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POLIMORFISMO GENÉTICO DE Echinococcus granulosus AISLADOS DE

DIFERENTES HOSPEDEROS DE ÁREAS ENDÉMICAS DEL PERÚ

MINISTERIO DE SALUDINSTITUTO NACIONAL DE SALUDCENTRO DE INFORMACIÓN Y DOCUMENTACIÓN CIENTÍFICA

[2002]

M.SC.: ELIZABETH SÁNCHEZ ROMANÍBLGO. OMAR CÁCERES REY

YDR. CÉSAR NÁQUIRA VELARDE

SERIE INFORMES TÉCNICOS Nº62

POLIMORFISMO GENÉTICO DE Echinococcus granulosus AISLADOS DE DIFERENTES HOSPEDEROS DE ÁREAS ENDÉMICAS DEL PERÚ

TITULO DE LA INVESTIGACIÓN

POLIMORFISMO GENÉTICO DE Echinococcus granulosus AISLADOS DE

DIFERENTES HOSPEDEROS DE ÁREAS ENDÉMICAS DEL PERÚ

NOMBRES Y APELLIDOS COMPLETOS DE LOS INVESTIGADORES (Mencionarafiliación institucional, teléfono, dirección y correo electrónico de cada uno).

Autores

M.Sc.: Elizabeth Sánchez Romaní

Laboratorio de Biotecnología y Biología Molecular del Centro Nacional en Salud

Pública- INS. Telf. 4719920 anexo 129. Capac Yupanqui 1400 Jesús María

[email protected]

Blgo.: Omar Cáceres Rey

Laboratorio de Biotecnología y Biología Molecular del Centro Nacional en Salud

Pública- INS. Telf. 4719920 anexo 129. Capac Yupanqui 1400 Jesús María

[email protected]

Coautores

Dr. : César Náquira Velarde

Laboratorio de Zoonosis Parasitaria del Centro Nacional en Salud Pública- INS.

Telf. 4719920 anexo 137. Capac Yupanqui 1400 Jesús María

[email protected]


Apoyo Técnico

Tec. Lab. David García Neyra

División de Biotecnología y Biología Molecular del Centro Nacional en Salud

Pública- INS

Telf. 4719920 anexo 129. Cápac Yupanqui 1400 Jesús María

[email protected]

DIVISIÓN EN LA CUAL SE VA A TRABAJAR

División de Biología Molecular y División de Parasitología del Centro Nacional en Salud

Pública del Instituto Nacional de Salud


RESUMEN ESTRUCTURADO

Introducción: Echinococcus granulosus es un pequeño platelminto parásito, que causa la

hidatidosis quística en el hombre y en animales domésticos. Esta zoonosis constituye un

importante problema de Salud Pública principalmente en la región sierra del Perú, donde

existen áreas hiperendémicas. Existen evidencias que en muchas áreas endémicas del

mundo circulan un complejo de variantes intraespecíficas o cepas de Echinococcus

granulosus los cuales pueden tener implicancia en la patogenicidad, infectividad a humanos

y patrones de desarrollo diferentes que en conjunto afectan la epidemiología del parásito.

Objetivos: Conocer los genotipos, que circulan en el país, de la población de Echinococcus

granulosus de hospederos domésticos (ovino, vacuno, caprino y porcino) provenientes de

diferentes áreas endémicas del Perú. Metodología: Protoescolices de Echinococcus

granulosus serán colectados de los hospederos domésticos, a los cuales se les aislará el

ADN. Se realizara PCR para amplificar los genes de la Citocromo Oxidasa I (COI) y NAD

deshidrogenasa I (NDI), los productos de amplificación de ambos genes serán sometidos a

la técnicas de SSCP para determinar si existe o no variaciones en estos genes los cuales son

indicadores de la existencia de polimorfismo genético. Se comprobara el polimorfismo

secuenciando los productos de PCR y realizando la técnica de RAPD para determinar con

exactitud las variantes genéticas de este céstode.

Cabe mencionar que para este proyecto se tiene colectado el material biológico de algunas

áreas endémicas del Perú (Cuzco, Puno, Arequipa, Junín y Huancavelica) faltando colectar

material de los departamentos de Ayacucho, Cajamarca, Ica y Ucayali.

