penicilina (reporte final)

7/17/2019 Penicilina (Reporte Final)

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Práctica # 1 “Elaboración de Penicilina

mediante la fermentación del Hongo

Penicillium Chrysogenum”.

Ingeniería de Fermentaciones

Unidad Profesional Interdisciplinaria de Ingeniería Campus Guanajuato Página 1Profesora: Diana Ramírez Sáenz

INSTITUTO POLITECNICO

NACIONALUNIDAD PROFESIONAL INSTERDISCIPLINARIA DE

INGENIERÍAS CAMPUS GUANAJUATO

INGENIERÍA FARMACÉUTICA

INGENIERIA DE FERMENTACIONES

“ Elabo ración d e la penici l ina mediante la fermentación

del Hongo Penic il l ium Chrysogenum ”

6FV1

PROFESOR: DIANA RAMIREZ SAENZ

ALUMNO: OSCAR EFRAIN FERNANDEZ DELGADO

BOLETA: 2012660037

FECHA DE ENTREGA

03/12/2013








Objetivo: Producir un antibiótico grado farmacéutico de mayor uso en el mercado,

mediante la fermentación del hongo Penicillium Chrysogenum, aprovechando sus

propiedades bioquímicas y funciones microbiológicas, utilizando como fuente un medio de

cultivo enriquecido con nutrientes necesarios para su desarrollo, y con la ayuda de unbiorreactor de tanque agitado ―Lambda‖ especializado para su producción.

Objetivos específicos

Producción del antibiótico bencilpenicilina mediante la fermentación del hongo

Penicillium Chrysogenum, en un biorreactor ―Lambda‖ de tanque agitado.

Purificación del caldo sobrenadante, producto de la fermentación del hongo

mencionado, mediante una cromatografía de columna, logrando la extracción del

antibiótico puro.

Identificación del compuesto extraído, utilizando técnicas microbiológicas de

cultivo in vitro, mediante varios antibiogramas que contengan diferentes cepas, enlas cuales se compruebe con halos de inhibición bacteriana, la presencia del

antibiótico obtenido.

INTRODUCCIÓN

Un antibiótico se conoce como aquel compuesto químico producido ya sea por hongos obacterias, y que posee una actividad de defensa ante diferentes microorganismospresentes en cualquier medio ambiente, para el hongo proteger los nutrientes quenecesita, mediante la interferencia del compuesto mismo en diversos pasos delmetabolismo de los microorganismos enemigos. Por consiguiente se le considera unmetabolito secundario, porque es antimicrobiano y resulta capaz de inhibir un crecimiento

bacteriano. [3-4]

Estructura general del antibiótico

El compuesto orgánico principal es el ácido 6- aminopenicilánico (6 – APA), su fórmulacondensada es C16H18N2O4S y su esqueleto se muestra a continuación:

Figura 1: Estructura Orgánica general de la molécula de penicilinas

Apreciamos una estructura consistente en un anillo tiazolídinico con un anillo β- lactámico, y unaparte variable acilada en la posición 6, lo que demuestra que se pueden obtener varios tipos de

penicilina gracias a las propiedades estructurales de la molécula.Imagen extraída de: [http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Penicillin-G.svg]

http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Penicillin-G.svg











La penicilina es un antibiótico producido por un hongo de nombre ― penicillium‖, que actúamediante el bloqueo de la actividad de la enzima transpeptidasa, generando uncruzamiento que conecta largos polímeros de azúcares formando la pared de la célulabacteriana, bloqueando irreversiblemente la actividad de la enzima por unión covalentecon el extremo funcional de la enzima misma. La obtención de la penicilina es un procesofermentativo que se realiza considerando una selección de los medios de comunicación(aquellos que proporcionan un ambiente favorable para el cultivo en cuestión, como laregulación del pH) adecuados para el rendimiento general de la fermentación,proporcionando un medio de cultivo que contenga todos los elementos necesarios para lasíntesis de materiales de la célula y la formación del producto deseado. [1-4]

Biosíntesis del Antibiótico

Se rige por la siguiente secuencia metabólica:

Figura 2.- Ruta metabólica que describe la producción de penicilina vía Penic i l l ium Chrysog enum

Se aprecia la ruta biosin tética del com puesto para dar com o pro duc to final penic il inas del t ipo G y VImag en ex traída de: Micr ob iol ogía Gen eral 2008

La producción del antibiótico se origina porque la penicilina tiene un precursor dondeyacen las bases de aminoácidos aromáticos, la penicilina es una ruta metabólica diferenteal ciclo de krebs que se engancha a los aminoácidos aromáticos que se generaron en el

ciclo mencionado. La fuente principal para que se lleve a cabo este proceso deriva de laglucosa (fuente de carbono) añadida al medio de cultivo, los antibióticos resultan a partirde metabolismos secundarios y rutas alternas del sustrato que sirva a la célula delmicroorganismo para deshacerse de las bacterias (mecanismo de defensa muy útil parasobrevivir bajo condiciones adversas) que pueden competir contra ellos hacia una fuentenutritiva. Para el caso de un medio de cultivo estéril y enriquecido, como representa unhongo in vitro, es menester añadir un precursor debido a que el hongo por naturalezaproducirá muy pocas cantidades del antibiótico, con el precursor se activara esa ruta








metabólica para que el hongo produzca mayores cantidades de penicilina demandadas.[2,4]

Factores microbiológicos propicios para fermentar un determinado hongo

En microbiología un medio de cultivo adecuado para todo tipo de hongo en general,incluyendo al penicillium, debe contener fuentes de carbono y nitrógeno principalmente.Según el modelo del Dr. Salomón Bartnicki (desarrollado en el año 1962), un medio decultivo mínimo y esencial debe contener fuentes de carbono, nitrógeno, sulfato de amonioy oligoelementos (donde se encuentran muchas sales con metales de transición, comoMn, Cr, Fe, Co), todos ellos requerimientos nutritivos necesarios para el desarrollo delmicroorganismo. [2,4]

Por último resta mencionar que una propiedad fundamental en los hongos, es quecontienen enzimas que son dependientes de metales como: Manganeso, Cromo, Hierro yCobalto, necesarios para que las enzimas cumplan su función, considerando que los

hongos son restrictivos en su crecimiento porque contienen muchas rutas metabólicasalternas para producir antibióticos, u otros metabolitos secundarios como pigmentos. Lasrutas metabólicas en los hongos poseen enzimas muy específicas que dependen demetales (metaloenzimas), y es importante que estén presentes en el medio de cultivo parael crecimiento y desarrollo del hongo, el medio debe tener un pH acido entre 4.5 y 5 (aexcepción del Penicillium, cuyo pH debe ser de 6.5 ya que influye a un mejor desarrollodel metabolito) puesto que a un valor mayor desarrollaría mayor cantidad de biomasa quela necesaria. [1-2,4]

