PRCTICA 4 AMPLIFICACIN DE DNA MEDIANTE PCR-RAPD

INSTITUTO POLITCNICO NACIONALUNIDAD PROFECIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGALABORATORIO DE INGENIERIA MOLECULAR

PRCTICA 4 AMPLIFICACION DE DNA MEDIANTE PCR-RAPD

EQUIPO 1: DIAZ BARROSO ARTURO HERNANDEZ MENDOZA TAIDA V. HERNANDEZ ORTEGA MONZERRAT LPEZ GOMEZ SANDRA

GRUPO: 7AV2

PROFESOR:GERARDO RODRGUEZ MUZ

9 MARZO DEL 2015Contenido1.Introduccin32.Propsito de la prctica43.Marco Terico4MAAP (Mltiples perfiles arbitrarios de amplificacin)4RAPD (DNA polimrfico amplificado al azar)4AP-PCR (PCR con oligonucletidos arbitrarios)54.Procedimiento65.Discusin de Resultados76.Conclusiones97.Anexos98.Referencias9

1. IntroduccinLa reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) cambi radicalmente los mtodos de anlisis a nivel molecular. Para estimar la diversidad gentica, se pueden amplificar mediante la PCR diferentes regiones del genoma y comparar entre individuos, poblaciones o especies diferentes. En especies para las que no se cuenta con suficientes datos genmicos previamente publicados, o bien para las cuales se quiere obtener informacin gentica de manera rpida y relativamente econmica, se pueden emplear marcadores moleculares inespecficos. Estos marcadores usan iniciadores (tambin llamados oligonucletidos o primers) que amplifican al azar diferentes regiones en el genoma y generan un patrn de productos de PCR o huella gentica (Wolfe y Liston 1998) que se visualizan mediante una electroforesis en geles de agarosa o acrilamida. Los marcadores conocidos como RAPDs (del ingls Random Amplified Polymorphic DNA o ADN polimrfico amplificado al azar) (Williams et al. 1990) y a los ISSRs (de Inter-Simple Sequence Repeats o regiones intermedias entre secuencias simples repetidas). Para fines de los estudios de gentica de poblaciones, estos marcadores son marcadores dominantes, lo cual significa que bajo el modelo de un locus con dos alelos, la presencia de una banda representa al genotipo dominante (tanto homcigo como hetercigo), mientras que una ausencia de la banda representa al genotipo homcigo recesivo. Los RAPDs son una tcnica que consiste en la amplificacin de segmentos de ADN con iniciadores pequeos (generalmente de 10 nucletidos de longitud) de secuencias aleatorias no-palindrmicas, con un contenido de G + C entre 50 y 80%, (Lynch y Milligan 1994). La secuencia del iniciador es elegida a priori de manera arbitraria y slo se utiliza un iniciador por reaccin, que actuar al mismo tiempo como iniciador sentido y antisentido. Los fragmentos obtenidos se visualizan como un patrn de bandeo caracterstico del individuo y cada banda observada se considera un locus. La presencia o la ausencia de las bandas entre individuos se deben a cambios en la secuencia (o a la prdida) de los sitios a los que se alinea el iniciador (Navarro 1999). La insercin o eliminacin de nucletidos en la secuencia intermedia entre los dos sitios de acoplamiento, aumentar o disminuir el tamao de la molcula amplificada.

2. Propsito de la prcticaEl propsito de la presente prctica es realizar la reaccin de PCR-RAPD para amplificar segmentos al azar y analizar el patrn de bandeo obtenido.

