PRÁCTICA 2

CONSERVACIÓN DE UNA CEPA DE INTERES BIOTECNOLÓGICO

INTRODUCCIÓN

Para la conservación de microorganismos existen diferentes métodos para su preservación.

Estos se pueden clasificar a largo plazo, métodos alternativos y métodos restringidos, entre

los que se destacan como favoritos el cultivo periódico en cuñas de agar, bajo aceite

mineral, conservación de esporas en tierra, arena o silica gel, cepas liofilizadas,

congelación en nitrógeno líquido y en agua destilada o de mar. Para la elección de alguno

de estos métodos se deben de tomar en cuenta varios factores, según sea el objetivo de la

colección. Si el objetivo es clasificar taxonómicamente los cultivos se precisan métodos que

garanticen la estabilidad morfológica de los microorganismos. Así mismo una colección de

interés para la industria debe hacer énfasis en los métodos que mantengan la estabilidad

genética.

Los tres objetivos que hay que alcanzar para conservar correctamente las cepas

microbianas en los laboratorios de microbiología son: que el cultivo a conservar sea puro,

evitando que se produzcan contaminaciones durante el proceso de conservación; que

durante el tiempo de conservación sobrevivan al menos el 70-80% de las células, y por

último, que estas células permanezcan genéticamente estables. Los dos primeros objetivos

no son muy difíciles de conseguir cuando se conoce bien la técnica microbiológica, pero el

tercero puede presentar dificultades, y este es el motivo por el cual existen varios métodos

de conservación para los microorganismos, y ninguno de ellos es de utilización general.

OBJETIVO

Realizar la conservación de una cepa de interés industrial, utilizando diferentes técnicas de

conservación para determinar el mejor método de preservación evaluando la viabilidad de

células.

METODOLOGÍA

Material sesión 1.3 Matraz Erlenmeyer de 125 mL1 Asa recta2 Vasos de precipitados de 250 mL 1 Mechero 1 Piceta para agua destilada 1 Probeta de 100 mL 1 Espátula Algodón Industrial Manta de cielo Papel estraza

Equipo Autoclave Balanza Analítica Reactivos y medios de cultivo Agar Papa DextrosaAgua Destilada Alcohol etílico al 70%

Material Biológico. Muestra problema (S. maydis, Trichoderma harzianum,Trametes sp., Penicillium rockeforti, Aspergillus nigger)

PROCEDIMIENTO

1. Preparar PDA tal y como indica el proveedor. 2. Esterilizar en autoclave, a 1 atm, durante 15 minutos, los matraces PDA.3. Pasar 250 μl de cada una de las diluciones perfectamente homogéneas a una

caja Petri con PDA. 4. Sembrar por picadura el hongo elegido.5. Incubar a temperatura ambiente durante una semana.

Material sesión 2.1 Cámara de Neubauer1 Agitador megnético2 Pipeta de 5 mL1 Propipeta7 Tubos de 10 x 100 con tapa rosca9 Tubos eppendorf de 1.5 mL2 Vasos de precipitados de 250 mL 1 Matraz Erlenmeyer de 125 mL1 Mechero 1 Piceta para agua destilada 1 Probeta de 100 mL 1 Probeta de mL1 Espátula Puntas amarillasPuntas azulesAlgodón Industrial Manta de cielo Papel estraza

Equipo Autoclave Balanza Analítica MicroscopioParrillaMicropipeta Reactivos y medios de cultivo Tween 20Agua Destilada GlicerolÁcido sulfúricoAlcohol etílico al 70%

Material Biológico. Muestra problema (S. maydis, Trichoderma harzianum,Trametes sp., Penicillium rockeforti, Aspergillus nigger)

PROCEDIMIENTO

1. Tratar la arena con una solución de ácido sulfúrico al 0.5 N y realizar de dos a tres lavados con agua destilada. Ponerla a secar.

2. Ya con la arena seca colocarla en los tres tubos eppendorf hasta llenar la mitad de éste.

3. Llenar los tubos de 16 x 150 mm con mL de agua.4. Preparar Tween 20 al 0.1%, y colocarlo en un matraz Erlenmeyer. 5. Esterilizar en autoclave, a 1 atm, durante 15 minutos, el matráz, los tubos, el glicerol,

las puntas.6. Realizar la cosecha de esporas del hongo elegido. 7. Realizar el conteo en la cámara de Neubauer. 8. De acuerdo a este conteo realizar diluciones si es necesario hasta obtener una

concentración de 104 a 105 esporas/mL.

Para realizar la conservación de esporas hacerla por triplicado para da una de las técnicas.

9. En los tubos eppendorf con arena colocar 300 µL. 10.Colocar en los tubos eppendorf 70% de glicerol y 30% de esporas (300 µL). 11.Colocar en los tubos eppendorf 70% de agua estéril y 30% de esporas (300 µL). 12.Conservarlo a 4°C.

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