Purificación

En términos microbiológicos y de Biorreactores, cuando se trabaja con cualquier cultivo y

se requiere la producción de un metabolito secundario en específico, para este caso laPenicilina, al añadir al cultivo cofactores que propicien en el hongo la producción de unaruta metabólica secundaria, este tendera a excretar muchos metabolitos secundariosposibles, no solamente uno, por ende se encontraran varios compuestos químicosinmersos en el caldo de cultivo, productos de la ruta metabólica originada. [2-4]

El compuesto de interés se encontrara inmerso junto con otros metabolitos secundariosposibles, y al tomar una alícuota y probarla en un antibiograma, no se conoceráexactamente que compuesto fue el que inhibió el crecimiento bacteriano, por ende elresultado esperado variara sin conocer que lo provoco. La purificación promueve aseparar el metabolito de interés de los otros metabolitos, mediante el uso de un solventecapaz de polarizar a los otros metabolitos y solubilizarlos para generar una separación de

fases, en estos casos apreciaremos dos fases: Orgánica (conteniendo a los otrosmetabolitos que no se necesitan) y Acuosa (contendrá el metabolito de interés). [1-3]

Para solubilizar metabolitos secundarios de desinterés, y propiciar la separación deambas fases, generalmente se usara un solvente orgánico de carácter polar, el cualarrastrara metabolitos no polares generando un precipitado, dejando en la fase liquida elmetabolito de interés, este compuesto se le conoce como ciclohexanona el cual atacaraen grupos aminos y carbonilicos de los metabolitos no polares propiciando una separaciónde fases y por ende un precipitado de carácter orgánico. [Wade 2012]








Por último, para la separación del antibiótico se utiliza la cromatografía en columna, estatécnica permite la separación de mezclas de sustancias, sus características y los factoresque en ella intervienen. Generalmente esta técnica se emplea en la purificación decompuestos químicos, ya que existe una afinidad diferencial de los distintos compuestosinmersos en la mezcla por la fase móvil o estacionaria, estos compuestos son arrastradospor un eluyente que los propicia a avanzar a lo largo de la columna, pero como no todoslos compuestos avanzaran a la misma velocidad, por consiguiente terminamos obteniendoel antibiótico de interés, ya que esperamos sea el compuesto que avance con mayorvelocidad que los otros. [1,4]

Presencia de penicilina mediante cuantificación de susceptibilidad microbiana

Existe una técnica fundamental dentro de la microbiología clínica llamada ―quimioterapiacon antimicrobianos‖, esta técnica ha venido jugando un papel vital para el tratamiento dediversas enfermedades infecciosas en seres humanos. Desde que se desarrollarondiferentes investigaciones acerca de las colonias microbianas por parte de Alexander

Fleming en 1924, Gerhard Dogmak en 1927 y Selman Waskman en 1932, han surgidocientos de agentes antimicrobianos, donde algunos han sido sintetizados y unos cuantosse encuentran disponibles para usos clínicos. Gracias a la gran variedad de agentesantimicrobianos existentes, podemos diagnosticar con un grado de certeza confiable, losagentes más apropiados para el tratamiento de diversos padecimientos a manerarutinaria. [5-7]

Figura 3: Se muestra que parte del metabolismo de un microorganismo se ve afectado por los diversosantibióticos.

Extraída de: [Delgado, A. (2010). Obtención de penicilina y comprobación de su actividadantimicrobiana. Bi ot ecn ol og ía Farm acéut ica . Instituto Politécnico Nacional]








Desde la síntesis de la penicilina, se han descubierto muchos antibióticos capaces decombatir todo tipo de enfermedades causadas por infecciones microbianas, pero el usoincorrecto y excesivo de los mismos, ha llevado a que las bacterias desarrollen ciertaresistencia hacia los mencionados, derivando en microorganismos multiresistentes, por talrazón se efectúan pruebas de sensibilidad, para corroborar cuál es el antibiótico másadecuado para atacar a un determinado microorganismo. Estas pruebas consistenprincipalmente en dos tipos, difusión y dilución, que nos ayudan a determinar lasensibilidad de un determinado microorganismos, para la elección del antibióticoapropiado. [5-6,8]

Figura 4: Inhibición en el crecimiento de la bacteria E. Coli por efecto del antibiótico Amoxicilina

Extraída de: [Trabajos experimentales realizados en laboratorio de Microbiología Farmacéutica enUPIIG-IPN]

La metodología empleada para realizar el estudio de susceptibilidad, toma enconsideración algunos de estos factores para determinar de manera eficiente cómo unmicroorganismo podría responder a un determinado antibiótico. [6,9]

Virulencia

Alta concentración de organismos

Infección mixta

Desarrollo de resistencia durante el tratamiento

Existen factores propios del agente antimicrobiano, como son absorción, distribución,metabolismo, eliminación, unión a proteínas plasmáticas y otros parámetrosfarmacocinéticos, los cuales pueden influenciar la respuesta del paciente. Debido a quelos microorganismos tienen susceptibilidad variable a agentes antimicrobianos, esnecesario tener una herramienta que permita determinar la susceptibilidad delmicroorganismo causante de la infección. [5-9]








Cada vez son menos los organismos que tienen susceptibilidad predecible, por lo quedebemos hacer estudio de susceptibilidad en la mayoría de los microorganismos aislados.La indicación primaria para el estudio de susceptibilidad es determinar el antibiótico másapropiado para iniciar la terapia en un paciente con un proceso infeccioso. En la mayoríade los casos, cuando comienza una enfermedad se indica un antibiótico de amplioespectro (o una combinación de antibióticos) hasta obtener resultados acerca de laidentificación del germen causal de la infección. Posteriormente al obtener una respuesta,puede indicarse un antibiótico más específico. [2,8]

En este momento existen varios métodos basados en la biología molecular que puedenser usados para detectar resistencia específica a varios antimicrobianos, pero su uso derutina no está indicado. Estos métodos son principalmente usados con finesepidemiológicos, para monitorear resistencia a antibióticos. [7]