El monto solicitado será de 40,000 nuevos soles


PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

La enfermedad hidatídica unilocular causada por el estadío quístico de Echinococcus

granulosus (Batsch 1786), es una de las más importantes zoonosis parasitarias, que

constituye un problema de Salud Pública en varias zonas del mundo.

E. granulosus es el céstode más pequeño que se conoce, tiene un ciclo de vida complejo

que envuelve dos hospederos (Thompson, R.C.A. et al. 1995, Thompson, R.C.A. 1986): La

forma adulta del parásito infecta un hospedero definitivo que siempre es un carnívoro como

el perro doméstico y otros cánidos; Mientras que la forma quística o larvaria (metacéstode)

se desenvuelve en hospederos intermediarios que son principalmente ungulados (ganado

ovino, vacuno, caprino y porcino entre otros).

A nivel mundial se ha reportado que existen varias cepas de Echinococcus granulosus en

distintas áreas endémicas y en diferentes hospedadores intermediarios (McManus, D.P. &

Smyth, J.D. 1986) estas cepas fueron caracterizadas utilizando en criterios morfológicos,

biológicos, bioquímicos y características epidemiológicas (Eckert, J. & Thompson, R.C.A

1997, Lymbery, J. et. al 1990, Thompson, R.C.A & Lymbery, A. J. 1988, McManus, D.P &

MacPherson, C.N.L 1984), que sugieren que algunas variantes son más infectivas que otras

para el hombre. Estudios basados principalmente en estos criterios indican diferencias de

Echinococcus entre ganado vacuno/perro; cerdo/perro; reno/perro en Europa (Eckert, J. &

Thompson, R.C.A.1988).

Por otro lado estudios bioquímicos realizados en cepas de Echinococcus granulosus

aislados de hospederos intermediaros como oveja, ganado vacuno, cabra y humanos

difieren ligeramente en sus perfiles isoenzimáticos, composición bioquímica básica y

metabolismo, mientras que las cepas aisladas de camello y cabra muestran diferencias

considerables (McManus, D.P 1981, MacPherson, & McManus, D.P. 1982).


Las técnicas moleculares también permitieron comprobar la existencia de las cepas o

variantes genéticas de Echinococcus granulosus, inicialmente se utilizó hibridación con

sondas de ADN marcadas con isótopos radioactivos (McManus, D.P and Rishi, A.K. 1989)

hasta técnicas más modernas tales como el PCR y su análisis utilizando enzimas de

restricción PCR-RFLP (Zhang, L. et. al. 1998, Bowles, J. et. al. 1994, Bowles, J. and

McManus, D.P 1993a), Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) (Scout, J.C. and

McManus, D.P. 1994), Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP) (Zhang, L. et. al

1999, Passer, R.B. et. al 1998) y secuenciamiento de ADN (Bowles, J. & McManus, D.P.

1993b, Bowles, J. et.al. 1992). Estas técnicas han sido ampliamente utilizados para

caracterizar variantes dentro de la especie de Echinococcus granulosus a los cuales se les

conoce como G, actualmente existen ocho genotipos descritos G1-G8 (Kamenetzky, L. et.al

2002)

En las áreas endémicas del Perú existen un amplio rango de hospedadores intermediarios de

Echinococcus granulosus (ovejas, ganado vacuno, cabras, porcinos y auquénidos)

incluyendo el hombre, en los cuales probablemente existan variantes genéticas. Por lo que

nuestro estudio estará dirigido a la determinación de estas variantes utilizando

protoescólices obtenidos de los diferentes hospedadores intermediarios procedentes de las

distintas áreas endémicas del Perú, utilizando para ello técnicas moleculares.

