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Método Cromogénico-Fluorogénico para la identificación y/o recuento de E. coli y coliformes con el empleo del medio CromoCen® CC

BioCen, código 4227

Aplicación en muestras de alimentos El método incluye una fase de identificación y enumeración con el empleo del medio cromogénico y fluorogénico CromoCen® CC para E. coli y coliformes en muestras de alimentos. Garantiza los resultados en 18-28 h y la confirmación de E. coli se complementa con la prueba de Indol Rápida y/o de Glutamato Descarboxilasa. Tipos de muestras que pueden ser procesadas por este método: sólidas y líquidas, de materias primas, alimentos crudos o procesados, o cualquier otro tipo de muestra donde se sospeche la presencia de los microorganismos diana. Resumen de la aplicación El medio basa su funcionamiento en la combinación de la reacción cromogénica del sustrato 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido (X-gal) para la detección de actividad β-galactosidasa presente tanto en E. coli, como en el resto de los coliformes, conjuntamente con una sal de 4-metil-umbeliferil-β-D-glucurónido (MUG) para la detección de la actividad de β-glucuronidasa de E. coli por la aparición de fluorescencia azul bajo la luz ultravioleta a 366 nm, permitiendo un procedimiento más sencillo. En la fase confirmativa, se comprueba la presencia de E. coli con la prueba de Indol Rápida y/o de Glutamato descarboxilasa (GAD). La combinación de nutrientes en el medio, conjuntamente con inhibidores para los microorganismos Gram-positivos, permite el adecuado crecimiento y recuperación de los microorganismos e interés. Procedimiento (Ver el esquema general del método). De estar congeladas las muestras, descongélelas hasta alcanzar la temperatura ambiente. Realice este proceso evitando cambios bruscos de temperatura para evitar mayor estrés celular. Pese 25 g de las muestras sólidas en un matraz de Erlenmeyer estéril de 500 mL u otro contenedor apropiado. Añada 225 mL de Agua Peptona Buferada y mezcle en la licuadora u otro equipo de igual finalidad. Deje reposar por espacio de aproximadamente 1 h (esta suspensión se considera la dilución 10-1). Proceda a realizar las diluciones pertinentes teniendo en cuenta el nivel de contaminación de la muestra. Para el caso de las muestras liquidas, tome 25 mL y dependiendo del nivel de contaminación inicial que tenga la muestra, realice las diluciones pertinentes, hasta que alcance al menos dos diluciones que sean contables (entre 30 y 300 UFC/ placa). Para aquellos productos en los cuales se espera un bajo nivel de contaminación, incluya la siembra directa. Algunos tipos de muestras pueden requerir procedimientos específicos para su preparación previo a la inoculación en el medio. Por ejemplo, para leche y productos lácteos según la ISO 8261 IDG 122-2001 (Milk and milk products. General guidance for the preparation of test simples, initial suspensions and decimal dilutions for microbiological examination). Luego de esperar el tiempo señalado después de la homogeneización, prepare diluciones decimales hasta obtener dos, en las que se puedan obtener recuentos aceptables. Siembre al menos dos diluciones consecutivas en las placas con el medio CromoCen® CC. El método de siembra a utilizar será por inundación de la superficie, distribuyendo homogéneamente la muestra con ayuda de una espátula de Drigalsky. Coloque la placa sobre una superficie lisa. Levante ligeramente la tapa de la placa de Petri e inocule de 0,1 a 0,5 mL de la porción de ensayo, en el centro de la placa con medio CromoCen® CC. Si se necesitara analizar volúmenes de hasta 1 mL, inocule en alícuotas de la muestra en varias placas, por ejemplo, para 1 mL inocule en cada placa según varios esquemas (3 placas con 0,2 mL y 1 placa con 0,4 mL; 2 placas con 0,2 mL y 2 placas con 0,3 mL). Distribuya la muestra sobre toda la superficie con una espátula de Drigalsky estéril (embeber en alcohol y flamear), girando esta última siempre en posición totalmente horizontal con respecto al plano de la placa. Para muestras en las que se requiera sólo la identificación de los microorganismos diana, se puede sembrar por agotamiento en la superficie (estriado). Deje la placa en reposo por 5–10 min para que la muestra penetre en el lecho del agar. Incube la placa en una incubadora bacteriológica a 35 ± 2 °C por 18-24 h. Para la determinación de coliformes fecales incube a 42 ± 2 °C por 18-24 h. En la incubadora, coloque las placas en posición horizontal, con la tapa hacia abajo, en columnas de no más de 4 placas. Al finalizar la incubación, observe el crecimiento y proceda a identificar el microorganismo. Concluida la incubación, examine las placas para determinar la presencia de colonias típicas de los microorganismos diana y las atípicas que pudieran considerarse dentro de estos microorganismos. Se marcan en la tapa de la placa y se cuentan las colonias azul verdosas correspondientes a coliformes totales. Para la identificación y recuento de E. coli se procede a alumbrar la placa con la lámpara UV y se cuentan las colonias fluorescentes marcadas con anterioridad como pertenecientes a los coliformes. La presencia de E. coli se confirma con la prueba de Indol Rápida y/o de GAD, para lo cual, se toman de 5 a