Materiales, Reactivos y Equipo

Material Reactivos3 matraces erlenmeyer de 500 mL Glucosa

2 charolas de aluminio Sulfato de amonio

1 Espátula Extracto de levadura

2 Probeta 50 mL KCl

1 Mechero de bunsen MgSO4

2 Asa para sembrar FeCl3

Algodón Etanol al 90°

Gazas Caja petri con hongo de penicillium cultivado

Papel destraza Tubo con esporas

2 matraces erlenmeyer de 1 L Ciclohexanona

Pinzas de disección Solución acido sulfúrico 1 N

Encendedor Agar PDAProbeta de 5 L Agar Bacteriológico

5 Lámparas de alcohol Peptona de Caseína

4 tubos Falcón Cloruro de sodio

Embudo de separación Penicilina Comercial

Columna cromatografía anionica Tubo eppendorf con esporas

Papel Filtro Cepa de cultivo con Lotto

1 Porta Objeto Cepa de cultivo con E. Coli

2 Cubre Objetos Cepa de cultivo con Salmonella

1 Caja petri de vidrio Agua destilada

Equipo para cromatografía de intercambioiónico

Equipo

Tubos Eppendorf estériles Equipo para filtración al vacio

Micropipeta de 1000 µL BombaPuntas para micropipeta Bomba peristáltica

Celdas para espectrofotómetro de vidrio yplástico

Fermentador Instrumentado

3 vasos de precipitado de 100 mL Microscopio

Pinzas de disección Autoclave

12 cajas petrí de plástico estériles Refrigerador

Encendedor Incubadora a 29°C

Secador Espectrofotómetro Uv-vis








Diagrama de flujo metodología

Preparación del medio de cultivo (PDA)

Microcultivo

Tomar dos muestras,

una de un homgo

aislado y la otra de unaespora inoculada.

En una caja petri

colocar un portaobjetoy PDA, todo en un

ambiente

completamente esteril

Tomar de las muestras

de interes y sembrarlaspor un lado en el

cuadro de agar, cubiri

con un cubreobjeto.

Colocar 2 ml de agua

destilada (no se pudoefectuar), sellar la caja

e incubarla por 36

horas a 37 °C

Observar el hongo al

microscopio utilizandoobjetivos 20 x y 40 x

En base a lo observado,

determinar el tipo de

cepa para cada muestray su especie.

Realizar los calculos

correspondientes decada reactivo, para

preparar 200 mL de

medio

Pesar en la balanza

la cantidad

correspondiente decada reactivo

Añadir 200 ml de agua

destilada al matrazerlenmeyer de 500 mL

posteriormente

añadir cada una de

las sales pesadas enla balanza

Agitar

vigorosamente

efectuando unadisolucion

Añadir a la solucion

el extracto delevadura y agitar

Añadir lentamente

la glucosa a la

solucion y agitarmientras se va

adhiriendo.

Seguir agitando

vigorosamentenuestra solucion

hasta que todos los

componentes esten

disueltos

Envolver con una

gasa un pedazo de

algodón, y protegernuestro medio de

cultivo








Inoculación del Hongo en el medio de cultivo

Fermentación del Hongo

Desmontar el

biorreactor lambda y

lavar cada uno de suscomponentes, verificar

la presencia de todoslos componentes

necesarios

Realizar los calculos

correspondientes de

reactivos parapreparar 800 mL de

medio de cultivoenriquecido (YPS), y

prepararlo

Una vez preparado el

medio de cultivo (YPS),añadirlo lentamente al

biorreactor y cubrir

todas las entradas del

mismo.

Esterilizar tanto el

biorreactor como las

fuentes de acido(H2SO4 1N) y alcali

(NaOH 1N).

Ajustar pH y conectar

las fuentes de acido yalcali a las

alimentaciones

correspondientes.

Verter el inoculo al

biorreactor, realizareste procedimiento

cuidando un ambientecompletamente esteril

para evitar

contaminación

Programar el biorreactor

en base a lascondiciones del hongo

penicillium

Chrysogenum y accionar

para comenzar la

fermentación.

Las condiciones son:

temperatura de 23 a

25 °C, VVM entre 0.5 a1 y pH de 6.5

Dejar el biorreactorfermentando una semanay posteriormente realizar

una filtracion para separarel producto de la biomasa.

Introducir el matraz

con todo y el medio de

cultivo al autoclavepara esterilizar,

asegurando la muerte

de toda bacteria

Una vez esterilizado,

llevarlo a la campanade flujo laminar para

inocular con ayuda del

mechero

Encender el mechero y

destapar el medio decultivo, flameando el

boquete del matraz y el

tapon de algodon

Flamear el Aza y tomar

una pequeña porcion delhongo, cuidando que se

efectue dentro de la

zona esteril.

Introducir la porcion

extraida del hongo enel medio de cultivo,

flameando el boquete

del matraz y la tapa de

algodon, cerrando

nuestro medio.

Flamear de nueva

cuenta el Aza y todo lo

que se utilizo.

Meter el medio de

cultivo inoculado a un

conservador durante 4dias.

Verificar la asepsia del

Biorreactor y considerar

todas las medidasnecesarias. .








Purificación del Caldo

Eliminar los residuos demayor tamaño mediante

una filtracion de vacio

Posteriormente tratar el

caldo por centrifugacion,colocando en tubo de 50

mL con tapa por 10 min

a 5000 rpm

Colocar el sobrenadanteen un recipiente.

Añadirle al mismo 200

mL de Ciclohexanona,realizar este paso en la

campana de flujo

laminar

Dejar reposar en el

solvente organico losprimeros 7 dias en una

gabeta, y los otros 6 dias

en refrigeracion

Verter la susbtancia en

un embudo dedecantacion y separar la

fase acuosa de la

organica.

Desechar la fase

organica y colocar la faseacousa en un vaso de

precipitados para

tratarla posteriomente

Preparar la columna

anionica cromatograficade intercambio ionico

Lavar la columna

anionica con unasolucion de H2SO4 [1 N],

(realizar calculos previos

para su preparación)