JUSTIFICACIÓN Y USO DE LOS RESULTADOS (Mencionar la importancia del estudio y los beneficios que se obtendrán de sus resultados para la población) (Máximo 1 página):

La identificación de las diferentes cepas de Echinococcus granulosus es un punto de

estudio muy importante ya que existe evidencias que en muchos áreas endémicas del

mundo, existen un complejo de variantes intraespecíficos o cepas de Echinococcus


granulosus los cuales pueden tener diferencias en lo que respecta a infectividad,

antigenecidad susceptibilidad a quimioterapia, patogénesis y características

epidemiológicas del parásito en relación con su hospedero intermediario y al hombre

(Thompson, R.C.A et. al. 1995)

Como resultado del trabajo contaremos con la información del polimorfismo genético de

las poblaciones de Echinococcus granulosus que circulan en las áreas endémicas del Perú,

datos que son importantes tomar en cuenta para estudios epidemiológicos dirigidos a un

posterior establecimiento de programas efectivos para el control de la hidatidosis

FUNDAMENTO TEÓRICO (describir las teorías que sustentan la investigación o antecedentes de otros estudios similares ya publicados) (Máximo media página):

Ocho genotipos de Echinococcus granulosus han sido descritas: la de ciervo, de oveja, de

oveja de Tasmania, de caballo, de bovino, de puerco, búfalo y de camello (Thompsom,

R.C.A. and McManus, D.P. 2002). El genotipo está relacionado al hospedero intermediario

en la cual una mayor proporción de quistes con determinada variantes genética fue

identificada, esto no significa que una cepa infecte solamente el hospedero intermediario

que le dio su nombre. Por ejemplo el genotipo de oveja infecta además de oveja, buey,

cabra, puerco, caballo y es la principal causa de infección en humanos ( Schantz, et. al.,

1995).

Los ocho genotipos descritos para Echinococcus granulosus presentan diferencias en su

distribución geográfica, en el grado de infectividad para diferentes hospederos

intermediarios (Schantz, et.al., 1995) en sus sistemas metabólicos (McManus, D.P. and

Bryant, C. 1995) y en las secuencias de genes mitocondriales COI (citocromo C oxidasa I)

y NDI (NAD deshidrogenasa I) (Bowles, et. al. 1995, 1992).


Las diferencias entre los genotipos de Echinococcus granulosus representan una de los

puntos principales a ser considerados en cualquier estudio epidemiológico dirigido al

establecimiento del programa de control de la hidatidosis. Estas diferencias no solo reflejan

distintas características biológicas, con importantes implicaciones en el estudio serológico a

nivel poblacional y en el desarrollo futuro de estrategias para quimioterapia y vacunación,

sino también refleja el potencial infectivo de estos diferentes genotipos para el hombre.

Existen pocos trabajos sobre la distribución de Echinococcus granulosus en los diferentes

países de América Latina, con excepción de Argentina (Kamenetzky, L. et.al 2002,

Rosenzvit, M. et.al. 1999), ningún otro país ha reportado como están distribuidos los

diferentes genotipos de este parásito en sus respectivos países.

En el Perú existen varios estudios con respecto a este céstode pero todos ellos son solo

estudios de seroprevalencia y diagnostico de campo, por lo que este proyecto seria el

primero en iniciar estudios de Epidemiología Molecular de Echinococcus granulosus en el

país.

OBJETIVOS DE LA INVESTIGACIÓN (Incluir sujetos, tiempo y lugar):

Objetivo General:

Determinar la variabilidad genética o polimorfismo genético de Echinococcus

granulosus circulantes en las diferentes áreas endémicas del Perú.

Objetivos Específicos:

Estandarización de los procedimientos para la extracción de ADN a partir de

protoescólices de Echinococcus granulosus.

Determinación del Polimorfismo genético del parásito utilizando PCR-SSCP de

los genes COI y NDI


Confirmación del polimorfismo por secuenciamiento de los genes COI y NDI y

aplicación de la técnica de RAPD.

Análisis y distribución de los genotipos de Echinococcus granulosus en las

diferentes áreas endémicas del país

HIPÓTESIS :

Echinococcus granulosus presenta variantes genéticas o polimorfismo genético distribuidos

en las diferentes áreas endémicas del Perú.

METODOLOGÍA

Tipo de estudio

Es un estudio Descriptivo y Analítico cuya duración es de un año

Área de estudio (Describir las características del área relevantes para el estudio)

La zona Sierra del Perú es considerada área endémica a Hidatidosis sobre todo aquellas

donde existe crianza de ganado ovino, bovinos entre otros. Por esta razón se visitaran los

camales en donde se beneficia al ganado para colectar el líquido hidatídico de los

departamentos de Ica, Ayacucho, Cajamarca y Ucayali.