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10 colonias típicas (verde azules-fluorescentes) con coloración azul-verdosa y fluorescencia azul bajo luz ultravioleta (366 nm), se calcula entonces el recuento confirmado como: R confirmado= (colonias picadas y confirmadas como positivas/colonias picadas para confirmar)* recuento presuntivo de colonias. Interpretación El crecimiento típico de los coliformes en el medio CromoCen® CC se observa como colonias de color azul-verdoso en su centro, o en toda la superficie de la colonia, con o sin fluorescencia azul bajo luz ultravioleta a 366 nm (sólo E. coli), pudiendo presentar bordes blancos, regulares o irregulares y halos de color azul o azul verdoso alrededor de las colonias. El crecimiento típico de Escherichia (excepto E. coli O157:H7) en el medio CromoCen® CC se observa como colonias azul verdosas que se distinguen del resto de los coliformes por su fluorescencia azul bajo la luz ultravioleta (366 nm), pudiendo presentar bordes blancos regulares o irregulares y halos de color azul o azul verdoso alrededor de las colonias. Las colonias incoloras o con pigmentación propia corresponden a otras bacterias Gram-negativas. Presuntivamente se puede detectar Pseudomonas aeruginosa al presentar colonias blancas con fluorescencia azul-verdosa bajo luz ultravioleta (366 nm) y Serratia marcencens por el desarrollo de las colonias rojizas. Cuando se sospeche de la presencia de Aeromonas en la muestra (colonias azul-verdosas) se procederá, además, a determinar la actividad de citocromo oxidasa. Los microorganismos Gram-positivos resultan inhibidos en el medio. Ventajas

•Identificación directa. El uso de los medios de cultivo cromogénicos y/o fluorogénicos en los laboratorios de microbiología introduce cambios en los criterios de identificación de los patógenos (son identificados directamente). Esto debe considerarse en las comparaciones con los estudios previos.

•Más rápido. La identificación y/o recuento confirmado de E. coli y coliformes se realiza en un período máximo de 28 h. La detección directa y simultánea de varias actividades enzimáticas en un mismo medio eleva la exactitud del análisis. Esto permite la identificación directa (o con un mínimo de pruebas adicionales), cuyos resultados no presentan diferencia con la identificación realizada por los métodos bioquímicos tradicionales que consumen más de 48 h.

•Más fácil de utilizar. No necesita esterilización durante su preparación. Disminución de la carga de trabajo asociada al procesamiento de las muestras.

•Más preciso. Sus Sensibilidad y Especificidad diagnósticas son superiores a las de los medios convencionales destinados al mismo propósito para todos los microorganismos de interés.