Sustraer una muestra de

10 mL de la fase acuosa

Tratar el restante de lafase acuosa pasando la

misma por la columnacromatografica

Rotular un frasco

determinado paraguardar el producto

resultante de la

cromatografia

Guardar el producto

final en refrigeracion porun periodo de 2 semanas








Curva de referencia penicilina comercial

Elaboración de antibiograma

Preparar diferentes

diluciones a distintasconcentraciones depenicilina comercial

Preparar el equipo de

espectrofotometria Uv-vis con tubo blanco a

200 nm

Calibrar elespectrofotometro

Introducir los

diferentes tubos conlas diluciones reaizadas

con la penicilina

comercial

Determinar la

absorbancia para cada

tubo con suconcentracion

Construir la curva de

calibracioncorrespondiente a las

asbrobancias obtenidas

en el espectro

Pesar las cantidades

correspondientes de cada

reactivo para prepararmedio LB y realizar la

solucion

Esterilizar en autoclave el

material necesario tal:matraz con agua

destilada, caja petri de

vidrio con discos y matraz

con medio LB

Determinar las

concentraciones depeniciina presente en el

caldo de extraccion y la

fase acousa de la

decantacion

Para determinar tal

concentracion, realizar una

espectro UV-VIS a cadamuestra de los componentes,

y comparar en base a la curva

de referencia obtenida de

penicilina comercial

Preparar tres diluciones a

distintas concentracionespara cada muestra de

penicilina: Comercial,Cromatografia y acuosa

Colocar cada dilucion en un

tubo eppendorf y rotular laconcentracion de la misma y

la sustancia de penicilinautilizada

Verter 15 mL de medio LB a

temperatura ambiente sobrelas 9 cajas petri esteriles,

cuidando que se tenga unambiente esteril

Esperar a que el medio

solidifique

Una vez que el medio

solidifico, ir inoculando cadacepa correspondidnte por

todo el agar, para cada cajapetri

Ir impregnando cada disco

con las dilucionescorrespondientes a las

distntas concentraciones depenicilinas: Comercial, acuosa

y cromatografia

Posterior a la inoculacion,

colocar el sensidiscoimpregnado con la dilucion

correspondiente y rotular lalocalizacion del mismo en la

caja petri

Por ultimo colocar las cajas

petri en la incubadora atemperatura de 29 °C por una

semana y observar








Resultados y Discusión

Preparación de 200 mL de medio de cultivo enriquecido

Se utilizaron las siguientes cantidades de cada reactivo:

Tabla 1: Cantidades y reactivos empleados para la elaboración del medio de cultivo enriquecido

Reactivos Cantidad (g)Glucosa 8

Sulfato de amonio 0.6

Extracto de levadura 0.4

KCl 0.1

MgSO4 0.1

FeCl3 0.1

Cada componente del medio se añadió con la finalidad de desarrollar la correctaproliferación del hongo que posteriormente se vaya a inocular en el mismo, brindándole

un correcto desarrollo y atendiendo a las demandas microbiológicas y bioquímicas del

hongo en común.

Contrastando con la literatura y algunos trabajos industriales de carácter farmacéutico, el

medio de cultivo que se preparo y los ingredientes que formaron parte del mismo, resultan

indispensables para propiciar la proliferación del hongo penicillium en el sustrato [1]. Es

importante mencionar que cada uno de los ingredientes indicados tiene su función

bioquímica en el medio de cultivo enriquecido, así se le añaden sales al mismo, porque

nuestro hongo es un ser vivo (microorganismo) y necesita de electrolitos para poder

desarrollarse, las sales también disminuyen las probabilidades de contaminación al mediodebido a que lo purifican y no permiten que se desarrollen bacterias, si se le hubiera

añadido cloruro de sodio se rompe el equilibrio de las bombas sodio y potasio y no se

desarrolla completamente (se limita mucho su crecimiento), en cambio con el cloruro de

potasio se genera el equilibrio adecuado [3-4].

La glucosa se le añade debido a que es una fuente de carbono y es básica para su

desarrollo, contribuye a formar los componentes estructurales y sirve como fuente de

energía para el microorganismo, considerando que cualquier organismo debe de pasar

por el ciclo de krebs, desdoblar la glucosa para producir piruvato (glucolisis) cuya única

vía de salida es el ciclo de Krebs para sintetizar todos los intermediarios y aminoácidos.

La razón por la que se le añade extracto de levadura al medio de cultivo, aparte de quesigue aportando fuentes de carbono al microorganismo en caso de que ya no cuente con

glucosa, es porque representa el proceso metabólico principal para llevarse a cabo la

fermentación, transformando los azucares en etanol por metabolismo oxidativo que

incluye la glucolisis y ciclo de krebs en hongos [2-4]. Por lo que todos los

microorganismos requieren de carbono, hidrógeno, oxígeno, azufre y nitrógeno para su

crecimiento celular, demandando pequeñas cantidades de elementos traza como Cu, Mn








y Co dependiente de la fuente de agua como la mayoría de las fuentes de agua o factores

de crecimiento, tales como vitaminas o aminoácidos. [1-4]

Microcultivo

Para continuar con la extracción del antibiótico, es importante la identificación y

comprobación del hongo que la produce, como se trabajo con dos compuestos, Hongo

aislado y esporas, era menester corroborar que ambos fueran Penicillium Chrysogeum, se

efectúa un microcultivo en el cual se identifico que solo el hongo aislado era Penicillium

mientras las esporas representaban otro componente desconocido.

No se tiene una imagen disponible del la identificación del hongo, pero a continuación se

muestra una imagen similar a la del hongo que se identifico experimentalmente y que

cumplió con las características que debe mostrar el penicillium.

Figura 5: Identificación del Hongo penicillium realizada en un trabajo experimental

En la presente imagen se aprecia que efectivamente este hongo es penicillium debido a laconformación terverticilado de una de sus ramificaciones

Extraída de:[http://www.google.com.mx/imgres?imgurl=http://www.pv.fagro.edu.uy/fitopato/cursos/fitopato/practicas/3/pexp.JPG&imgrefu

rl=http://www.pv.fagro.edu.uy/fitopato/cursos/fitopato/practicas/hongos.html&h=654&w=640&sz=44&tbnid=5nTOG24FOgB9

aM:&tbnh=115&tbnw=113&zoom=1&usg=__cNjOr5ylM7fxFkTE378KHAwbp8Q=&docid=WTW3zN12yYH7DM&sa=X&ei=wK

FlUsa3K8SD2QXr84DoDQ&ved=0CC8Q9QEwAQ]

En el hongo que se identifico al microscopio se apreciaron las siguientes características:formaba conidios en una estructura ramificada, algunas ramificaciones presentaron dos

tipos de estructuras: las monoverticiladas y biverticiladas, especie esponjosa con

vellosidades la cual se asemejaba mas una esponja dura y a punto de romperse debido a

que no se le agrego agua al microcultivo y por ende no se encontraba hidratado.

