• Paso 1: Desnaturalización del DNA

• Paso 2: Hibridación de los "Primers"

• Paso 3: Extensión

P.C.R."Técnica de amplificación

enzimática de secuencias específicas de DNA"

P.C.R."Técnica de amplificación

enzimática de secuencias específicas de DNA"

Paso 1: Desnaturalización del DNA (>90ºC)Paso 1: Desnaturalización del DNA (>90ºC)

Paso 2: Hibridación de los "Primers"(40-65ºC)Paso 2: Hibridación de los "Primers"(40-65ºC)

Paso 3: Extensión (72ºC)Paso 3: Extensión (72ºC)

Final del Primer Ciclo de PCRFinal del Primer Ciclo de PCR

A C GT3’

A T G C A T G C A T G C

Alineamiento y extensiónAlineamiento y extensiAlineamiento y extensióónn

5’

•

• -A T G C A T G C A T G C * *

A C G T-T5’ 3’

Alineamiento y extensiónAlineamiento y extensiAlineamiento y extensióónn

•

• -A T G C A T G C A T G C * *

A C G T-T A5’ 3’

Alineamiento y extensiónAlineamiento y extensiAlineamiento y extensióónn

•

• -A T G C A T G C A T G C * *

A C G T-T A C5’ 3’

Alineamiento y extensiónAlineamiento y extensiAlineamiento y extensióónn

•

• -A T G C A T G C A T G C * *

A C G T-T A C G5’ 3’

Alineamiento y extensiónAlineamiento y extensiAlineamiento y extensióónn

2

48

16 32 64

El Poder de la P.C.R.

"En cada ciclo de PCR se consigue duplicar el

número de copias de DNA"

El Poder de la El Poder de la P.C.RP.C.R..

"En cada ciclo de PCR se consigue duplicar el

número de copias de DNA"

• ELISA en Microplaca

• Electroforesis en Gel de Agarosa

• Hibridación en membrana

• Secuenciación

DetecciónDetección

Reacción de color

Se añade el DNAal soporte.

Soporte con las sondas unidas para cada especificidad HLA-II

Identificacióndel DNA unidopor la posición en el soporteExtracción DNA

Se añade los primersmarcados con biotina

La PCR amplificala parte seleccionada

DNA amplificado

Lavados

Tipaje por PCR-SSO de los genes HLA clase IITipajeTipaje por PCRpor PCR--SSO de los genes HLA clase IISSO de los genes HLA clase II

Se añade el DNAal gel de agarosa.

Extracción DNA

Se añaden los primers

La PCR amplificala parte seleccionada

DNA amplificado

Tipaje por PCR-SSP de los genes HLA clase IITipajeTipaje por PCRpor PCR--SSP de los genes HLA clase IISSP de los genes HLA clase II

BSABSABSA BSABSABSA BSABSABSA BSABSABSA

BB

BB

BBBB

BB

BB

BSABSABSA BSABSABSA BSABSABSA BSABSABSA

BB

TMB oxidadoTMB oxidado

TMBTMB

AvAv--HRPHRP

Medir a 450 Añadir Substratopara HRP

Añadir Avidina-HRP

Lavar

BSABSABSA BSABSABSA BSABSABSA BSABSABSA

BB

AvAv--HRPHRP

AvAv--HRPHRP

AvAv--HRPHRP

AvAv--HRPHRP

Productos de PCR

biotinilados

BBB

BBB

BBB

BBB

BBB

Añadir solución stop

Lavar

Elisa microplacaElisa microplaca

ADN*biotina

Sustrato

Conjugado

SAHRP

Visualización del ADNVisualización del ADN

HLA- A HLA-B HLA-C

Ex 2

Ex 3

Ex 4

Ex 2

Ex 3

Ex 4

Ex 2

Ex 3

Comparación de la secuencia obtenida con la base de datos

TIPAJE MEDIANTE SECUENCIACIÓN (SBT)

TIPAJE MEDIANTE SECUENCIACIÓN (SBT)

• Preparación ARN:–Eliminar ribonucleasas

–RNAm

–Guantes

–Recipientes de plástico estériles

–Soluciones libres de ARNasas

P.C.R. de RNA: RT-PCRP.C.R. de RNA: RT-PCR

• Transcripción Reversa del RNA para convertirlo en cDNA

• P.C.R. del cDNA

P.C.R. de RNA: RT-PCRP.C.R. de RNA: RT-PCR

Componentes y optimización de la

reacción de amplificación

Componentes y optimización de la

reacción de amplificación

Muestra de ADN

�Integridad del ADN: no puede estar fragmentado en trozos más pequeños de lo que queremos amplificar.