Sujetos (Mencionar el tamaño de la población y el número de sujetos en la población con la

condición a estudiar en el centro de salud u hospital donde se realizará el estudio)

Se obtendrá liquido hidatídico de por lo menos 10 animales de cada especie (ovino, vacuno,

etc.) sacrificados e infectados con el parásito en cada camal de un área endémica del Perú.

Los datos de las muestras obtenidas serán registradas en una ficha epidemiológica

elaborada para tal fin ( anexo I ).

Se procurara obtener, en todo momento, las capas germinativas de cada quiste elegido.


Criterios de Inclusión y Exclusión

Criterios de Inclusión: Se obtendrán muestras de líquido hidatídico transparente de

pulmón y/o hígado de ganado ovino, bovino, caprino y camélidos.

Criterios de Exclusión: No se tomaran en cuenta líquido hidatídico contaminado (color

amarillo) ni quistes calcificados.

Diseño Muestral (Determinar el tamaño mínimo muestral y el tipo de muestreo empleado)

Se trabajara con 10 animales de cada especie que presente quistes hidatídicos y que lleguen al camal

para ser sacrificados, por lo tanto el muestreo es al azar pues dependerá de la existencia de animales

infectados del total de animales sacrificados en el camal.

DESCRIPCIÓN DE LA INTERVENCIÓN PROPUESTA

Material biológico

Para la obtención del material biológico se acudirán a los camales o mataderos de ganados

de las áreas endémicas de hidatidosis (Ayacucho, Cajamarca, Ica y Ucayali). El líquido

hidatídico de Echinococcus granulosus serán colectados por aspiración de los quistes de

pulmón y/o hígado de ovejas, ganado vacuno, cabras y cerdos infectados.

las muestras colectadas en esta oportunidad así como las muestras previamente colectadas

(Cuzco, Arequipa, Puno, Junín y Huancavelica) serán centrifugados a 5000 r.p.m por 10

minutos con la finalidad de colectar los protoescólices, los cuales serán lavados con

solución salina isotónica para luego ser fijados en alcohol al 95% y mantenidos a -20ºC

hasta su procesamiento.


Aislamiento y purificación de ADN.

En el laboratorio, los protoescólices serán descongelados y lavados por una vez con PBS

1X por centrifugación a 5000 r.p.m por 5 minutos, el pellet obtenido será resuspendido en

buffer de lisis (100 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 100 mM NaCl) al cual se le

añadirá SDS al 1% y Proteinasa K 1 mg/ml (concentración final) e incubado a 55ºC por al

menos 2 horas o hasta cuando la solución este transparente, esto es con la finalidad de lisar

a los parásitos (Maizels, R.M et. al. 1990)

El ADN será extraído con fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1) por 2 veces y una

vez con cloroformo/alcohol isoamílico, luego el ADN será precipitado con acetato de Sodio

3M y alcohol absoluto en frío. Finalmente el ADN será lavado con alcohol al 70%, secado,

resuspendido en buffer TE estéril y guardado a 4ºC. Alternativamente se utilizara el método

de extracción de ADN utilizando sales de guanidina.

Se utilizará también el kit Genomic Prep (QIAGEN) para extraer el ADN genómico de los

parásitos los cuales serán utilizados para realizar la técnica de RAPD.

PCR de protoescólises E. granulosus.

Regiones del ADN mitocondrial serán amplificados utilizando primers reportados para tal

fin; en ese sentido, regiones del gen de la NADH deshidrogenasa I (NDI) y del Citocromo

C oxidasa subunidad I (COI) serán amplificados por PCR según el procedimiento seguido

por Zhang, L. y cols. (1999). Los productos de amplificación serán visualizados en un gel

de agarosa al 1.5% al teñirlos con bromuro de etidio.

