PRACTICA DE LABORATORIO N005

EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DEL SUSTRATO: CALCULO DEL KM

I. FUNDAMENTO TEÓRICO

Las enzimas son proteínas altamente especializadas que catalizan numerosas reacciones en los sistemas biológicos. Una propiedad importante es su especificidad a la hora de reaccionar con sustratos, acelerando determinadas reacciones químicas en disolución.

En general, un enzima proporciona el ambiente en que una reacción determinada es, energéticamente, más favorable. El rasgo distintivo de una reacción catalizada enzimáticamente es que ocurre en un lugar específico del enzima, el sitio activo. La molécula fijada en el sitio activo y sobre la que actúa el enzima se denomina sustrato. El complejo enzima-sustrato formado es de vital importancia para definir el comportamiento cinético de las reacciones catalizadas.

Una reacción enzimática sencilla puede formularse como sigue:

Donde E, S y P representan enzima, sustrato y producto, respectivamente. ES y EP son complejos del enzima con el sustrato y con el producto.

La función del catalizador es aumentar la velocidad de una reacción reduciendo la energía de activación de la misma, Ea. Los catalizadores no modifican los equilibrios de la reacción ni se consumen durante el proceso.

Los principios generales de la cinética de las reacciones químicas son aplicables a las reacciones catalizadas por las enzimas, en los seres vivos

Un rasgo característico que no se observa en los catalizadores no enzimáticos, se trata de la saturación por el sustrato, entendida en términos de ocupación de los centros activos de todas las moléculas de enzima.

Estudiar el efecto de la concentración de sustrato sobre la actividad de una enzima no es sencillo si pensamos que lógicamente la concentración del sustrato disminuye según avanza la reacción

Una simplificación en los experimentos cinéticos consiste en medir la velocidad inicial (Vo).

Si el tiempo es suficientemente corto la disminución de sustrato será mínima y ésta podrá considerarse, por tanto, casi constante.

Hay un número limitado de sitios en la enzima para fijar substrato; una vez que están ocupados todos, por mucho que aumente la concentración de substrato, la velocidad permanecerá constante tendiendo a un valor asintótico

La figura muestra el efecto de distintas concentraciones de sustrato sobre la velocidad inicial de la reacción catalizada por un enzima:

En la cinética enzimática de la figura se distinguen tres fases:

Para una concentración baja de sustrato, la velocidad de la reacción es directamente proporcional a la concentración del sustrato (relación lineal), la cinética es de primer orden.

k1

K -1

k2

Para una concentración alta de sustrato, la velocidad de la reacción se hace prácticamente constante e independiente de la concentración de sustrato, la cinética se considera de orden cero.

Para concentraciones de sustrato intermedias la velocidad del proceso deja de ser lineal, y a esta zona se la denomina de cinética mixta.

La velocidad de una reacción catalizada nos indica la cantidad de sustrato consumido, o producto formado, por unidad de tiempo. En el Sistema Internacional se designa por “U” (unidad de actividad enzimática) y corresponde a los µmoles de sustrato consumidos en 1 min, o bien a los µmoles de producto formado en 1 min.

La curva que expresa la relación entre la concentración de sustrato y la velocidad inicial tiene la misma forma para la mayoría de las enzimas; se trata de una hipérbola rectangular, cuya expresión algebraica viene dada por la ecuación de Michaelis-Menten

Los términos Vmax (velocidad máxima) y Km (constante de Michaelis) son dos parámetros cinéticos característicos de cada enzima, que pueden determinarse experimentalmente.

Velocidad Máxima:

La velocidad de una reacción (v) es el número de moléculas de substrato convertidas en producto por unidad de tiempo y usualmente se expresa en µmoles de producto formadas por minuto. La velocidad de una reacción catalizada por una enzima, aumenta conforme se incrementa la concentración de substrato hasta que se llega a una velocidad máxima (Vmax), a partir de la cual la velocidad de la reacción, es independiente de la cantidad de substrato. El que la velocidad no pueda seguirse incrementando, refleja la saturación del sitio activo con el substrato.

El Km nos indica la concentración de sustrato a la cual la velocidad de reacción es la mitad de la velocidad máxima, este parámetro es independiente de la concentración de enzima, y es característico de cada enzima según el sustrato utilizado (si tiene varios).

