en un pH fisiológico (7.4). El PBS se utiliza

para lavar las células a través de centrifugación, ya que es isotónico y no es tóxico para las células

7.- ¿Cuál es la composición del medio DMEM?

Tabla 1. Composición del medio DMEM 3

8.- ¿Qué tipo de células son las células MDCK y cuál es su morfología?

En esta práctica trabajamos con la línea celular epitelial MDCK, por sus siglas en inglés Riñón

Canino Madin Darby, procedentes de un riñón de perra adulta. Esta línea celular generalmente se

utiliza para estudiar los mecanismos en los que algunas proteínas se insertan en sitios particulares

de la membrana plasmática. Muchos de ellos, implican estudios del brote de virus en la membrana

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apical o basolateral. Así mismo ésta línea celular es útil para el estudio in vitro de hormonas, factores

de crecimiento y señales de transducción 2. La morfología de esta tipo de células es epitelial.

Referencias

1. Brito, L. S.f, Aspectos básicos sobre el manejo y la preservación de los cultivos celulares.

Recuperado el 25 de Agosto del 2015 de

https://www.uam.es/personal_pdi/.../CursocultivosUAM2008.pdf

2. Rudolfs K. Zalups, Lawrence H. Lash, 1996. Methods in Renal Toxicology. CRC Press., Pág.

226-228.

3. Coll M, J. 1993. Técnicas de diagnóstico en virología. Díaz de Santos. Pág 151.

4. Asenjo, J. (2000). Obtenido de

http://sgpwe.izt.uam.mx/files/users/uami/favela/tejeda_cap_5.pdf

5. Cultek. (2005). Cultek. Obtenido de http://www.cultek.com/aplicaciones.asp?

p=Aplicacion_Almacenamiento&opc=tecnicas&idap=58#indice

6. IDIPAZ. (2009). Obtenido de http://www.idipaz.es/ficheros/files/Que%20es/2015/RIESGOS

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7. Humana, L. d. (22 de Mayo de 2008). genomica.uaslp. Obtenido de

http://www.genomica.uaslp.mx/Protocolos/Cell_Buffer_PBS.pdf