SSCP (Single-Strand Conformation Polymorphism)

Para realizar ésta técnica, 10 ul. del producto de PCR será mezclado con 10 ul. de buffer

SSCP (10 mM NaOH, 95% formamida, 0.05% azul de bromofenol y 0.05% xylene


cyanole), denaturado a 95ºC por 5 minutos e inmediatamente colocado a -20ºC por 10

minutos.

Un volumen de 3.5 ul. de cada muestra serán colocados en los pocillos de un gel de

poliacrilamida no denaturante tipo secuenciamiento (0.6X MDE: Mutation Detection

Enhancement) y sometido a una electroforesis convencional a 7 W por 20 horas y a 20ºC.

Las diferencias de corrida serán visualizadas al teñir el gel con nitrato de plata según el

procedimiento descrito por Bassam, B. J. y cols. (1991).

Secuenciamiento de los fragmentos genéticos NDI y COI

Para confirmar las diferentes variantes de Echinococcus granulosus detectados por SSCP,

los productos amplificados por PCR de los genes NDI (525 pb) y COI (460 pb) serán

secuenciados y analizados utilizando un secuenciador automático de ADN (ALF Express,

Amersham Biosciences) para observar las mutaciones presentes en cada variante.

RAPD-PCR de protoescólices de Echinococcus granulosus.

Para evidenciar y confirmar las variantes de Echinococcus granulosus, se utilizará la

técnica de RAPD-PCR (Random Amplified Polymorphic DNA-Polymerase Chain

Reaction), en este caso DNA genómico e intacto extraído de E. granulosus será sometido a

un PCR utilizando 4 primers aleatorios reportados (Scott J.C. and McManus D.P 1994).

Los patrones obtenidos serán visualizados en un gel de agarosa al 1.5% teñido con bromuro

de etidio. Los diversos productos de amplificación serán analizados utilizando software

informáticos especializados (Gel Compar II) para determinar las variantes de Echinococcus

granulosus.


Finalmente los resultados de las técnicas de SSCP y de RAPD-PCR serán confrontados y

analizados simultáneamente para determinar cuales son las variantes genéticas de

Echinococcus granulosus presentes en las diferentes áreas endémicas del país.

DEFINICIONES OPERACIONALES DE LAS VARIABLES

Polimorfismo Genético: Variación a nivel de un gen o región de ADN que presentan los

individuos de una misma especie, esta variación ocurre en la secuencia de los

nucleótidos de la región de ADN elegida para el análisis y que es producto de

mutaciones que suceden a lo largo del tiempo.

SSCP: Técnica molecular muy utilizada para evidenciar mutaciones en una región

pequeña de ADN, se basa en la movilidad electroforética diferente de las moléculas de

ADN de simple hebra, la diferencia en la movilidad es resultado de las diferentes

estructuras secundarias adoptadas por las simples hebras de ADN.

RAPD: Técnica molecular muy útil para determinar polimorfismo genético en los

organismos, esta basada en la técnica de PCR cuya diferencia es que utiliza primers o

iniciadores pequeños (10 bases) cuya secuencia es al azar. Se emplean 2 o 3 pares de

primers los cuales originan un patrón de bandas de amplificación el cual es específico

para cada especie o variante genética.

INDICADORES PARA EL MONITOREO (Describir los indicadores que servirán para supervisar y monitorear al estudio, este ítem necesariamente debe ser llenado)

Numero de muestras de protoescolices obtenidos

Numero de muestras ADN extraídos

Numero de PCR realizados

Numero de análisis de polimorfismo (SSCP. RAPD) realizados

CONTROL DE CALIDAD (Describir los procedimientos que asegurarán la calidad de la recolección de datos, de las actividades (p. ej.: lectura de láminas) u otros pertinentes)

Todas las muestras de protoescólices serán corroboradas de que son Echinococcus granulosus al

realizarse las mediciones morfométricas de los ganchos del rostelo; los análisis moleculares serán


realizados utilizando controles positivos de los diferentes genotipos reportados para Echinococcus

granulosus de otros países.

ANÁLISIS DE LOS DATOS (Mencionar las variables dependientes e independientes, las pruebas estadísticas a utilizar, y el software)

Se utilizará el programa LabWorks 4.0 (UVP) para capturar las imágenes de los geles producto del

SSCP y del RAPD, luego se usará el programa Gel Compar II (Applied Maths) para determinar

exactamente la variabilidad de las cepas y el programa MEGA 2 para analizar las relaciones

filogenéticas entre los genotipos de Echinococcus granulosus.