3. Marco TericoMAAP (Mltiples perfiles arbitrarios de amplificacin) Trmino genrico acuado en 1994 con el que se designan las tcnicas que emplean oligonucletidos arbitrarios para generar huellas dactilares complejas. RAPD (DNA polimrfico amplificado al azar)Es una de las tcnicas ms verstiles desde que se desarroll en el ao 1990. Se usa una coleccin de decanucletidos para amplificar por PCR reas especficas distribudas al azar por el genoma. Su pequeez y la baja temperatura de alineamiento (36C) aseguran que se unen a infinidad de secuencias en el genoma para conseguir amplificar muchos fragmentos de DNA. Estos fragmentos se pueden separar en geles de agarosa para obtener perfiles electroforticos que variarn segn el polimorfismo de los distintos individuos o grupos de individuos, y proporcionarn una huella dactilar caracterstica. Es muy cmoda, rpida, requiere poco DNA que adems no necesita estar muy puro, no presupone conocimientos previos sobre la secuencia, y se pueden distinguir rpida y simultneamente muchos organismos. Sus inconvenientes son que los fragmentos amplificados no suelen corresponder a DNA ligado a algn carcter, sino redundante, y que no da informacin sobre el nmero de copias que el DNA genmico contiene de la secuencia amplificada. Esta tecnologa ha sido utilizada para la catalogacin de frutos, seleccin de variedades, y diferenciacin de lneas clonales. Tambin se est utilizando para el anlisis de las variedades de apio, uva, limn y olivo.AP-PCR (PCR con oligonucletidos arbitrarios) La idea es similar a la de la RAPD, desarrollndose a la vez que sta, aunque se cambia el diseo de los oligonucletidos y el tipo de PCR. Los oligonucletidos han de ser largos (no menos de 20 nt), y la PCR consta dos de ciclos de baja astringencia (poco especficos) que permite la polimerizacin de una batera de fragmentos caractersticos de cada variedad. Esta fase va seguida de ciclos de alta astringencia para amplificar (visualizar) especficamente las bandas anteriores. Los fragmentos amplificados se pueden migrar en un gel de agarosa para observar las grandes diferencias entre especies, o bien se puede marcar radiactivamente y migrar en gel de poliacrilamida para obtener resultados mucho ms finos y precisos. Existe una variacin denominada DAF (Huellas dactilares por amplificacin de DNA) que utiliza oligonucletidos de 5 a 15 bases, pero las huellas proporcionadas suelen ser muy complejas y difciles de interpretar.