La hidratación es un factor importante en microorganismos del reino Fungi, ya que sin

agua el hongo no puede sobrevivir y por ende no tendera a producir el antibiótico, aparte

http://www.google.com.mx/imgres?imgurl=http://www.pv.fagro.edu.uy/fitopato/cursos/fitopato/practicas/3/pexp.JPG&imgrefurl=http://www.pv.fagro.edu.uy/fitopato/cursos/fitopato/practicas/hongos.html&h=654&w=640&sz=44&tbnid=5nTOG24FOgB9aM:&tbnh=115&tbnw=113&zoom=1&usg=__cNjOr5ylM7fxFkTE378KHAwbp8Q=&docid=WTW3zN12yYH7DM&sa=X&ei=wKFlUsa3K8SD2QXr84DoDQ&ved=0CC8Q9QEwAQ

















de ser necesaria para el cumplimiento de sus funciones fisiológicas, representa un

inductor de sus rutas metabólicas las cuales serán compatibles con el precursor que

propiciara la máxima producción de antibiótico posible. En este caso como se trato de un

microcultivo el hongo apenas se alcanzo a apreciar, aunque se corrió el riesgo deconfundirse con el hongo de la estreptomicina, ya que al estar deshidratado el hongo le

dio una apariencia similar a la estreptomicina, y despreciar al mismo antes de continuar

con el trabajo experimental. [1,3-4]

Preparación de 800 mL de medio de cultivo enriquecido, 400 mL para cada matraz

Tabla 2: Cantidades y reactivos empleados para la elaboración del medio de cultivo enriquecido

Reactivos Cantidad (g)Glucosa 16

Sulfato de amonio 1.2

Extracto de levadura 0.8KCl 0.2

MgSO4 0.2FeCl3 0.2

Se preparo el medio de cultivo en dos matraces erlenmeyer de 1 L cada matraz, y seañadieron las cantidades indicadas en la tabla para preparar 400 mL de medio en cadauno. Una vez preparado el medio y verificando que la base del biorreactor estuvieralimpia, se procede a verter los 800 mL de medio en la base, y se mete al autoclave paraesterilización, protegiendo el mismo cerrando bien cada orificio.

Imagen 1.- Medio de cultivo con el hongo desarrollado.

Se aprecia la fermentación del hongo penicillium en el Biorreactor.








Después de una semana que se dejo fermentando el hongo en el medio de cultivo, se

aprecio una cantidad considerable de biomasa, y se procedió a llevar a cabo una filtración

de vacio para separar la biomasa del sobrenadante y posteriormente realizar una

purificación en base al sobrenadante extraído.

En un trabajo industrial realizado en la farmacéutica Shering Plaug se realizo

fermentación de penicillium en un biorreactor más sofisticado y con la mayoría de los

ingredientes añadidos al medio que se preparo en esta práctica, según sus resultados,

tienen comparación con los obtenidos en la práctica debido a la explicación tanto

bioquímica como microbiología de las condiciones y nutrientes que demanda el hongo;

Alexander Fleming que fue el que descubrió el antibiótico comprobó que con la glucosa y

el extracto de levadura se producía la fermentación en el hongo para producir una

sustancia capaz de eliminar bacterias, descubrimiento que fue un gran avance al mundo

de la ciencia y sobre todo la medicina. Todo el medio preparado se hizo en base a las

necesidades que demandan el hongo penicillium para su desarrollo, considerando quenecesita una atención especial para desarrollarse y si no se le brinda lo necesario el

hongo se contamina o simplemente no se desarrolla y expira. Por ende todas las

consideraciones anteriores al preparar el medio antes de efectuar una inoculación. [2,4]

Realizando una investigación más profunda, también se discute que pudo haberseutilizado sacarosa, su efecto respecto a nuestro medio de cultivo hubiese sido próspero,pero no brinda suficientes fuentes de carbono debido a su inestabilidad como moléculaorgánica (no tiene todas sus conformaciones en posición ecuatorial como la glucosa), porende bioquímicamente no se adapta completamente a las necesidades de desarrollo ycrecimiento en el hongo según la literatura contrastada. [1-4]

Imagen 2.- Cantidad de biomasa presente en el medio de cultivo fermentado

Se aprecia una cantidad considerable de biomasa








En otras investigaciones se encontró que el pH óptimo para que un hongo produzcamayor cantidad de antibiótico y menor cantidad de biomasa es de 4.5 a 5 a unatemperatura de 25 grados Celsius, debido a que una menor cantidad de biomasarepresenta mayor acción del precursor sobre el metabolismo secundario en un hongo.Para el caso del hongo penicillium se observo una buena proliferación a los 3 días defermentación a un pH 6.5 y una temperatura de 26 grados Celsius, pero se produjo muchabiomasa después de una semana en el fermentador. Según la literatura este no es buenopuesto que hora que se extraiga el antibiótico este no será tan efectivo como unantibiótico comercial, porque el precursor actuó como inductor del metabolismo primarioen lugar del secundario. Otros trabajos industriales señalan que mientras mayor numerode biomasa producida, mayor cantidad y efectividad del antibiótico procesado, debido aque alcanzo un estado estacionario, y una cantidad predominante de biomasa representaun crecimiento paulatino, el hongo se adapto bien durante su etapa “lag” y continuo uncrecimiento logarítmico exitoso. Su reproducción fue tan prospera que el antibióticoprocesado será identificado mediante un antibiograma en la primera prueba. [1-3]

Purificación del sobrenadante

Una vez realizada la filtración al vacio se obtuvo un caldo impuro el cual se procedió apurificar para obtener la penicilina. Después de centrifugar el caldo y añadirle 200 mL deCiclohexanona, dejar reposar 5 días y añadir a un tubo de decantación, se observo laseparación de dos fases: Orgánica (tenía otros metabolitos ajenos a la penicilina) de coloramarillo fuerte y Acuosa (contenía a la penicilina) de color amarillo claro. Se separa lafase acuosa y posteriormente se pasa sobre una columna cromatografía anionica, paraguardar y conservar el producto.

Es importante este proceso puesto que se tiene que extraer el antibiótico de los otrosmetabolitos inmersos en el caldo, para lo cual se centrifuga el sobrenadante y se le añade

ciclohexanona, cabe mencionar que la ciclohexanona es buena para solubilizarmetabolitos polares inmersos en el caldo, puesto que es un compuesto polar que ataca agrupos aminos y carbonilicos de otro metabolitos secundarios. Comparando con otrostrabajos experimentales de obtención de penicilina, se encuentra que anteriormente hubootros intentos de purificación utilizando otros solventes polares como: éter, cloruro demetileno y acetato de etilo, pero estos no resultaron en una separación de fasesadecuada, aparte de que muchos metabolitos secundarios se colaban en la fase acuosade penicilina, por ende el solvente orgánico que ha dado mayor resultado es laCiclohexanona, de haberse usado éter o cualquier otro mencionado, se hubiese obtenidouna fase acuosa de un amarillo más pronunciado. [Wade 2012]

Cuantificación en la concentración de penicilina obtenida

Todas las penicilinas tienen una estructura básica (figura 1), la cual tiene una absorbanciacon una longitud de onda entre 200 y 230 nm. Se tomó una longitud de onda de 285 nm,ya que el espectrofotómetro no admitía lecturas a menores longitudes de onda, aparte285 nm todavía se encuentra en el rango donde se obtiene una absorbancia relevante.