�Origen de la muestra y proceso de extracción: la muestra no debe llevar agentes quelantes (EDTA). Tampoco debe haber determinados factores sanguíneos, fenol, detergentes... que inhibirían la actividad de la polimerasa.

�Cantidad de la muestra: si se dispone de suficiente cantidad para la amplificación de ADN genómico de copia única se usan cantidades de 100-500 ng. En el caso de zonas repetidas se puede reducir esta cantidad a 10-50 ng.

Diseño de los cebadores

� El contenido en G + C debe ser aproximadamente del 50%. La relación máxima de purinas/pirimidinas será 60%/40%. � Deben evitarse zonas con largas secuencias de una sola base. � No seleccionar cebadores que en su extremo 3´ tenga una importante estructura secundaria. � Recomendable, los extremos las últimas bases sean G o C. � Se debe evitar la complementariedad entre la pareja de cebadores (dimeros primers).. � Normalmente deben tener un tamaño de 18-30 pb. � La Temperatura de hibridación de los cebadores debe ser similar en ambos y será variable en función de la secuencia de los mismos. Generalmente oscila entre los 45 y 60 ° C.

DNA Polimerasa

Taq polimerasa, carecen de actividad 3´-> 5´ exonucleasa.

Conseguir las mejores condiciones para disminuir errores: �No usar un alto número de ciclos, ya que la tasa de error es proporcional al número de estos (25-45).

�La concentración de dNTPs debe ser igual para los 4, siendo lo mas baja posible, sin perder rendimiento.

�Disminuir en lo posible el tiempo de cada etapa.

�La concentración de Mg++ no debe estar en exceso, ya que disminuye la especificidad de la PCR.

Deoxinucleótidos trifosfato (dNTPs)

�dATP, dGTP, dCTP y dTTP.

�Añadir en la solución de la reacción en concentraciones iguales que normalmente oscila entre los 20 y los 200 mMol".

�Los dNTPs pueden captar Mg++, por lo que las concentraciones de ambos componentes deben guardar siempre la misma relación. La concentración de Mg++ debe ser de 0.5 – 1.0 mM veces superior a la concentración de dNTPs.

Amortiguador de la reacciónPor lo general está formado por: 10 mM tris-HCl (pH=8.4 a Tª ambiente) 50 mM KCl, 0.1% 1.5 mM MgCl2. Adyuvantes (aumentan la especificidad y fidelidad de la PCR):•El dimetilsulfóxido (DMSO al 10%) contribuye a la disminución de la estructura secundaria del ADN

•Detergentes como el tween 20, laureth 12 (0.1%) o Tritón x10, que ayudan a estabilizar la enzima.

•Polietilenglicol (PEG), glicerol, formamida, seroalbúminabovina (BSA), etc, aunque no son en ningún caso imprescindibles.

Sales

�Es de gran importancia la concentración de dos cationes *KCl (Influye en la desnaturalización del ADN)

Elevadas concentraciones del K+ favorece la desnaturalización de secuencias cortas de ADN. Bajas concentraciones de K+ ayudan a la desnaturalización de secuencias largas de ADN. *MgCl++ (Aumenta la temperatura de hibridación del DNA) Altas concentraciones de Mg++ disminuyen la especificidad de la reacción.Bajas concentraciones de Mg++ aumentan la especificidad de la reacción

Temperaturas y tiempos de los ciclos

�La Reacción en Cadena de la Polimerasa se realiza en tres etapas que constituyen un ciclo, que repite durante un número determinado de veces:1.- Desnaturalización 2.- Hibridación3.- Elongación

�El tiempo, la temperatura y el número de ciclos son factores determinantes en los resultados de la PCR, por lo tanto modificándolos podemos optimizar la reacción.

