porque buscamos la hepatitis c? - … diagnostico serologico y molecular... · no mide la presencia...
TRANSCRIPT
PORQUE BUSCAMOS LA HEPATITIS C?ESTE INDIVIDUO TIENE HCV?
ESTA PERSONA (POTENCIAL DONANTE DE SANGRE) PUEDE ESTAR EXPUESTO A HCV ?
QUE EFECTOS TIENE LA INFECCION POR HCV EN EL HIGADO?
CUAL ES LA PROBABILIDAD QUE EL TRATAMIENTO SEA EFECTIVO EN ESTE PACIENTE?
EXISTEN TRATAMIENTOS EFECTIVOS?
QUIENES SON LOS CANDIDATOS A ESTUDIAR EL HCV ?
1- AQUELLOS QUE TIENEN FACTORES DE RIESGO PARA LA INFECCION POR HCV
2- AQUELLOS CON RESULTADOS DE SU FUNCION HEPATICA ANORMAL
3- LOS DONANTES DE SANGRE
4- PACIENTES INFECTADOS CON TERAPIA ANTIVIRAL
IMPACTO DE LA INFECCION
HISTORIA NATURAL DE LA HEPATITIS C
GRAN COHORTE DE PACIENTESGRAN COHORTE DE PACIENTES
AMBOS SEXOS Y DE DIFERENTES ETNICIDAD
FECHA DE INFECCION: HEPATITIS C AGUDAFECHA DE INFECCION: HEPATITIS C AGUDA
SIN TRATAMIENTO
CONOCIMIENTO DE COFACTORES
ESTRATEGIAS PARA EL ESTUDIO DE LA HISTORIA NATURAL DE HCV
INFECCION INICIALFASE TEMPRANA
HEPATITIS CRONICA
FASE TARDIA HEPATITIS CRONICA
(CIRROSIS)
20 A 40 AÑOS
ESTUDIOS RETROSPECTIVOS
ESTUDIOS PROSPECTIVOS
ESTUDIOS RETROSPECTIVOS - PROSPECTIVOS
Leonard Seeff 2002; Hepatology
DINAMICA DE LA INFECCION TEMPRANA POR HCV
INFECCION POR HCV
CLEARANCE VIRAL
TRANSMISSION
PATOGENESIS
PERSISTENCIA VIRAL
Doubling Time Viral :10,8 a 17 horas
HCV RNA 4-7 log
SCREENING SEROLSCREENING SEROLÓÓGICOGICOC
on
cen
trac
ión
Rel
ativ
a
Infección
Anti-HCV 3ra
Anti-HCV 2da
Ag/Ac 4ª
Período de Ventana Serológica
Co
nce
ntr
ació
n R
elat
iva
Días
0 10 20 60 80 10030 40 50 70 90 110
Eclipse
Anti-HCV 2
Anti-HCV 1ra
EIA para Anti HCV
ALGORITMO ALGORITMO DIAGNÓSTICODIAGNÓSTICO
Relación S/CO
BajoAlto
-NEGATIVONEGATIVONEGATIVONEGATIVO
RIBA Anti RT-PCR
++++
-BajoS/CO
AltoS/CO
RIBA Anti HCV
RT-PCR HCV
-
NEGATIVONEGATIVONEGATIVONEGATIVO
-
Evaluación adicional
(PCR, ALT, etc)
IND
INDETERMINADOINDETERMINADOINDETERMINADOINDETERMINADO POSITIVOPOSITIVOPOSITIVOPOSITIVO
++++++++
POSITIVOPOSITIVOPOSITIVOPOSITIVO
Alter et al, Recommendations and Reports, CDC,2003
SCREENING SEROLSCREENING SEROLÓÓGICOGICO
CORE E1 E2 NS1 NS2 NS3 NS4 NS5ELISAELISA
c100-31º
S
80%c100-31º 80%
c200C22-32º 95%
c200 NS5C22-33º 97%
La Pregunta Inicial
¿Falso positivo?
Pruebas Suplementarias:
�Pacientes sanos�No antecedentes parenterales�ALT normal
AntiAnti--HCV (+)HCV (+)
¿Verdadero positivo?
Pruebas Suplementarias:� RIBA-LIA� HCV RNA
�Transfusiones o drogas IV� Incremento de ALT�Enfermedad hepática
Limitaciones del Anti-HCV
�No mide la presencia de virus circulante
�No distingue entre infección aguda, crónica o resuelta
�Es negativo en alrededor del 10% de los �Es negativo en alrededor del 10% de los pacientes con infección crónica C
�No es útil para el diagnóstico de infección aguda (seroconversión en semanas)
�En poblaciones de bajo riesgo la tasa de resultados falsos positivos es alta
EN LOS INMUNOENSAYOS
MUESTRAS QUE PERMANECEN POSITIVAS Y QUE SONNEGATIVAS POR UN TEST CONFIRMATORIO
INESPECIFICA O FALSA REACTIVIDAD
FALSOS POSITIVOS O BFR
2- LAS CAUSAS
INMUNOENSAYOS
La causa primaria de BFR es la reactividad de anticuerpos La causa primaria de BFR es la reactividad de anticuerpos No específicos ya sea contra epitopes virales o no viralescontaminantes
Vacunación contra FLU o RabiaInfecciones agudas recientes o AlergiasAgentes relacionados inmunologicamente
CARACTERISTICAS DE LOS BFR
2- CAMBIOS DE LA TASA DE BFR CON LOS LOTES
1- RELACIONADOS AL ENSAYO
3- VARIACIONES DE BFR DEBIDO A LAS MODIFICACIONES DEL ENSAYO
4- RESULTADOS DE BFR TRANSITORIO
5- LA SEÑAL S/CO
CARACTERISTICAS DE LOS BFR
5- LA SEÑAL S/CO
ENSAYOS DE MICROPLACAS
HCV
ENSAYOS EN TUBOS
HCVBFR S/CO : 1.524
ANTI HCV (+)/ RNA (-) S/CO: 4.546ANTI HCV (+) RNA(+) S/CO: 6.467
MÉTODOS SUPLEMENTARIOSMÉTODOS SUPLEMENTARIOS
RIBA O LIARIBA O LIA
Mayor Especificidad y menor Sensibilidad que EIA de 3º Generación
LUDWIG VAN BEETHOVEN – 1770-1827
El término música clásica es un amplio, a veces impreciso, término que se refiere a la música producida
o arraigada en la tradición
INTERPRETACION
La Biología Molecular es una ciencia cuyo objetivo fundamental es la comprensión de todos aquellos
procesos celulares, que contribuyen a que la informacióngenética se transmita eficientemente de unos seres a
otros, y se exprese en los nuevos individuos.