Tabla 3.- Concentración de cada una de las diluciones de Penicilina Comercial

Dilución Concentración Absorbancia

0 500 1.218

1 125 1.005

2 62.5 1.052

3 31.25 0.702

4 7.8125 0.561

5 3.90625 0.483

6 1.953125 0.464

7 0.48828125 0.289

Estos resultados se obtuvieron en el espectro UV-VIS, cabe mencionar que el aparatopresento algunas fallas técnicas y por consiguiente para la obtención de las absorbancias

observadas, se tuvo que calibrar el espectro en la toma de cada muestra de penicilinacomercial, obteniendo unas lecturas más adecuadas que las anteriores. Al elucidar lasabsorbancias en el espectro, de principio se efectuó una sola calibración, tomando comoblanco una celda con agua destilada, y arrojando unas lecturas bastantes variables y quemostraban datos inconsistentes, no mostraban ninguna tendencia en específico, por endese tuvo que volver a realizar el espectro para presentar la tabla aquí mostrada.

Gráfica 1: Curva de Calibración de la penicilina comercial

Debido a la inconsistencia de la grafica, y al resultado que arrojo en el cálculo de laconcentración de la penicilina obtenida por fermentación, que fue de 46,332.07385mg/mL, es notable que este dato es mayor que la concentración de la penicilinacomercial, y por tanto no es posible haber producido demasiada penicilina en un soloproceso. Por lo tanto se procede a eliminar los dos datos que se señalan de verde, serealiza una nueva regresión lineal, y se obtiene el siguiente grafico:

y = 0.1396ln(x) + 0.338R² = 0.9453

0

0.2

0.4

0.6

0.8

11.2

1.4

0 100 200 300 400 500 600

A b s o r b a n c i a

Concentración y Dilución

Absorbancia de Penicilina Comercial

Absorbancia

Logarítmica

(Absorbancia)








Gráfica 2: Curva de calibración de la penicilina comercial (mejorada)

Con esta gráfica, se obtiene una tendencia lineal y congruente en la curva de calibraciónde la penicilina comercial, contrastando estos resultados con las lecturas de absorbanciarealizadas al producto de la cromatografía de penicilina, que fue de 1.886, el resultadonos otorga una concentración final de 143.64 mg/mL, y para el producto sobrenadante,que fue de 1.795, el resultado fue una concentración final de 134.805 mg/mL.

Un factor que puede interferir en la lectura de la absorbancia para la penicilina comercial,son los excipientes contenidos en este medicamento, en especial la solución inyectable

que se adjunta en la presentación del mismo, otorgando valores no solo de la penicilinasino también de los componentes mencionados. [4]

Al comparar los resultados del grafico con varios análisis estadísticos en minitab, seelucida que este método es de los más exactos para la determinación de uncomportamiento grafico útil para conocer concentraciones y constantes, cabe mencionarque este tipo de datos resulto indispensable para la determinación de la concentración enproductos de penicilina obtenida por la fermentación, y como las concentraciones tuvieronun rango de números aceptable, por ende se corrobora la eficiencia del método dereferencia para conocer la cantidad de producto elaborado. [3]

Elaboración de Antibiograma

Se realizaron 9 antibiogramas en total con tres cepas de diferentes hongos (Lotto, B.Subtilus y Salmonella) y tres muestras distintas de penicilina (Comercial, sobrenadante yproducto de cromatografía), para comparar ambas y determinar la presencia de penicilinaobtenida después de la fermentación.

Las imágenes se aprecian a continuación:

y = 0.0103x + 0.4065

R² = 0.9307

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

0 20 40 60 80

A b s o r b a n c i a

Concentración y Dilución

Absorbancia de Penicilina Comercial

Series1

Lineal (Series1)








Imagen 3: Halos de inhibición de penicilina extraída a distintas concentraciones en cultivo Salmonella

Imagen 4: Halos de inhibición de penicilina comercial a distintas concentraciones en cultivo B.Subtilus

Imagen 5: Halos de inhibición de penicilina comercial a distintas concentraciones en cultivoSalmonella

Contaminación

Inhibición tanto del hongo

inoculado en el medio como

de los microorganismos invasores








Imagen 6: Antibiograma infectado por hongos ajenos al cultivado y halos de inhibición penicilinasobrenadante a distintas concentraciones en cultivo salmonella

Imagen 7: Halos de inhibición de muestra sobrenadante de penicilina a distintas concentraciones encultivo B. Subtilus

Imagen 8: Halos de inhibición de producto cromatografía de penicilina a distintas concentraciones encultivo B. Subtilus

Contaminación

Inhibición tanto del hongo

inoculado en el medio como

de los microorganismos

invasores








Imagen 9: Halos de inhibición de penicilina comercial a distintas concentraciones en cultivo Lotto

Imagen 10: Halos de inhibición de producto cromatografía de penicilina a distintas concentraciones encultivo Lotto

Considerando que cada antibiótico tiene un mecanismo de acción diferente, y cuenta condiferentes regiones moleculares activas, que pueden reaccionar con una bacteria, seusaron tres muestras distintas del mismo antibiótico, penicilina, aproximando lasconcentraciones de las mismas, a las concentraciones que se encuentran de maneracomercial tanto en forma farmacéutica, como medicamentos.

Como podemos apreciar en las siguientes imágenes, hubo inhibición en todos los cultivos

donde se colocaron sensidiscos impregnados con las distintas penicilinas trabajadas en el

laboratorio, la mayor inhibición apreciada en las tres cepas fue de la penicilina comercial,

posteriormente el producto obtenido de la cromatografía y al ultimo la muestra

sobrenadante. Con los halos de inhibición obtenidos se corrobora la presencia y

producción de penicilina en la fermentación, y se aprecia que la excesiva biomasa

(imagen 2) contenida al fermentar el hongo, no afecto a la obtención del antibiótico, sino








de lo contrario produjo mayor cantidad del mismo. A pesar de haberse contaminado las

cepas de las imágenes 3 y 6, se observa una inhibición en el crecimiento de los hongos

enemigos desarrollados, corroborando con mayor certeza la obtención del antibiótico

puro, a tal magnitud de propagarse una combinación de hongos por invasiones deespacio en el agar, que propagarse por el mismo, porque el antibiótico impedía

mencionada propagación, por consiguiente, la afectividad de los antibióticos ayudo a

inhibir una mayor contaminación en las cepas cultivadas en las cajas petri. [5-7,9]