4. Procedimiento ExperimentalSe program el termociclador de la siguiente forma: 95C 8min; 95C 1min, 45C 1min, 72C 2min (40 ciclos); 72C 15min; Almacenamiento 4C.Se prepar la mezcla de reaccin en tubos de microensayo de 0.5mL, en condiciones de esterilidad con: Amortiguador de amplificacin 10X (3l), MgCl2 (16mM), dATP, dCTP, dGTP, dTTP (1.5mM c/u), Primer 1nM, Agua desionizada y esteril c.b.p (20l). Se agregaron de 20-50 ng de DNA de pepino.Posteriormente se aadi una gota de aceite mineral estril a cada tubo, y se colocaron en el termociclador calentado a 90C, 1 min.Despus se adicionaron 1.5 unidades de la enzima Taq polimerasa, una vez adicionada la enzima se colocaron los tubos en el termociclador y se corri el programa. Electroforesis en gelSe prepar un gel de agarosa al 3% con TE y se sumergi dentro del tanque de la cmara llena del regulador TAE. Se colocaron las muestras de PCR, procurando no tomar el aceite y se mezclaron con 7l de colorante de corrimiento y cargaron los pozos de gel con la mezcla. Dejar un pozo para el marcador de PM. y otro pozo para una muestra de DNA sin amplificar.Se tap la cmara y desarrollar la electroforesis a 100 mV, 30min y se revelaron las bandas obtenidas con luz UV.5. Discusin de Resultadosa) Anlisis PracticaEn la obtencin de resultados de esta prctica, por razones que se intentan explicar a continuacin, no se obtuvieron evidencias a analizar; por esta razn para efectos del anlisis de la Amplificacin de DNA mediante PCR-RAPD, tambin se muestra el anlisis de resultados de un estudio realizado sobre: la amplificacin de DNA polimrfico mediante RAPD para detectar el efecto genotxico de metales pesados.Las principales ventajas del mtodo RAPD es su rapidez, la aplicabilidad a cualquier organismo (ya que no se requiere ninguna informacin sobre la secuencia de nucletidos, ciclo celular o cromosoma) y la sensibilidad para detectar una amplia gama de dao en el ADN y las mutaciones. Sin embargo, RAPD es un mtodo cualitativo y la naturaleza y cantidad de los efectos de ADN slo se puede especular.La reaccin de PCR es muy sensible a cambios de iones, temperaturas, contaminantes que pueden estar en el ADN o en el agua. Una de las desventajas de esta tcnica es la contaminacin cruzada: a pesar de la extremada sensibilidad de PCR, la cual es una de las ventajas principales, existe riesgo de resultados falso-positivos. En teora, una sola molcula del producto previa a una amplificacin puede contaminar muestras negativas en una amplificacin subsecuente. Otra gran desventaja que puede afectar en la obtencin de resultados, es la inestabilidad de este reactivo. Este problema aumenta en climas donde la temperatura es alta. En cuanto al DNA es realmente estable a temperatura ambiente cuando es seco y el tiempo de vida media de la Taq DNA polimerasa es prolongada si se mantiene en frio. Una recomendacin que hacen otros estudios para la obtencin de resultados positivos, es hacer la mezcla del PCR lo ms homognea posible. Una causa muy comn de errores se encuentra aqu, el congelar y descongelar cambia las concentraciones de los reactivos y/o forma gradientes dentro de los tubos, y al homogeneizarlos se asegura obtener resultados reproducibles. Ya preparados, los tubos deben mantenerse en hielo o a 4 C hasta meterlos al termociclador, para evitar que la polimerasa sintetice fragmentos inespecficos.Cuando no se obtiene nada el problema puede estar en el ADN que puede estar contaminado con protenas o alguna sustancia que inhibe la reaccin de PCR. La polimerasa necesita de iones de magnesio para funcionar adecuadamente (MgCl2 permite aumentar la intensidad de las bandas y una mejor visualizacin) pero mucho magnesio inhibe a la polimerasa, y poco puede generar productos inespecficos.Revisar los oligonucletidos ya que podran estar degradados, defectuosos, mal diseados o incluso que la cantidad utilizada no sea la correcta. Si hay mucha cantidad aumenta el rendimiento del PCR, pero podran formarse productos inespecficos, y si se agrega an mayor cantidad los oligos pueden formar dmeros, en vez de unirse al ADN, y eso impide la amplificacin del producto. Si se utiliza muy poco, podra tener mayor especificidad en el producto, pero puede suceder que no veremos el amplificado (pues baja el rendimiento), as que es necesario encontrar el ptimo para cada reaccin.Es muy frecuente que los PCRs se contaminen. Para monitorearlo, siempre hay que trabajar con un control negativo: un tubo extra al que se le agreguen todos los reactivos utilizados en el PCR, excepto ADN. Si en esta muestra hay amplificacin significa que en algn reactivo hay restos de ADN o de producto de PCR que est contaminando el experimento. Si esto sucede, consideramos que lo ms fcil es deshacerse de todas las alcuotas sospechosas (por eso es importante preparar alcuotas de todos los reactivos) y tomar alcuotas nuevas. Para prevenirlo sugerimos algunas medidas que podran ser de utilidad: los productos de PCR son frecuentemente los que contaminan, al ser molculas de tamao muy pequeo y al estar tan concentradas es fcil que una gotita de producto quede en una pipeta (las pipetas absorben el lquido por aspersin y las gotitas quedan regadas como si fueran spray); al preparar una mezcla posteriormente, esto contamina alguno de los reactivos que se utilizan. Para evitarlo existen puntas con filtro y pipetas especiales, pero son caras. Tambin existen cabinas con luz UV y flujo laminar, aunque tambin son caras. La luz UV forma dmeros de pirimidina entre las dobles cadenas de ADN, por lo que estas molculas se vuelven imposibles de amplificar. Por otro lado, el flujo laminar evita contaminacin de un tubo a otro, y es til sobre todo si se trabaja con plsmidos o reamplificando productos de PCR ya que las molculas pequeas son altamente contaminantes. Sugerimos tambin separar las reas de trabajo (la zona de preparacin y la zona de amplificacin; si no es posible, limpiar muy bien la zona con alcohol antes de preparar la mezcla del PCR, y trabajar siempre sobre un papel) y tener un juego de pipetas exclusivo para trabajar la mezcla para la reaccin de PCR, separadas de las pipetas con las que se manejen los productos de PCR ya amplificados. Otra fuente de contaminacin es el ADN que amplificamos, aqu el problema puede ser sobre todo los dedos, al abrir y cerrar los tubos. La sugerencia ms comn es utilizar guantes. Tambin sugerimos agregar el ADN al final en cada tubo, si es posible utilizar una pipeta slo para el ADN, y si no hay, tener mucho cuidado y limpiar muy bien las pipetas despus de agregarlo. Tambin se evita la contaminacin si se guardan en lugares y/o cajas distintas los reactivos del PCR, las muestras de ADN y los productos de PCR.Otra sugerencia es utilizar material que haya sido esterilizado en autoclave para que est libre de ADN y de nucleasas. Esta es una medida muy comn, pero se pueden tener contaminaciones provenientes del agua de la autoclave, tambin se puede descontaminar utilizando luz ultravioleta en las pipetas; Adems del control negativo que nos permite visualizar posibles casos de contaminacin, una vez que se ha ajustado el protocolo de PCR es siempre recomendable incluir un control positivo. ste es un tubo que contiene ADN de una muestra que haya amplificado adecuadamente y cuyo patrn de bandas es conocido. De esta manera, puede esperarse que si la reaccin se llev a cabo correctamente, esta muestra siempre salga. En caso contrario, si el PCR no gener bandas en ninguna de las muestras, ni siquiera en el control positivo, puede suponerse que el error radica en que no se agreg algn reactivo o bien que los ciclos de temperatura no se llevaron a cabo adecuadamente, ya sea por problemas de la mquina o bien por error al elegir el programa de amplificacin.b) Anlisis del artculo