INTERPRETACION MUSICA CLASICA
ORQUESTA
LA BIOLOGIA MOLECULAR
ENSAYOS
VIOLINES, VIOLAS, FLAUTAS, HIBRIDACION, CLONACION
OBRA MUSICAL(SINFONIA)
HEPATITIS C
VIOLINES, VIOLAS, FLAUTAS, VIOLONCELOS CONTRABAJO, OBOE, FAGOT, CLARINETE
HIBRIDACION, CLONACIONPLASMIDOS, TRANSFECCIONAMPLIFICACION DE ACIDOS NUCLEICOS, SATELITISMO
1º Allegro
2º Adagio o Andante
3º Minuetto o Scherzo
4º Allegro Finale o Rondó
SINFONIA HEPATITIS C
Replicación y Persistencia
Interacción con el SI
Mutaciones
Carga Viral4º Allegro Finale o Rondó Carga Viral
CARGA VIRAL HCV
EL MOVIMIENTO DE ESTA SINFONIA : NAT
LOS INSTRUMENTOS : PCR CUANTITATIVATMA REAL TIME PCRbDNA
ARMONIA : LOS ACORDES
LIMITE DE DETECCION Y CUANTIFICACION
Utilidad Clínica del HCV RNA
�Marcador directo de replicación viral
�Diagnóstico de infección aguda
�Diagnóstico de infección oculta
�Transmisión vertical
�Transmisión por órganos sólidos
�Recurrencia de HCV post-trasplante
�Confiabilidad de los productos sanguíneos
�Accidentes de trabajo
�Monitoreo del tratamiento antiviral
¿Para qué sirve la carga viral de HCV?
�Para estimar la respuesta al tratamiento antiviral
�Para evaluar la respuesta virológica precoz (12 semanas de tratamiento):� HCV RNA negativo o ↓↓↓↓ >2 log� HCV RNA negativo o ↓↓↓↓ >2 log
¿Qué valor tienen la carga viral para evaluar la severidad o el pronóstico
de una hepatitis crónica C?
Ninguno fehacientemente comprobadoNinguno fehacientemente comprobado
Taqman
Syber Green
Tecnología Real time
Syber Green
Easy Q (Molecular Beacon)
A. Martinez-Lab Virología-CEMIC
REAL TIME PCR
Molecular
beacons
Sondas de hibridización
HCV RNA
Syber Green
Tecnología Taqman
Journal of Molecular Endocrinology (2000) 25,169-193
HEPATITIS VIRALES-CARGA VIRAL
REAL TIME PCR :
AUMENTO DEL RANGO DINAMICO : LOG DE 8 O 9
BAJO LIMITE DE DETECCION
BAJA CONTAMINACION
REPRODUCIBILIDAD – HIT RATE 95%
RESULTADOS EN UI/mL
“Workflow” 48 muestras
PCR Extracción, automatizada Amplificación Detección
9:00 10:00 11:00 12:00 13:00 14:00 15:00 16:00 9:00 10:00 11:00 12:00 13:00 14:00 15:00 16:00
DIA 1 DIA 2
RT AmplificaciónDetecciónExtracción, automatizada
SCOTT JD, GRETCH DR. JAMA 2007; 21:724-732
ENSAYOS MOLECULARES PARA HCV
•NASBA HCV QT (BIOMERIEUX) 278 UI/mL
•Procleix HIV 1/ HCV (Gene Probe ) 5 UI/mL
•AmpliScreen HCV (Roche) 50 UI/mL
HCV RNA CUANTITATIVO MONITOREO TRATAMIENTO
SCOTT JD, GRETCH DR. JAMA 2007; 21:724-732
* LOS ENSAYOS MOLECULARES DEBEN ESTAR VALIDADOS
* LOS ENSAYOS MOLECULARES: ESTANDARIZADOS
* LOS ENSAYOS MOLECULARES: CONTROLES DE CALIDAD
PERO CUIDADO!!
* ENSAYOS MOLECULARES COMERCIALES : TRAZABILIDAD
SOBREESTIMACION
DE LA CARGA VIRAL
CAP/ CTM
PAWLOTSKY JM, 2007 Hepatology ;46: 22-31
SUBESTIMACION DE LA CARGA VIRALGENOTIPO 2 (15%)GENOTIPO 4 (30%)
LOS ENSAYOS DE BIOLOGIA MOLECULAR CONSTITUYEN EL NUEVO PARADIGMA EN LAS HEPATITIS VIRALES
NUEVAS TECNOLOGÍAS : ARRAY LÍQUIDO (LUMINEX)
NUEVOS MARCADORES : cccDNA (HBV)
INTERPRETACION