La penicilina es un antibiótico que pertenece al grupo de las aminopenicilinas, de manerageneral, se sabe que la acción de este tipo de antibióticos, es bactericida, por lo queactúan sobre la pared celular inhibiendo la actividad transpeptidasa de las proteínasenzimáticas fijadoras en bacterias. [Faría Reyes & et al., 2000]

Un mecanismo de resistencia a este antibiótico, es la disminución de porinas de la paredcelular, disminuyendo así la permeabilidad, teniendo como consecuencia una inhibición, la

única bacteria capaz de inhibir por completo el antibiótico, es la Gram (-) Enterobacter,Lotto y salmonella en cambio fueron las bacterias más susceptibles ya que muestranhalos de inhibición más extensos. [6-8]

Imagen 11: Antibiograma más llamativo y sobresaliente, halos de inhibición de la muestrasobrenadante en la fermentación de penicilina, a distintas concentraciones en cultivo Lotto

En esta imagen se observan los halos de inhibición del producto sobrenadante de lapenicilina extraída a distintas concentraciones en cultivo Lotto, cabe mencionar que Lottoes gram (+), y por ende la inhibición tuvo lugar y no ofreció resistencia al antibiótico. Los

67.4 mg/mL

33.7 mg/mL








procesos biológicos por los que un microorganismo puede adquirir resistencia a unantibiótico son [5-7]:

Transformación: cuando se transfiere ADN del medio ambiente hacia la bacteria yse modifica el ADN de ésta.

Conjugación: Transferencia de ADN de una bacteria a otra por medio de unplásmido.

Transducción: Paso de material genético de una célula a otra a través de un fago. Evolución: A través de proceso de adaptación, selección natural y reproducción

diferencial.

Conclusión

Con base a los resultados obtenidos se concluye sobre la importancia de considerar los

factores necesarios para la preparación de un medio de cultivo enriquecido, adecuado a

un determinado microorganismo a desarrollar, ya que la fermentación de un metabolitosecundario en especifico, no solo es producto del tipo de biorreactor empleado para su

elaboración, sino de los factores microbiológicos adecuados al microorganismo

seleccionado para producirlo, tales como: reactivos, materiales, y condiciones

ambientales (esterilidad, pH y temperatura), ya que de ello depende el sano desarrollo del

hongo inoculado. Fundamentando que el medio de cultivo debe ser apropiado al

microorganismo de interés, y quedar exento de cualquier microorganismo contaminante,

esto se logra gracias a la añadidura de sales al medio de cultivo y la esterilización del

mismo, y la zona de trabajo, como cada uno de los materiales a emplear, durante la etapa

de inoculación.

También se menciona la importancia de la cantidad de biomasa producida en el medio,porque garantiza si hubo una correcta proliferación del hongo en el mismo y se excretaron

los metabolitos secundarios de interés, las condiciones de temperatura y pH deben ser tal

cual lo señalan trabajos experimentales y fuentes literarias, ya que el hongo Penicillium

Chrysogenum es adaptable a pH casi neutro y temperatura ambiente, ya que se propicia

su ruta metabólica secundaria la cual produce el antibiótico de interés.

La purificación del caldo de cultivo resulta esencial para la obtención del compuesto, se

necesita un antibiótico 100 % puro para poderse administrar por cualquier vía, por ende

su importancia, porque administrar una penicilina impura puede generar efectos

secundarios y adversos a la salud del consumidor, y como no se conoce a los otros

metabolitos secundarios producidos por el hongo Penicillium Chrysogenum, por lo tantose desconoce su acción y posibles efectos biológicos en el organismo.

Las Bacterias pueden tener diferentes métodos de resistencia a los antibióticos, esto

debido al uso descomunal que la industria farmacéutica ah dado a los mismos, en el área

de la salud, este es un tema de interés para la población civil, ya que se requieren de

nuevos fármacos capaces de inhibir un determinado crecimiento bacteriano por rutas

metabólicas alternas que no generen ningún tipo de resistencia. Para la realización de un








estudio de resistencia a antibióticos, no se puede generalizar a las bacterias por su

taxonomía ni tampoco por ser Gram (-) o Gram (+), porque cada bacteria tiene rutas

metabólicas diferentes, y puede darse el caso que bacterias del mismo género arrojen

resultados diferentes para cada antibiótico, lo mismo ocurre con los antibióticos, que apesar de estar en la misma clasificación pueden dar resultados distintos a los esperados,

por lo cual si se desean resultados precisos, lo mejor es manipular una determinada cepa,

con un seleccionado antibiótico.

Por último se produjo penicilina pura a una concentración de 143.64 mg/mL, gracias a lafermentación del hongo Penicillium chrysogenum en un biorreactor de tanque agitadolamba, y un medio de cultivo enriquecido con precursores necesarios para inducir alhongo a desarrollar un metabolismo secundario propicio a la excreción del antibióticodeseado. Se sometió el producto empleando métodos que implican bioseparaciones,procesos utilizados en la producción de antibióticos por la microbiología clínica.

Cuestionario Complementario

Nota: Este cuestionario se encontró en un protocolo experimental de una prácticade laboratorio de microbiología, y se decidió anexar las preguntas mas destacadasa procesos que no se elaboraron en el laboratorio de fermentaciones, pero que sonde gran utilidad conocerlos.

1. Explica en qué consiste la prueba “E”.

La prueba E o método PDM de epsilómetro ha sido usado exitosamente para analizaranaerobios y otros organismos aeróbicos. El término epsilómetro se refiere a una tira fina,

de 5 x 50 mm, inerte y no porosa con un gradiente continuo exponencial de agenteantimicrobiano inmovilizado en un lado y una escala de interpretación impresa en el otrolado. El gradiente de agente antimicrobiano cubre un amplio rango de concentración, quecorresponde aproximadamente diluciones dobles. La pendiente de los cambios y losrangos de concentración están óptimamente diseñados para corresponder a rangos ylímites de CIM clínicamente relevantes que son seleccionados para categorizar grupos desusceptibilidad. Se inocula una placa de agar, que contenga un medio de prueba apto,con un organismo de prueba de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Luego seaplican las tiras de prueba en un patrón óptimo de tal manera que la máximaconcentración en cada tira esté más cerca al borde exterior de la placa de Petri. La placaes inmediatamente incubada aeróbicamente o anaeróbicamente por el periodo de tiempoestipulado. Cuando es aplicado a una placa de agar inoculada, el gradiente

antimicrobiano de la tira es liberado inmediatamente en el agar, creando un gradientecontinuo y exponencial de concentraciones de agente antimicrobiano debajo del eje linealdel material de soporte. [7]