ASPECTOS ÉTICOS (Mencionar si habrá consentimiento informado en estudios que impliquen humanos y explique. Mencionar si solicitará aprobación de algún Comité de Ética)

El presente estudio no implica trabajo con muestras humanas


REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES

ACTIVIDAD/MES 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12Obtención de material biológico:Ica xAyacucho xCajamarca xUcayali xExtracción de DNA de protoescólices de E. granulosus

x x x x

Estandarización de técnicas moleculares x x xProcesamiento de muestras utilizando técnicas moleculares.

x x x x x

Análisis de datos x xElaboración de informe x

PRESUPUESTO

PRESUPUESTO DETALLADO

RUBRO COSTO UNITARIO

NÚMERO DE UNIDADES

TOTAL

Recursos humanos 03 Biólogos01 Médico01 Tec. Lab.

MATERIALES E INSUMOS

Insumos:Marcador de DNA 100 pb 800.00 02 viales 1600.00MDE (Mutation Detection Enhancement) gel de poliacrilamida x 250 mL

1500.00 01 Frasco 1500.00

Enzima DNA polimerasa de alta fidelidad, termoactivable 5U/ul x 500 U

1800.00 02 viales 3600.00

Kit de secuenciamiento TermoSequenase Cy5 Dye terminador kit x 100 Rxns

6800.00 1 kit 6800.00

Enzima DNA polimerasa termoactivable 5U/ul x 1000U

3600.00 1 kit 3600.00

Tiosulfato de Sodio pentahidratado x 1kg 110.00 01 frasco 110.00Nitrato de plata x 100 g 500.00 01 frasco 500.00Kit purificación Qiaquick para productos de PCR x 250 rxns

3500.00 01 Kit 3500.00


Materiales de laboratorio:Software LabWorks 4.0 8000.00 01 unidad 8000.00Tubos para PCR de 0.2ml (caja x 1000) 700.00 01 caja 700.00Tubos de microcentrifuga x 1,5 ml (caja x 500 unidades)

400.00 03 cajas 1200.00

Fotografias instantáneas Polaroid 665 caja x 10 fotos

150.00 04 cajas 600.00

Tips con filtro de 200 ul (caja x 1000) 500.00 01 caja 500.00Tips con filtro de 20 ul (caja x 1000) 600.00 01 caja 600.00Tips con filtro 0,5-10 ul (caja x 1000) 500.00 01 caja 500.00

Sub Total 33310.00

PRESUPUESTO MENSUALIZADO

RUBRO/MES 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 TOTALRECURSOS HUMANOS

x x x x x x x x x x x x

MATERIALES E INSUMOS

x x x 33310.00

Pasajes terrestres ida y vuelta a Ica

x 20 soles x 2 personas = 80.00

Pasajes aéreos ida y vuelta a Ayacucho, Cajamarca y Ucayali

x x x 480soles x 2 personas x 3 dptos = 2880.00

Viáticos por 6 días

x x x x 110soles x 2 personas x 6 dias x 4 dptos = 5280.00

TOTAL 41550.00


ANEXO I

FICHA EPIDEMIOLOGICA DE MUESTRAS DE PROTOESCOLICES PARA ESTUDIO DE POLIMORFISMO GENETICO

Tipo de muestra:……………………………………………………………………………

Código de la muestra:………………………………………………………………………

Fecha de obtención de la muestra:…………………………………………………..…….

Tipo de hospedero intermediario: Ovino ( ), Vacuno ( ), Caprino ( ), Otros ( )………..…

Lugar de procedencia del hospedero intermediario:Departamento:…………………Localidad:……………….……..Matadero:………………………

Órgano de procedencia de la muestra: Hígado ( ) Pulmón ( )

Medio de transporte de la muestra:Alcohol al 96 % ( )Solución de formol al 10% ( )

polimorfismo genÉtico de echinococcus granulosus …áreas endémicas del perú (cuzco, puno,...

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