Figura 1 Optimizacin de RAPD-PCR

Figura 2 RAPD derivado de las plantas de rin de frijol tratado con metales pesados

Figura 3 RAPD derivado de las plantas de rin de frijol tratado con metales pesadosEl estudio del artculo Aplicacin de RAPD para detectar el efecto genotoxico de los metales pesados, busca evidenciar la genotoxicidad de ciertos los metales y de qu forma modifica la huella gentica, en este caso de la planta de frijol. Y esto se puede decir que es una de las muchas aplicaciones que tiene el RAPD.

El estudio se realiz con cadmio, plomo y manganeso, que son metales pesados y son conocidos por ser genotxicos, es decir que se distinguen por modificar a los cromosomas y con ello las caractersticas del individuo.En la figura uno se muestra la comparacin, de la banda 4-9 del ADN del frijol a diferentes concentraciones y con ello la influencia del mismo que podra producir en una PCR, por lo que observamos que a mayor concentracin de ADN hay mayor concentracin en cada una de las bandas y por ello el grosor de cada una es mayor.En los resultados se log evidenciar que la huella gentica del frijol tiene 77 bandas, de las cuales se modifica su cantidad en las plantas de frijol suministradas con los metales pesados anteriormente nombrados. Las plantas a las que se les suministr 350mg/l se encontraron la aparicin de 22 bandas y desaparecieron 34 bandas que se presentaban en la huella original, de igual forma a la concentracin de 150mg/l aparecieron 18 bandas. La modificacin gentica se hace ms evidente en que hay una disminucin en el crecimiento de la raz en un 50-70% adems de que se presenta una deficiencia de clorofila (clorosis).6. ConclusionesPara estimar la diversidad gentica, se pueden amplificar mediante la PCR diferentes regiones del genoma y comparar entre individuos, poblaciones o especies diferentes. Empleando marcadores moleculares inespecficos. Estos usan iniciadores (tambin llamados oligonucletidos o primers) que amplifican al azar diferentes regiones en el genoma y generan un patrn de productos de PCR o huella gentica que se visualiza mediante una electroforesis en geles de agarosa o acrilamida.La reaccin de PCR es muy sensible a cambios de iones, temperaturas, contaminantes que pueden estar en el ADN o en el agua. Una de las desventajas de esta tcnica es la contaminacin cruzada. Otra fuente de contaminacin es el ADN que amplificamos, puede ser la contaminacin por nuestras manos, al abrir y cerrar los tubos. Generando el anlisis se puede suponer que el error radica tambin en que no se agreg de manera correcta algn reactivo o bien que los ciclos de temperatura no se llevaron a cabo adecuadamente, ya sea por problemas de la mquina o bien por error al elegir el programa de amplificacin.En el artculo analizado se busc evidenciar la genotoxicidad de ciertos los metales y de qu forma modifica la huella gentica de la planta de frijol. Y esto se puede decir que es una de las muchas aplicaciones que tiene el RAPD.7. AnexosCantidades de la Reaccin Amortiguador 3 l DNTPs Factor de dilucin: 2/15= 13.3 l

MgCl2: Marca Sigma Catalogo M8 787-1Factor de dilusin: 25 Mm/10=2.5 Mm

Primer

DNA

Preparacin de la MezclaAmortiguador3 l

DNTPs2.25 l

Primer0.6 l

DNA0.6 l

Taq Polimerasa1.5 l

MgCl212 l

Agua10.05 l

Total30 l

ReferenciasYeates,C., METHODS FOR MICROBIAL DNA EXTRACTIOM FROM SOIL FOR PCR AMPLIFICATION, 1998Miller, D., EVALUATION AND OPTIMIZATION OF DNA EXTRACTION AND PURIFICATION PROCEDURES FROM SOIL AND SEDIMENTS SAMPLES, 1999Clria, J., HERRAMIENTAS BSICAS DE ANLISIS GENTICO, Afseth G.1997. PCR primer, stategies to improve results http://www.biotechlab.nwu. edu/pe/ , accesado 08/03. Casas Ciria F.J, 2003. Microbiologa qumica en la www http://www.microbiologiaclinica.com/generalidades.htm, accesado 08/01.