Después de la incubación, se observa una elipse de inhibición de crecimiento. Laintersección entre el borde de la zona de inhibición y la tira de soporte se produce en laconcentración del antimicrobiano que ya no es capaz de inhibir el crecimiento. El punto deintersección da la ―concentración inhibitoria‖ (CI) en µg/mL— una medida directa de la








susceptibilidad del microorganismo al agente antimicrobiano probado. Las CIMs se leendirectamente sobre la escala en la tira de soporte. [8]

2. Explica, ejemplifica y esquematiza un proceso de sinergismo en antibióticos.

El sinergismo de los Antibióticos ocurre cuando el efecto de una combinación es mayorque la suma de los efectos de los antibióticos usados individualmente. En pacienteshospitalizados con cateterización venosa profunda y sonda vesical, la presencia de fiebre,escalofríos e hipotensión arterial se debe sospechar la presencia de una sepsis urinaria orelacionada con la cateterización, los microorganismos más comunes que puedenocasionarlas son los estafilococos y otros Gram positivos, así como algunos Gramnegativos potencialmente resistentes. En estas situaciones se han obtenido buenos resultados al combinar oxacilina o vancomicina con un aminoglucósido, fosfomicín, algunos monobactámicos y el augmentín. [8]

3. Discute los efectos en la salud pública por el reciente surgimiento de MRSA enhospitales.

La aparición de MRSA en hospitales y recientemente en la comunidad hace más difícil eltratamiento médico para infecciones con MRSA pues ya que al ser multiresistentes aantibióticos se necesita conocer muy bien los antibióticos que aún pueden ser útiles paratratar a estas cepas y no contribuir a que aumente su multiresistencia. [2-3]

4. Discute la importancia de la reforma al artículo 226, fracción IV de la Ley Generalde Saludrespecto a l surgimiento de cepas multiresistentes.

Es importante que un médico sea el que pueda controlar la prescripción de un medicamento y por su parte la adquisición de éste por el paciente, pues ya que así se promueve la buena aplicación de un tratamiento médico específico para las enfermedades que un paciente pudiera tener y no permitir la automedicación de la persona enferma y por consiguiente contribuir a la aparición de cepas multiresistentes a antibióticos. [7,9]

Referencias

[1] Romero Caballero Raúl. (2008). Microbiología y parasitología humana: basesetiológicas de las enfermedades infecciosas y parasitarias (1era Edición). México.Editorial Medica Panamericana.

[2] Melo Ruiz V. (2007). Bioquímica de los procesos metabólicos (2da Edición).México. Editorial Reverte.

[3] Microbial Technology. Microbial Processes. Second Edition (Volume I). Ed. H.J.Peppler and D. Perlman. Academic Press, N. Y., 1979.

[4] R M Atlas & B Bartha. (2005). Ecología Microbiana y Microbiología Ambiental.México. Editorial Pearson España.








[5][ Prescott, Harley, Klein][ Microbiología, quinta edición] [editorial McGRAW-HILLinteramericana]4FV1[6] [Michael T. Madigan, John M, Jack P, Brock] [Biologia de los Microorganismos,10° edición] [Pearson Prentice Hall]

[7] [Reporte multicéntrico de los resultados de los ensayos de susceptibilidad aantibióticos] [Ileana González Bonet, Fernando Travieso Ruiz,* Leonora GonzálezMesa, Estrella Álvarez Varela,* Gilberto Tillán Ochoa* y Rolando ContrerasAlarcón.*] [Departamento de Investigaciones Biomédicas, Centro de QuímicaFarmacéutica.][ Centro Nacional de Investigaciones Científicas. Avenida 25 y 158,Apartado Postal 6414, Playa, Ciudad de La Habana, Cuba.]

[8] [INTERPRETACION DE LOS ESTUDIOS DE SUSCEPTIBILIDADANTIMICROBIANA] [Boletín Escuela de Medicina. Pontificia Universidad Católica deChile][Dra. Elizabeth Palavecino Rosales]

[9] [Clasificación de Antimicrobianos y Quimioterápicos][Dra. Almudena CalvoZamorano][Capitulo 54]








Base de Calculo

Medio PYM de cultivo composición para 1 L

Reactivo Cantidad (g) para1000 mL

Cantidad (g) para800 mL

Cantidad (g) para200 mL

Glucosa 40 32 8Sulfato de amonio 3 2.4 0.6

Extracto deLevadura

2 1.6 0.4

KCl 0.5 0.4 0.1

MgSO4 0.5 0.4 0.1

FeCl3 0.5 0.4 0.1

Calculo de la concentración de la penicilina presente en el producto de la cromatografía

Con base a la ecuación de la línea de tendencia (Curva mejorada)

y = 0.0103x + 0.4065

Despejamos ―x‖ para obtener el valor de la ecuación

X = (y – 0.4065)/0.0103

Sustituyendo el valor de la absorbancia medida a la muestra del producto de la

cromatografía y el sobrenadante, tenemos:

X = (1.886 – 0.4065)/0.0103 = 143.64 mg/mL (cromatografía)

X = (1.795 – 0.4065)/0.0103 = 134.805 mg/mL (Muestra sobrenadante)

Con base a la ecuación de la línea de tendencia (Curva normal)

y = 0.1443 ln (x) + 0.3357

Despejamos ―x‖ para obtener el valor de la ecuación

X = exp ((y – 0.3357)/0.1443)

Sustituyendo el valor de la absorbancia medida a la muestra del producto de lacromatografía y el sobrenadante, tenemos:

X = exp ((1.886 – 0.3357)/0.1443) = 46,332.07 mg/mL (cromatografía)

X = exp ((1.795 – 0.3357)/0.1443) = 24,660.52 mg/mL (Muestra sobrenadante)







Concentraciones y diluciones para el espectro UV en penicilina comercial

La concentración total de penicilina comercial era de 800,000 UI que a mg/mL son 500

Por lo tanto tenemos una concentración de 500 mg/mL de penicilina comercial en ámpula

Se realizan diluciones de mitad en mitad para determinar la absorbancia a diferentes

concentraciones, por tanto tenemos:

C1 = 500

C2 = C1/2 = 500/2 = 250

C3 = C2/2 =250/2 =125

C4 = C3/2 =125/2 = 62.5

C5 = C4/2 =62.5/2 = 31.25

C6 = C5/2 = 31.25/2 = 15.625

C7 = C6/2 =15.625/2 = 7.8125

C8 = C7/2 =7.8125/2 = 3.90625

C9 = C8/2 =3.90625/2 = 1.953125

C10 = C9/2 =1.953125/2 = 0.9765625

C11 = C10/2 = 0.9765625/2 = 0.48828125

penicilina (reporte final)

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