El Km también indica la afinidad que posee la enzima por el sustrato, siendo ésta mayor, cuanto menor es la Km. Cuanto menor sea la Km menor será la cantidad de sustrato necesaria para alcanzar la mitad de la velocidad máxima, por lo que mayor será la afinidad del enzima hacia ese sustrato.

En las reacciones no catalizadas, la velocidad de reacción es proporcional a la concentración de cada uno de los reactantes. Esto es consistente con el hecho de que la velocidad de colisión entre los reactantes es proporcional a la concentración de cada uno de ellos. Las reacciones catalizadas por enzimas son algo diferente. Cuando se mide el efecto de la concentración del sustrato de la velocidad de reacción en presencia de una cantidad constante de enzimas, se encuentran a muy bajas concentraciones de sustrato, cantidades incrementadas de este, causan velocidades marcadamente incrementadas.

II. OBJETIVO

La presente práctica tiene como objetivo estudiar la influencia de la concentración del sustrato sobre la velocidad de una reacción enzimática, para lo cual se utilizara la glucosa oxidasa.

III. MATERIALES Y REACTIVOS

Reactivos y Material Biológico

Fenol4-aminofenazona

Agua destiladaGlucosa oxidasa

Oeroxidasa

Glucosa

IV. PROCEDIMIENTOa. Efecto de la concentración del sustrato sobre la actividad de la glucosa

oxidasa.

TUBO 1 2 3 4Reactivo de trabajo(ml) 1 1 1 1Glucosa(ul) 10 20 30 40Mezclar * * * *Incubar a 370C/10min * * * *

Mezclar: Leer en el fotocolorímetro usando filtro de 505 nm. Determinar la actividad enzimática en cada uno de los tubos de incubación (del 1 al4), para lo cual comparar la lectura recogida de cada tubo con las lecturas de la curva de calibración que será proporcionada. Utilizando concentración molar del sustrato en cada tubo de incubación y su correspondiente actividad, graficar de acuerdo a la ecuación de LINEWEAVER BURK y empleando la grafica, calcular el Km y la Vmax.

V. CÁLCULOS Y RESULTADOS

TUBO 1 2 3 4Reactivo de trabajo(ml) 1 1 1 1Glucosa(ul) 10 20 30 40Mezclar * * * *Incubar a 370C/10min * * * *Absorvancia 0.29 0.247 0.235 0.21[Glucosa]mg/dl 137.7935 117.76205 111.66025 99.7815

Observaciones:

En el laboratorio las primeras lecturas tomadas por el espectrofotómetro estuvieron mal realizadas debido a que el equipo esta des calibrado, y los resultados obtenidos (mostrados en el cuadro) se realizaron mucho tiempo después de agregada la enzima (20 min aproximadamente) y habiendo dejado las muestras sin una temperatura constante (factor que varia la velocidad de reacción enzimática).

VI. CONCLUSIONES

Un rasgo característico que no se observa en los catalizadores no enzimáticos, se trata de la saturación por el sustrato, entendida en términos de ocupación de los centros activos de todas las moléculas de enzima.

Estudiar el efecto de la concentración de sustrato sobre la actividad de una enzima no es sencillo si pensamos que lógicamente la concentración del sustrato disminuye según avanza la reacción .

La velocidad de una reacción catalizada nos indica la cantidad de sustrato consumido, o producto formado, por unidad de tiempo.

El Km nos indica la concentración de sustrato a la cual la velocidad de reacción es la mitad de la velocidad máxima, este parámetro es independiente de la concentración de enzima, y es característico de cada enzima según el sustrato utilizado.

VII. RECOMENDACIONES

Tener el debido cuidado al manipular tanto la enzima como el sustrato.

Una vez realizada la incubación de la muestra realizar inmediatamente su respectiva lectura en el espectrofotómetro dado que la velocidad de reacción enzimática se ve afectada por diversos factores entre ellos las temperatura, presión, pH, etc.

Cerciorarse de que el espectrofotómetro este debidamente calibrado antes de realizar las lecturas.

Al momento de manipular el espectrofotómetro tomar las debidas precauciones como: no tocar la parte inferior del tubo de ensayo, no mover los controles para evitar des calibrarla, etc.

VIII. BIBLIOGRAFÍA

Adamas, R y Davison R., 1980 Bioquímica de los Ácidos Nucleídos. Edic. Reverte. Barcelona España.

Lehninger, A.; 1971 Bioquímica. Edit. Omega. Barcelona. España. Conn, E. 1978. Bioquímica. Fundamental; Edit. Limusa Mexico.