1.- Desnaturalización

�Se trata de una etapa crítica ya que es muy importante que el ADN molde se desnaturalice completamente. Se recomiendan temperaturas de 94º-95ºC durante 30´´ a 1´Alto contenido de G + C aumentar el tiempo o la Tª.

�La actividad de la enzima decrece de manera muy rápida a partir de los 95ºC, por lo que a estas temperaturas o superiores es aconsejable disminuir el tiempo de incubación.

�En la práctica se suele añadir un período de desnaturalización antes de comenzar los ciclos para asegurarnos que se produce a lo largo de toda la muestra de ADN. Esta etapa suele ser de 5´a 94ºC.

2.- Hibridación

En este caso, la temperatura y el tiempo van a depender de 3 factores relacionados con los iniciadores: la composición de bases, el tamaño y la concentración.

En la práctica, la temperatura de hibridación puede oscilar entre 45ºC y 65ºC, durante un tiempo comprendido entre 30 segundos y 1 minuto.

Un aumento de temperatura favorece la especificidad ya que disminuye las uniones incorrectas de los iniciadores.

Un aumento del tiempo favorece la inespecificidad por amplificación de productos inespecíficos

3.- Elongación

�En la mayoría de las reacciones, la etapa de extensión se realiza a 72ºC. Teóricamente esta temperatura puede variar entre 70-72ºC.

�El tiempo de extensión depende del tamaño de la amplificación. Se puede estimar un tiempo de 1 minuto para elongar 1 Kb

�En la práctica es normal que al final de todos los ciclos se realice una última elongación de 5´a 72ºC.

Número de ciclos�Este número depende de la cantidad de ADN que existe en la muestra una vez que el resto de factores han sido optimizados.

�Es importante no realizar un número alto de ciclos ya que puede dar lugar a la amplificación de productos inespecificos

�La reacción está producida por una enzima que tiene el efecto meseta.

�Después de un número de ciclos la amplificación deja de ser exponencial y llega a fase estacionaria.

�Cuando el efecto meseta se produce, la cantidad de ADN sintetizado es suficiente para su posterior utilización.

Contaminación en la PCR �La PCR es una técnica muy sensible, por lo que se deben evitar contaminaciones, ya que es posible que el ADN no deseado se amplifique.�Una de sus mayores ventajas se convierte en el principal inconveniente.�Existen una serie de normas que ayudan a evitar las contaminaciones:

Lugar físico exclusivo para realizar la PCR Uso de instrumental exclusivo para la PCR Utilización de reactivos y tubos estériles Uso de guantes por el manipulador Realización de controles de blanco

Preparación

ADN

Preparación

PCR

Post-PCRAREAS DE

TRABAJO

Organización del laboratorioOrganización del laboratorio

• Control Positivo – Interno

–Externo

• Control Negativo–Wipe test

–Contaminación ambiental

CONTROLESCONTROLES

• CARGA VIRAL HEPATITIS C• CARGA VIRAL HEPATITIS B• CARGA VIRAL HIV• GENOTIPO HEPATITIS C• CRIBADO Y GENOTIPADO DE PAPILOMAVIRUS• DETECCIÓN DE MUTACIONES EN EL GEN HFE• FACTOR V LEIDEN• POLIMORFISMOS DE LA PROTOMBINA• MUTACIONES MTHFR• HLA B27• PCR HSV1• PCR HSV2• PCR CMV• PCR SEMICUANTITATIVA CMV• PCR EBV• PCR VZ• PCR HH6• PCR ENTEROVIRUS

PARAMETROS DETERMINADOS EN EL LABORATORIO MEDIANTE PCR

PARAMETROS DETERMINADOS EN EL LABORATORIO MEDIANTE PCR

CONTINUARA

PCR TIEMPO REAL