•Más confiable. El contraste de colores y la fluorescencia para E. coli no permiten confusión. Composición y preparación de los medios de cultivo y reactivos 1. Medio CromoCen® CC Composición: Bases nutritivas-11,0 g; Cloruro de sodio- 5,0 g; Mezcla cromogénica-flourogénica- 1,4; Agar- 13,0 g. 1.1 Preparación De acuerdo a la cantidad deseada, pese el polvo en proporción de 30,4 g/L de agua destilada o desionizada. Hierva hasta disolución completa. Ajuste el pH, de ser necesario, el cual después de fundir deberá mostrar un valor de 7,1 ± 0,2. No esterilizar en autoclave. 1.2 Preparación de las placas del medio CromoCen® CC. Transfiera inmediatamente a un baño con temperatura de 44 a 47 °C. Dispense el medio en placas y deje solidificar. Inmediatamente ante de su uso, seque las placas en posición invertida en el horno a temperatura entre 35-55 °C, por un tiempo suficiente hasta que la superficie del medio esté seca. 2. Prueba Rápida de GAD Composición del reactivo de la prueba rápida de glutamato descarboxilasa (GAD): Acido L-glutámico- 0,1 g; Cloruro de sodio- 9 g; Verde de bromocresol- 0,005 g; Tritón X-100- 0,3 mL; Agua destilada- 100 mL. 2.1 Preparación: El reactivo debe tener el pH 3,5; tener color amarillo y estar transparente. Esterilice el reactivo por filtración y enváselo asépticamente en un frasco de vidrio de color ámbar para su posterior almacenamiento en refrigeración. Se ha comprobado una estabilidad satisfactoria del reactivo en dichas condiciones en un período de 5 meses de almacenamiento. 2.2 Procedimiento: Pique una colonia de interés y prepare una suspensión concentrada en 0,5 mL de solución salina estéril. A esta suspensión añádale 0,2 mL del reactivo de GAD e incube a 35 ºC durante

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10-13 h, observando cada 30 min. Cualquier cambio de color amarillo a verde o azul considérelo como reacción positiva. Existen algunas cepas de E. coli que responden de manera más rápida y por tanto su respuesta se observa en menor tiempo. 3. Prueba Rápida de indol Prueba de Arnold Weaver

Medios de cultivo: Caldo de triptona (Agua de peptona) conteniendo triptófano. Composición: Hidrolizado enzimático de caseína- 10,0 g; cloruro de sodio- 5,0 g. 3.1 Preparación: Suspender 15 g en 1 L de agua destilada o desionizada, mezclar bien, distribuir y esterilizar a 121 °C por 15 min. 3.2 Procedimiento: Inocule con gran abundancia un cultivo puro proveniente en cantidades de 0,4 mL de caldo de triptona (agua de triptona) conteniendo triptófano. Incube a 37 ºC durante 2 h. Agregue reactivo de Kovac y agite suavemente. Interpretación: El color rojo en la capa reactiva indica formación de indol. 4. Prueba de Citocromo oxidasa La prueba debe realizarse con un asa de platino para evitar los resultados falsos positivos. Existen 3 métodos para su detección: en placa directa, indirecto de Kovacs y el método de tiras o discos impregnados con el reactivo tetrametil (o dimetil)–p–fenilendiamina; este último tiene la ventaja de ser más rápido, más económico, y que el reactivo permanece estable por lo menos hasta 6 meses después de preparado. Procedimiento: Tomar con un asa de platino, previamente esterilizada a la llama, la colonia de interés y frotarla sobre el papel de filtro impregnado con el reactivo. Interpretación: La presencia de una coloración azul o marrón (en dependencia del reactivo que se use) indica una prueba positiva y por consiguiente la presencia de la enzima citocromo oxidasa en el microorganismo. Almacenamiento del medio CromoCen® CC • Mantenga el frasco con el medio deshidratado herméticamente cerrado en lugar seco, fresco, protegido

de la luz, a temperatura de 15 a 30 °C • Se podrá almacenar las placas listas para el uso por un período de 30 días a temperatura de 2 a 8 °C.

Para mayor información dirigirse a: Departamento de ventas: Ing. Carlos Prendes, tel. 8-81-70-24, e-mail: prendes@biocen.cu Asistencia técnica: DrC Raisa Zhurbenko, tel. 047-68-2441, e-mail: raisa@biocen.cu

Anexo A. Diagrama de flujo para la determinación de E. coli y coliformes en muestras de alimentos

Muestra 25 g + 225 mL de agua fosfato buferada o agua peptona 0,1 %. (Homogeneice por un minuto en una licuadora a alta velocidad)

Prepare diluciones seriadas según los niveles de coliformes y/o E. coli previstos

Transfiera 0,2 – 0,5 mL de las suspensiones anteriores a placas de Petri utilizando el método de inundación de la superficie

Incube las placas por 18-24 h a 35 ± 2 °C

Cuente las colonias verde azules para el recuento de coliformes totales y las verde azules con o sin bordes blancos y con fluorescencia azul para detectar presuntivamente E. coli

Determine el número de UFC por gramos de muestra estimados

Confirme la identidad de las colonias realizando la pruebas GAD o rápida de indol