Universidad Politcnica de Puebla

Ingeniera en BiotecnologaGentica Molecular

Practica 1 Electroforesis (mtodo casero)

Por: Marco Antonio Mendoza Garca Rivers Emmanuel Morales Salazar

5BP

Introduccin:La electroforesis es una tcnica para la separacin de molculas segn la movilidad de estas en un campo elctrico a travs de una matriz porosa, la cual finalmente las separa por tamaos moleculares y carga elctrica, dependiendo de la tcnica que se use, el uso de la electroforesis para separar protenas lo informo por primera vez en 1973 el bioqumico sueco Arne Tiselius. La tcnica que el introdujo, fue una de las pocas tcnicas analticas poderosas disponibles en los primeros aos de la qumica de protenas. Existe una gran variedad de mtodos.Electroforesis de campo pulsante: mtodo empleado para separar una mezcla de molculas grandes, tales como fragmentos de ADN o protenas, haciendo pasar una corriente elctrica a travs de un gel que contiene las muestras que se desea separar.Electroforesis capilar: muy extendido en los servicios de secuenciacin de ADN a gran escala en donde la muestra se hace pasar a travs de un tubo largo.Electroforesis en gel: separacin de varias molculas biolgicas bajo la influencia de un campo elctrico, usando un polmero como alginato, agarosa o poliacrilamida.Electroforesis en gel azarosa: permite separar molculas de ADN y ARN en funcin de su tamao, la muestra se somete a la accin de un campo elctrico aplicado a un gel agarosa.Electroforesis en gel de campo pulsante: separacin de molculas de ADN muy grandes (de 50 kpba varios mpb) alternando de forma pulsante la direccin de la corriente elctrica a travs del gel.Electroforesis en gel gradiente trmico: separacin de ADN segn su movilidad, en condiciones que favorecen progresivamente la desnaturalizacin por calor.Electroforesis en gel de poliacrilamida: separacin de cidos nucleicos y protenas, atendiendo a su tamao molculas, se basa en la migracin de molculas cargadas elctricamente a travs de un matriz inerte.

Principio generalLa electroforesis separa partculas en base al movimiento incluido por un campo elctrico. El campo elctrico resulta en la aplicacin de una fuerza sobre las partculas que es proporcional a su carga o potencial de superficie. La fuerza resultante induce una velocidad diferente en las distintas macromolculas. En otras palaras si se aplica un campo elctrico durante un perodo de tiempo dado a travs de una matriz que contiene una mezcla de macromolculas con diferentes potenciales de superficie, las molculas estarn en diferentes lugares al detener el campo. Tipos de electroforesisExisten dos modalidades de electroforesis: Electroforesis libreEl campo elctrico se aplica a disoluciones o suspensiones. Electroforesis zonalEs una de las tcnicas ms utilizadas en bioqumica y biologa molecular por su elevada resolucin. El campo elctrico se aplica a un medio o soporte estabilizante y la muestra se deposita en una reducida zona del mismo.Objetivos: Construir una cmara de electroforesis casera Preparar una solucin buffer de corrida y el soporte solido Observar el fundamento de la electroforesis Materiales y mtodos:Materialesreactivos

Eliminador de corriente (9 a 12 volts)Agua embotellada

Matraz Erlenmeyer 250mlAgar bacteriolgico

Jeringa Vinagre

Parafilm o papel ceraGlicerina

Tijeras o cutterBicarbonato de sodio

Papel aluminio Cloruro de sodio

Cinta de aislarAzul de metileno

Tapa de plstico

Metodologa:Preparacin del buffer de corridaSe pesaron 15gr de bicarbonato de sodio, 1.25gr de sal y se diluyeron en un matraz aforado de 500ml, se y posteriormente se le adicionaron 2.5ml de vinagre, se agito para obtener la solucin buffer.

Construccin de la cmara de electroforesisSe tom un topper de plstico que tuvo la funcin de una cmara, y en el cual se colocaron los cables (polo positivo y polo negativo) de un eliminador de corriente en los dos extremos de la cmara, asegurndolos con silicn para que quedaran firmes en el recipiente. Se construy una peineta de forma que encajara correctamente en un recipiente ms pequeo en el cual se arm el gel.Preparacin del soporte solidoSe prepar el gel a una concentracin del 2% p/v de grenetina, utilizando 50ml del buffer de corrida agregndolos en un vaso de pp., posteriormente se calent hasta que la solucin quedo homognea. Se dej enfriar y se agreg en un contenedor pequeo, se coloc la peineta, la cual nos permiti dejar huecos en el gel (pequeas perforaciones) en donde se cargaron las muestras. Corrida de la pruebaUna vez gelificado el soporte solido se retir con cuidado la peineta y se sac el gel del contenedor, se transfiri a la cmara de electroforesis construida.Se cubri el gel con el buffer de corrida. Se tomaron tres gotas de cada muestra y se colocaron en el parafilm y se mesclo con una gota de colorante, una vez mezcladas se volvi a tomar y colocar en los huecos del gel.Por ltimo se conect el eliminador de corriente y se observ el movimiento del colorante del gel, el cual se dej desplazar por 15 minutos o hasta observarse movimiento de hasta 1/3 del gel.Resultados:Como resultados se obtuvo la construccin de una cmara de electroforesis y se realiz una prueba para determinar el funcionamiento de la misma y lograr observar el principio de la electroforesis.

Imagen 1: Cmara de Electroforesis Discusin de resultados:Los resultados en esta prctica se vieron limitados debido a distintos factores, uno de los principales fue la realizacin del soporte solido ya que despus de haber gelificado fue un tanto difcil extraerlo del molde, esto fue a que el molde no tena la forma adecuada adems de que el gel se adherido a las paredes del gel, y al intentarlo extraer se rompi, esto nos hiso suponer que la concentracin de grenetina fue baja y adems que el molde debi llevar una base antiadherente. Otro factor que afecto para obtener un resultado satisfactorio fue que en la cmara que se logr realizar la prueba los polos se haban invertido por lo que no se logro observar un movimiento de las molculas del colorante. Conclusin:Se logr construir una cmara de electroforesis utilizando materiales de uso comn como lo son toppers, un cargador de celular sin usar, y tapas de plstico. As tambin se logr realizar la preparacin de la solucin buffer de corrida y el soporte slido para realizar la electroforesis, y con ello observar el fundamento de la electroforesis poniendo en prctica una corrida con colorante. Bibliografa: 1. Jacqueline Kroschwitz, ed., Encyclopedia of chemical technology. 4th ed., John wiley & Sons, 1994, p. 3562. Alan Townshend, ed., enciclopedia of Analytical Science, vol. 2, Harcourt Brace and Company, 1995, p. 1041.3. Jorgenson, J. W. Analytical Chem, 1986, 58, 7, 743A